專利名稱：重組蛋白a/g基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組蛋白A/G基因，以及含有這種重組基因的載體、轉(zhuǎn)化的菌株和重組蛋白A基因表達(dá)的產(chǎn)物，及其純化方法和親和填料的制備和用途。
背景技術(shù)：
:葡萄球菌蛋白A (Staphylococal Protein A, SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)。1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)在某些金黃色葡萄球菌中含有一種物質(zhì)，在雙向擴(kuò)散試驗(yàn)中，能與正常人血清形成沉淀。1959年Jensen也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，將其命名為A抗原。1963年Lofkvist等人分離了 A物質(zhì),證明它是一種蛋白質(zhì),且與糖有不同；1960年Grov命名其為葡萄球菌蛋白A，簡(jiǎn)稱SPA (Protein A)。編碼SPA的基因于1983年被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)。Uhlen等在1984年闡明了蛋白A的全基因序列和相應(yīng)的氣基酸序列。對(duì)蛋白A的結(jié)構(gòu)和功能研 究發(fā)現(xiàn)，SPA包括A、B、C、D、E等5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有與大多數(shù)哺乳動(dòng)物IgG的Fe區(qū)獨(dú)立結(jié)合的能力。2003年，L.Yang等應(yīng)用表面張力探針證明每個(gè)蛋白A分子可結(jié)合兩個(gè)IgG分子。鏈球菌蛋白G(Streptococcal Protein G, SPG)是一種從鏈球菌細(xì)胞壁和培養(yǎng)上清中分離的蛋白質(zhì)。1973年，Kronvall報(bào)道了鏈球菌A、C和G群許多菌株的細(xì)胞壁及培養(yǎng)上清中含有能與IgG Fe片段結(jié)合的蛋白質(zhì)，其特性與金黃色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcus aureus A protein, SPA)明顯不同。1984 年,Bjorck 等將其統(tǒng)稱為鏈球菌蛋白G(SPG)。SPG與SPA雖然都能結(jié)合IgG，但分子結(jié)構(gòu)研究表明，它們是完全不同的分子。除C端有小段氨基酸相同外，兩者的基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)并無(wú)相同之處。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在G蛋白的C端有3處氨基酸序列相同的結(jié)構(gòu)與IgG結(jié)合有關(guān)。此外，通過(guò)計(jì)算蛋白G與IgG反應(yīng)的平衡常數(shù)并與SPA比較，結(jié)果蛋白G對(duì)多數(shù)IgG的親和常熟較SPA高，表明蛋白G的結(jié)合力比SPA強(qiáng)。對(duì)蛋白G與IgG結(jié)合譜的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白G對(duì)不同種屬的IgG結(jié)合力與SPA有明顯不同，詳見(jiàn)表I。表1.免疫球蛋白與Protein A和Protein G的結(jié)合力
權(quán)利要求
1.一種重組融合蛋白A/G的基因表達(dá)序列，其特征是: 1)其序列根據(jù)宿主菌大腸桿菌密碼子的特點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化； 2)包含I個(gè)重組蛋白A的B結(jié)構(gòu)域和I個(gè)重組蛋白G的IgG結(jié)合功能區(qū)； 3)N端包含his標(biāo)簽序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，所述的重組蛋白A/G基因序列為SEQNol0
3.根據(jù)權(quán)利要求1，所述的重組蛋白A/G的氨基酸序列為SEQNo2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，所述的重組蛋白A/G基因表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，其特征為所述表達(dá)載體優(yōu)先為PBV220。
5.一種重組蛋白A/G親和填料，其特征是以瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，采用環(huán)氧活化基質(zhì)，將所述的重組蛋白A/G配基以共價(jià)鍵的方式固定在載體表面，從而合成了蛋白A/G親和填料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5，所述的重組蛋白A/G親和填料可以用于多種不同種屬哺乳動(dòng)物IgG抗體的分離 純化。
全文摘要
一種重組融合蛋白的制備及應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是將金黃色葡萄球菌蛋白A和鏈球菌蛋白G的IgG結(jié)合域基因進(jìn)行串聯(lián)，插入熱誘導(dǎo)型大腸桿菌載體pBV220，構(gòu)建了含有該基因的大腸桿菌重組表達(dá)載體及其轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α重組菌株和利用此菌株生產(chǎn)重組蛋白A/G的方法。此菌株所產(chǎn)生的可溶性重組蛋白A/G達(dá)到細(xì)菌可溶性蛋白總量的40％以上，經(jīng)鎳離子螯合層析純化和陰離子交換層析純化可將重組蛋白A/G的純度達(dá)到95％以上，該蛋白具有表達(dá)量高、成本低、易純化等優(yōu)點(diǎn)。用這種重組蛋白為配基制備的親和填料兼具有蛋白A和蛋白G與IgG結(jié)合的特點(diǎn)，可以和更多種屬哺乳動(dòng)物的IgG很好地結(jié)合，可廣泛用于不同種屬哺乳動(dòng)物IgG的純化。
文檔編號(hào)C07K16/00GK103184229SQ20111046129
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者宮照龍, 何新舟, 曹暉, 許允立 申請(qǐng)人:本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司