專利名稱：一種淤泥趨磁細菌及其分離純化和制備磁小體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細菌，尤其涉及菌體能產(chǎn)生磁小體的趨磁細菌，本發(fā)明還涉及趨磁細菌的分離純化及其制備磁小體的方法。
趨磁細菌(Magnetotactic bacterium，簡稱MB)MB-YN是從我國印染工廠廢水淤泥樣品中分離出的，該趨磁細菌MB-YN易于培養(yǎng)、磁小體的產(chǎn)生量大，現(xiàn)已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2002年5月10日，保藏編號M202021，分類命名為Magnetotactic bacterium MB-YN。
趨磁細菌是生物磁學(xué)和仿生學(xué)研究領(lǐng)域一種良好的模式材料，其產(chǎn)生的磁小體顆粒小而均勻，外有生物膜包被，顆粒間不聚集，是一種生物來源的良好納米材料。趨磁細菌及其磁小體具有廣泛的用途，如(1)趨磁細菌用于制作磁化細胞；(2)用于廢水處理；(3)磁小體作為酶、藥物、核酸等的載體，用于生物傳感器、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域(4)用于信息存儲，磁小體可用于制作容量大、高清晰度、高保真水平的記錄材料；(5)趨磁細菌的磁小體合成基因克隆到發(fā)酵工業(yè)中的生產(chǎn)菌株，可大大改善發(fā)酵工藝。
本發(fā)明的趨磁細菌MB-YN已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2002年5月10日，保藏編號M202021，分類命名為Magnetotactic bacterium MB-YN。其特征為微好氧細菌，菌體形態(tài)為長桿狀或園形、腎形、瓶狀等，產(chǎn)生圓形磁小體，每一菌體含3-20的磁小體，生長周期為25天-30天；磁小體的主要元素組成為鐵(Fe)、鈣(Ca)、磷(P)、氧、鎂。
趨磁細菌MB-YN的分離純化方法按下列步驟順序進行(1)對趨磁細菌進行富集培養(yǎng)①、取含趨磁細菌MB-YN淤泥土壤樣品，加入僅趨磁細菌能生長的選擇性富集培養(yǎng)基的瓶中，將瓶口密封；②、在22℃-30℃室溫下避光培養(yǎng)25～30天；③、用滴管吸取菌體及部分培養(yǎng)液，用5000～7000轉(zhuǎn)/分鐘離心8～12分鐘，去掉上清液；④、收集菌體即離心后的沉淀物，懸浮于無菌水中；(2)對趨磁細菌MB-YN進行純化培養(yǎng)⑤、先在培養(yǎng)皿中加入經(jīng)富集培養(yǎng)獲得的趨磁細菌水懸液，再倒入半固體生長培養(yǎng)基，冷卻凝固；⑥、在22-30℃下培養(yǎng)3天，挑選趨磁細菌MB-YN的單菌落，即為純化的趨磁細菌MB-YN。
上述的半固體生長培養(yǎng)基為在生長培養(yǎng)基中加入0.7％的瓊脂，113℃滅菌20分鐘。
上述的選擇性富集培養(yǎng)基每升的組份為丁二酸鈉1克，硝酸鈉0.1克，醋酸鈉0.2克，巰基乙酸鈉0.05克，維生素混合液10ml，礦物質(zhì)混合液10ml，0.01M奎寧酸鐵1ml，余者為水。再用NaOH調(diào)pH值為6.7，113℃滅菌20分鐘。
上述的維生素混合液每升的組份為生物素2.0毫克/升，葉酸2.0毫克/升，維生素B610.0毫克/升，維生素B25.0毫克/升，維生素B15.0毫克/升，維生素B55.0毫克/升，維生素B35.0毫克/升，維生素B120.1毫克/升，硫辛酸5.0毫克/升，ρ-aminobenzoic acid 5.0毫克/升，余者為水。
