專利名稱：多肽的生產(chǎn)的制作方法
相關(guān)申請本申請要求于2004年8月27日遞交的臨時專利申請?zhí)?0/605,097、60/604,941和60/605,074的優(yōu)先權(quán)，均在此處整體引用作為參考。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)和多肽作為治療物質(zhì)已日益重要。大多數(shù)情況下，治療性蛋白質(zhì)和多肽產(chǎn)生于細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述細(xì)胞經(jīng)過基因工程操作和/或選擇以產(chǎn)生非比尋常的高水平特定目的蛋白質(zhì)或多肽。細(xì)胞培養(yǎng)條件的調(diào)控和優(yōu)化對于蛋白質(zhì)和多肽的成功商業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要。
許多在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽均系分批或補料分批方法產(chǎn)生，其中將細(xì)胞培養(yǎng)一段時間，然后終止培養(yǎng)并分離產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽。細(xì)胞培養(yǎng)條件能顯著影響所產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽的最終數(shù)量和質(zhì)量。例如，常規(guī)分批或補料分批培養(yǎng)方法常常導(dǎo)致產(chǎn)生對細(xì)胞增殖、存活力以及目的蛋白質(zhì)和多肽的產(chǎn)生或穩(wěn)定性有不良影響的代謝廢物。盡管已經(jīng)努力改善分批或補料分批培養(yǎng)方法中蛋白質(zhì)和多肽的生產(chǎn)，仍然有進(jìn)一步改進(jìn)的需要。
此外，也投入了大量的精力以發(fā)展用于培養(yǎng)細(xì)胞(特別是哺乳動物細(xì)胞)的限定培養(yǎng)基(即由已知單個成分組合的、缺乏血清或其他動物性副產(chǎn)物的培養(yǎng)基)。細(xì)胞在限定培養(yǎng)基中的生長特性相對于血清來源培養(yǎng)基中可能有很大差別。尤其需要發(fā)展出在限定培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)和多肽的改良系統(tǒng)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了在細(xì)胞培養(yǎng)物中大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)和/或多肽的改良系統(tǒng)。例如，本發(fā)明提供了利用培養(yǎng)基進(jìn)行商業(yè)規(guī)模(如500L或更多)培養(yǎng)的方法，所述培養(yǎng)基具有下列一項或多項的特征i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM；ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2；iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2；iv)累積無機離子與累積總氨基酸的比率為約0.4至1；或v)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺濃度的組合累積量大于約16mM。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理應(yīng)知道上文所用的“累積”是指，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入的特定成分的總量，包括在培養(yǎng)起始時加入的成分以及其后加入的成分。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，期待將培養(yǎng)期間的“補料”減少到最小，因此需要最大化培養(yǎng)起始時的量。當(dāng)然培養(yǎng)基成分在培養(yǎng)期間被代謝，因此如果在不同時間加入某些成分(例如全部于起始時加入和一些通過補料加入)，則特定成分累積量相同的培養(yǎng)基的絕對水平會有所差異。
根據(jù)本發(fā)明，此類培養(yǎng)基的應(yīng)用能提高蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水平，并減少某些不良因子如銨鹽和/或乳酸鹽的蓄積。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道，本發(fā)明的培養(yǎng)基配方包括限定和非限定培養(yǎng)基。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)基為成分已知并受控的限定培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)方法包括將第一組培養(yǎng)條件變?yōu)榈诙M培養(yǎng)條件，從而改變細(xì)胞的代謝。在某些實施方案中，當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到其最大細(xì)胞密度約20-80％時實施這一改變。在某些實施方案中，所述改變包括改變培養(yǎng)物的維持溫度(或溫度范圍)。備選地或額外地，本發(fā)明提供了調(diào)整的方法，以使培養(yǎng)物中乳酸鹽和/或銨鹽水平在達(dá)到峰值后隨時間而下降。在其他實施方案中，所述改變包括改變pH值、摩爾滲透壓濃度或化學(xué)物誘導(dǎo)物如鏈烷酸或其鹽的水平。
本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物可任選添加營養(yǎng)素和/或其他培養(yǎng)基成分，包括激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(終濃度通常極低的無機化合物)、氨基酸、脂質(zhì)或葡萄糖或其他能源。在本發(fā)明的某些實施方案中，向培養(yǎng)基中添加化學(xué)誘導(dǎo)物如六亞甲基二乙酰胺(“HMBA”)和丁酸鈉(“NaB”)是有利的。這些任選增補劑可在培養(yǎng)起始時加入，或者稍后加入以補充消耗的營養(yǎng)素或以備他用。一般而言，期望根據(jù)本發(fā)明需要選擇初始培養(yǎng)基成分以使添加降至最低。
可監(jiān)測本發(fā)明的多種培養(yǎng)條件，包括pH、細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力、乳酸鹽水平、銨鹽水平、摩爾滲透壓濃度或表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的滴度。
附圖簡述

圖1顯示了利用抗GDF-8細(xì)胞對搖瓶中培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2的比較。
圖2顯示了培養(yǎng)基1中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長和存活力。
圖3顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對照和無谷氨酰胺補料培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長。
圖4顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對照和無谷氨酰胺補料培養(yǎng)條件下的細(xì)胞存活力。
圖5顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對照和無谷氨酰胺補料培養(yǎng)條件下的銨鹽水平。
圖6顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對照和無谷氨酰胺補料培養(yǎng)條件下的乳酸鹽水平。
圖7顯示了在對照和無谷氨酰胺補料培養(yǎng)條件下的抗GDF-8滴度。
圖8顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對照和谷氨酰胺饑餓的補料培養(yǎng)條件下的細(xì)胞密度。
圖9顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對照和谷氨酰胺饑餓的補料培養(yǎng)條件下的細(xì)胞存活力。
圖10顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對照和谷氨酰胺饑餓的培養(yǎng)條件下的銨鹽水平。
圖11顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對照和谷氨酰胺饑餓的培養(yǎng)條件下的乳酸鹽水平。
圖12顯示了在對照和谷氨酰胺饑餓的培養(yǎng)條件下的抗GDF-8滴度。
圖13顯示了培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2中抗GDF-8細(xì)胞的鐵劑量應(yīng)答。
圖14顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度。
圖15顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活力。
圖16顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的抗Lewis Y滴度。
圖17顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的乳酸鹽水平。
圖18顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的銨鹽水平。
圖19顯示了補充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。
圖20顯示了抗Lewis Y細(xì)胞的細(xì)胞密度。每一曲線為相同條件下生長的兩只搖瓶的平均值。
圖21顯示了抗Lewis Y細(xì)胞的細(xì)胞存活力。每一曲線為相同條件下生長的兩只搖瓶的平均值。
圖22顯示了抗Lewis Y培養(yǎng)物的平均滴度。每一曲線為相同條件下生長的兩只搖瓶的平均值。
圖23顯示了抗Lewis Y細(xì)胞的銨鹽水平。每一曲線為相同條件下生長的兩只搖瓶的平均值。
圖24顯示了補料分批培養(yǎng)中所用的葉輪竄動。
圖25顯示了多種試驗條件下抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長。
圖26顯示了多種試驗條件下抗GDF-8細(xì)胞的存活力。
圖27顯示了多種試驗條件下的抗GDF-8滴度。
圖28顯示了多種試驗條件下抗GDF-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。
圖29顯示了多種試驗條件下抗GDF-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。
圖30顯示了多種試驗條件下抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長。
圖31顯示了多種試驗條件下的抗GDF-8滴度。
圖32顯示了多種試驗條件下抗GDF-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。
圖33顯示了多種試驗條件下抗GDF-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。
圖34顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長。
圖35顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞存活力。
圖36顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。
圖37顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。
圖38顯示了在不同水平含谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8培養(yǎng)物的谷氨酰胺水平。
圖39顯示了含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中的抗GDF-8滴度。
圖40顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。
圖41顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長。
圖42顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。
圖43顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。
圖44顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的谷氨酰胺水平。
圖45顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的谷氨酸水平。
圖46顯示了含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中的抗GDF-8滴度。
圖47顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。
圖48顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長。
圖49顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。
圖50顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。
圖51顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的谷氨酰胺水平。
