專利名稱：一種新型白果蛋白的制備和表征方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型白果蛋白的制備方法，尤其是白果蛋白的提取分離和結(jié)構(gòu)表征技術(shù)。背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在不同的pH值環(huán)境下可解離為正離子和負(fù)離子，而且具有各自的等電點(diǎn)。而使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的基本因素是它分子表面的水化層與同性電荷的作用，若破壞這些因素即可促使蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀，這就是蛋白質(zhì)鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分離沉淀法的基本原理。蛋白質(zhì)按其溶解度分類可分為(I)清蛋白，溶于水及稀鹽、稀酸或稀堿溶液，為飽和硫酸銨所沉淀；(2)球蛋白，溶于稀鹽溶液，為半飽和硫酸銨所沉淀；(3)谷蛋白，不溶于水、醇及中性鹽溶液，但易溶于稀酸或稀堿；(4)醇溶谷蛋白，不溶于水及無(wú)水乙醇，但溶于70 80%乙醇中；(5)組蛋白，溶于水及稀酸，但為稀氨水所沉淀，分子呈堿性；(6)魚精蛋白，溶于水及稀酸，不溶于氨水；(7)硬蛋白，這類蛋白一般是動(dòng)物體內(nèi)做為結(jié)締及保護(hù)功能的蛋白質(zhì)，不溶于水、鹽、稀酸或稀堿。蛋白質(zhì)按其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的不同可分為兩大類，即纖維狀蛋白質(zhì)和球狀蛋白質(zhì)兩大類。然后用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行提取。如清蛋白可選擇用水和鹽溶液，球蛋白用鹽溶液，組蛋白和谷蛋白等不溶于水或鹽的可選擇用稀酸或稀堿溶液。在提取的過(guò)程中，考慮到蛋白質(zhì)受溫度的影響會(huì)變性，一般選擇常溫?cái)嚢杼崛?、低溫減壓提取、超聲波和微波輔助提取等。當(dāng)獲得蛋白質(zhì)混合物提取液后，想要將所要的蛋白質(zhì)與其它雜質(zhì)初步分離開來(lái)，一般采用鹽析等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。同時(shí)可采用離子交換層析、凝膠過(guò)濾、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法，膜過(guò)濾分級(jí)的方法。銀杏樹(Ginkgo Biloba L.)是落葉喬木中雌雄異株的裸子植物,原產(chǎn)于中國(guó)，素有“活化石”，“植物界的熊貓”之稱。白果在我國(guó)食用、藥用歷史已有3000年之久。近十幾年來(lái)，對(duì)銀杏白果蛋白的研究取得了一定的進(jìn)展。Uwe等在1989年從白果中分離出一種類似豆球蛋白的物質(zhì)。牛衛(wèi)寧等報(bào)道了從白果中提取得到的蛋白具有抗菌作用。黃文等應(yīng)用不同的提取方法，分離出白果清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和堿溶蛋白等，發(fā)現(xiàn)白果中的蛋白質(zhì)主要以清蛋白和球蛋白為主，其中白果清蛋白具有抗氧化和延緩衰老等作用。鄧乾春等分離出一種新蛋白GAPIIa并對(duì)其進(jìn)行氨基酸殘基分析，指出氨基酸組成為脂肪族氨基酸殘基占33. 21% (共90個(gè))，芳香族氨基酸殘基占7. 38% (共20個(gè))，羥基氨基酸殘基與含硫氨基酸殘基占26. 57% (共72個(gè))，酸性氨基酸殘基及其酰胺占23. 61% (共64個(gè))，堿性氨基酸殘基占6. 27% (共17個(gè))。經(jīng)證實(shí)GAP具有較明顯的抗生物氧化活性。黃文等采用Halliwell方法對(duì)白果中不同蛋白清除羥基自由基(.OH)的能力進(jìn)行了測(cè)定，相應(yīng)的抑制率為清蛋白(50. 84% )、球蛋白(24. 09% )、醇溶蛋白(45. 78% )、堿溶蛋白(41. 33% )。鄧乾春等探討白果清蛋白(GAP)對(duì)正常小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。由于白果蛋白具有很好的藥食價(jià)值，隨著我國(guó)銀杏種植業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大，白果產(chǎn)量日益增加，需要開發(fā)具有高新技術(shù)含量的白果蛋白深加工產(chǎn)品。