專利名稱：一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
橄欖苦苷(oleuroprin)成分來源油橄欖樹(英文名01ive,拉丁文名europaea L)的葉子。橄欖苦苷是一種活性成份，具有強(qiáng)力的抗細(xì)菌和抗病毒特性、還有極強(qiáng)的抗氧化能力。橄欖苦苷的功能如下
I、它可以阻止細(xì)胞和病毒的生長，并刺激免疫系統(tǒng)中重要細(xì)胞的活性，以抵抗感染。2、對(duì)皰疹、膀胱和微菌感染也極為有效。3、它有抗氧化能力，能減輕低密度脂蛋白的氧化程度，預(yù)防冠心病，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。4、有舒緩血管平滑肌，降低血壓的能力。目前，采用現(xiàn)有的提取方法從油橄欖葉中提取橄欖苦苷，提取物中橄欖苦苷的含量在10%-40%，提取效果不佳，提取物中橄欖苦苷的含量較低，油橄欖葉的利用度不高。公開號(hào)CN102228514A的發(fā)明公開了一種從油橄欖葉中提取橄欖苦苷的方法，在用水或醇水混合溶劑提取之后，將提取液濃縮之后依次經(jīng)過三步分離大孔樹脂吸附并用醇水溶劑洗脫、脫色樹脂吸附和有機(jī)溶劑萃取，逐步對(duì)提取液當(dāng)中的橄欖苦苷進(jìn)行分離純化，最后獲得高含量的橄欖苦苷提取物，橄欖苦苷的含量大于40%。雖然該方法獲得的橄欖苦苷提取物中橄欖苦苷的含量有所提高，但仍不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，操作簡便，生產(chǎn)成本低，所得橄欖苦苷提取物中橄欖苦苷的含量高達(dá)80%-90%，油橄欖葉的利用度高。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，所述的制備方法步驟如下
①將油橄欖葉粉碎，向粉碎物中加入提取溶劑提取得粗提液，提取溫度40-100°C，提取時(shí)間1-2. 5小時(shí)，提取2-3次；
②將粗提液濃縮至干得粗提物I，粗提物I加2-10倍重量的蒸餾水溶解，離心，取上清液，上DM130或DlOl大孔吸附樹脂層析柱吸附，先用保留體積2-4倍量的蒸餾水洗脫，再用保留體積2-6倍量的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮至干得粗提物II ；上DM130或DlOl大孔吸附樹脂層析柱吸附先用蒸餾水洗脫以去除雜質(zhì)，加強(qiáng)分離效果，提高產(chǎn)品純度；保留體積為從進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積；
③粗提物II加堿性溶液溶解得混合液，所述堿性溶液用量為每千克粗提物II加入10-30L堿性溶液，混合液用1-2倍體積的萃取溶劑萃取2-5次，收集萃取液，濃縮至干得粗提物III ；
④粗提物III上硅膠或氧化鋁 柱層析，用保留體積4-6倍量的洗脫劑洗脫，所述洗脫劑為氯仿甲醇混合液或乙醇水溶液，收集洗脫液，冷凍干燥或噴霧干燥得成品。氯仿甲醇混合液是配合硅膠柱層析使用，乙醇水溶液是配合氧化鋁柱層析使用。本發(fā)明在獲得粗提液后，先經(jīng)大孔吸附樹脂吸附分離，再加堿性溶液溶解、萃取后經(jīng)硅膠或氧化鋁柱層析分離，最后干燥得高含量橄欖苦苷提取物。通過這樣操作，本發(fā)明獲得的橄欖苦苷提取物中橄欖苦苷的含量高達(dá)80%-90%，油橄欖葉的利用度高。步驟③粗提物II加堿性溶液溶解，堿性條件下粗提物II的溶解性好，所需的分散水相(即溶劑)消耗少，同時(shí)可以節(jié)省萃取溶劑的消耗量，節(jié)省了提取成本，分散水相、萃取溶劑的消耗量可節(jié)省30%-40%。而且，這樣萃取操作也方便，簡化了操作，為下一步更進(jìn)一步的分離打好了基礎(chǔ)，對(duì)于提高橄欖苦苷提取物中橄欖苦苷的含量有著重要的作用。作為優(yōu)選，步驟①中所述的提取溶劑為蒸餾水、甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液，提取溶劑用量為每千克粉碎物加入6-20L提取溶劑。