圖52顯示了含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中的抗GDF-8滴度。
圖53顯示了在含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長。
圖54顯示了在含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。
圖55顯示了在含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。
圖56顯示了含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基中的抗GDF-8滴度。
圖57顯示了在培養(yǎng)基1、3和9中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長。
圖58顯示了培養(yǎng)基1、3和9中的抗GDF-8滴度。
圖59顯示了含不同水平谷氨酰胺以及含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺組合總量時的外推抗GDF-8滴度。
圖60顯示了在多種測試培養(yǎng)基條件下抗Aβ細(xì)胞的細(xì)胞生長。
圖61顯示了在多種測試培養(yǎng)基條件下抗Aβ細(xì)胞的存活力。
圖62顯示了在多種測試培養(yǎng)基條件下抗Aβ培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。
圖63顯示了在多種測試培養(yǎng)基條件下抗Aβ培養(yǎng)物的銨鹽水平。
圖64顯示了多種測試培養(yǎng)基條件下的抗Aβ滴度。
圖65顯示了在多種測試培養(yǎng)基條件下抗Aβ培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。
圖66顯示了在多種試驗條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞的細(xì)胞生長。
圖67顯示了在多種試驗條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞的存活力。
圖68顯示了在多種試驗條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞培養(yǎng)物中的殘留葡萄糖。
圖69顯示了在多種試驗條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞培養(yǎng)物中的谷氨酰胺水平。
圖70顯示了在多種試驗條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞培養(yǎng)物中的乳酸鹽濃度。
圖71顯示了在多種試驗條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞培養(yǎng)物中的銨鹽水平。
圖72顯示了多種試驗條件下的TNFR-Ig相對滴度。
圖73顯示了生長于6000L和1L生物反應(yīng)器內(nèi)的抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞密度。
圖74顯示了生長于6000L和1L生物反應(yīng)器內(nèi)的抗GDF-8細(xì)胞的滴度。
圖75顯示了生長于6000L和1L生物反應(yīng)器內(nèi)的抗GDF-8細(xì)胞的乳酸鹽水平。
圖76顯示了生長于6000L和1L生物反應(yīng)器內(nèi)的抗GDF-8細(xì)胞的銨鹽水平。
定義“約”、“大約”當(dāng)此處所用的術(shù)語“約”和“大約”用于一種或多種具體細(xì)胞培養(yǎng)條件時，是指與所述培養(yǎng)條件下指定的參考值相似的一系列值。在某些實施方案中，術(shù)語“約”是指處在所述培養(yǎng)條件下指定參考值的百分之25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更小范圍的系列值。
“氨基酸”此處所用的術(shù)語“氨基酸”，指用于常規(guī)制備多肽的20種天然氨基酸中的任意一種，或所述氨基酸的類似物或衍生物。本發(fā)明中于培養(yǎng)基內(nèi)向細(xì)胞培養(yǎng)物提供氨基酸。培養(yǎng)基中所含的氨基酸可為鹽或水合物形式。
“抗體”此處所用的術(shù)語“抗體”，是指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，如Fab或F(ab′)2片段，其含有一個或多個能與抗原特異性結(jié)合(免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合位點。此處所用的術(shù)語“單克隆抗體”和“單克隆抗體組合物”，是指僅含有一種能與特定抗原表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點的抗體分子克隆群，而術(shù)語“多克隆抗體”和“多克隆抗體組合物”是指含有多種能與某一特定抗原相互作用的抗原結(jié)合位點的抗體分子群。單克隆抗體的定義既包括了常規(guī)技術(shù)得到的克隆分子，也包括了通過操作或變異特定殘基得到的指定序列分子，如人源化抗體。
“分批培養(yǎng)”此處所用的術(shù)語“分批培養(yǎng)”是一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所有最終將用于培養(yǎng)細(xì)胞的成分均于培養(yǎng)過程起始時加入，包括培養(yǎng)基(見下文“培養(yǎng)基”定義)和細(xì)胞本身。一般在某一點終止分批培養(yǎng)，收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或成分，并任選純化之。
“生物反應(yīng)器”此處所用的術(shù)語“生物反應(yīng)器”是指用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物生長的任何容器。只要能用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞，生物反應(yīng)器可為任意大小。一般而言，生物反應(yīng)器為至少1升，也可為10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或更大，或其間任意容積。一般在培養(yǎng)期間調(diào)控生物反應(yīng)器的內(nèi)部條件，包括但不僅限于pH和溫度。生物反應(yīng)器可以由適于容納在本發(fā)明培養(yǎng)條件下懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物的任何材料構(gòu)成，包括玻璃、塑料或金屬。此處所用的術(shù)語“生產(chǎn)生物反應(yīng)器”是指用于生產(chǎn)目的多肽或蛋白質(zhì)的終末生物反應(yīng)器。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)生物反應(yīng)器的容積一般至少為500升，也可為1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或更大，或其間任意容積。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解并能夠選擇合適的生物反應(yīng)器用于實施本發(fā)明。
“細(xì)胞密度”此處所用的術(shù)語“細(xì)胞密度”是指在指定體積培養(yǎng)基中存在的細(xì)胞數(shù)目。
“細(xì)胞存活力”此處所用的術(shù)語“細(xì)胞存活力”是指培養(yǎng)物中的細(xì)胞在一組指定培養(yǎng)條件或試驗變量下存活的能力。此處所用的術(shù)語也指在某一特定時間內(nèi)存活的那部分細(xì)胞與該時間培養(yǎng)物中活細(xì)胞和死細(xì)胞總數(shù)之間的關(guān)系。
“培養(yǎng)物”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”和“哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物”此處所用的這些術(shù)語是指在適于細(xì)胞群存活和/或生長的條件下，懸浮于培養(yǎng)基(見下文“培養(yǎng)基”定義)內(nèi)的哺乳動物細(xì)胞群。對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，此處所用的這些術(shù)語也指包含哺乳動物細(xì)胞群和細(xì)胞群懸浮于其中的培養(yǎng)基的組合。
“補料分批培養(yǎng)”此處所用的術(shù)語“補料分批培養(yǎng)”是在培養(yǎng)過程起始后的某一時間向培養(yǎng)物內(nèi)加入額外成分的細(xì)胞培養(yǎng)方法。所提供的成分一般包括在培養(yǎng)過程中已消耗的細(xì)胞營養(yǎng)添加劑。一般在某一點終止補料分批培養(yǎng)，收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或成分，并任選純化之。
“片段”此處所用的術(shù)語“片段”指多肽并且被定義為給定多肽中特有的或特征性的任意分離部分。此處所用的該術(shù)語也指給定多肽中保留至少部分全長多肽活性的任意分離部分。優(yōu)選保留的活性部分至少為全長多肽活性的10％。更優(yōu)選保留的活性部分至少為全長多肽活性的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。更優(yōu)選保留的活性部分至少為全長多肽活性的95％、96％、97％、98％或99％。最優(yōu)選保留的活性部分為全長多肽活性的100％。此處所用的該術(shù)語也指包括全長多肽中至少一個確定序列元件的指定多肽的任意部分。優(yōu)選該序列元件跨越全長多肽的至少4-5個，更優(yōu)選至少約10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多氨基酸。
“基因”此處所用的術(shù)語“基因”指DNA或RNA的任意核苷酸序列，其中至少某些部分編碼分離的在細(xì)胞代謝或發(fā)育的某些方面發(fā)揮作用的終產(chǎn)物，一般為(但不僅限于)多肽。該術(shù)語并非僅指編碼多肽或其他分離終產(chǎn)物的編碼序列，還包括位于編碼序列之前或之后、調(diào)節(jié)基礎(chǔ)表達(dá)水平的區(qū)域(見下文“遺傳控制元件”定義)，以及單個編碼區(qū)段(“外顯子”)之間的插入序列(“內(nèi)含子”)。
“遺傳控制元件”此處所用的術(shù)語“遺傳控制元件”，是指調(diào)節(jié)與其有效連接的基因表達(dá)的任意序列元件。遺傳控制元件通過提高或降低表達(dá)水平而發(fā)揮功能，可位于編碼序列之前、之中或之后。通過調(diào)節(jié)如轉(zhuǎn)錄起始、延伸或終止；mRNA剪接、mRNA編輯、mRNA穩(wěn)定性、mRNA細(xì)胞內(nèi)定位；翻譯起始、延伸或終止；或基因表達(dá)的任何其他階段，遺傳控制元件可以作用于基因表達(dá)的任意階段。遺傳控制元件可以單獨作用或彼此聯(lián)合作用。
“雜交瘤”此處所用的術(shù)語“雜交瘤”，是指將免疫來源的永生細(xì)胞與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合而得到的細(xì)胞。所產(chǎn)生的雜交瘤為能產(chǎn)生抗體的永生細(xì)胞。用于產(chǎn)生雜交瘤的單個細(xì)胞可來自任何哺乳動物，包括但不僅限于大鼠、豬、兔、綿羊、豬、山羊和人。該術(shù)語也包括三體瘤細(xì)胞系，后者為人細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合產(chǎn)生的異雜交骨髓瘤融合體的子代，再與漿細(xì)胞融合的產(chǎn)物。此外，該術(shù)語還包括任何產(chǎn)生抗體的永生雜交細(xì)胞系，例如四體瘤(見如Milstein等人.，Nature，5373053(1983))。
“綜合活細(xì)胞密度”此處所用的術(shù)語“綜合活細(xì)胞密度”，是指在培養(yǎng)過程中活細(xì)胞的平均密度乘以培養(yǎng)持續(xù)的時間量。假設(shè)產(chǎn)生多肽和/或蛋白質(zhì)的量與培養(yǎng)過程中存在的活細(xì)胞數(shù)目成正比，則綜合活細(xì)胞密度是估計培養(yǎng)過程中產(chǎn)生多肽和/或蛋白質(zhì)量的有力工具。
“培養(yǎng)基”、“細(xì)胞培養(yǎng)基”此處所用的這些術(shù)語是指含有滋養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞生長的營養(yǎng)素的溶液。一般而言，這些溶液提供細(xì)胞基本生長和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、維生素、能源、脂質(zhì)和微量元素。溶液中也可含有促進(jìn)最低速率以上生長和/或存活的成分，包括激素和生長因子。所述溶液優(yōu)選配制為適于細(xì)胞存活和增殖的pH和鹽濃度。培養(yǎng)基也可為“限定培養(yǎng)基”——不含蛋白質(zhì)、水解產(chǎn)物或未知組合物成分的無血清培養(yǎng)基。限定培養(yǎng)基中不含有動物來源的成分，并且其所有成分均具有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
“代謝廢物”此處所用的術(shù)語“代謝廢物”是指細(xì)胞培養(yǎng)物在正?；蚍钦４x過程中產(chǎn)生的、對細(xì)胞培養(yǎng)物的某些方面(特別是對所需重組多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性)具有不良作用的化合物。例如，代謝廢物可能對細(xì)胞培養(yǎng)物的生長或存活力有不良作用，可能減少重組多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，可能改變表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性、糖基化或其他翻譯后修飾，可能對細(xì)胞和/或重組多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的任意其他方面具有不良作用。代謝廢物的實例包括糖代謝產(chǎn)生的乳酸鹽，以及谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的銨鹽。本發(fā)明的目的之一在于減慢哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中代謝廢物的生成，減少或甚至杜絕哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中的代謝廢物。