上述的礦物質(zhì)混合液每升的組份為nitrolotriacetic acid1.5克/升，硫酸鎂3克/升，硫酸錳0.5克/升，氯化鈉1克/升，硫酸鐵0.1克/升，氯化鈣0.1克/升，氯化鈷0.1克/升，硫酸鋅0.1克/升，硫酸銅0.01克/升，硫酸鉀鋁0.01克/升，硼酸0.01克/升，鉬酸鈉0.01克/升，余者為水。
趨磁細菌MB-YN制備磁小體的方法按下列步驟順序進行(1)對趨磁細菌MB-YN進行擴大培養(yǎng)a、在瓶中裝入生長培養(yǎng)基，113℃滅菌20分鐘，靜置12-20小時，接入純化的趨磁細菌MB-YN；b、在22℃-30℃室溫下，避光培養(yǎng)20～25天；c、再用5000轉(zhuǎn)/分離心10～12分鐘，去上清液，收集菌體；d、將菌體懸浮于無菌水中成菌體懸浮液；(2)對趨磁細菌MB-YN進行生長培養(yǎng)e、在瓶中裝入生長培養(yǎng)基，113℃滅菌20分鐘，靜置12-20小時，接入菌體懸浮液；f、在22℃-30℃室溫下，避光培養(yǎng)25～60天；g、再用5000轉(zhuǎn)/分離心10～12分鐘，去上清液，收集沉淀物；h、將沉淀物懸浮于無菌水中成懸浮液；(3)將懸浮液，用孔徑45um的濾紙初過慮，再用孔徑20um的濾紙過慮以除去細胞碎片；(4)再用5000轉(zhuǎn)/分離心10～12分鐘，去上清液，收集磁小體沉淀、真空干燥、密封保存，即制成趨磁細菌MB-YN來源的納米材料-磁小體。
上述的生長培養(yǎng)基為每1000ml的組份為維生素混合液10ml，礦物質(zhì)混合液10ml，KH2PO450mM，奎寧酸鐵250uM，丁二酸鈉1g，無水醋酸鈉0.2g，硝酸鈉0.1g，巰基乙酸鈉0.05g，加水至1000ml。再用NaOH調(diào)至pH值為6.7，113℃滅菌20分鐘。
上述維生素混合液的組份與選擇性富集培養(yǎng)基中的維生素混合液的組份相同。
上述礦物質(zhì)混合液的組份與選擇性富集培養(yǎng)基中礦物質(zhì)混合液的組份相同。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點其趨磁細菌MB-YN易于培養(yǎng)，可制備具有廣泛用途的生物來源的納米材料-磁小體，磁小體產(chǎn)生量大，具有廣泛的開發(fā)、應(yīng)用前景，使納米科技研究領(lǐng)域的納米材料來源更豐富，性能更優(yōu)良，品種多樣化。
上述選擇性富集培養(yǎng)基每升的組份為丁二酸鈉1克，硝酸鈉0.1克，醋酸鈉0.2克，巰基乙酸鈉0.05克，維生素混合液10ml，礦物質(zhì)混合液10ml，0.01M奎寧酸鐵1ml，余者為水。再用NaOH調(diào)至pH值為6.7，113℃滅菌20分鐘。
上述維生素混合液每升的組份為生物素2.0毫克/升，葉酸2.0毫克/升，維生素B610.0毫克/升，維生素B25.0毫克/升，維生素B15.0毫克/升，維生素B55.0毫克/升，維生素B35.0毫克/升，維生素B120.1毫克/升，硫辛酸5.0毫克/升，ρ-aminobenzoic acid 5.0毫克/升，余者為水。
上述礦物質(zhì)混合液每升的組份為nitrolotriacetic acid 1.5克/升，硫酸鎂3克/升，硫酸錳0.5克/升，氯化鈉1克/升，硫酸鐵0.1克/升，氯化鈣0.1克/升，氯化鈷0.1克/升，硫酸鋅0.1克/升，硫酸銅0.01克/升，硫酸鉀鋁0.01克/升，硼酸0.01克/升，鉬酸鈉0.01克/升，余者為水。
趨磁細菌MB-YN可用如下方法進行純化先在培養(yǎng)皿中加入經(jīng)富集培養(yǎng)獲得的趨磁細菌水懸液，再倒入半固體生長培養(yǎng)基，冷卻凝固；在22-30℃下培養(yǎng)3天，挑選趨磁細菌MB-YN的單菌落；該單菌落即為純化的趨磁細菌MB-YN。
