專利名稱:一種淤泥趨磁細菌及其分離純化和制備磁小體的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及細菌,尤其涉及菌體能產(chǎn)生磁小體的趨磁細菌,本發(fā)明還涉及趨磁細菌的分離純化及其制備磁小體的方法。
趨磁細菌(Magnetotactic bacterium,簡稱MB)MB-YN是從我國印染工廠廢水淤泥樣品中分離出的,該趨磁細菌MB-YN易于培養(yǎng)、磁小體的產(chǎn)生量大,現(xiàn)已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,地址為中國.武漢.武漢大學(xué),保藏日期2002年5月10日,保藏編號M202021,分類命名為Magnetotactic bacterium MB-YN。
趨磁細菌是生物磁學(xué)和仿生學(xué)研究領(lǐng)域一種良好的模式材料,其產(chǎn)生的磁小體顆粒小而均勻,外有生物膜包被,顆粒間不聚集,是一種生物來源的良好納米材料。趨磁細菌及其磁小體具有廣泛的用途,如(1)趨磁細菌用于制作磁化細胞;(2)用于廢水處理;(3)磁小體作為酶、藥物、核酸等的載體,用于生物傳感器、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域(4)用于信息存儲,磁小體可用于制作容量大、高清晰度、高保真水平的記錄材料;(5)趨磁細菌的磁小體合成基因克隆到發(fā)酵工業(yè)中的生產(chǎn)菌株,可大大改善發(fā)酵工藝。
本發(fā)明的趨磁細菌MB-YN已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,地址為中國.武漢.武漢大學(xué),保藏日期2002年5月10日,保藏編號M202021,分類命名為Magnetotactic bacterium MB-YN。其特征為微好氧細菌,菌體形態(tài)為長桿狀或園形、腎形、瓶狀等,產(chǎn)生圓形磁小體,每一菌體含3-20的磁小體,生長周期為25天-30天;磁小體的主要元素組成為鐵(Fe)、鈣(Ca)、磷(P)、氧、鎂。
趨磁細菌MB-YN的分離純化方法按下列步驟順序進行(1)對趨磁細菌進行富集培養(yǎng)①、取含趨磁細菌MB-YN淤泥土壤樣品,加入僅趨磁細菌能生長的選擇性富集培養(yǎng)基的瓶中,將瓶口密封;②、在22℃-30℃室溫下避光培養(yǎng)25~30天;③、用滴管吸取菌體及部分培養(yǎng)液,用5000~7000轉(zhuǎn)/分鐘離心8~12分鐘,去掉上清液;④、收集菌體即離心后的沉淀物,懸浮于無菌水中;(2)對趨磁細菌MB-YN進行純化培養(yǎng)⑤、先在培養(yǎng)皿中加入經(jīng)富集培養(yǎng)獲得的趨磁細菌水懸液,再倒入半固體生長培養(yǎng)基,冷卻凝固;⑥、在22-30℃下培養(yǎng)3天,挑選趨磁細菌MB-YN的單菌落,即為純化的趨磁細菌MB-YN。
上述的半固體生長培養(yǎng)基為在生長培養(yǎng)基中加入0.7%的瓊脂,113℃滅菌20分鐘。
上述的選擇性富集培養(yǎng)基每升的組份為丁二酸鈉1克,硝酸鈉0.1克,醋酸鈉0.2克,巰基乙酸鈉0.05克,維生素混合液10ml,礦物質(zhì)混合液10ml,0.01M奎寧酸鐵1ml,余者為水。再用NaOH調(diào)pH值為6.7,113℃滅菌20分鐘。
上述的維生素混合液每升的組份為生物素2.0毫克/升,葉酸2.0毫克/升,維生素B610.0毫克/升,維生素B25.0毫克/升,維生素B15.0毫克/升,維生素B55.0毫克/升,維生素B35.0毫克/升,維生素B120.1毫克/升,硫辛酸5.0毫克/升,ρ-aminobenzoic acid 5.0毫克/升,余者為水。
