專利名稱：抗體與診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及診斷試劑以及利用試劑盒診斷疾病的方法，特別是利用抗體及包含抗體的試劑盒診斷遺傳性的乳腺癌和卵巢癌。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性人群中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。在美國，每年有超過二十萬的女性被診斷患有乳腺癌，在歐洲和中國，每年確診患有乳腺癌的人數(shù)也都在這一水平之上，全世界每年死于乳腺癌的人數(shù)超過五十萬。然而，如果能夠盡早診斷發(fā)現(xiàn)，乳腺癌病情的預(yù)后發(fā)展還是相當(dāng)令人樂觀的。例如，在第IV期才得到診斷的乳腺癌患者只有約20%能夠活到 5年之后，而在第I期就確診的患者幾乎能百分之百地活到5年之后。相比之下，盡管卵巢癌的發(fā)病幾率小得多，但它卻是致死率最高的癌癥之一，確診后能生存5年以上患者少于 50%。但是這很大程度上是由于卵巢癌不能得到及時(shí)的診斷所致，因?yàn)楦哌_(dá)75%的卵巢癌病例是在癌組織已經(jīng)擴(kuò)散后才被診斷出來的。大約有10%的乳腺癌和卵巢癌是由遺傳性的BRCAl和BRCA2基因突變引發(fā)的。攜帶有這些突變基因的女性在70歲之前得乳腺癌或卵巢癌的幾率分別可高達(dá)85%和55%。 在最近的十年里，發(fā)達(dá)國家已經(jīng)能夠?qū)ε訠RCAl和BRCA2突變基因的攜帶者進(jìn)行乳腺癌和卵巢癌的易感性基因檢測。一旦發(fā)現(xiàn)有這類突變基因，就需要加強(qiáng)病情的日常監(jiān)測(包括乳房X光片、核磁共振、CA-125篩查等)，以期能夠盡早診斷是否有惡性腫瘤發(fā)生，從而使病情有良好的預(yù)后發(fā)展。另外，伴隨有BRCAl和BRCA2基因突變的腫瘤與其他腫瘤有著十分不同的表現(xiàn)型，特別地，能引起DNA損傷的化學(xué)治療(如鉬類抗癌藥物)以及放射治療方法對前者有很好的效果，但微管蛋白抑制劑(如紫杉醇類)則對其沒有很顯著的效果。此外，人們正在研發(fā)一類新的特異性針對BRCAl和BRCA2基因缺陷型癌癥的藥物——PARP抑制劑，而這類藥物的使用通常要求先對病人進(jìn)行BRCAl和BRCA2基因突變的檢測?，F(xiàn)行的BRCAl和BRCA2基因的遺傳檢測通常是在分子水平上對基因組DNA進(jìn)行復(fù)雜的分析，需要投入大量的勞力，成本很高。這樣的高成本對于發(fā)展中國家來說幾乎是無法克服的壁壘，而技術(shù)的復(fù)雜性也使得普通醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室都不能進(jìn)行這種檢測。相比之下，基于抗體的BRCA基因突變檢測技術(shù)是一種更為廉價(jià)的方法。美國專利編號為5，965，377的技術(shù)發(fā)明就提供了一種這樣的方法利用BRCAl或BRCA2蛋白N端和 C端的特異性抗體檢測BRCA蛋白是否存在截?cái)嘧儺?，抗體不能與C末端特異性結(jié)合就表明蛋白質(zhì)存在截?cái)嗤蛔?。然而，這種檢測方法的特異性和靈敏度都不高。Kashima等人研究了家族性卵巢癌(Jpn. J. Cancer Res. ,91 :399-409 QOOO))，利用對BRCAl蛋白的免疫組化染色檢驗(yàn)了這種方法，他們發(fā)現(xiàn)有時(shí)候在腫瘤樣品包含突變時(shí)C末端抗體也會(huì)著色，我們不得不進(jìn)一步仔細(xì)考察抗體著色的亞細(xì)胞定位才能據(jù)此確定BRCAl基因變異的狀態(tài)。因而， 現(xiàn)行的檢測方法尚未能滿足我們所期望的高精確度和低成本的要求