“摩爾滲透壓濃度”和“重量摩爾滲透壓濃度”“重量摩爾滲透壓濃度”是對水溶液中溶解的溶質(zhì)顆粒滲透壓的測量。溶質(zhì)顆粒包括離子和非離子分子。重量摩爾滲透壓濃度表示為溶于1kg溶液中滲透活性顆粒的濃度(即滲透壓摩爾)(38℃的1mOsm/kg H2O相當(dāng)于19mmHg滲透壓)。與之相反，“摩爾滲透壓濃度”是指溶于1升溶液中溶質(zhì)顆粒的數(shù)目。此處所用的簡寫“mOsm”指“毫滲透壓摩爾/kg溶液”。
“灌流式培養(yǎng)”此處所用的術(shù)語“灌流式培養(yǎng)”為一種在培養(yǎng)過程起始后，持續(xù)或半持續(xù)地向培養(yǎng)物中供以額外成分的細(xì)胞培養(yǎng)方法。所提供的成分一般包括在培養(yǎng)過程中消耗的細(xì)胞營養(yǎng)添加劑。一般在持續(xù)或半持續(xù)的基礎(chǔ)上收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或成分部分，并任選純化之。
“多肽”此處所用的術(shù)語“多肽”是指通過肽鍵相連的順序氨基酸鏈。該術(shù)語用以指任意長度的氨基酸鏈，然而本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道該術(shù)語不僅指代長鏈，也可用于指含有通過肽鍵相連的2個氨基酸的最短鏈。
“蛋白質(zhì)”此處所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指作用如離散單位的一個或多個多肽。如果單個多肽即為離散的功能單位，且不需要與其他多肽的持久物理締合以形成該獨立的功能單位，則此處術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。如果該離散功能單位由多于一個彼此物理締合的多肽組成，則此處所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”指物理偶聯(lián)的并且共同作為離散單位起作用的多個多肽。
“重組表達(dá)多肽”和“重組多肽”此處所用的這些術(shù)語是指從經(jīng)遺傳工程修飾以表達(dá)該多肽的哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)的多肽。重組表達(dá)多肽可以與哺乳動物宿主細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)的多肽相同或相似。重組表達(dá)多肽也可為宿主細(xì)胞的外源物，即異源于哺乳動物宿主細(xì)胞正常表達(dá)的多肽?；蛘咧亟M表達(dá)多肽為嵌合多肽，即部分多肽含有與哺乳動物宿主細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其他部分為宿主細(xì)胞外源物。
“接種”此處所用的術(shù)語“接種”是指將細(xì)胞培養(yǎng)物供予生物反應(yīng)器或另一容器的方法。之前細(xì)胞可在另一生物反應(yīng)器或容器中增殖?；蛘呒?xì)胞為冰凍并于供予生物反應(yīng)器或容器之前解凍。該術(shù)語用于指任意數(shù)目細(xì)胞，包括單個細(xì)胞。
“滴度”此處所用的術(shù)語“滴度”是指由哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的總量除以給定量的培養(yǎng)基體積。滴度一般用每毫升培養(yǎng)基毫克多肽或蛋白質(zhì)的單位表示。
某些優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明提供了通過細(xì)胞培養(yǎng)物生成蛋白質(zhì)和/或多肽的改良系統(tǒng)。具體而言，本發(fā)明提供了使一種或多種對細(xì)胞生長、存活力和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)生或質(zhì)量有害的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生最小化的系統(tǒng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物為分批或補料分批培養(yǎng)。其他某些本發(fā)明的優(yōu)選實施方案將詳述于下文。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道多種對這些優(yōu)選實施方案的修改均處于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求書及其等同物定義了本發(fā)明的范圍，并不限于也不應(yīng)當(dāng)限于此處對某些優(yōu)選實施方案的說明。
多肽根據(jù)本發(fā)明，可以生成任何能在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多肽。該多肽表達(dá)自宿主細(xì)胞內(nèi)源性基因，或表達(dá)自通過基因工程引入宿主細(xì)胞中的基因。該多肽可為天然存在的多肽，也可以具有人工操作或選擇的序列。經(jīng)加工的多肽可為天然存在的其他單個多肽片段組裝而成，也可包括一個或多個并非天然存在的片段。
能夠根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的多肽的選擇，是基于其目的生物或化學(xué)活性。例如，本發(fā)明可用于表達(dá)任意藥物或商業(yè)相關(guān)的酶、受體、抗體、激素、調(diào)節(jié)因子、抗原、結(jié)合劑等。
抗體考慮到目前應(yīng)用或研究中的用作藥物或其他商業(yè)物質(zhì)的抗體數(shù)目之巨，本發(fā)明的抗體生產(chǎn)具有特別意義?？贵w為能特異性結(jié)合特定抗原的蛋白質(zhì)。任何表達(dá)于宿主細(xì)胞的抗體都可以用于本發(fā)明。在優(yōu)選實施方案中，表達(dá)的抗體為單克隆抗體。
在另一優(yōu)選實施方案中，單克隆抗體為嵌合抗體。嵌合抗體含有來源于多于一種生物的氨基酸片段。嵌合抗體分子可包括，例如來自小鼠、大鼠或其他物種抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人恒定區(qū)。制備嵌合抗體的多種方法已被描述。見如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985)；Takeda等人，Nature 314，452(1985)，Cabilly等人，美國專利號4,816,567；Boss等人，美國專利號4,816,397；Tanaguchi等人，歐洲專利出版號EP171496；歐洲專利出版號0173494，英國專利GB 2177096B。
在另一優(yōu)選實施方案中，單克隆抗體為人抗體，如通過應(yīng)用核糖體展示或噬菌體展示文庫得到(見如Winter等人，美國專利號6,291,159和Kawasaki，美國專利號5,658,754)，或利用天然抗體基因失活并被人抗體基因功能性替代、而天然免疫系統(tǒng)的其他成分完好的異種移植物種得到(見如Kucherlapati等人，美國專利號6,657,103)。
在另一優(yōu)選實施方案中，單克隆抗體為人源化抗體。人源化抗體為嵌合抗體，其中大部分氨基酸殘基來自人抗體，因此將施用于人受試者時的潛在免疫反應(yīng)降至最低。人源化抗體中互補性決定區(qū)域的氨基酸至少部分被非人物種的殘基所取代，后者可賦予所需的抗原特異性或親和力?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的若干技術(shù)中的任意一種制備此類改變的免疫球蛋白分子(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，7308-7312(1983)；Kozbor等人，Immunology Today，4，7279(1983)；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92，3-16(1982))，并優(yōu)選根據(jù)PCT出版號WO92/06193或EP0239400的教導(dǎo)制備，均在此處引用作為參考)。人源化抗體可以由如Scotgen Limited，2Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain商業(yè)化制備。更多參考見Jones等人，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)，均在此處引用作為參考。
在另一優(yōu)選實施方案中，上述單克隆、嵌合或人源化抗體中可能含有自然界任何物種的任何抗體中都不天然存在的氨基酸殘基。這些外源性殘基可用于，如為單克隆、嵌合或人源化抗體帶來新的或改良的特異性、親和力或效應(yīng)物功能。在另一優(yōu)選實施方案中，上述抗體可綴合于藥物用于全身性藥物治療，例如毒素、低分子量細(xì)胞毒藥物、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物和放射性核素(見如Kunz等人，Calicheamicin derivative-carrier conjugates，US20040082764 A1)。
在一個實施方案中，該抗體特異性結(jié)合淀粉樣前體蛋白的Aβ片段或淀粉樣斑塊的其他成分，且可用于對抗Alzheimer’s病特征性大腦中淀粉樣斑塊的聚集(見如美國臨時申請60/636,684)。
在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體針對增殖性疾病如癌癥的靶細(xì)胞和/或組織中表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。在某一實施方案中，該抗體為IgG1抗Lewis Y抗體。Lewis Y為糖抗原，其結(jié)構(gòu)為Fuca1→2Galβ1→4[Fuca1→3]GlcNacβ1→3R(Abe等人(1983)J.Biol.Chem.，258 11793-11797)。LewisY抗原表達(dá)于60％至90％的人上皮腫瘤(包括乳腺、結(jié)腸、肺和前列腺上皮腫瘤)的表面，其中至少40％過量表達(dá)該抗原，而在正常組織中限量表達(dá)。
為靶定Ley并有效靶定腫瘤，最好需要對該抗原有專一特異性的抗體。因此，優(yōu)選本發(fā)明的抗Lewis Y抗體不與1型結(jié)構(gòu)(即乳糖系列血型(Lea和Leb))發(fā)生交叉反應(yīng)，且優(yōu)選不結(jié)合其他2型表位(即新乳糖結(jié)構(gòu))如Lex和H-型2型結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的抗Lewis Y抗體的實例命名為hu3S193(見美國專利號6,310,185；6,518,415；5,874,060，在此處整體引用作為參考)。人源化抗體hu3S193(Attia，M.A.等人.1787-1800)經(jīng)CDR移植從3S193(Kitamura，K.，12957-12961)產(chǎn)生，3S193為針對腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的對Ley具有高度特異性的鼠單克隆抗體。Hu3S193不僅保留了3S193對Ley的特異性，而且獲得了介導(dǎo)補體依賴性細(xì)胞毒作用(以下稱為CDC)以及抗體依賴性細(xì)胞毒作用(以下稱為ADCC)的能力(Attia，M.A.等人1787-1800)。該抗體靶定裸鼠中表達(dá)Ley的異種移植物，如利用125I、111In或18F，以及需要螯合劑的其他放射性標(biāo)記如111In、99mTc或90Y標(biāo)記的hu3S193進(jìn)行生物分布研究所示(Clark等人4804-4811)。
在另一實施方案中，抗體為稱為Myo29、Myo28及Myo22的人抗GDF-8抗體以及由其衍生的抗體和抗原結(jié)合片段之一。這些抗體能高親和力結(jié)合成熟GDF-8，抑制GDF-8的體外和體內(nèi)活性(如抑制ActRIIB結(jié)合和報告基因檢測所示)，還可抑制與骨骼肌重量和骨密度負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)的GDF-8活性。見如Veldman等人，美國專利申請?zhí)?0040142382。