本發(fā)明專利重點(diǎn)研究白果蛋白質(zhì)提取和分離方法，制備一種新型白果蛋白，為銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題蛋白質(zhì)在提取分離過(guò)程中受外界因系影響會(huì)變性，本發(fā)明的技術(shù)難點(diǎn)在于提取白果蛋白的過(guò)程中保持蛋白的結(jié)構(gòu)不變，制備高純度的蛋白質(zhì)，分離鑒定新型結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種新型白果蛋白的制備和表征方法，新鮮白果經(jīng)脫脂和減壓沸騰提取，分離富集蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個(gè)蛋白帶。為了實(shí)現(xiàn)本技術(shù)方案，本發(fā)明具體步驟如下第一步新鮮白果在-10°C至_50°C下冷凍干燥，除去外殼和內(nèi)衣，將果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6%、粒度在10目-50目的白果粗粉。第二步用非極性溶劑與白果粗粉按質(zhì)量比例4-30 I (g/g)加入到脫脂釜萃取0. 5 10小時(shí)，萃取溫度-10°C至80°C，過(guò)濾，濾渣在室溫通風(fēng)下干燥，制備脫脂白果粉。第三步將脫脂白果粉加入到0. 1-0. 50mol/L NaCl鹽溶液減壓沸騰提取5 30min，提取溶劑pH8-9，提取溫度20°C -75 °C，脫脂白果粉與提取劑質(zhì)量體積比例為1:3-1: 30 (g/ml)，提取次數(shù)2-6次，合并提取液。第四步將鹽溶液提取液采用40% -80%硫酸銨溶液兩次沉淀，沉淀時(shí)間3_24h，pH 5-7，濾液經(jīng)過(guò)不同孔徑膜切割分離分子量10 000 Da 30 000 Da的蛋白質(zhì)溶液，-10°C至_50°C下冷凍干燥制備高純度白果蛋白粉。第五步用DEAE-Cellulose樹脂對(duì)白果蛋白粉進(jìn)行純化。白果蛋白粉與去離子水質(zhì)量體積比例為I 3-1 50 (g/ml)，用緩沖液pH 7. 0-9. 5的0. 1-1. 5mol/L NaCl溶液洗脫樹脂，洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)電泳分析，得到蛋白質(zhì)樣品由分子量為21. 4KDa、17. 9KDa和15. 8KDa譜帶組成。第六步將DEAE-Cellulose樹脂洗脫液經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠G純化，分離得到蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個(gè)蛋白帶。第七步采用電泳技術(shù)及MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜技術(shù)對(duì)純化的蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個(gè)蛋白帶進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)表征，分離鑒定新型白果蛋白。第八步采用17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品做外標(biāo)對(duì)照，建立HPLC氨基酸的分析方法，分析新型白果蛋白中氨基酸的組成和相對(duì)含量。本發(fā)明采用電泳技術(shù)及MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜技術(shù)對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。MALDI-T0F-MS質(zhì)譜分析儀(Applied Biosystems)緩沖溶液采用l/15mol/LNaHPO4, l/15mol/L KH2PO4,以不同的比例配制不同pH值的樣品緩沖液。pH = 3. 5，pH = 4，pH = 4. 5, pH = 5，pH = 5. 5，pH = 6，pH = 6. 5，pH = 7. 0, pH = 7. 5，pH = 8. 0, pH = 8. 5，pH = 9. 0的樣品緩沖液。分析條件UV激光，355nm下200Hz的重復(fù)率，20KV電壓，質(zhì)量分辨率為I 500Da，采用胰蛋白酶消化肌紅蛋白做為儀器內(nèi)部校正。MS檢測(cè)限為100ppm，MS/MS檢測(cè)限為0. 6Da ;在此條件下獲得的樣品質(zhì)譜峰使用4700Explore Software (AppliedBiosystems)在默認(rèn)模式下進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果由GPS Explore (V3. 