專利名稱：多肽的天然連接方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽的天然連接方法。本發(fā)明還涉及可用于實(shí)施該天然連接方法的功能化多肽，以及制備這些功能化多肽的方法。本發(fā)明還涉及可用于實(shí)施所述功能化多肽制備方法的胺化合物以及功能化樹脂。
背景技術(shù)：
當(dāng)所合成的多肽具有大尺寸時(shí)，利用常規(guī)固相方法合成多肽(逐個(gè)氨基酸地合成)受到產(chǎn)量低的限制。為了克服該限制，已知的是通過化學(xué)連接使兩個(gè)多肽組裝以產(chǎn)生較長的多肽。一般地，期望通過連接所組裝的多肽之間的鍵是天然的，即對(duì)應(yīng)于多肽的天然結(jié)構(gòu)。目前，天然連接的主要方法是Kent和Dawson描述的方法，其例如描述于文獻(xiàn)WO96/34878和WO 98/28434中。該方法基于(C末端)硫酯肽和半胱氨酰肽之間的化學(xué)選擇性反應(yīng)。該方法的主要缺點(diǎn)在于制備硫酯肽需要復(fù)雜的化學(xué)過程。一種替代性方法是在文獻(xiàn)WO 01/68565和WO 01/87920中描述的所謂“Staudinger連接”。該方法包括膦硫酯與疊氮化物的反應(yīng)，以及所化合試劑的水解以形成酰胺鍵。該方法難以在產(chǎn)業(yè)規(guī)模應(yīng)用。文獻(xiàn)WO 2007/037812中描述了第三種方法，其基于脫羧縮合反應(yīng)中a-酮酸與胺的反應(yīng)。但是，酮酸是難以制備且難以引入肽中的分子。此外，該第三種方法難以在沒有配備實(shí)施復(fù)雜有機(jī)合成手段的肽合成實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用。因此，非常需要開發(fā)一種新的多肽天然連接方法，實(shí)現(xiàn)既有效又更容易實(shí)施(包括產(chǎn)業(yè)規(guī)模的實(shí)施)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先涉及制備式(III)多肽的方法(III)X「X〃 —X2 X1和X2均表示肽片段，X"表示包含巰基功能基團(tuán)的氨基酸殘基，所述方法包括至少一個(gè)步驟，即，使式(I)多肽與式(II)多肽發(fā)生連接反應(yīng)(I)X1-N(CH2CH2SH)2(II)H-X" _X2。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，通過在存在至少一種還原二硫鍵之化合物的條件下將式(I')多肽與式(II)多肽接觸以進(jìn)行連接反應(yīng)
權(quán)利要求
1.制備下式多肽的方法(III)X1-X" -X2, X1和X2均表示肽片段，X"表示包含巰基功能基團(tuán)的氨基酸殘基，所述方法包括如下至少一個(gè)步驟一使式(I)多肽與式(II)多肽發(fā)生連接反應(yīng)(I)X1-N(CH2CH2SH)2(II)H-X"-X2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述連接反應(yīng)通過在存在至少一種還原二硫鍵之化合物的條件下使式(I')多肽與式(II)多肽相接觸來進(jìn)行
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中X2表示式(IV)肽片段 (iv)v -(Xi" -V )卜3.』， n是大于或等于3的整數(shù)；對(duì)于i取自3至n的整數(shù)，每個(gè)Xi"表示包含巰基功能基團(tuán)的氨基酸殘基；對(duì)于i取自2至n的整數(shù)，每個(gè)Xi'表示肽片段； 所述方法包括在所述式(I)多肽與式(II)多肽的連接反應(yīng)步驟之前，進(jìn)行一系列n-2步的連接反應(yīng)，連接反應(yīng)的第j步是式(V)多肽與式(VI)多肽進(jìn)行連接反應(yīng)以形成式(VII)多肽(V)H-Xn-,-Xn-/ -N(CH2CH2SH)2(VI)IHXi"-V )^(n-J+D...n (VII)IHXi"-V hu.』， 其中j取自I至n-2的整數(shù)，所述殘基Xn_/的胺功能基團(tuán)和/或巰基功能基團(tuán)被保護(hù)，在連接反應(yīng)結(jié)束時(shí)，對(duì)式(VII)多肽之殘基Xn_/的巰基功能基團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，通過使式(V)多肽與式(VI)多肽在存在至少一種還原二硫鍵之化合物的條件下接觸，以進(jìn)行式(V)多肽和式(VI)多肽的n-2步連接反應(yīng)中的一個(gè)或更多個(gè)
5.制備式(X)環(huán)狀多肽的方法
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中通過將式(XI')多肽與至少一種還原二硫鍵之化合物相接觸來進(jìn)行連接反應(yīng)
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述連接反應(yīng)在含水介質(zhì)中進(jìn)行，優(yōu)選在pH 6. 5 8. 5下進(jìn)行，更特別優(yōu)選在pH 7 8下，理想地在約pH 7. 5下。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述連接反應(yīng)在存在至少一種還原二硫鍵之化合物的條件下進(jìn)行，所述化合物選自三(2-羧乙基)膦、4-巰基苯乙酸、二硫蘇糖醇、芐硫醇以及其混合物。
9.式⑴多肽或式(r)多肽
10.根據(jù)權(quán)利要求9的多肽，其中X1包含2 300個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選5 100個(gè)氨基酸殘基，更特別優(yōu)選8 50個(gè)氨基酸殘基。