受體可有效作為藥物和/或商業(yè)物質(zhì)的另一類多肽包括受體。受體一般為通過識別細(xì)胞外信號配體而發(fā)揮作用的跨膜糖蛋白。除配體識別結(jié)構(gòu)域外，受體一般還具有蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，后者在結(jié)合受體后通過磷酸化細(xì)胞內(nèi)靶分子而起始信號途徑，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)育或代謝改變。在一個實施方案中，修飾目的受體以移除其跨膜和/或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，而可任選以IgG結(jié)構(gòu)域取代之。在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的受體為受體酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包括對眾多細(xì)胞類型中多種功能具有關(guān)鍵作用的受體(見如Yarden和Ullrich，Ann.Rev.Biochem.57433-478，1988；Ullrich和Schlessinger，Cell 61243-254，1990，此處引用作為參考)。RTK的非限制性實例包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)受體家族成員、表皮生長因子(EGF)受體家族成員、血小板衍生生長因子(PDGF)受體、攜帶免疫球蛋白和EGF同源結(jié)構(gòu)域-1(TIE-1)及TIE-2受體的酪氨酸激酶(Sato等人，Nature376(6535)70-74(1995)，此處引用作為參考)以及c-Met受體，其中一些似乎能直接或間接促進(jìn)血管形成(Mustonen和Alitalo，J.Cell Biol.129895-898，1995)。其他RTK的非限制性實例包括胎肝激酶1(FLK-1)(有時稱為含激酶插入結(jié)構(gòu)域的受體(KDR)(Terman等人，Oncogene61677-83，1991)或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(VEGFR-2))、fms樣酪氨酸激酶-1(Flt-1)(DeVries等人Science 255；989-991，1992；Shibuya等人，Oncogene 5519-524，1990)，有時稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1(VEGFR-1)、神經(jīng)氈蛋白-1、內(nèi)皮糖蛋白、內(nèi)皮唾液酸蛋白和Axl。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選表達(dá)的其他受體。
在特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的腫瘤壞死因子抑配方如腫瘤壞死因子α和β受體形式(TNFR-1，發(fā)表于1991年3月20日的EP417,563；以及TNFR-2，發(fā)表于1991年3月20日的EP 417,014)(綜述見Naismith和Sprang，J Inflamm.47(1-2)1-7(1995-96)，此處引用作為參考)。根據(jù)一個實施方案，腫瘤壞死因子抑配方包括可溶性TNF受體及優(yōu)選TNFR-Ig。在一個實施方案中，本發(fā)明優(yōu)選的TNF抑配方為TNFRI和TNFRII的可溶形式，以及可溶性TNF結(jié)合蛋白質(zhì)。在另一實施方案中，該TNFR-Ig融合物為TNFR:Fc，此處所用的該術(shù)語指“依那西普(etanercept)”，其為兩分子p75 TNF-α受體胞外部分的二聚體，每一分子由人IgG亞型1的Fc部分的235個氨基酸組成。
生長因子和其他信號分子可有效作為藥物和/或商業(yè)物質(zhì)的另一類多肽包括生長因子和其他信號分子。生長因子一般為糖蛋白，其由細(xì)胞分泌并結(jié)合和活化其他細(xì)胞上的受體，起始受體細(xì)胞中的代謝或發(fā)育改變。在一個實施方案中，目的蛋白質(zhì)為包括ActRIIB受體胞外結(jié)構(gòu)域和抗體Fc部分的ActRIIB融合多肽(見如Wolfman等人，ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor，US2004/0223966 A1)。在另一實施方案中，生長因子為修飾的GDF-8前肽(見如Wolfman等人.，Modifed and stabilized GDF propeptides and usesthereof，US2003/0104406 A1)?；蛘吣康牡鞍诪楹瑸V泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(見如Hill等人，GASP1a follistatin domain containing protein，US2003/0162714 A1，Hill等人，GASP1a follistatin domain containing protein，US 2005/0106154 A1，Hill等人，F(xiàn)ollistatin domain containing proteins，US2003/0180306 A1)。
哺乳動物生長因子和其他信號分子的非限制性實例包括細(xì)胞因子；表皮生長因子(EGF)；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)如aFGF和bFGF；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白質(zhì)如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；紅細(xì)胞生成素；骨生成誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)；干擾素如干擾素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(TL)如IL-1至IL-10；腫瘤壞死因子(TNF)α和β；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和馮維勒布蘭德因子；抗凝因子如蛋白C；心鈉素；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活物如尿激酶或人尿或組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子(t-PA)；蛙皮素；凝血酶、造血生長因子；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子)；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白質(zhì)(MIP-1-α)；米勒抑制物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；神經(jīng)營養(yǎng)因子如骨源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、4、5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長因子如NGF-β。一名本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解可根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的其他生長因子或信號分子。
G-蛋白偶聯(lián)受體可有效作為藥物和/或商業(yè)物質(zhì)的另一類多肽包括生長因子和/或其他信號分子。G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)為具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。一旦配體與GPCR結(jié)合，將在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，從而使細(xì)胞的生物或生理性質(zhì)發(fā)生改變。
GPCR以及G蛋白和效應(yīng)物(受G蛋白調(diào)控的胞內(nèi)酶和通道)，是將細(xì)胞內(nèi)第二信使?fàn)顟B(tài)和細(xì)胞外輸入相聯(lián)系的調(diào)節(jié)信號系統(tǒng)的組分。這些基因和基因產(chǎn)物是疾病的潛在誘因。
視紫紅質(zhì)基因和V2血管加壓素受體基因的特定缺陷會導(dǎo)致多種形式的常染色體顯性和常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性、腎性尿崩癥。這些受體對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周生理過程都至關(guān)重要。GPCR蛋白質(zhì)超家族目前包括250種以上的旁系同源物(基因復(fù)制(或其他過程)產(chǎn)生的變體受體)，與之對應(yīng)的直系同源物為不同物種的相同受體。該超家族可分為5個家族家族I，以視紫紅質(zhì)和β2腎上腺素受體為代表的受體，目前具有200以上的獨特成員；家族II，最近表征的甲狀旁腺激素/降鈣素/胰泌素受體家族；家族III，哺乳動物代謝型谷氨酸受體家族；家族IV，cAMP受體家族，在化學(xué)趨化作用和盤基網(wǎng)柄菌(D.discoideum)的發(fā)育中具有重要作用；以及家族V，真菌交配信息素受體如STE2。
GPCR包括生物胺、炎癥脂質(zhì)介質(zhì)、肽激素和感覺信號介質(zhì)的受體。當(dāng)受體結(jié)合其細(xì)胞外配體時GPCR被活化。配體-受體相互作用引發(fā)的GPCR構(gòu)象改變，會影響G蛋白對GPCR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力。這使得GTP以增強的親和力結(jié)合于G蛋白。
由GTP活化G蛋白，引發(fā)了G蛋白α亞基與腺苷酸環(huán)化酶或其他第二信使分子產(chǎn)生物間的相互作用。這一相互作用調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性，繼而調(diào)節(jié)了第二信使分子cAMP的產(chǎn)生。cAMP調(diào)節(jié)其他細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化和活化。備選地，GPCR的活性也可上調(diào)或下調(diào)其他第二信使分子如cGMP或eicosinoid的細(xì)胞水平。GTPase水解GTP失活G蛋白α亞基，隨后α、β和γ亞基重新組合。然后異三聚體G蛋白從腺苷酸環(huán)化酶或其他第二信使分子產(chǎn)生物上脫落下來。也可通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或環(huán)的磷酸化調(diào)節(jié)GPCR的活性。
谷氨酸受體構(gòu)成了一組在神經(jīng)傳導(dǎo)中很重要的GPCR。谷氨酸為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元可塑性、認(rèn)知、記憶、學(xué)習(xí)和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、中風(fēng)和神經(jīng)變性中起重要作用(Watson，S.和S.Arkinstall(1994)The G-Protein Linked Receptor Facts Book，AcademicPress，San Diego CA，130-132頁)。谷氨酸的這些作用主要通過兩類不同的受體介導(dǎo)，即離子型和代謝型。離子型受體含有內(nèi)源性陽離子通道并介導(dǎo)谷氨酸的快速激動性作用。代謝型受體為調(diào)節(jié)性受體，通過抑制鈣依賴性鉀電導(dǎo)并同時抑制和加強離子型受體的興奮性傳導(dǎo)，提高神經(jīng)元的膜興奮性。代謝型受體基于激動劑藥理學(xué)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可分為5個亞類，并廣泛分布于腦組織中。
血管活性腸肽(VIP)家族為一組也通過GPCR介導(dǎo)作用的相關(guān)多肽。該家族的核心成員為VIP本身、胰泌素和生長激素釋放因子(GRF)。VIP具有廣泛的生理作用，包括松弛平滑肌、刺激或抑制多種組織中的分泌、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種免疫細(xì)胞活性以及多種興奮性或抑制性活性。胰泌素刺激胰腺和腸中酶和離子的分泌，在腦中也少量存在。GRF為重要的神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)，調(diào)節(jié)腺垂體中生長激素的合成和釋放(Watson，S.和S.Arkinstall同上，278-283頁)。
配體結(jié)合GPCR后，構(gòu)象變化傳遞到G蛋白，導(dǎo)致α亞基將結(jié)合的GDP分子更換為GTP分子，并從β、γ亞基上解離下來。α亞基的GTP結(jié)合形式一般作用如效應(yīng)物調(diào)節(jié)部分，導(dǎo)致第二信使的產(chǎn)生，如環(huán)化AMP(如通過腺苷酸環(huán)化酶的活化)、甘油二酯或肌醇磷酸。已知人有多于20種不同類型的α亞基，與較少類型的β和γ亞基相連。哺乳動物G蛋白的實例包括Gi、Go、Gq、Gs和Gt。G蛋白詳述于Lodish H.等人Molecular CellBiology中(Scientific American Books Inc.，New York，N.Y.，1995)，其內(nèi)容在此處引用作為參考。
GPCR為藥物作用和研發(fā)的主要靶位。實際上，目前已知藥物的一半以上均為受體所致(Drews，Nature Biotechnology，1996，141516)，而GPCR為治療干預(yù)最重要的靶位，臨床用藥的30％為GPCR的拮抗劑或激動劑(Milligan，G.和Rees，S.，(1999)TIPS，20118-124)。這表明，這些受體作為治療物質(zhì)已有確定的且經(jīng)證實的歷史。
一般而言，本發(fā)明的實施者會選擇其目的多肽，并已知其準(zhǔn)確的氨基酸序列。本發(fā)明的技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于生產(chǎn)多樣化多肽，其包括如針對生長和分化因子8的人單克隆抗體(實施例1、3、4、7-14)、人源化抗Lewis Y抗體(實施例5和6)、抗Aβ(實施例15)以及腫瘤壞死因子受體的二聚Fc-融合蛋白(實施例16)，提示本發(fā)明可用于表達(dá)多種不同的多肽和蛋白質(zhì)。將根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的任何給定蛋白質(zhì)都具有自身的特異反應(yīng)性特征，并可能影響培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞密度或存活力，其表達(dá)水平可能低于相同培養(yǎng)條件下生長的另一種多肽或蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能適當(dāng)修飾本發(fā)明的步驟和組合物，從而優(yōu)化細(xì)胞生長和/或任意給定表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