6)提供的MASC0T(2. I)搜索引擎進(jìn)行分析比對(duì)，參數(shù)設(shè)置如下=NCBI (美國(guó)國(guó)立生物信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)；蛋白分子質(zhì)量范圍700 3 200 Da ;胰蛋白酶消化；蛋白匹配度(protein scores)大于59或MS/MS的離子匹配度(ion score)大于30為顯著(P < 0. 05)。本發(fā)明電泳marker標(biāo)準(zhǔn)曲線以14. 4KD marker條帶為基線,量取每個(gè)條帶到基線的距離，并以此為橫坐標(biāo)X，分子量為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y = 4. 8312X+14. 4，R2 = O. 8746。本發(fā)明分離富集蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個(gè)蛋白帶。其特征在于蛋白 beltl 由分子量分別為 m/z 1408. 65,1663. 94,1823. 86,2064. 99 和 2208. 08 五條肽段組成的球蛋白llS-globulin，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性蛋白質(zhì)分析，匹配到蛋白質(zhì)gi/949869 (Iegumin)，分子量為51418，等電點(diǎn)(pi) 8. 69。蛋白belt2為新蛋白，由分子量m/z 2131和m/z :2338肽段組成，m/z :2131肽段的精確序列為I/L S A I/L T A D I/LGNff Q/KD S P G I/L R, m/z :2338 肽段的精確序列為 AAQ/KVDSSSDVYASD N I/L P G G N R0 蛋白 belt3 為分子量分別為 1605、1913、2053、2242 和 2355 五 5 個(gè)肽段組成，通過(guò)NCBI通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性蛋白質(zhì)分析，匹配到的蛋白是beltl蛋白和 belt2蛋白混合物。本發(fā)明蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個(gè)蛋白帶的一級(jí)結(jié)構(gòu)解析如

圖1-7.beltl蛋白的質(zhì)譜利用MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜對(duì)條帶I蛋白進(jìn)行肽段測(cè)序，如圖1，共獲得近50條肽段，選取離子強(qiáng)度較大的5個(gè)肽段1409、1664、1824、2065和2208進(jìn)行MS/MS分析，通過(guò)BLAST(蛋白質(zhì)序列對(duì)比工具)將獲得的這5條肽段序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性蛋白質(zhì)分析，匹配到蛋白質(zhì)gi/949869 (Iegumin)，llS-globulin,匹配度121,分子量為51.418KDa，等電點(diǎn)(pl)8.69。MASCOT顯示此種蛋白質(zhì)全序列如表I所示，下劃線部分是匹配到的序列組，占全序列的38%。表Ibeltl的蛋白全序列
NO.氨基酸序列 Amino acid sequence
IMEKQTTLLILLVCLLFSIQCFTSNAREAEVERRQREQLQQSCRFDRLNAQ
51EPTQRITSEGGSVELLNVEDSEQFQCAGVAPLRETLNPNALSLPRYTNTP
101TMAYVVEGEGRLGVVFPGCPETFQSSTSRGGEGQQSQERSQKIRRVRRGD
151VVAIPAGVAYWLYNDGNRRLQIVAIADTSNHQNQLDQTYRPFYLAGSAPS
201GAQKAAGATSIGDNILQGFDTDTLAEAMGISQDTARRIQQNQKKGLIVKV
251ERGLRMPGPPSDDYEREREREGNNVEEFYCSMRL畫ADDSEDADVYVRN
301GGRLNTVNRLKLPALRSLRLGAERGILQPNAMFAPSWLNAHAVMYVTRGQ
351GRIQIVQNEGRRVFDGAVKEGQFLVIPQLHAIAKQAGKDGLEWISFTTSD
401SPIRSTLTGRNSVLKAMPQEVVMNAYRINGKDARDLRRNREHETIILSPT
451PQHQQPRAIEbe 112蛋白的質(zhì)譜