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過構(gòu)建新的特異性抗體為BRCAl變異的檢測提供了一種更加簡易方便的方法。這種方法有著精確度高，操作簡易以及成本低的特點(diǎn)。特別地，本發(fā)明提供并利用一種獨(dú)立抗體，能夠選擇性地與人類BRCAl基因的第11個(gè)外顯子編碼的多肽片段C端發(fā)生免疫反應(yīng)。這種抗體對于檢測BRCAl基因的第11個(gè)外顯子突變尤其有效。將這種抗體與人類BRCAl蛋白的C端抗體聯(lián)合使用，就構(gòu)成了能夠檢測乳腺癌或卵巢癌腫瘤樣品中幾乎所有類型的BRCAl蛋白截?cái)嘧儺惖脑\斷試劑盒。在一般的實(shí)施方案中，這種抗體能選擇性地與含有如序列編號1 (SEQ ID N0:1) 所示氨基酸序列的多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種抗體是用含有序列編號 KSEQ ID NO 1)中至少6個(gè)連續(xù)氨基酸的抗原免疫動(dòng)物所得到的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 這種抗體為單克隆抗體。另外，本發(fā)明還包括用來產(chǎn)生這種抗體的動(dòng)物以及雜交瘤細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明也提供了這種抗體用途，用于制備診斷試劑盒以檢測病人腫瘤樣品中BRCAl的截?cái)嗤蛔?。在?yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用(1)本發(fā)明中的抗體， (2)選擇性與人類BRCAl蛋白N端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，以及C3)選擇性與人類BRCAl蛋白 C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，用于制備診斷BRCAl基因截?cái)嗤蛔兊脑噭┖校貏e是針對乳腺癌或卵巢癌的腫瘤樣品。本發(fā)明的試劑盒同時(shí)還提供獨(dú)立分裝的容器，其中包含(1)針對人類BRCAl基因的第11個(gè)外顯子編碼的多肽的C端的特異性抗體，以及(2)選擇性與人類BRCAl蛋白C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。在一些優(yōu)選方案中，試劑盒還包含能夠選擇性與人類BRCA2蛋白C 端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。另外，本發(fā)明的試劑盒還可以同時(shí)包含與人類BRCAl蛋白N端特異發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體和/或與人類BRCA2蛋白N端特異發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。除了以上所述之外，本發(fā)明還提供了檢測腫瘤樣品中BRCAl蛋白截?cái)嗤蛔兊姆椒ǎ?1)用本發(fā)明中特異性地針對BRCAl基因第11個(gè)外顯子編碼的多肽片段C端的抗體與腫瘤樣品接觸，并測定其與樣品的結(jié)合情況；以及( 用選擇性地與人類BRCAl蛋白C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體與腫瘤樣品接觸，并測定其與樣品的結(jié)合狀況。在這種檢測操作方法下，如果樣品中的BRCAl蛋白與針對BRCAl基因第11個(gè)外顯子編碼的多肽片段C端的抗體和針對BRCAl蛋白C端的抗體這兩種抗體都不結(jié)合，就表明樣品中BRCAl基因在第 11個(gè)外顯子的上游區(qū)域發(fā)生了截?cái)嗤蛔?。如果檢測到腫瘤樣品中BRCAl蛋白和針對BRCAl 蛋白C端的抗體的結(jié)合能力減弱或不能結(jié)合，但卻和針對BRCAl基因第11個(gè)外顯子編碼的多肽片段C端的抗體正常結(jié)合，就表明BRCAl基因在第11個(gè)外顯子的下游區(qū)域發(fā)生了截?cái)嗤蛔?。如果檢測到樣品中的BRCAl蛋白與針對BRCAl基因第11個(gè)外顯子編碼的多肽片段 C端的抗體結(jié)合能力減弱或缺失，但卻與針對BRCAl蛋白C端的抗體正常結(jié)合，就表明第11 個(gè)外顯子區(qū)域發(fā)生了截?cái)嗤蛔?。而如果針對BRCAl基因第11個(gè)外顯子編碼的多肽片段C 端的抗體和針對BRCAl蛋白C端的抗體都與樣品正常結(jié)合，則表明BRCAl基因沒有發(fā)生截?cái)嗤蛔?。前面已?jīng)提到的和其他還沒有提及的本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征，以及它們所實(shí)現(xiàn)的方式，都將在下面的發(fā)明詳述中給予清楚地說明。另外，發(fā)明詳述中還將結(jié)合具體例子闡釋優(yōu)選及典型的實(shí)施方案。