遺傳控制元件對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，遺傳控制元件可用于調(diào)控多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。選擇此類遺傳控制元件使其在相關(guān)宿主細(xì)胞中具有活性?？刂圃删哂薪M成型活性或為指定條件下可誘導(dǎo)?？烧T導(dǎo)型控制元件在表達(dá)蛋白質(zhì)具毒性或?qū)?xì)胞生長和/或存活力具其他不良影響時特別有用。在這種情況下，通過可誘導(dǎo)型控制元件調(diào)控多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)，可以改善細(xì)胞存活力、細(xì)胞密度和/或表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的總產(chǎn)率。可用于實施本發(fā)明的大量控制元件為本領(lǐng)域公知且可獲取。
可用于本發(fā)明的代表性組成型哺乳動物啟動子包括但不僅限于，次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPTR)啟動子、腺苷脫氨酶啟動子、丙酮酸激酶啟動子、β肌動蛋白啟動予以及其他本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的組成型啟動子。此外，能驅(qū)動真核細(xì)胞中編碼序列的組成型表達(dá)的病毒啟動子包括，如猿猴病毒啟動子、單純皰疹病毒啟動子、乳頭瘤病毒啟動子、腺病毒啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、莫洛尼鼠白血病病毒及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子，以及其他本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的病毒啟動子。
誘導(dǎo)型啟動子可在存在誘導(dǎo)劑時驅(qū)動有效連接的編碼序列的表達(dá)，也可根據(jù)本發(fā)明使用。例如在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，金屬硫蛋白啟動子在某些金屬離子存在時能誘導(dǎo)下游編碼序列的轉(zhuǎn)錄。其他誘導(dǎo)型啟動子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所識別和/或公知。
一般而言，基因表達(dá)序列也包括分別涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5’非轉(zhuǎn)錄和5’非翻譯序列，如TATA盒、帽子序列、CAAT序列等。增強子元件可任選用于增強欲表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。可在哺乳動物細(xì)胞中作用的增強子元件的實例包括SV40早期基因增強子(如Dijkema等人，EMBOJ.(1985)4761所述)、以及來自勞斯肉瘤病毒(RSV)(如Gorman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)796777所述)和人巨細(xì)胞病毒(如Boshart等人，Cell(1985)41521所述)長末端重復(fù)序列的增強子/啟動子。
將控制元件連接到編碼序列的系統(tǒng)為本領(lǐng)域公知(普通分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)，如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989，此處引用作為參考)。適用于插入優(yōu)選編碼序列以在多種生長和誘導(dǎo)條件下的多種哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的商業(yè)載體也為本領(lǐng)域所公知。
將編碼序列和相關(guān)控制元件引入宿主細(xì)胞適于將表達(dá)目的多肽或蛋白質(zhì)所需的足量核酸引入哺乳動物宿主細(xì)胞內(nèi)的方法為本領(lǐng)域所公知。見如Gething等人，Nature，293620-625(1981)；Mantei等人，Nature，28140-46(1979)；Levinson等人；EP 117,060；以及EP 117,058，均在此處引用作為參考。
對于哺乳動物細(xì)胞而言，優(yōu)選轉(zhuǎn)化方法包括，Graham和van der Erb，Virology，52456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法，或Hawley-Nelson，F(xiàn)ocus1573(1193)的lipofectamineTM.(Gibco BRL)法。哺乳動物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面已由Axel述于1983年8月16日遞交的美國專利號4,399,216。轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞的多種技術(shù)可見Keown等人，Methods inEnzymology(1989)、Keown等人，Methods in Enzymology，185527-537(1990)，以及Mansour等人，Nature，336348-352(1988)。在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的合適載體的非限制性代表實例包括pCDNA1；pCD，見Okayama等人.(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMClneoPoly-A，見Thomas等人.(1987)Cell 51503-512；以及桿狀病毒載體如pAC373或pAC610。
在優(yōu)選的實施方案中，多肽或蛋白質(zhì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，本發(fā)明可用于瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞。
細(xì)胞本發(fā)明中可應(yīng)用任何易于細(xì)胞培養(yǎng)及表達(dá)多肽的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞類型。可用于本發(fā)明的哺乳動物細(xì)胞的非限制性實例，包括BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(NSO/l，ECACC No85110503)；人成視網(wǎng)膜細(xì)胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))；SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胎腎細(xì)胞系(亞克隆的293或293細(xì)胞用于在懸浮培養(yǎng)基中生長，Graham等人，J.Gen Virol.，3659(1977))；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細(xì)胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠支持細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HeLa，ATCC CCL 2)；狗腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細(xì)胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細(xì)胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，38344-68(1982))；MRC 5細(xì)胞；FS4細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系(Hep G2)。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明用于培養(yǎng)和表達(dá)來自CHO細(xì)胞系的多肽及蛋白質(zhì)。
此外，任意數(shù)目的商業(yè)和非商業(yè)可得的能表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的雜交瘤細(xì)胞系可用于本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，雜交瘤細(xì)胞系可能具有不同的營養(yǎng)要求，和/或可能需要不同的培養(yǎng)條件以達(dá)到最佳的生長和多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)，并能按需改變條件。
如上所述，在許多情況下需要選擇或設(shè)計細(xì)胞以產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)或多肽。通常對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程操作以產(chǎn)生高水平蛋白質(zhì)，例如通過引入編碼目的蛋白質(zhì)或多肽的基因，和/或通過引入調(diào)控編碼目的多肽的基因(內(nèi)源性或引入的)表達(dá)的控制元件。
某些多肽可能對細(xì)胞生長、細(xì)胞存活力或某些其他細(xì)胞特征具有不良影響，從而最終在某些方面限制了目的多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。即使在經(jīng)過遺傳工程改造以表達(dá)某一特定多肽的特定類型細(xì)胞群中，細(xì)胞群內(nèi)部也存在差異，某些細(xì)胞個體生長更好和/或產(chǎn)生更多目的多肽。在本發(fā)明某些優(yōu)選實施方案中，實施者經(jīng)驗性選擇在選定的特定細(xì)胞培養(yǎng)條件下生長良好的細(xì)胞系。在特別優(yōu)選的實施方案中，基于細(xì)胞生長、最終細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力百分比、表達(dá)多肽的滴度或由這些或由實施者重視的其他條件的任意組合，選擇經(jīng)改造表達(dá)特定多肽的個體細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
細(xì)胞培養(yǎng)階段生產(chǎn)目的多肽的一般方法包括分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)。分批培養(yǎng)方法一般包括用特定細(xì)胞密度的種子培養(yǎng)物接種大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)物，使細(xì)胞在有利于細(xì)胞生長和存活力的條件下生長、當(dāng)細(xì)胞達(dá)到特定細(xì)胞密度時收集培養(yǎng)物，并純化表達(dá)多肽。補料分批培養(yǎng)方法包括額外的步驟，即向分批培養(yǎng)物中補充營養(yǎng)素或其他細(xì)胞生長中消耗的成分。常規(guī)分批和補料分批培養(yǎng)中長期未決的問題，在于對細(xì)胞生長、存活力以及表達(dá)多肽產(chǎn)生有害的代謝廢物的產(chǎn)生。兩類特別有害的代謝廢物為乳酸鹽和銨鹽，分別為葡萄糖和谷氨酰胺代謝所產(chǎn)生。除谷氨酰胺代謝中酶促產(chǎn)生銨鹽外，細(xì)胞培養(yǎng)物中也會因為隨時間的非代謝降解蓄積銨鹽。本發(fā)明提供了大規(guī)模生產(chǎn)多肽的改良方法，能通過減緩甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中這些廢物的蓄積，使銨鹽和乳酸鹽的不良影響最低化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到本發(fā)明可用于任何細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，包括但不僅限于分批、補料分批和灌流系統(tǒng)。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞生長于分批或補料分批系統(tǒng)。
培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)基配方，包括可購買培養(yǎng)基如Ham′s F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基([MEM]，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基([DMEM]，Sigma)，含有相對高水平的葡萄糖和與其他氨基酸相比而言相對高水平的谷氨酰胺。通常認(rèn)為需要大量這些成分，因為它們是細(xì)胞的主要代謝能量來源。然而，這些營養(yǎng)物質(zhì)的快速消耗導(dǎo)致了上述乳酸鹽和銨鹽的蓄積。此外，高初始水平的葡萄糖和谷氨酰胺以及隨后乳酸鹽和銨鹽的蓄積會導(dǎo)致高摩爾滲透壓濃度，后者本身往往就對細(xì)胞生長、細(xì)胞存活力和多肽的產(chǎn)生有害。
本發(fā)明提供了多種培養(yǎng)基配方，當(dāng)與此處所述的其他培養(yǎng)步驟一同使用時，能最小化甚至逆轉(zhuǎn)乳酸鹽和銨鹽的蓄積。對細(xì)胞生長和/或存活力以及對多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)有利的本發(fā)明培養(yǎng)基配方，包括以下一項或多項i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM；ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2；iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2；iv)累積無機離子與累積總氨基酸的比率為約0.4至1；或v)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺濃度的組合累積量大于約16mM。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解上文所用的“累積”，是指細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入的特定成分或成分的總量，包括在培養(yǎng)起始時加入的成分和其后加入的成分。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的培養(yǎng)基配方包括限定和非限定培養(yǎng)基。