belt2經(jīng)胰蛋白酶酶解，MALDI-T0F-T0F分析后得到該酶的肽指紋圖譜，如圖3，由于在MALDI條件下C端為Arg的肽離子化效率明顯高于C端的Lys肽，因而經(jīng)過(guò)磺化反應(yīng)后，如圖4，選擇2條離子化效率相對(duì)較高的Arg肽(肽段m/z :2131和肽段m/z :2338)進(jìn)RMS/MS分析，如圖5，清晰的展出一系列離子，通過(guò)手工計(jì)算相鄰系列離子的質(zhì)量差可知，肽段 m/z 2131 的的精確序列為 I/L S A I/L T A D I/L G N WQ/K D S P G I/L R，肽段m/z 2338 的精確序列為 AAQ/KVDSSSDVYASDNI/LPGGNR。be 113蛋白的質(zhì)譜belt3蛋白經(jīng)過(guò)MALDI-T0F-T0F分析，如圖5，獲得一系列肽段，選取離子強(qiáng)度較大的5個(gè)肽段1605、1913、2053、2242和2355進(jìn)一步進(jìn)行MS/MS分析，通過(guò)BLAST (蛋白質(zhì)序列對(duì)比工具)將獲得的這5條肽段序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性蛋白質(zhì)分析，匹配到的蛋白與beltl蛋白相同，只是匹配度稍低，為89，并且從質(zhì)譜圖中得到部分峰與belt2蛋白相同，也就是說(shuō)，belt3可能不是單一組分純蛋白質(zhì),而是一個(gè)混合蛋白條帶,包含beltl的一個(gè)大片段和belt2的部分片段，可能是因?yàn)榈鞍椎臄嗔鸦蛘叩鞍紫嗷プ饔脤?dǎo)致的。本發(fā)明采用電泳圖譜分析，得到蛋白質(zhì)樣品由分子量不同的三個(gè)譜帶組成。其中蛋白帶beltl分子量為21. 4KDa，是蛋白質(zhì)gi/949869的一個(gè)主要的肽段。belt2分子量為17. 9KDa, belt3 分子量為 15. 8KDa。如圖 6-7。本發(fā)明制備的新型白果蛋白，富含16種氨基酸，其中丙氨酸Ala、賴氨酸(Lys)和纈氨酸Val大于4.0%，天冬氨酸Asp大于6. 5%絲氨酸(Ser)大于10. 5%，組氨酸(His)大于40. 5%。本發(fā)明HPLC氨基酸分析條件鄰苯二甲醛柱前衍生，固定相C18 (0 4. 6X 50mm，5um)，流動(dòng)相A:醋酸鈉溶液(內(nèi)含3%。四氫呋喃)；流動(dòng)相:甲醇乙腈=200 450 350，進(jìn)行線性梯度洗脫。如表2 :表2鹽溶蛋白的氨基酸組成
權(quán)利要求
1.一種新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于新鮮白果經(jīng)脫脂和減壓沸騰提取，分離富集蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個(gè)蛋白帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于蛋白beltl由分子量分別為 m/z 1408. 65、1663. 94、1823. 86,2064. 99 和 2208. 08 五條肽段組成的球蛋白llS-globulin,通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性蛋白質(zhì)分析，匹配到蛋白質(zhì)gi/949869 (Iegumin)，分子量為 51418，等電點(diǎn)(pi) 8. 69。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于蛋白belt2為新蛋白，由分子量m/z :2131和m/z :2338肽段組成，m/z :2131肽段的精確序列為I/L SAI/LTA DI/LG N W Q/K D S P GI/L R, m/z :2338 肽段的精確序列為 AA Q/K VDSSSDVYASD NI/L P G G N R0
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于蛋白belt3為分子量分別為1605、1913、2053、2242和2355五5個(gè)肽段組成，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性蛋白質(zhì)分析，匹配到的蛋白是beltl蛋白和belt2蛋白混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于新型白果蛋白富含16種氨基酸，其中丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)和纈氨酸(Val)大于4.0%，天冬氨酸(Asp)大于6. 5%,絲氨酸(Ser)大于10. 5% ,組氨酸(His)大于40. 5%