上述的礦物質(zhì)混合液每升的組份為nitrolotriacetic acid1.5克/升,硫酸鎂3克/升,硫酸錳0.5克/升,氯化鈉1克/升,硫酸鐵0.1克/升,氯化鈣0.1克/升,氯化鈷0.1克/升,硫酸鋅0.1克/升,硫酸銅0.01克/升,硫酸鉀鋁0.01克/升,硼酸0.01克/升,鉬酸鈉0.01克/升,余者為水。
趨磁細菌MB-YN制備磁小體的方法按下列步驟順序進行(1)對趨磁細菌MB-YN進行擴大培養(yǎng)a、在瓶中裝入生長培養(yǎng)基,113℃滅菌20分鐘,靜置12-20小時,接入純化的趨磁細菌MB-YN;b、在22℃-30℃室溫下,避光培養(yǎng)20~25天;c、再用5000轉(zhuǎn)/分離心10~12分鐘,去上清液,收集菌體;d、將菌體懸浮于無菌水中成菌體懸浮液;(2)對趨磁細菌MB-YN進行生長培養(yǎng)e、在瓶中裝入生長培養(yǎng)基,113℃滅菌20分鐘,靜置12-20小時,接入菌體懸浮液;f、在22℃-30℃室溫下,避光培養(yǎng)25~60天;g、再用5000轉(zhuǎn)/分離心10~12分鐘,去上清液,收集沉淀物;h、將沉淀物懸浮于無菌水中成懸浮液;(3)將懸浮液,用孔徑45um的濾紙初過慮,再用孔徑20um的濾紙過慮以除去細胞碎片;(4)再用5000轉(zhuǎn)/分離心10~12分鐘,去上清液,收集磁小體沉淀、真空干燥、密封保存,即制成趨磁細菌MB-YN來源的納米材料-磁小體。
上述的生長培養(yǎng)基為每1000ml的組份為維生素混合液10ml,礦物質(zhì)混合液10ml,KH2PO450mM,奎寧酸鐵250uM,丁二酸鈉1g,無水醋酸鈉0.2g,硝酸鈉0.1g,巰基乙酸鈉0.05g,加水至1000ml。再用NaOH調(diào)至pH值為6.7,113℃滅菌20分鐘。
上述維生素混合液的組份與選擇性富集培養(yǎng)基中的維生素混合液的組份相同。
上述礦物質(zhì)混合液的組份與選擇性富集培養(yǎng)基中礦物質(zhì)混合液的組份相同。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點其趨磁細菌MB-YN易于培養(yǎng),可制備具有廣泛用途的生物來源的納米材料-磁小體,磁小體產(chǎn)生量大,具有廣泛的開發(fā)、應(yīng)用前景,使納米科技研究領(lǐng)域的納米材料來源更豐富,性能更優(yōu)良,品種多樣化。
上述選擇性富集培養(yǎng)基每升的組份為丁二酸鈉1克,硝酸鈉0.1克,醋酸鈉0.2克,巰基乙酸鈉0.05克,維生素混合液10ml,礦物質(zhì)混合液10ml,0.01M奎寧酸鐵1ml,余者為水。再用NaOH調(diào)至pH值為6.7,113℃滅菌20分鐘。
上述維生素混合液每升的組份為生物素2.0毫克/升,葉酸2.0毫克/升,維生素B610.0毫克/升,維生素B25.0毫克/升,維生素B15.0毫克/升,維生素B55.0毫克/升,維生素B35.0毫克/升,維生素B120.1毫克/升,硫辛酸5.0毫克/升,ρ-aminobenzoic acid 5.0毫克/升,余者為水。
上述礦物質(zhì)混合液每升的組份為nitrolotriacetic acid 1.5克/升,硫酸鎂3克/升,硫酸錳0.5克/升,氯化鈉1克/升,硫酸鐵0.1克/升,氯化鈣0.1克/升,氯化鈷0.1克/升,硫酸鋅0.1克/升,硫酸銅0.01克/升,硫酸鉀鋁0.01克/升,硼酸0.01克/升,鉬酸鈉0.01克/升,余者為水。
趨磁細菌MB-YN可用如下方法進行純化先在培養(yǎng)皿中加入經(jīng)富集培養(yǎng)獲得的趨磁細菌水懸液,再倒入半固體生長培養(yǎng)基,冷卻凝固;在22-30℃下培養(yǎng)3天,挑選趨磁細菌MB-YN的單菌落;該單菌落即為純化的趨磁細菌MB-YN。