相對于本發(fā)明培養(yǎng)基配方，常規(guī)培養(yǎng)基配方起始時具有相對低水平的總氨基酸。例如，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基DME-F12(Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基與Ham′s F培養(yǎng)基12的50∶50混合物)中總氨基酸含量為7.29mM，而常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640的總氨基酸含量為6.44mM(見如H.J.Morton，In Vitro，689-108(1970)，R.G.Ham，Proc.Nat.Assoc.Sci.(USA)，53288-293(1965)，G.E.Moore等人，J.Am.Medical Assn.，199519-24(1967)，均在此處引用作為參考)。在某些本發(fā)明某些實施方案中，培養(yǎng)基中的氨基酸濃度優(yōu)選大于約70mM。更優(yōu)選本發(fā)明培養(yǎng)基配方中初始培養(yǎng)基含有氨基酸濃度大于約70mM。已經(jīng)證實當(dāng)初始培養(yǎng)基的氨基酸濃度在此范圍內(nèi)時，培養(yǎng)物生長期間的細(xì)胞密度和滴度得以提高(見實施例13)。
此外，在本發(fā)明的某些實施方案中，培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比比其他可購買或不可購買的培養(yǎng)基降低。優(yōu)選培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比小于約2。
此外，在本發(fā)明的某些實施方案中，培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比比其他可購買或不可購買的培養(yǎng)基降低。優(yōu)選培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比小于約0.2。
如本發(fā)明中降低初始培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與天冬酰胺或與總氨基酸濃度的摩爾比，得到的有趣而出人預(yù)料的結(jié)果是，除了觀察到銨鹽蓄積減少外，乳酸鹽蓄積也減少了。在某些實施方案中，銨鹽和乳酸鹽的蓄積水平不僅低于對照培養(yǎng)物的水平，實際上在初始蓄積后也降低了(例如，見實施例3和7)。
Boraston(美國專利號5,871,999)已公開了總無機離子與總氨基酸摩爾比為1至10的培養(yǎng)基。Boraston顯示，使用總無機離子與總氨基酸摩爾比位于此范圍內(nèi)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中生長的CHO細(xì)胞聚集有所減少。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)基中總無機離子與總氨基酸摩爾比進(jìn)一步降低至約0.4至1。如實施例13所示，將該比例從1.75降至約0.7，使得培養(yǎng)物生長期間的細(xì)胞密度和表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生顯著增加。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)基含有谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度為約16至36mM。如實施例14、表22所示，含谷氨酰胺與天冬酰胺的組合總濃度位于此范圍內(nèi)的培養(yǎng)基，相對于谷氨酰胺與天冬酰胺的組合總濃度在此范圍外的培養(yǎng)基，其表達(dá)多肽的滴度更高。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠選擇該范圍內(nèi)恰當(dāng)?shù)墓劝滨０放c天冬酰胺組合濃度，從而優(yōu)化細(xì)胞生長和/或存活力，并最大化表達(dá)多肽的產(chǎn)生。
此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到以上所列的任一種條件都可單獨使用或彼此多種組合使用。利用具有上述一種、幾種或所有特征的培養(yǎng)基配方，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠優(yōu)化細(xì)胞生長和/或存活力，并最大化表達(dá)多肽的產(chǎn)生。
本發(fā)明中公開的任何培養(yǎng)基配方可任選于必要時添加激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物或葡萄糖或其他能量來源。在本發(fā)明的某些實施方案中，向培養(yǎng)基中添加化學(xué)誘導(dǎo)劑如六亞甲基二乙酰胺(“HMBA”)和丁酸鈉(“NaB”)是有利的。可于培養(yǎng)起始加入這些任選添加劑，也可在稍后加入以補充消耗的營養(yǎng)或另作他用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道可加入公開培養(yǎng)基配方中的任何有利或必需的添加劑。
提供哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物制備用于通過分批或補料分批培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽的哺乳動物細(xì)胞的多種方法為本領(lǐng)域公知。如上所述，可通過任意數(shù)目的公知技術(shù)將足以進(jìn)行表達(dá)的核酸(一般為含有編碼目的多肽或蛋白質(zhì)基因及任何有效連接的遺傳控制元件的載體)引入宿主細(xì)胞系內(nèi)。一般而言，篩查細(xì)胞以確定哪些宿主細(xì)胞實際獲得了載體并表達(dá)目的多肽或蛋白質(zhì)。檢測哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的某一特定目的多肽或蛋白質(zhì)的常規(guī)方法，包括但不僅限于免疫組化、免疫沉淀、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光顯微術(shù)、SDS-PAGE、Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)技術(shù)、生物活性測定和親和層析。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會知道檢測表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的其他合適技術(shù)。如果多個宿主細(xì)胞表達(dá)目的多肽或蛋白質(zhì)，可以使用某些或所有上述技術(shù)確定哪些細(xì)胞表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的水平最高。
一旦表達(dá)目的多肽或蛋白質(zhì)的細(xì)胞得以鑒定，通過任意的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的多種方法于培養(yǎng)物中增殖細(xì)胞。一般使細(xì)胞在有利于細(xì)胞存活、生長和存活力的溫度和培養(yǎng)基中生長，來增殖表達(dá)目的多肽和蛋白質(zhì)的細(xì)胞。初始培養(yǎng)基體積可為任意大小，但通常小于最終生成目的多肽或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基體積，且通常在將細(xì)胞接種于生產(chǎn)生物反應(yīng)器前，使細(xì)胞在容積遞增的生物反應(yīng)器傳代數(shù)次。攪拌或搖動細(xì)胞培養(yǎng)物以提高培養(yǎng)基的充氧程度和營養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)胞中的散布。備選地或額外地，可使用本領(lǐng)域公知的特殊噴射裝置提高和控制培養(yǎng)物的充氧程度。根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道控制或調(diào)控某些生物反應(yīng)器的內(nèi)部條件是有利的，包括但不僅限于pH、溫度、充氧等。
生產(chǎn)生物反應(yīng)器中的起始細(xì)胞密度可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員選定。根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)生物反應(yīng)器中的起始細(xì)胞密度可低至每單位培養(yǎng)物體積含一個細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，生產(chǎn)生物反應(yīng)器中的起始細(xì)胞密度可為約每毫升2×102個活細(xì)胞，至約每毫升2×103、2×104、2×105、2×106、5×106或10×106個活細(xì)胞及更高。
可使起始和中間細(xì)胞培養(yǎng)物生長至任何所需的密度，再接種下一中間或最終生產(chǎn)生物反應(yīng)器。優(yōu)選在接種前大部分細(xì)胞都存活，盡管具有完全存活力或近于完全的存活力并非必需。在本發(fā)明的某一實施方案中，可通過如低速離心將細(xì)胞從上清液中分離出來。也可以在接種下一生物反應(yīng)器前用培養(yǎng)基洗滌取出的細(xì)胞，以除去任何不需要的代謝廢物或培養(yǎng)基成分。該培養(yǎng)基可為細(xì)胞之前生長的培養(yǎng)基，也可為由本發(fā)明實施者選擇的不同的培養(yǎng)基或洗滌溶液。
可將細(xì)胞稀釋至合適的密度以接種生產(chǎn)生物反應(yīng)器。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，將細(xì)胞稀釋于生產(chǎn)生物反應(yīng)器所用的相同培養(yǎng)基中?；蛘咭部筛鶕?jù)本發(fā)明實施者的需要或愿望，或為適應(yīng)細(xì)胞本身的特定需求(例如在接種生產(chǎn)生物反應(yīng)器前它們需短期貯存)，將細(xì)胞稀釋至另一培養(yǎng)基或溶液中。
起始生長階段一旦如上所述接種生產(chǎn)生物反應(yīng)器，在有利于細(xì)胞培養(yǎng)物存活、生長和存活力的條件下將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在起始生長階段。準(zhǔn)確的條件將取決于細(xì)胞類型、獲取細(xì)胞的生物以及表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的性質(zhì)和特征而改變。
根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)生物反應(yīng)器可以為適合多肽或蛋白質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)的任意容積。在優(yōu)選實施方案中，生產(chǎn)生物反應(yīng)器的容積為至少500升。在另一優(yōu)選實施方案中，生產(chǎn)生物反應(yīng)器的容積為1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或更大，或其間的任意容積。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道也能夠選擇合適的生物反應(yīng)器用于實施本發(fā)明。該生產(chǎn)生物反應(yīng)器可由有利于細(xì)胞生長和存活力、且不干擾產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)或穩(wěn)定性的任意材料構(gòu)成。
起始生長階段細(xì)胞培養(yǎng)物溫度的選擇主要是基于細(xì)胞培養(yǎng)物可保持存活力的溫度范圍。例如，在起始生長階段，CHO細(xì)胞在37℃生長良好。一般而言，大部分哺乳動物細(xì)胞在約25℃至42℃的范圍內(nèi)生長良好。優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞在約35℃至40℃的范圍內(nèi)生長良好。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能根據(jù)細(xì)胞的需求和實施者的生產(chǎn)要求，選擇細(xì)胞生長的合適溫度。
在本發(fā)明的某一實施方案中，將起始生長階段的溫度維持在單一、恒定的溫度。在另一實施方案中，將起始生長階段的溫度維持在一系列溫度范圍內(nèi)。例如可在起始生長階段穩(wěn)步提高或降低溫度?；蛘咭部稍谄鹗忌L階段的多個時間點不連續(xù)地提高或降低溫度。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定是否應(yīng)當(dāng)使用單一或多個溫度，以及該溫度是否應(yīng)當(dāng)穩(wěn)步改變還是不連續(xù)地改變。
根據(jù)實施者的需要和細(xì)胞本身的需求，細(xì)胞在起始生長階段生長的時間可長可短。在一個實施方案中，使細(xì)胞生長足以達(dá)到活細(xì)胞密度的時間，所述活細(xì)胞密度為細(xì)胞在不受干擾時生長最終可達(dá)到的最大活細(xì)胞的給定百分比。例如，可使細(xì)胞生長一段時間，該時間內(nèi)足以達(dá)到所需的活細(xì)胞密度，其為最大活細(xì)胞密度的百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99。
