專利名稱：一種去離子甲酰胺的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及法醫(yī)遺傳學及分子生物學領域。特別涉及一種去離子甲酰胺的制備方法。
背景技術：
很多分子生物學DNA檢測技術需要對樣品DNA需要進行變性處理，即使DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為單鏈結(jié)構(gòu)。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可破壞雙螺旋結(jié)構(gòu)引起核酸分子變性。甲酰胺作為一種變性劑被廣泛用于核酸雜交和核酸變性，如Southern， Northern, Slot blot分析，YAC篩選等，法醫(yī)DNA檢測中需要使用甲酰胺對樣品DNA進行變性處理，以保持DNA的單鏈狀態(tài)，便于后續(xù)毛細管電泳檢測。能夠滿足上述應用的甲酰胺必須高度去離子化以及具備較高的純度(無污染物)，因此甲酰胺的質(zhì)量非常重要，務必使用電導率小于100μ S/cm的去離子甲酰胺。電導率大于100μ S/cm的甲酰胺含有離子，在進樣時與DNA競爭，這會導致低的峰值，降低靈敏度。延長進樣時間不能提高信號強度。離子交換樹脂是帶有官能團(有交換離子的活性基團)、具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、不溶性的高分子化合物。通常是球形顆粒物。離子交換樹脂的全名稱由分類名稱、骨架(或基因)名稱、基本名稱組成?？紫督Y(jié)構(gòu)分凝膠型和大孔型兩種，凡具有物理孔結(jié)構(gòu)的稱大孔型樹脂， 在全名稱前加“大孔”。分類屬酸性的應在名稱前加“陽”，分類屬堿性的，在名稱前加“陰”。 如大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂。樹脂中化學活性基團的種類決定了樹脂的主要性質(zhì)和類別。離子交換樹脂首先區(qū)分為陽離子樹脂和陰離子樹脂兩大類。陽離子樹脂又分為強酸性和弱酸性兩類，陰離子樹脂又分為強堿性和弱堿性兩類(或再分出中強酸和中強堿性類)。離子交換樹脂通常制成珠狀的小顆粒，它的尺寸也很重要。樹脂顆粒較細者，反應速度較大，但細顆粒對液體通過的阻力較大，需要較高的工作壓力；特別是濃糖液粘度高， 這種影響更顯著。因此，樹脂顆粒的大小應選擇適當。如果樹脂粒徑在0.2mm(約為70目) 以下，會明顯增大流體通過的阻力，降低流量和生產(chǎn)能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種去離子甲酰胺的制備方法。本發(fā)明的提供去離子甲酰胺的制備方法，包括如下步驟(1)將甲酰胺與離子交換樹脂混合，得到混合液；(2)將上述步驟(1)中得到的混合液混合均勻，再將混合液通過過濾器去除離子交換樹脂，收集濾液，得到所述去離子甲酰胺。步驟⑴中，所述甲酰胺與離子交換樹脂的配比為(100-500)ml (2_8)g，優(yōu)選為甲酰胺離子交換樹脂為100ml 5g。
步驟O)中，所述混合均勻通過攪拌進行。上述攪拌是通過磁力攪拌器進行的；所述攪拌的攪拌時間為45分鐘-120分鐘，優(yōu)選為45-60分鐘；所述磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為400-800rpm，優(yōu)選是600rpm ；上述攪拌時間為如下1)或2)所述1)步驟(1)中甲酰胺的pH小于7. 0，攪拌時間為45分鐘；2)步驟(1)中甲酰胺的pH大于7. 0，攪拌時間為60分鐘。步驟O)中，所述混合均勻通過震蕩進行。上述震蕩步驟的震蕩時間為2-7小時，優(yōu)選為3小時。上述離子交換樹脂為陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂；所述離子交換樹脂優(yōu)選是經(jīng)過冷凍脫水處理的離子交換樹脂；所述離子交換樹脂為AG501-X8樹脂和/或MB-3樹脂；所述離子交換樹脂的交聯(lián)度為5%。上述過濾器為Whatman過濾器、Millipore過濾器或尼龍過濾器，所述過濾器的孔徑優(yōu)選為0. 22um。