控制提取溶劑的用量及濃度等參數(shù)，以提高提取效果。作為優(yōu)選，甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液的體積濃度均為30-90%。作為優(yōu)選，步驟②和步驟③中所述的濃縮至干的具體操作為先在70-80°C水浴蒸干，再送至烘箱中，70-80°C下烘3-5小時(shí)。通過這樣操作，去除殘留溶劑。作為優(yōu)選，步驟②中甲醇水溶液、乙醇水溶液的體積濃度均為40%_80%。作為優(yōu)選，步驟②中上DM130或DlOl大孔吸附樹脂層析柱吸附，洗脫流速為Iml/min-3ml/min，大孔吸附樹脂的徑高比為I :8或I :10。利用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離和初步的純化比較符合大規(guī)模生產(chǎn)的要求。使用的分離介質(zhì)經(jīng)濟(jì)易得，且可多次反復(fù)利用，操作簡單，避免了用很多其他分離介質(zhì)時(shí)所要求的苛刻條件，最重要的是分離性能穩(wěn)定，可重復(fù)性高。洗脫流速和大孔吸附樹脂的徑高比對(duì)分離效果影響較大，控制洗脫流速為Iml/min-3ml/min和大孔吸附樹脂的徑高比為I :8或I :10，以達(dá)到最佳的分離純化效果。作為優(yōu)選，步驟③中所述的堿性溶液為質(zhì)量濃度0. 1%-0. 4%的氫氧化鈉溶液、質(zhì)量濃度0. 1%-0. 4%的氫氧化鉀溶液或質(zhì)量濃度1%_5%的碳酸鈉溶液，所述的萃取溶劑為乙酸乙酯或正丁醇。堿性溶液的選擇和濃度的控制較關(guān)鍵，這樣能對(duì)樣品(粗提物II)最佳的適應(yīng)和溶解，為進(jìn)一步的分離純化打好基礎(chǔ)，對(duì)于提高橄欖苦苷提取物中橄欖苦苷的含量有著重要的作用。作為優(yōu)選，步驟④中所述的氯仿甲醇混合液中氯仿的體積為甲醇體積的8倍或9倍，步驟④中所述的乙醇水溶液的體積濃度為70-95%。作為優(yōu)選，步驟④中所述的硅膠柱的硅膠大小為200-300目，上樣量為meK=1:10-20。本步驟的上樣量指樣品的質(zhì)量與硅膠質(zhì)量的比值?？刂乒枘z大小和上樣量，以達(dá)到最佳的分離效果，橄欖苦苷的轉(zhuǎn)移率高，最終產(chǎn)品的純度高。作為優(yōu)選，步驟④中所述的氧化鋁柱的氧化鋁大小為200-300目，上樣量為
本步驟的上樣量指樣品的質(zhì)量與氧化鋁質(zhì)量的比值。氧化鋁柱為中性氧化鋁柱?？刂蒲趸X大小和上樣量，以達(dá)到最佳的分離效果，橄欖苦苷的轉(zhuǎn)移率高，最終產(chǎn)品的純度高。
本發(fā)明的有益效果是操作簡便，生產(chǎn)成本低，所得橄欖苦苷提取物中橄欖苦苷的含量高達(dá)80%-90%，油橄欖葉的利用度高。


圖I是本發(fā)明制備的橄欖苦苷提取物的HPLC檢測圖譜。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。實(shí)施例I
①將5kg油橄欖葉粉碎，向粉碎物中加入30L體積濃度均90%的乙醇水溶液提取得粗提液，提取溫度40°C，提取時(shí)間2. 5小時(shí)，提取3次；
②將粗提液濃縮至干得粗提物I，粗提物I加2倍重量的蒸餾水溶解，離心，取上清液，上DM130大孔吸附樹脂層析柱吸附，先用保留體積2倍量的蒸餾水洗脫，再用保留體積6倍量的體積濃度為40%的乙醇水溶液洗脫，洗脫流速為3ml/min，DM130大孔吸附樹脂的徑高比為I :8，收集洗脫液，洗脫液先在70°C水浴蒸干，再送至烘箱中，70°C下烘5小時(shí)得粗提物II ;
③粗提物II加質(zhì)量濃度0.1%的氫氧化鈉溶液溶解得混合液，所述氫氧化鈉溶液用量為每千克粗提物II加入30L，混合液用等體積的乙酸乙酯萃取5次，收集萃取液，萃取液先在70°C水浴蒸干，再送至烘箱中，70°C下烘5小時(shí)得粗提物III ；