在另一實施方案中使細(xì)胞生長指定的時間。例如，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物的起始濃度、細(xì)胞生長的溫度以及細(xì)胞的內(nèi)在生長速率，可使細(xì)胞生長0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天時間。在某些情況下，可使細(xì)胞生長一個月或更長時間。如果細(xì)胞在起始生長階段的溫度下、接種生物反應(yīng)器中的生長足以使接種時生產(chǎn)生物反應(yīng)器中活細(xì)胞密度已經(jīng)達(dá)到所需的最大活細(xì)胞密度百分比，則細(xì)胞可在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中生長0天。本發(fā)明實施者能夠根據(jù)多肽或蛋白質(zhì)生產(chǎn)需求和細(xì)胞本身需求選擇起始生長階段的長度。
在起始培養(yǎng)期間可攪拌或搖動細(xì)胞培養(yǎng)物，以提高充氧和細(xì)胞中營養(yǎng)物質(zhì)的分布。根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在起始生長階段控制或調(diào)控生物反應(yīng)器的某些內(nèi)部條件(包括但不僅限于pH、溫度、充氧等)是有利的。例如，可以通過供以適量的酸或堿控制pH，而可通過本領(lǐng)域公知的噴射裝置控制充氧。
改變培養(yǎng)條件根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，在起始生長階段終末期至少可以改變一種培養(yǎng)條件，以應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件并使培養(yǎng)物中發(fā)生代謝轉(zhuǎn)變。抑制性代謝物(最主要為乳酸鹽和氨)的蓄積會抑制生長。通過如改變細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度、pH、重量摩爾滲透壓濃度或化學(xué)誘導(dǎo)物水平而完成的代謝轉(zhuǎn)變，其特征在于降低了特定乳酸鹽產(chǎn)生速率與特定葡萄糖消耗速率的比率。在非限制性實施方案中，通過轉(zhuǎn)變培養(yǎng)物的溫度轉(zhuǎn)變培養(yǎng)條件。然而，如本領(lǐng)域所公知，改變溫度不是完成合適代謝改變的唯一機制。例如，此類代謝轉(zhuǎn)變也可通過改變其他培養(yǎng)條件而完成，包括但不僅限于pH、重量摩爾滲透壓濃度或丁酸鈉水平。如上所述，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)變的時間由本發(fā)明實施者根據(jù)多肽或蛋白質(zhì)生產(chǎn)需要或細(xì)胞本身需求所確定。
當(dāng)改變培養(yǎng)物溫度時，溫度的轉(zhuǎn)變可能相對漸變。例如，溫度改變的完成可能需要數(shù)小時至數(shù)天。或者溫度轉(zhuǎn)變可以相對突然。例如，溫度轉(zhuǎn)變可能在少于數(shù)小時內(nèi)完成。利用適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)和控制設(shè)施(如商業(yè)大規(guī)模多肽或蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)施)，溫度改變甚至可以在1小時以內(nèi)完成。
隨后生長階段中細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度的選擇，主要是基于細(xì)胞培養(yǎng)物保持存活力且能在商業(yè)滿足量水平上表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)的溫度范圍。一般而言，大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞在約25℃至42℃的溫度范圍能保持存活力并且在商業(yè)滿足量水平上表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)。優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞在約25℃至35℃的溫度范圍保持存活力且能在商業(yè)滿足量水平上表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能根據(jù)細(xì)胞需求和實施者的生產(chǎn)需要，選擇生長細(xì)胞的合適溫度。
在本發(fā)明的一個實施方案中，維持隨后生長階段的溫度為單一、恒定的溫度。在另一實施方案中，維持隨后生長階段的溫度在一系列溫度范圍內(nèi)。例如可在隨后生長階段穩(wěn)步提高或降低溫度?；蛘咭部稍陔S后生長階段的多個時間點不連續(xù)地提高或降低溫度。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解該實施方案中包括多個不連續(xù)的溫度轉(zhuǎn)換。例如，溫度可能轉(zhuǎn)變一次，細(xì)胞在該溫度或溫度范圍內(nèi)維持一段時間，隨后可再次轉(zhuǎn)變溫度——至更高或更低溫度。每次不連續(xù)地轉(zhuǎn)變后，培養(yǎng)物溫度可為恒定，也可維持于某—溫度范圍內(nèi)。
在實施例16中，顯示的數(shù)據(jù)證實應(yīng)用兩次連續(xù)溫度改變的有效性，然而本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明中可以使用3次或更多次連續(xù)的溫度改變提高細(xì)胞的存活力或密度和/或提高重組多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)。每次連續(xù)溫度轉(zhuǎn)變后細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度或溫度范圍可能高于或低于轉(zhuǎn)變前的溫度或溫度范圍。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，每一連續(xù)的溫度或溫度范圍都低于前一溫度或溫度范圍。
后續(xù)生產(chǎn)階段根據(jù)本發(fā)明，一旦如上述轉(zhuǎn)變了細(xì)胞培養(yǎng)物條件，將細(xì)胞培養(yǎng)物維持于第二組培養(yǎng)條件的后續(xù)生產(chǎn)階段，所述培養(yǎng)條件有利于細(xì)胞培養(yǎng)物的存活和存活力，且適于所需多肽或蛋白質(zhì)以商業(yè)滿足水平表達(dá)。
如上所述，可以通過改變數(shù)種培養(yǎng)條件中的一種或多種來轉(zhuǎn)變培養(yǎng)物，包括但不僅限于溫度、pH、重量摩爾滲透壓濃度和丁酸鈉水平。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)變培養(yǎng)物的溫度。根據(jù)該實施方案，在后續(xù)生產(chǎn)階段，將培養(yǎng)物維持于低于起始生長階段溫度或溫度范圍的溫度或溫度范圍內(nèi)。例如，在后續(xù)生產(chǎn)階段中，CHO細(xì)胞在25℃至35℃范圍內(nèi)良好表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)。如上所述，可利用多重不連續(xù)的溫度轉(zhuǎn)變提高細(xì)胞密度或存活力，或提高重組多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明，可維持細(xì)胞于后續(xù)生產(chǎn)階段直至達(dá)到所需的細(xì)胞密度或生產(chǎn)滴度。在一個實施方案中，維持細(xì)胞于后續(xù)生產(chǎn)階段直至重組多肽或蛋白質(zhì)的滴度達(dá)到最大。在其他實施方案中，可根據(jù)實施者的生產(chǎn)要求或細(xì)胞本身的需求，在此時間點前收集培養(yǎng)物。例如，可維持細(xì)胞一段時間，以足以達(dá)到活細(xì)胞密度為最大活細(xì)胞密度的百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99。在某些情況下，使活細(xì)胞密度達(dá)到最大后再于收集培養(yǎng)物前使活細(xì)胞密度下降至某一水平可能是有利的。在極端實例中，在收集培養(yǎng)物前使活細(xì)胞密度接近或達(dá)到0可能有利。
在本發(fā)明的另一實施方案中，使細(xì)胞于后續(xù)生產(chǎn)階段中生長指定的時間。例如，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物在后續(xù)生產(chǎn)階段的起始濃度、細(xì)胞生長的溫度以及細(xì)胞的內(nèi)在生長速率，可使細(xì)胞生長0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天時間。在某些情況下，可使細(xì)胞生長一個月或更長時間。本發(fā)明實施者能夠根據(jù)多肽或蛋白質(zhì)生產(chǎn)需求和細(xì)胞本身需求選擇后續(xù)生長階段的長度。
在某些情況下，于后續(xù)生產(chǎn)階段中向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加細(xì)胞消耗或代謝的營養(yǎng)物質(zhì)或其他培養(yǎng)基成分，可能為有利或必要的。例如，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加在細(xì)胞培養(yǎng)物監(jiān)測(見下文“監(jiān)測培養(yǎng)條件”章節(jié))中發(fā)現(xiàn)消耗的營養(yǎng)物質(zhì)或其他培養(yǎng)基成分是有利的。備選地或額外地，在后續(xù)生產(chǎn)階段前補充細(xì)胞培養(yǎng)物也是有利或必要的。在非限制性實例中，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂質(zhì)或葡萄糖或其他能量來源，是有利或必要的。
可將這些增補成分全部一次加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，或可以系列添加提供給細(xì)胞培養(yǎng)物。在本發(fā)明的某一實施方案中，在多個時間點按比例量向細(xì)胞培養(yǎng)物中提供增補成分。在另一實施方案中，可于起始時僅提供某些增補成分，并于稍后提供其余成分。在本發(fā)明的另一實施方案中，以這些增補成分持續(xù)向細(xì)胞培養(yǎng)物補料。
根據(jù)本發(fā)明，最好應(yīng)將向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加的總量保持為最小。例如，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加的含有增補成分的培養(yǎng)基或溶液的總量可為提供增補成分之前細(xì)胞培養(yǎng)物體積的百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50。
在后續(xù)生產(chǎn)階段期間可攪拌或搖動細(xì)胞培養(yǎng)物，以提高充氧和細(xì)胞中營養(yǎng)物質(zhì)的分散。根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在后續(xù)生長階段控制或調(diào)控生物反應(yīng)器的某些內(nèi)部條件(包括但不僅限于pH、溫度、充氧等)是有利的。例如，可以通過供以適量的酸或堿控制pH，而可通過本領(lǐng)域公知的噴射裝置控制充氧。
監(jiān)測培養(yǎng)條件在本發(fā)明的某些實施方案中，實施者會發(fā)現(xiàn)周期性監(jiān)測生長的細(xì)胞培養(yǎng)的具體條件是有利或必要的。監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)條件使得實施者能確定細(xì)胞培養(yǎng)物是否在次佳水平上生產(chǎn)重組多肽或蛋白質(zhì)，或培養(yǎng)物將進(jìn)入次佳生產(chǎn)階段。為監(jiān)測某些細(xì)胞培養(yǎng)條件，有必要取出少量等份的培養(yǎng)物進(jìn)行分析。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解此類取出有可能會向細(xì)胞培養(yǎng)物中引入污染，并會適度注意以最小化此類污染的風(fēng)險。
作為非限制性實例，監(jiān)測溫度、pH、細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力、綜合活細(xì)胞密度、乳酸鹽水平、銨鹽水平、摩爾滲透壓濃度或表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的滴度，是有利或必要的。本領(lǐng)域公知有多種技術(shù)可使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測量這些條件。例如，可以利用血細(xì)胞計數(shù)儀、Coulter計數(shù)器或細(xì)胞密度檢查(CEDEX)測量細(xì)胞密度。可以通過臺盼藍(lán)染色培養(yǎng)物樣本確定活細(xì)胞密度。由于只有死細(xì)胞才攝取臺盼藍(lán)，通過計量細(xì)胞總數(shù)、用攝取染料的細(xì)胞數(shù)目除以細(xì)胞總數(shù)，取剩余值即可確定活細(xì)胞密度?？梢岳肏PLC確定乳酸鹽、銨鹽或表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的水平?；蛘?，也可利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)例如SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色、Western印跡、Bradford測定、勞里測定、雙縮脲測定和UV吸收確定表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的水平。監(jiān)測表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(包括磷酸化和糖基化)也是有利或必要的。