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于新鮮白果在-10°C至-50°C下冷凍干燥，除去外殼和內(nèi)衣，將果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6%、粒度在10目-50目的白果粗粉。再用非極性溶劑與白果粗粉按質(zhì)量比例4-30 l(g/g)加入到脫脂釜萃取0. 5 10小時(shí)，萃取溫度-10°C至80°C，過(guò)濾，濾渣在室溫通風(fēng)下干燥，制備脫脂白果粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于減壓沸騰提取是將脫脂白果粉加入到0. 1-0. 50mol/L NaCl鹽溶液減壓沸騰提取5 30min，提取溶劑PH8-9，提取溫度20°C_75°C，脫脂白果粉與提取劑質(zhì)量體積比例為I : 3_1 30(g/ml)，提取次數(shù)2-6次，合并提取液。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于分離純化是將鹽溶液提取液經(jīng)過(guò)40% -80%硫酸銨溶液兩次沉淀，沉淀時(shí)間3-24h，pH 5_7，濾液經(jīng)過(guò)不同孔徑膜切割分離分子量10 OOODa 30 OOODa的蛋白質(zhì)溶液，_10°C至_50°C下冷凍干燥制備高純度白果蛋白粉。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于分離純化是采用DEAE-Cellulose樹脂對(duì)白果蛋白粉進(jìn)行純化。白果蛋白粉與去離子水質(zhì)量體積比例為1:3-1: 50(g/ml)，用緩沖液pH 7. 0-9. 5的0. 1-1. 5mol/L NaCl溶液洗脫樹脂，洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)電泳分析，得到蛋白質(zhì)樣品由分子量為21. 4KDa、17. 9KDa和15. 8KDa譜帶組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于分離純化是將DEAE-Cellulose樹脂洗脫液經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠G純化,分離得到蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個(gè)蛋白帶。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備方法，其特征在于新型白果蛋白采用電泳技術(shù)及MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜技術(shù)對(duì)純化的蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個(gè)蛋白帶進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)表征。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述新型白果蛋白的制備方法，其特征在于新型白果蛋白富含.16種氨基酸，其中丙氨酸Ala、賴氨酸(Lys)和纈氨酸Val大于4. O %，天冬氨酸Asp大于6.5%,絲氨酸(Ser)大于10. 5%,組氨酸(His)大于40. 5%
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述非極性溶劑，其物征為正己烷、石油醚、6號(hào)溶劑油、丙酮等溶劑中一種或幾種任意比例的混合溶劑。
全文摘要
本發(fā)明公開一種新型白果蛋白的制備和表征方法，將新鮮白果經(jīng)脫脂和減壓沸騰提取，沉淀、膜分離和DEAE纖維素樹脂及葡聚糖凝膠(Sephadex)G純化蛋白質(zhì)，首次分離富集蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三個(gè)蛋白帶，分子量分別為21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa。蛋白belt1由分子量分別為m/z1408.65、1663.94、1823.86、2064.99和2208.08五條肽段組成的球蛋白11S-globulin。蛋白belt2為新蛋白，由分子量m/z2131和m/z2338肽段組成，m/z2131肽段的精確序列為I/L S A I/L T A DI/L G N W Q/K D S P G I/L R，m/z2338肽段的精確序列為A A Q/K V D S S S D V Y A S D N I/L P G G N R。蛋白belt3為分子量分別為1605、1913、2053、2242和2355五條肽段組成。本發(fā)明制備富集的白果蛋白質(zhì)含量高于90％，由16種氨基酸組成，其中丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)和纈氨酸(Val)大于4.0％，天冬氨酸(Asp)大于6.5％，絲氨酸(Ser)大于10.5％，組氨酸(His)大于40.5％。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102617716SQ20121007934
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者原姣姣, 周彥, 王成章, 陳虹霞, 陳西娟 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所