再在250ml瓶中,裝入200ml生長培養(yǎng)基,靜置12~20小時,接入純化的趨磁細菌MB-YN的單菌落,在22℃~30℃室溫下,避光培養(yǎng)20~25天。
趨磁細菌MB-YN用如下方法進行生長培養(yǎng)在500ml瓶中裝入400ml生長培養(yǎng)基,靜置12~20小時,接入趨磁細菌MB-YN水懸浮液,在22℃-30℃室溫下,避光培養(yǎng)25~60天。
再用5000轉(zhuǎn)/分離心10~12分鐘,去上清液,收集沉淀物將沉淀物懸浮于無菌水中成懸浮液。
將懸浮液,用孔徑45um的濾紙初過慮,再用孔徑20um的濾紙過慮以除去細胞碎片;再用5000轉(zhuǎn)/分離心10~12分鐘,去上清液,收集磁小體沉淀,真空干燥,密封保存,即制成趨磁細菌MB-YN來源的納米材料-磁小體。
上述半固體生長培養(yǎng)基為,在生長培養(yǎng)基中加入0.7%的瓊脂,113℃滅菌20分鐘。
上述生長培養(yǎng)基每1000ml的組份為維生素混合液10ml,礦物質(zhì)混合液10ml,KH2PO450mM,奎寧酸鐵250uM,丁二酸鈉1g,無水醋酸鈉0.2g,硝酸鈉0.1g,巰基乙酸鈉0.05g,加水至1000ml。用NaOH調(diào)至pH值為6.7,113℃滅菌20分鐘。
上述維生素混合液的組份與選擇性富集培養(yǎng)基中的維生素混合液的組份相同。
上述礦物質(zhì)混合液的組份與選擇性富集培養(yǎng)基中礦物質(zhì)混合液的組份相同。
權(quán)利要求
1.一種趨磁細菌,其特征在于,Magnetotactic bacterium MB-YN,CCTCC NOM202021。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種趨磁細菌,其特征在于,該趨磁細菌MB-YN為微好氧細菌,菌體形態(tài)為長桿狀、園形、腎形或瓶狀,產(chǎn)生圓形磁小體,每一菌體含3-20的磁小體,生長周期為25天-30天;磁小體的主要元素組成為鐵、鈣、磷、氧、鎂。
3.實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種趨磁細菌MB-YN的分離純化方法,該方法按下列步驟順序進行(1)對趨磁細菌進行富集培養(yǎng)a、取含趨磁細菌MB-YN淤泥土壤樣品,加入僅趨磁細菌能生長的選擇性富集培養(yǎng)基的瓶中,將瓶口密封;b、在22℃-30℃室溫下避光培養(yǎng)25~30天;c、用滴管吸取菌體及部分培養(yǎng)液,用5000~7000轉(zhuǎn)/分鐘離心8~12分鐘,去掉上清液;d、收集菌體即離心后的沉淀物,懸浮于無菌水中;(2)對趨磁細菌MB-YN進行純化培養(yǎng)A、先在培養(yǎng)皿中加入經(jīng)富集培養(yǎng)獲得的趨磁細菌水懸液,再倒入半固體生長培養(yǎng)基,冷卻凝固;B、在22-30℃下培養(yǎng)3天,挑選趨磁細菌MB-YN的單菌落,即為純化的趨磁細菌MB-YN。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備磁小體的方法,其特征在于,所述的半固體生長培養(yǎng)基為在生長培養(yǎng)基中加入0.7%的瓊脂,113℃滅菌20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備磁小體的方法,其特征在于,所述的擇性富集培養(yǎng)基每升的組份為丁二酸鈉1克,硝酸鈉0.1克,醋酸鈉0.2克,巰基乙酸鈉0.05克,維生素混合液10ml,礦物質(zhì)混合液10ml,0.01M奎寧酸鐵1ml,余者為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備磁小體的方法,其特征在于,所述的維生素混合液每升的組份為生物素2.0毫克/升,葉酸2.0毫克/升,維生素B610.0毫克/升,維生素B25.0毫克/升,維生素B15.0毫克/升,維生素B55.0毫克/升,維生素B35.0毫克/升,維生素B120.1毫克/升,硫辛酸5.0毫克/升,ρ-aminobenzoic