④粗提物III上硅膠柱層析，硅膠柱的硅膠大小為200-300目，上樣量為m#s:m桂膠=1:10，用保留體積4倍量的氯仿甲醇混合液(氯仿甲醇混合液中氯仿的體積為甲醇體積的8倍)洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥得成品125. 6g。經(jīng)HPLC檢測，成品中橄欖苦苷的含量在80. 6%。
實(shí)施例2
①將5kg油橄欖葉粉碎，向粉碎物中加入100L體積濃度均30%的甲醇水溶液提取得粗提液，提取溫度100°C，提取時(shí)間I小時(shí)，提取2次；
②將粗提液濃縮至干得粗提物I，粗提物I加10倍重量的蒸餾水溶解，離心，取上清液，上DlOl大孔吸附樹脂層析柱吸附，先用保留體積4倍量的蒸餾水洗脫，再用保留體積2倍量的體積濃度為80%的甲醇水溶液洗脫，洗脫流速為lml/min，DlOl大孔吸附樹脂的徑高比為I : 10，收集洗脫液，洗脫液先在80°C水浴蒸干，再送至烘箱中，80°C下烘3小時(shí)得粗提物II ;
③粗提物II加質(zhì)量濃度5%的碳酸鈉溶液溶解得混合液，所述碳酸鈉溶液用量為每千克粗提物II加入10L，混合液用2倍體積的正丁醇萃取2次，收集萃取液，萃取液先在80°C水浴蒸干，再送至烘箱中，80°C下烘3小時(shí)得粗提物III ；
④粗提物III上氧化鋁柱層析，氧化鋁柱的氧化鋁大小為200-300目，上樣量為m#smft 10，用保留體積6倍量的質(zhì)量濃度70%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥得
成品 202. 4g。經(jīng)HPLC檢測，成品中橄欖苦苷的含量在85. 7%。
實(shí)施例3
①將5kg油橄欖葉粉碎，向粉碎物中加入40L體積濃度均50%的丙酮水溶液提取得粗提液，提取溫度60°C，提取時(shí)間2小時(shí)，提取2次；
②將粗提液濃縮至干得粗提物I，粗提物I加5倍重量的蒸餾水溶解，離心，取上清液，上DM130大孔吸附樹脂層析柱吸附，先用保留體積3倍量的蒸餾水洗脫，再用保留體積4倍量的體積濃度為50%的乙醇水溶液洗脫，洗脫流速為2ml/min，DM130大孔吸附樹脂的徑高比為I : 10，收集洗脫液，洗脫液先在75°C水浴蒸干，再送至烘箱中，75°C下烘4小時(shí)得粗提物II ；
③粗提物II加質(zhì)量濃度0.4%的氫氧化鉀溶液溶解得混合液，所述氫氧化鉀溶液用量為每千克粗提物II加入15L，混合液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，收集萃取液，萃取液先在75°C水浴蒸干，再送至烘箱中，75°C下烘4小時(shí)得粗提物III ；
④粗提物III上氧化鋁柱層析，氧化鋁柱的氧化鋁大小為200-300目，上樣量為m#smftftfg=l: 7，用保留體積5倍量的質(zhì)量濃度95%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥得成品 220. 8g。經(jīng)HPLC檢測，成品中橄欖苦苷的含量在90. 0%。
此外，本發(fā)明提及的堿性溶液氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度可在0. 1%-0. 4%作出調(diào)整，氫氧化鉀溶液質(zhì)量濃度可在0. 1%-0. 4%作出調(diào)整，碳酸鈉溶液質(zhì)量濃度可1%_5%作出調(diào)整。本發(fā)明成品的HPLC檢測采用Agilent 1200型液相色譜儀，Thermo色譜柱-C18。液相色譜具體參數(shù)為
流動(dòng)相乙腈0. 1%磷酸溶液=7 3 (體積比)；
柱溫30度,流速0. 6ml/min ；
檢測波長240納米，檢測圖譜見附圖I。以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的 限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
權(quán)利要求