11.制備式⑴多肽的方法 (I)X1-N(CH2CH2SH)2, 其中，X1表示肽片段，-N(CH2CH2SH)2基團(tuán)與肽片段X1之C末端位置氨基酸殘基的C =0末端結(jié)合，該方法包括至少一個(gè)多肽合成步驟和一個(gè)C末端功能化步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中肽合成步驟在功能化步驟之前；肽合成步驟提供式(IX)多肽 (IX) X1-OH, 優(yōu)選地，除了其C末端羧基功能基團(tuán)之外，在其胺和羧基功能基團(tuán)上包含保護(hù)性基團(tuán)；功能化步驟包括 -使式(IX)多肽與式(VIII)胺化合物在液相中反應(yīng)以形成式(I)多肽(VIIi)NH(CH2-CH2-S-G1)2, 其中G1表示保護(hù)性基團(tuán)，所述保護(hù)性基團(tuán)優(yōu)選地形成硫醚、硫酯或二硫化物功能基團(tuán)，更特別地優(yōu)選是三苯甲基； -任選地，使式(I)多肽脫保護(hù)。
13.用于多肽固相合成的聚合物樹脂支持物，其包含主骨架和NH-(CH2CH2-S-Trt-)2功能基團(tuán)或NH- (CH2CH2-S-Trt-CO-NH-) 2功能基團(tuán)，其中Trt表示任選地被一個(gè)或更多個(gè)取代基取代的三苯甲基，所述取代基特別地選自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基取代基；其中NH-(CH2CH2-S-Trt-)2功能基團(tuán)通過兩個(gè)三苯甲基與主骨架結(jié)合，或者，NH- (CH2CH2-S-Trt-CO-NH-) 2功能基團(tuán)通過兩個(gè)胺基團(tuán)與主骨架結(jié)合。
14.用于多肽固相合成的聚合物樹脂支持物，其包含主骨架和G2-AA-N- (CH2CH2-S-Trt-) 2 功能基團(tuán)或 G2-AA-N- (CH2CH2-S-Trt-CO-NH-) 2 功能基團(tuán)，其中Trt表示任選地被一個(gè)或更多個(gè)取代基取代的三苯甲基，所述取代基特別地選自氯、甲氧基、甲基、氟和氰基取代基；AA表示任選地具有一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)性基團(tuán)的氨基酸殘基；G2表示氫原子或保護(hù)胺功能基團(tuán)的基團(tuán)；其中G2-AA-N(CH2CH2-S-Trt-)2功能基團(tuán)通過兩個(gè)三苯甲基與主骨架結(jié)合，或者，G2-AA-N-(CH2CH2-S-Trt-CO-NH-)2功能基團(tuán)通過兩個(gè)胺基團(tuán)與主骨架結(jié)合。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的聚合物樹脂支持物，其中所述主骨架選自聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、纖維素、聚乙烯、聚酯、乳膠、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙烯共聚物、聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物骨架及其衍生物。
16.制備用于多肽固相合成之聚合物樹脂支持物的方法，其包括 -提供聚合物樹脂； -通過與式(viir )胺化合物反應(yīng)使聚合物樹脂功能化 (VIir ) NH (CH2-CH2-S-H) 2 o
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，該方法包括在使聚合物樹脂功能化的步驟之前 -提供式(VIII)胺化合物(VIIi)NH(CH2-CH2-S-G1)2, 其中，G1表示保護(hù)性基團(tuán)，所述保護(hù)性基團(tuán)優(yōu)選地形成硫醚、硫酯或二硫化物功能基團(tuán)，更特別地優(yōu)選是三苯甲基； -使該胺化合物脫保護(hù)，以獲得式(VIir )的胺化合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中 -功能化步驟在多肽合成步驟之前； -功能化步驟包括 ■將氨基酸偶聯(lián)至權(quán)利要求13或15的聚合物樹脂支持物，以提供起始支持物；或 ■提供起始支持物，其為權(quán)利要求14的聚合物樹脂支持物； -肽合成步驟包括起始支持物上的一系列氨基酸偶聯(lián)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中將氨基酸偶聯(lián)至聚合物樹脂支持物包括將聚合物樹脂支持物與氨基酸齒化物或者與氨基酸和活化劑接觸，所述活化劑優(yōu)選地選自PyB0P、B0P、PyBROP，更特別地優(yōu)選PyBROP。
20.制備式(I')多肽的方法
21.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求11、12、18或19的方法制備式(I)和/或式(V)或式(XI)多肽的步驟，或者包括根據(jù)權(quán)利要求20的方法制備式(I')和/或式(V')或式(XI')多肽的步驟。
22.制備藥物組合物的方法，其包括 -根據(jù)權(quán)利要求1-8或21中任一項(xiàng)的方法制備多肽，以及 -將該多肽與一種或更多種可藥用輔藥一起配制。
23.制備診斷裝置的方法，其包括 -根據(jù)權(quán)利要求1-8或21中任一項(xiàng)的方法制備多肽，以及 -將該多肽配制成適于診斷用途的形式。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及制備下式多肽的方法(III)X1-X″-X2，其中X1和X2均為肽片段，X″是包含巰基功能基團(tuán)的氨基酸殘基，所述方法包括至少一個(gè)步驟，即，使式(I)多肽與式(II)多肽發(fā)生連接反應(yīng)(I)X1-N(CH2CH2SH)2(II)H-X″-X2。本發(fā)明還涉及式(I)多肽和獲得其的方法，以及涉及適于獲得其的樹脂基質(zhì)。
文檔編號(hào)C07K1/02GK102770437SQ201080055379
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者奧列格·梅爾尼克, 朱利恩·德爾, 納塔莉·奧利維耶, 雷達(dá)·姆希迪亞 申請(qǐng)人:國家科學(xué)研究中心, 里爾巴斯德研究所