acid 5.0毫克/升,余者為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備磁小體的方法,其特征在于,所述的礦物質(zhì)混合液每升的組份為nitrolotriacetic acid 1.5克/升,硫酸鎂3克/升,硫酸錳0.5克/升,氯化鈉1克/升,硫酸鐵0.1克/升,氯化鈣0.1克/升,氯化鈷0.1克/升,硫酸鋅0.1克/升,硫酸銅0.01克/升,硫酸鉀鋁0.01克/升,硼酸0.01克/升,鉬酸鈉0.01克/升,余者為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種趨磁細菌MB-YN制備磁小體的方法,該方法按下列步驟順序進行(1)對趨磁細菌MB-YN進行擴大培養(yǎng)a、在瓶中裝入生長培養(yǎng)基,113℃滅菌20分鐘,靜置12-20小時,接入純化的趨磁細菌MB-YN;b、在22℃-30℃室溫下,避光培養(yǎng)20~25天;c、再用5000轉(zhuǎn)/分離心10~12分鐘,去上清液,收集菌體;d、將菌體懸浮于無菌水中成菌體懸浮液;(2)對趨磁細菌MB-YN進行生長培養(yǎng)A、在瓶中裝入生長培養(yǎng)基,113℃滅菌20分鐘,靜置12-20小時,接入菌體懸浮液;B、在22℃-30℃室溫下,避光培養(yǎng)25~60天;C、再用5000轉(zhuǎn)/分離心10~12分鐘,去上清液,收集沉淀物;D、將沉淀物懸浮于無菌水中成懸浮液;(3)將懸浮液,用孔徑45um的濾紙初過慮,再用孔徑20um的濾紙過慮以除去細胞碎片;(4)再用5000轉(zhuǎn)/分離心10~12分鐘,去上清液,收集磁小體沉淀,真空干燥,密封保存,即制成趨磁細菌MB-YN來源的納米材料—磁小體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備磁小體的方法,其特征在于,所述的生長培養(yǎng)基為每1000ml的組份為維生素混合液10ml,礦物質(zhì)混合液10ml,KH2PO450mM,奎寧酸鐵250uM,丁二酸鈉1g,無水醋酸鈉0.2g,硝酸鈉0.1g,巰基乙酸鈉0.05g,余者為水。
全文摘要
一種趨磁細菌,該細菌從淤泥土壤樣品中分離出來,現(xiàn)已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號:M202021分類命名為:Magnetotactic bacterium MB-TK。該趨磁細菌MB-TK的特征為:微好氧細菌,菌體形態(tài)為桿狀或長橢圓形,產(chǎn)生圓形或多角形磁小體,每一菌體產(chǎn)生2~10顆磁小體;磁小體的主要元素組成為鐵(Fe)、硅(Si)、鋁(Al)、鈣(Ca)、碳(C)、氯(Cl)、氧、鎂。該趨磁細菌MB-TK具有如下優(yōu)點:易于培養(yǎng),可制備具有廣泛用途的生物來源的納米材料-磁小體,磁小體產(chǎn)生量大,具有廣泛的開發(fā)、應(yīng)用前景,使納米科技研究領(lǐng)域的納米材料來源更豐富,性能更優(yōu)良,品種多樣化。
文檔編號C12N1/20GK1379085SQ0211586
公開日2002年11月13日 申請日期2002年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月20日
發(fā)明者高梅影, 戴順英, 彭可凡 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所