上述制備方法得到的去離子甲酰胺也屬于本發(fā)明的保護范圍。經(jīng)過本發(fā)明方法獲得的超純的甲酰胺具有較高的純度，無RNase和DNase。這使得甲酰胺成分分子生物學領域的一種理想的變性劑。甲酰胺不會引起一些珍貴DNA或RNA樣本的降解。甲酰胺必須通過一個混合離子交換樹脂進行預過濾以去除殘留金屬離子或其它降解產(chǎn)物。這個過濾的過程保證了溶液的最終純度高于99. 5%，280nm處吸收值低于0. 05。 能夠使DNA氫鍵斷裂，從而實現(xiàn)DNA變性。本發(fā)明的去離子甲酰胺能夠降低核酸的溶解溫度使得核酸兩條鏈更容易分離。通常，DNA在雙鏈結(jié)構(gòu)狀態(tài)下相對比較穩(wěn)定(即使是在堿基不互補的條件下)，而在單鏈條件下DNA結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，所以甲酰胺必須增加單鏈分子的穩(wěn)定性，即本發(fā)明方法中所選用的待去離子的超純的甲酰胺應具有較高的純度，且無RNase和DNase。本發(fā)明的制備去離子甲酰胺的方法中所需的甲酰胺為高純級，即純度為99. 9%以上的甲酰胺，并在氮氣的環(huán)境下包裝，檢測無RNA酶，磷酸酶，DNA酶以及蛋白酶。本發(fā)明的方法中需要借助一種或幾種離子交換樹脂的使用，從而有效地去除甲酰胺中的各種離子雜質(zhì)。實驗證明采用上述方案制備得到的去離子甲酰胺的含水量均在1.8%以下。實施例2所制備的甲酰胺電導大大低于100 μ S/cm,批次間重復性較好，在室溫下的穩(wěn)定性良好，完全能夠滿足應用要求(表3)。毛細管電泳檢測結(jié)果如圖1和圖2所示，采用本發(fā)明所制備的甲酰胺進行DNA雙鏈樣本的變性處理，然后進行毛細管電泳，結(jié)果顯示，內(nèi)標峰型尖銳，分離度好，無非特異性雜峰出現(xiàn)，DNA片段進樣量均勻，峰高分布正常，表明去離子甲酰胺的電導率完全符合毛細管電泳樣本處理要求。


圖1為實施例1得到的去離子甲酰胺與DNA樣本混合進行毛細管電泳檢測的電泳檢測結(jié)果。圖2為實施例2得到的去離子甲酰胺與DNA樣本混合進行毛細管電泳檢測的電泳檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、去離子甲酰胺的制備(1)取分析純(99. 9%質(zhì)量百分含量)甲酰胺IOOml (購自Fisher公司)，置于燒瓶瓶中。稱出25g交聯(lián)度為5%的Bio-Rad AG501-X8樹脂。將樹脂進行冷凍脫水處理，即進行冷凍脫水過夜，使離子交換樹脂的水分被完全蒸干，上述樹脂的粒徑為300-1180um。(2)將上述步驟⑴中冷凍脫水處理后的樹脂與燒瓶中的甲酰胺混合，溫和震蕩不超過7小時，本實施例震蕩3小時，使離子交換樹脂與甲酰胺充分接觸。(3)將上述步驟O)中混合均勻的混合液通過預清洗的Whatmaniil過濾器(過濾器的孔徑為0. 22um)過濾，收集濾液，得到去離子甲酰胺。(4)將上述步驟(3)中得到的去離子甲酰胺進行分裝，在-20°C的條件下儲存。實施例2、去離子甲酰胺的制備(1)取分析純(99. 9% )甲酰胺100ml (購自Amresco公司)，置于250ml燒瓶里， 并檢測其PH值。稱出5g交聯(lián)度為5%的Bio-Rad MB-3樹脂。將樹脂加入到裝有甲酰胺的燒瓶中(即比例為甲酰胺離子交換樹脂為 IOOml 5g)，并加入磁力攪拌子(長度為1. 2cm)。(2)蓋住上述步驟(1)中已加入磁力攪拌子的燒瓶并啟動磁力攪拌器進行攪拌， 攪拌的轉(zhuǎn)速為600rpm。根據(jù)上述步驟(1)中檢測的甲酰胺的PH值，確定攪拌時間①如果初始甲酰胺的 PH小于7. 0，磁力攪拌時間為45分；②如果初始甲酰胺的pH大于7. 0，磁力攪拌時間為60 分。至此得到攪拌后的混合液。(3)將上述步驟O)中得到的混合液通過孔徑0. 2um尼龍過濾器(型號Nalgene， cat#153-0020)，收集濾液，得到去離子甲酰胺。(4)將上述步驟(3)中得到的去離子甲酰胺進行分裝，在-20°C的條件下儲存。實施例3、檢測分析—、測定制備的去離子甲酰胺樣品的含水量去離子甲酰胺的含水量是考察本制備工藝的重要的指標。同時也是評價本制備方法優(yōu)劣的重要參考參數(shù)。