圖1是用不同的BRCAl抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)試驗(yàn)的示意圖，據(jù)此可以判定造成蛋白截?cái)嗟腂RCAl基因的突變位點(diǎn)所在；圖2是雜交瘤細(xì)胞克隆BZ-98的上清液對MCF-7細(xì)胞裂解物進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡檢測(Western Blot)的圖象。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用一種新設(shè)計(jì)的特異性抗體對BRCAl蛋白的截?cái)嗤蛔冞M(jìn)行檢測，具有精確度高，操作簡易和成本低的特點(diǎn)。新設(shè)計(jì)的抗體能夠特異性地與人類BRCAl基因第11外顯子編碼的多肽片段的C端發(fā)生免疫反應(yīng)，即該抗體能夠識別從該多肽鏈C末端起300個(gè)氨基酸殘基之內(nèi)的表位(以下簡稱這抗體為“第11外顯子抗體”)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 這一表位定位在距多肽鏈C末端200個(gè)或100個(gè)氨基酸殘基之內(nèi)的位點(diǎn)。最優(yōu)的情況是， 這一抗體特異性地與第11外顯子編碼的多肽鏈C端50個(gè)氨基酸殘基順序發(fā)生免疫反應(yīng)， 也就是說，這種抗體能選擇性地與含有如序列編號1 (SEQ ID NO :1)所示氨基酸序列的多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種抗體是用含有序列編號1 (SEQ ID NO 1)中至少 6個(gè)，7個(gè)，8個(gè)，9個(gè)，10個(gè)，11個(gè)，12個(gè)，15個(gè)，17個(gè)或20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的抗原免疫動(dòng)物所得到的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種抗體是用含有序列編號1 (SEQ ID NO 1)中至少6 個(gè)，7個(gè)，8個(gè)，9個(gè)，10個(gè)，11個(gè)，12個(gè)，15個(gè)，17個(gè)或20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的抗原免疫動(dòng)物所得到的，并且其在免疫細(xì)胞化學(xué)染色試驗(yàn)中對MCF-7細(xì)胞染色至少是對UWB1. 289細(xì)胞染色強(qiáng)度的5到10倍以上。依照本發(fā)明的方法，利用抗體對病人的腫瘤樣品進(jìn)行免疫測定就能夠檢測出 BRCAl蛋白的截?cái)嗤蛔儭κ褂玫拿庖邷y定方法沒有特殊要求，只要是能夠檢測抗體與腫瘤樣品中BRCAl蛋白的結(jié)合情況即可。比如，合適的免疫測定方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)、免疫熒光測定(immunofluorescence assay)、免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)，以及上述方法的改良形式。用于檢測的合適的腫瘤樣品可以是手術(shù)樣品、活組織檢查樣品、腫瘤組織的FFPE樣品，以及從病人身上取得的細(xì)胞或其培養(yǎng)液。為方便起見，我們可以利用腫瘤組織使用免疫組織化學(xué)的方法測定。檢測中可以至少使用兩種抗體(1)上已述及的所設(shè)計(jì)的特異性抗體，即能選擇性與人類BRCAl基因的第11外顯子編碼的多肽片段C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體(簡稱“第 11外顯子抗體”)，(2)選擇性與人類BRCAl蛋白的C端免疫反應(yīng)的抗體(簡稱“BRCA1 C 端抗體”)。選擇性與人類BRCAl蛋白的C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體(“BRCA1 C端抗體”)的識別表位位于BRCAl蛋白質(zhì)從C端起300個(gè)氨基酸殘基之內(nèi)。