再在250ml瓶中，裝入200ml生長培養(yǎng)基，靜置12～20小時，接入純化的趨磁細菌MB-YN的單菌落，在22℃～30℃室溫下，避光培養(yǎng)20～25天。
趨磁細菌MB-YN用如下方法進行生長培養(yǎng)在500ml瓶中裝入400ml生長培養(yǎng)基，靜置12～20小時，接入趨磁細菌MB-YN水懸浮液，在22℃-30℃室溫下，避光培養(yǎng)25～60天。
再用5000轉(zhuǎn)/分離心10～12分鐘，去上清液，收集沉淀物將沉淀物懸浮于無菌水中成懸浮液。
將懸浮液，用孔徑45um的濾紙初過慮，再用孔徑20um的濾紙過慮以除去細胞碎片；再用5000轉(zhuǎn)/分離心10～12分鐘，去上清液，收集磁小體沉淀，真空干燥，密封保存，即制成趨磁細菌MB-YN來源的納米材料-磁小體。
上述半固體生長培養(yǎng)基為，在生長培養(yǎng)基中加入0.7％的瓊脂，113℃滅菌20分鐘。
上述生長培養(yǎng)基每1000ml的組份為維生素混合液10ml，礦物質(zhì)混合液10ml，KH2PO450mM，奎寧酸鐵250uM，丁二酸鈉1g，無水醋酸鈉0.2g，硝酸鈉0.1g，巰基乙酸鈉0.05g，加水至1000ml。用NaOH調(diào)至pH值為6.7，113℃滅菌20分鐘。
上述維生素混合液的組份與選擇性富集培養(yǎng)基中的維生素混合液的組份相同。
上述礦物質(zhì)混合液的組份與選擇性富集培養(yǎng)基中礦物質(zhì)混合液的組份相同。
權(quán)利要求
1.一種趨磁細菌，其特征在于，Magnetotactic bacterium MB-YN，CCTCC NOM202021。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種趨磁細菌，其特征在于，該趨磁細菌MB-YN為微好氧細菌，菌體形態(tài)為長桿狀、園形、腎形或瓶狀，產(chǎn)生圓形磁小體，每一菌體含3-20的磁小體，生長周期為25天-30天；磁小體的主要元素組成為鐵、鈣、磷、氧、鎂。
3.實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種趨磁細菌MB-YN的分離純化方法，該方法按下列步驟順序進行(1)對趨磁細菌進行富集培養(yǎng)a、取含趨磁細菌MB-YN淤泥土壤樣品，加入僅趨磁細菌能生長的選擇性富集培養(yǎng)基的瓶中，將瓶口密封；b、在22℃-30℃室溫下避光培養(yǎng)25～30天；c、用滴管吸取菌體及部分培養(yǎng)液，用5000～7000轉(zhuǎn)/分鐘離心8～12分鐘，去掉上清液；d、收集菌體即離心后的沉淀物，懸浮于無菌水中；(2)對趨磁細菌MB-YN進行純化培養(yǎng)A、先在培養(yǎng)皿中加入經(jīng)富集培養(yǎng)獲得的趨磁細菌水懸液，再倒入半固體生長培養(yǎng)基，冷卻凝固；B、在22-30℃下培養(yǎng)3天，挑選趨磁細菌MB-YN的單菌落，即為純化的趨磁細菌MB-YN。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備磁小體的方法，其特征在于，所述的半固體生長培養(yǎng)基為在生長培養(yǎng)基中加入0.7％的瓊脂，113℃滅菌20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備磁小體的方法，其特征在于，所述的擇性富集培養(yǎng)基每升的組份為丁二酸鈉1克，硝酸鈉0.1克，醋酸鈉0.2克，巰基乙酸鈉0.05克，維生素混合液10ml，礦物質(zhì)混合液10ml，0.01M奎寧酸鐵1ml，余者為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備磁小體的方法，其特征在于，所述的維生素混合液每升的組份為生物素2.0毫克/升，葉酸2.0毫克/升，維生素B610.0毫克/升，維生素B25.0毫克/升，維生素B15.0毫克/升，維生素B55.0毫克/升，維生素B35.0毫克/升，維生素B120.1毫克/升，硫辛酸5.0毫克/升，ρ-aminobenzoic