因此，將上述實施例1和實施例2制備得到的不同批次的胺分別進行含水量的測定。其具體步驟如下1.先取400 μ L制備的去離子甲酰胺，并確定其質(zhì)量；2.按照卡爾費休水分儀的操作說明注入其反應池中；3.等測試數(shù)據(jù)穩(wěn)定，該數(shù)值為400uL去離子甲酰胺樣品中水的質(zhì)量4.用水的質(zhì)量除以400uL去離子甲酰胺樣品的質(zhì)量即為去離子甲酰胺樣品含水量值。用離子交換樹脂得到的去離子甲酰胺的含水量一般在1.5% _3%，離子越多，含水量越大。表1.實施例1中獲得的不同批次的去離子甲酰胺的含水量(質(zhì)量百分含量)
權(quán)利要求
1.一種去離子甲酰胺的制備方法，包括如下步驟(1)將甲酰胺與離子交換樹脂混合，得到混合液；(2)將上述步驟(1)中得到的混合液混合均勻，再將混合液通過過濾器去除離子交換樹脂，收集濾液，得到所述去離子甲酰胺。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述甲酰胺與離子交換樹脂的配比為(100-500)ml (2-8) g;優(yōu)選的是，甲酰胺與離子交換樹脂配比為IOOml 5g。
3.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于步驟O)中，所述混合均勻通過攪拌進行。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述攪拌是通過磁力攪拌器進行的； 所述攪拌的攪拌時間為45分鐘-120分鐘，優(yōu)選為45-60分鐘；所述磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為 400-800rpm,優(yōu)選是 600rpm。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述攪拌時間為如下1)或2)所述1)步驟(1)中甲酰胺的PH小于7.0，攪拌時間為45分鐘；2)步驟(1)中甲酰胺的pH大于7.0，攪拌時間為60分鐘。
6.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中，所述混合均勻通過震蕩進行。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述震蕩步驟的震蕩時間為2-7小時， 優(yōu)選為3小時。
8.如權(quán)利要求1-7中任一所述的制備方法，其特征在于所述離子交換樹脂為陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂；所述離子交換樹脂優(yōu)選是經(jīng)過冷凍脫水處理的離子交換樹脂；所述離子交換樹脂為AG501-X8樹脂和/或MB-3樹脂；所述離子交換樹脂的交聯(lián)度為5%。
9.如權(quán)利要求1-8中任一所述的制備方法，其特征在于所述過濾器為Whatman過濾器、Millipore過濾器或尼龍過濾器，所述過濾器的孔徑優(yōu)選為0. 22um。
10.權(quán)利要求1-9中任一所述制備方法得到的去離子甲酰胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種去離子甲酰胺的制備方法。本發(fā)明的提供去離子甲酰胺的制備方法，包括如下步驟(1)將甲酰胺與離子交換樹脂混合，得到混合液；(2)將上述步驟(1)中得到的混合液混合均勻，再將混合液通過過濾器去除離子交換樹脂，收集濾液，得到所述去離子甲酰胺。采用上述方案制備得到的去離子甲酰胺的含水量均在1.8％以下，甲酰胺電導大大低于100μS/cm，批次間重復性較好，在室溫下的穩(wěn)定性良好，完全能夠滿足應用要求。毛細管電泳檢測結(jié)果顯示，內(nèi)標峰型尖銳，分離度好，無非特異性雜峰出現(xiàn)，DNA片段進樣量均勻，峰高分布正常，表明去離子甲酰胺的電導率完全符合毛細管電泳樣本處理要求。
文檔編號C07C233/03GK102241602SQ20111011523
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月5日
發(fā)明者葉健, 姜伯瑋, 趙興春 申請人:公安部物證鑒定中心