適用的BRCAl C端抗體可以是現(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道的GLK-2單克隆抗體。見Kashima et al.，Jpn. J. Cancer Res. 91(4) 399(2000)。檢測病人的腫瘤樣品中是否含有BRCAl蛋白的截?cái)嗤蛔兊倪^程至少包含以下幾個(gè)操作步驟(1)用以上所述的“第11外顯子抗體”，即能選擇性與人類BRCAl基因的第11 外顯子編碼的多肽片段C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，與腫瘤樣品接觸反應(yīng)，并測定其與腫瘤樣品的結(jié)合情況；(2)用選擇性與人類BRCAl蛋白的C端發(fā)生免疫反應(yīng)的“BRCA1 C端抗體”與腫瘤樣品接觸反應(yīng)，并測定其與腫瘤樣品的結(jié)合情況。在這種檢測操作方法下，同時(shí)檢測到第11外顯子抗體和BRCAl C端抗體與樣品中BRCAl蛋白結(jié)合減弱或者不能結(jié)合，就表明樣品中BRCAl基因在第11個(gè)外顯子的上游區(qū)域發(fā)生了截?cái)嗤蛔?；檢測到BRCAl C端抗體與樣品中BRCAl蛋白結(jié)合減弱或不能結(jié)合，而第11外顯子抗體正常結(jié)合，就表明樣品中BRCAl基因在第11個(gè)外顯子的下游區(qū)域發(fā)生了截?cái)嗤蛔?。檢測到第11外顯子抗體與樣品中BRCAl蛋白結(jié)合減弱或缺失，而C端抗體與樣品正常結(jié)合，就表明在第11個(gè)外顯子區(qū)域發(fā)生了截?cái)嗤蛔儭６绻?1外顯子抗體和C端抗體與樣品中BRCAl蛋白的結(jié)合都正常，則表明樣品中BRCAl基因沒有發(fā)生對應(yīng)的蛋白的截?cái)嗤蛔??？赡艿那闆r，也是優(yōu)選的情況是，整個(gè)操作步驟還將包含另一步，即用能夠特異性與人類BRCAl蛋白的N端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體(簡稱“BRCA1 N端抗體”)與腫瘤樣品接觸反應(yīng)，并測定其與腫瘤樣品的結(jié)合情況。N端抗體與腫瘤樣品的結(jié)合情況可以作為陽性對照。當(dāng)然，某些樣品中，由于BRCAl蛋白降解，N端抗體也可能顯現(xiàn)不與樣品結(jié)合。選擇性與人類BRCAl蛋白的N端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體(簡稱“BRCA1 N端抗體”)，其識別表位在BRCAl蛋白質(zhì)從N端起300個(gè)氨基酸殘基之內(nèi)；適用的BRCAl N端抗體可以是現(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道的Ab-2或MS-13單克隆抗體，可以從 Calbiochem/Merch Chemicals (Darmstadt,Germany)買到。這一抗體的特異結(jié)合部位在 BRCAl 蛋白 N 端 1-300 氨基酸順序內(nèi)。見 Frazer et al. ,British Journal of Cancer 88，1263-1270(2003).對以上操作方法總結(jié)如下面的表1所示
表 權(quán)利要求
1.一種經(jīng)純化的抗體，能夠選擇性與含有如序列編號1或2所示的氨基酸序列的多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。
2.制備如權(quán)利要求1所述的抗體的方法，包括以下步驟提供一種能夠產(chǎn)生和釋放上述抗體的細(xì)胞或動(dòng)物；培養(yǎng)這種細(xì)胞或動(dòng)物；收集細(xì)胞培養(yǎng)液或動(dòng)物血清；以及從細(xì)胞培養(yǎng)液或動(dòng)物血清中純化上述可以與含有如序列編號1或2所示的氨基酸序列的多肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。
3.能夠產(chǎn)生如權(quán)利要求1-3所述的抗體的細(xì)胞或非人類動(dòng)物，所述的抗體為單克隆抗體。