1.一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于所述的制備方法步驟如下 ①將油橄欖葉粉碎，向粉碎物中加入提取溶劑提取得粗提液，提取溫度40-100°C，提取時(shí)間1-2. 5小時(shí)，提取2-3次； ②將粗提液濃縮至干得粗提物I，粗提物I加2-10倍重量的蒸餾水溶解，離心，取上清液，上DM130或DlOl大孔吸附樹脂層析柱吸附，先用保留體積2-4倍量的蒸餾水洗脫，再用保留體積2-6倍量的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮至干得粗提物II ； ③粗提物II加堿性溶液溶解得混合液，所述堿性溶液用量為每千克粗提物II加入10-30L堿性溶液，混合液用1-2倍體積的萃取溶劑萃取2-5次，收集萃取液，濃縮至干得粗提物III ； ④粗提物III上硅膠或氧化鋁柱層析，用保留體積4-6倍量的洗脫劑洗脫，所述洗脫劑為氯仿甲醇混合液或乙醇水溶液，收集洗脫液，冷凍干燥或噴霧干燥得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于步驟①中所述的提取溶劑為蒸餾水、甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液，提取溶劑用量為每千克粉碎物加入6-20L提取溶劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液的體積濃度均為30-90%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于步驟②和步驟③中所述的濃縮至干的具體操作為先在70-80°C水浴蒸干，再送至烘箱中，70-80°C下烘3-5小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于步驟②中甲醇水溶液、乙醇水溶液的體積濃度均為40%-80%。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于步驟②中上DM130或DlOl大孔吸附樹脂層析柱吸附,洗脫流速為lml/min-3ml/min,大孔吸附樹脂的徑高比為I :8或I :10。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于步驟③中所述的堿性溶液為質(zhì)量濃度0. 1%-0. 4%的氫氧化鈉溶液、質(zhì)量濃度0. 1%-0. 4%的氫氧化鉀溶液或質(zhì)量濃度1%_5%的碳酸鈉溶液，所述的萃取溶劑為乙酸乙酯或正丁醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于步驟④中所述的氯仿甲醇混合液中氯仿的體積為甲醇體積的8倍或9倍，步驟④中所述的乙醇水溶液的體積濃度為70-95%。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于步驟④中所述的硅膠柱的硅膠大小為200-300目，上樣量為m#s :mejR=l: 10-20。
10.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其特征在于步驟④中所述的氧化招柱的氧化招大小為200-300目，上樣量為=1:7-10。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高含量橄欖苦苷提取物的制備方法，其目的在于克服現(xiàn)有制備方法存在的橄欖苦苷提取物中橄欖苦苷含量不高的問題。本發(fā)明在獲得粗提液后，先經(jīng)大孔吸附樹脂吸附分離，再加堿性溶液溶解、萃取后經(jīng)硅膠或氧化鋁柱層析分離，最后干燥得高含量橄欖苦苷提取物。本發(fā)明獲得的橄欖苦苷提取物中橄欖苦苷的含量高達(dá)80%-90%，油橄欖葉的利用度高。
文檔編號(hào)C07H17/04GK102659867SQ20121008867
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者孫振蛟, 汪俊, 蔣富強(qiáng), 謝繼才 申請(qǐng)人:寧波立華植物提取技術(shù)有限公司