acid 5.0毫克/升，余者為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備磁小體的方法，其特征在于，所述的礦物質(zhì)混合液每升的組份為nitrolotriacetic acid 1.5克/升，硫酸鎂3克/升，硫酸錳0.5克/升，氯化鈉1克/升，硫酸鐵0.1克/升，氯化鈣0.1克/升，氯化鈷0.1克/升，硫酸鋅0.1克/升，硫酸銅0.01克/升，硫酸鉀鋁0.01克/升，硼酸0.01克/升，鉬酸鈉0.01克/升，余者為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種趨磁細菌MB-YN制備磁小體的方法，該方法按下列步驟順序進行(1)對趨磁細菌MB-YN進行擴大培養(yǎng)a、在瓶中裝入生長培養(yǎng)基，113℃滅菌20分鐘，靜置12-20小時，接入純化的趨磁細菌MB-YN；b、在22℃-30℃室溫下，避光培養(yǎng)20～25天；c、再用5000轉(zhuǎn)/分離心10～12分鐘，去上清液，收集菌體；d、將菌體懸浮于無菌水中成菌體懸浮液；(2)對趨磁細菌MB-YN進行生長培養(yǎng)A、在瓶中裝入生長培養(yǎng)基，113℃滅菌20分鐘，靜置12-20小時，接入菌體懸浮液；B、在22℃-30℃室溫下，避光培養(yǎng)25～60天；C、再用5000轉(zhuǎn)/分離心10～12分鐘，去上清液，收集沉淀物；D、將沉淀物懸浮于無菌水中成懸浮液；(3)將懸浮液，用孔徑45um的濾紙初過慮，再用孔徑20um的濾紙過慮以除去細胞碎片；(4)再用5000轉(zhuǎn)/分離心10～12分鐘，去上清液，收集磁小體沉淀，真空干燥，密封保存，即制成趨磁細菌MB-YN來源的納米材料—磁小體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備磁小體的方法，其特征在于，所述的生長培養(yǎng)基為每1000ml的組份為維生素混合液10ml，礦物質(zhì)混合液10ml，KH2PO450mM，奎寧酸鐵250uM，丁二酸鈉1g，無水醋酸鈉0.2g，硝酸鈉0.1g，巰基乙酸鈉0.05g，余者為水。
全文摘要
一種趨磁細菌,該細菌從淤泥土壤樣品中分離出來,現(xiàn)已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號:M202021分類命名為:Magnetotactic bacterium MB－TK。該趨磁細菌MB－TK的特征為:微好氧細菌,菌體形態(tài)為桿狀或長橢圓形,產(chǎn)生圓形或多角形磁小體,每一菌體產(chǎn)生2～10顆磁小體;磁小體的主要元素組成為鐵(Fe)、硅(Si)、鋁(Al)、鈣(Ca)、碳(C)、氯(Cl)、氧、鎂。該趨磁細菌MB－TK具有如下優(yōu)點:易于培養(yǎng),可制備具有廣泛用途的生物來源的納米材料－磁小體,磁小體產(chǎn)生量大,具有廣泛的開發(fā)、應(yīng)用前景,使納米科技研究領(lǐng)域的納米材料來源更豐富,性能更優(yōu)良,品種多樣化。
文檔編號C12N1/20GK1379085SQ0211586
公開日2002年11月13日 申請日期2002年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月20日
發(fā)明者高梅影, 戴順英, 彭可凡 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所