4.一種能夠選擇性與人類BRCAl基因的第11個(gè)外顯子編碼的多肽片段C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體的用途，用于制備可以檢測出病人樣品中BRCAl基因第11個(gè)外顯子中的截?cái)嗤蛔兊臋z測試劑盒。
5.一種檢測BRCAl基因第11個(gè)外顯子中的截?cái)嗤蛔兊姆椒ǎ▽⒁徊∪藰悠放c一種能夠選擇性與人類BRCAl基因的第11個(gè)外顯子編碼的多肽片段C 端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體相接觸，如果所述抗體能夠和所述樣品發(fā)生特異性免疫結(jié)合就判定病人的BRCAl基因第11個(gè)外顯子中沒有發(fā)生截?cái)嗤蛔?，反之則判定為病人的BRCAl基因第 11個(gè)外顯子中有截?cái)嗤蛔儭?br> 6.一種檢測腫瘤樣品中BRCAl蛋白的截?cái)嘧儺惖姆椒?，包括用?1外顯子抗體，即能選擇性與人類BRCAl基因的第11外顯子編碼的多肽片段C 端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，與上述腫瘤樣品接觸反應(yīng)；以及用選擇性與人類BRCAl蛋白的C端發(fā)生免疫反應(yīng)的C端抗體與上述腫瘤樣品接觸反應(yīng)，并測定其與上述腫瘤樣品的結(jié)合情況，在這種方法下同時(shí)檢測到上述獨(dú)立抗體和上述C 端抗體結(jié)合能力的減弱或者缺失，就表明BRCAl基因在第11個(gè)外顯子區(qū)域或其上游區(qū)域發(fā)生了截?cái)嗤蛔儯粰z測到上述C端抗體結(jié)合能力的減弱或缺失，而上述獨(dú)立抗體正常結(jié)合，就表明BRCAl基因在第11個(gè)外顯子的下游區(qū)域發(fā)生了截?cái)嗤蛔儭６鴻z測到上述獨(dú)立抗體和上述C端抗體結(jié)合情況都正常，則表明BRCAl基因沒有發(fā)生對應(yīng)的蛋白的截?cái)嗤蛔儭?br> 7.一種試劑盒，包括一種第11外顯子抗體，能夠選擇性與人類BRCAl基因的第11個(gè)外顯子編碼的多肽的 C端發(fā)生免疫反應(yīng)；一種能夠選擇性與人類BRCAl蛋白的C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，還包括一種能夠選擇性與人類BRCA2蛋白的C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，還包括一種能夠選擇性與人類BRCAl蛋白的N端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體；以及一種能夠選擇性與人類BRCA2蛋白的N端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。
10.一種試劑盒，包括(1) 一種第11外顯子抗體，能夠選擇性與人類BRCAl基因的第11個(gè)外顯子編碼的多肽的C端發(fā)生免疫反應(yīng)；(2)一種能夠選擇性與人類BRCAl蛋白的C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體；(3)一種能夠選擇性與人類BRCA2蛋白的C端發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體；(4)一種能夠選擇性與人類雌激素受體(ER)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體；(5)一種能夠選擇性與人類孕酮受體(PR)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體；(6)一種能夠選擇性與Her/neu發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了針對一種腫瘤抑制蛋白特定區(qū)域的新抗體。以抗體為基礎(chǔ)，本發(fā)明還提供了用來區(qū)分乳腺癌或卵巢癌具體類型的診斷方法和試劑。
文檔編號C07K16/18GK102241772SQ201110126050
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日
發(fā)明者祝建 申請人:湖州數(shù)問生物技術(shù)有限公司