表達(dá)多肽的分離一般而言，一般優(yōu)選分離和/或純化本發(fā)明中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽。在優(yōu)選實施方案中，表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)分泌于培養(yǎng)基中，因此通過如離心或過濾去除細(xì)胞和其他固體是純化過程的第一步。該實施方案在用于本發(fā)明時特別有用，因為此處描述的方法和組合物使細(xì)胞存活力增加。結(jié)果在培養(yǎng)過程中死亡的細(xì)胞減少，且釋放入培養(yǎng)基中能潛在降低表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)量的蛋白水解酶減少。
或者可將表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合于宿主細(xì)胞的表面。在該實施方案中，去除培養(yǎng)基，并裂解表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞作為純化過程中的第一步?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意方法裂解哺乳動物宿主細(xì)胞，包括利用玻璃珠物理破壞，以及暴露于高pH值條件。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離和純化多肽或蛋白質(zhì)，包括但不限于色譜法(例如離子交換、親和力、尺寸排阻和羥基磷灰石層析)、凝膠過濾、離心或差異溶解度、乙醇沉淀或任何其他可用的純化蛋白質(zhì)技術(shù)(見如Scopes，Protein Purification Principles and Practice第二版，Springer-Verlag，NewYork，1987；Higgins，S.J.和Hames，B.D.(編輯)，Protein ExpressionAPractical Approach，Oxford Univ Press，1999；以及Deutscher，M.P.，Simon，M.I.，Abelson，J.N.(編輯)，Guide to Protein PurificationMethods inEnzymology(Methods in Enzymology Series，Vol 182)，Academic Press，1997，均在此處引用作為參考)。具體對于免疫親和層析而言，通過將蛋白質(zhì)結(jié)合于含有抗體的親和柱可以分離蛋白質(zhì)，所述抗體為針對該蛋白質(zhì)所產(chǎn)生并固定于固態(tài)支持物上?；蛘呖衫脴?biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)將親和標(biāo)記如流感外殼序列、多聚組氨酸、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶連接于蛋白質(zhì)，以使得可通過合適的親和柱進(jìn)行簡單純化?？稍谌我饣蛩须A段加入蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制劑或抑酶肽，以減少或消除純化過程中多肽或蛋白質(zhì)的降解。當(dāng)必須裂解細(xì)胞以分離和純化表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)時，尤其需要蛋白酶抑制劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到根據(jù)待純化多肽或蛋白質(zhì)的特性、表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的細(xì)胞特性，以及細(xì)胞生長的培養(yǎng)基組成，具體純化技術(shù)有所不同。
藥物配方在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，生產(chǎn)的多肽或蛋白質(zhì)具有藥理學(xué)活性并可用于藥物制備。上述的發(fā)明組合物可施用于受試者或可先配制以通過任何可用的途徑遞送，所述途徑包括但不限于胃腸道外(如靜脈內(nèi))、皮內(nèi)、皮下、口服、經(jīng)鼻、經(jīng)氣管、經(jīng)眼(opthalmic)、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜、經(jīng)直腸以及經(jīng)陰道途徑。發(fā)明性藥物組合物一般包括表達(dá)自哺乳動物細(xì)胞系的純化的多肽或蛋白質(zhì)、遞送物質(zhì)(即陽離子聚合物、肽分子轉(zhuǎn)運蛋白、表面活性物質(zhì)等，如上文所述)，與可藥用載體的組合。此處所用的詞語“可藥用載體”包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等與藥物施用相容的物質(zhì)。組合物中也可含有增補的活性化合物。
配制藥物組合物以使之與其預(yù)期的施用途徑相容。應(yīng)用于胃腸道外、皮內(nèi)或皮下的溶液或懸浮液包括以下成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、非揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細(xì)菌劑如苯甲醇或?qū)αu苯甲酸甲酯；抗氧化劑如維生素C或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及調(diào)節(jié)張力物質(zhì)如氯化鈉或右旋糖?？捎盟峄驂A(如鹽酸或氫氧化鈉)調(diào)節(jié)pH?？砂b胃腸道外制品于安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多劑小瓶。
適于注射用的藥物組合物一般包括無菌水溶液(其中可溶于水)或分散體，以及無菌散劑，用以制備無菌注射溶液或分散系的臨時制品?？捎糜诮?jīng)靜脈施用的合適載體包括生理鹽水、制菌水、聚氧乙烯醚(CremophorELTM)(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物都必須無菌且為可易于注射的液態(tài)。優(yōu)選的藥物制劑在生產(chǎn)和貯存條件下穩(wěn)定，且必須貯存以避免微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。一般而言，相關(guān)載體可為溶劑或分散介質(zhì)，其中含有如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液態(tài)聚乙二醇等)及其合適混合物。通過如利用如卵磷脂包衣、維持分散系中所需顆粒的尺寸以及通過利用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃有??？衫枚喾N抗細(xì)菌和抗真菌劑來防止微生物作用，例如對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙基汞硫代水楊酸鈉等。在許多情況下，優(yōu)選向組合物中加入等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉?？梢酝ㄟ^向組合物中加入延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠，延長注射組合物的吸收。
根據(jù)需求，向含有上述成分的一種或數(shù)種組合的合適溶劑中摻入所需量的純化多肽或蛋白質(zhì)，然后過濾滅菌，可制備無菌注射用溶液。一般而言，向含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及所需上述列舉中的其他成分的無菌載體中摻入純化的哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)，可制備分散系。對于用于制備無菌注射溶液的無菌散劑而言，優(yōu)選制備方法為真空干燥以及冷凍干燥，可產(chǎn)生具有活性成分以及來自以前無菌過濾溶液的任意其他所需成分的散劑。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。為進(jìn)行口服治療施用，可將純化多肽或蛋白質(zhì)混合于賦形劑，并以片劑、錠劑或膠囊如明膠膠囊的形式使用。也可利用液態(tài)載體制備口服組合物，用如漱口液。藥物相容性粘合劑和/或佐劑材料可作為組合物的組成部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有任意以下成分，或具有相似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或增味劑如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或桔子香精?？诜f送制劑可以有利地?fù)饺肽芴岣呶改c道內(nèi)穩(wěn)定性和/或增強吸收的物質(zhì)。
為吸入施用，優(yōu)選從含有合適推進(jìn)劑(如氣體如二氧化碳)或霧化器的加壓容器或分散器以氣溶膠噴霧的形式遞送含有表達(dá)自哺乳動物細(xì)胞系的純化的多肽或蛋白質(zhì)和遞送劑的本發(fā)明組合物。本發(fā)明特別涉及利用鼻噴霧、吸入或其他直接遞送方式將組合物遞送至上和/或下呼吸道。經(jīng)鼻施用針對流感病毒的DNA疫苗已經(jīng)顯示能夠引發(fā)CD8 T細(xì)胞應(yīng)答，提示至少呼吸道內(nèi)的某些細(xì)胞能攝取經(jīng)此途徑遞送的DNA，且本發(fā)明的遞送劑會增強細(xì)胞攝取。根據(jù)本發(fā)明某些實施方案，含有表達(dá)自哺乳動物細(xì)胞系的純化多肽和遞送劑的組合物，被配制為大的多孔顆粒用于氣溶膠施用。
也可通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方法全身施用。為進(jìn)行經(jīng)粘膜或經(jīng)皮施用，制劑中使用適合于待穿透屏障的滲透劑。此類滲透劑一般為本領(lǐng)域公知，包括如用于經(jīng)粘膜施用的去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜施用可通過使用鼻噴霧或栓劑而實現(xiàn)。對于經(jīng)皮施用而言，將純化的多肽或蛋白質(zhì)以及遞送劑配制為本領(lǐng)域公知的軟膏、油膏、凝膠或霜劑中。
組合物也可制備為栓劑(例如使用如可可油或其他甘油酯的常規(guī)栓劑基質(zhì))或用于直腸遞送的留置灌腸劑形式。
在一個實施方案中，制備的組合物中含有可保護(hù)多肽或蛋白質(zhì)以避免體內(nèi)迅速消除的載體，例如控釋制劑(包括埋植和微囊遞送系統(tǒng))?？墒褂蒙锟山到獾暮蜕锵嗳菪跃酆衔铮缫蚁┮宜嵋蚁?、聚酐、聚羥基乙酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類制劑的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見。這些材料也可購自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc。脂質(zhì)體懸浮液(包括含有針對病毒抗原單克隆抗體的靶定感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作可藥用載體。這些均可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如美國專利號4,522,811中所述。
最好可將口服或胃腸道外組合物配制為單劑形式以便于劑量的使用和均一性。此處所用的單劑形式是指適合待治療受試者的單位劑量的物理分離單位；其中每一單位含有經(jīng)計算能與所需藥物載體一同產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的活性多肽或蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)可按需以多個間隔、持續(xù)不同時期施用，例如每周一次，持續(xù)約1至10周、2至8周、約3至7周、約4、5或6周等。技術(shù)人員認(rèn)識到某些因素會影響有效治療受試者所需的劑量和時間選擇，包括但不僅限于疾病或紊亂的嚴(yán)重性、既往治療、受試者的一般健康狀況和/或年齡，以及存在的其他疾病。一般而言，用此處所述的多肽或蛋白質(zhì)治療受試者可包括單次治療，或在多種情況下可包括一系列治療。進(jìn)一步認(rèn)識到合適的劑量將取決于多肽或蛋白質(zhì)的效力，且可任選根據(jù)具體受者調(diào)整，例如通過施用遞增的劑量直至出現(xiàn)預(yù)選的期望反應(yīng)。對于任何具體動物受試者的特定劑量水平可能取決于多種因素，包括所用特定多肽或蛋白質(zhì)的活性、受試者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食、施用時間、施用途徑、排泄速率、任何藥物組合以及被調(diào)節(jié)的表達(dá)水平或活性。
本發(fā)明包括利用發(fā)明組合物治療非人類動物。因此，可根據(jù)已知的獸醫(yī)藥理學(xué)和醫(yī)學(xué)原則選擇施用的劑量和方法。指南可見于如Adams，R.(編輯)，Veterinary Pharmacology and Therapeutics，第8版，Iowa StateUniversity Press；ISBN0813817439；2001。
發(fā)明藥物組合物可與施用說明一起含于容器、包裹或分散器中。
應(yīng)該理解，前述說明僅為代表而非限制。實施本發(fā)明的其他方法和材料以及額外的應(yīng)用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見，并包括于所附權(quán)利要求中。
實施例實施例1用于抗GDF-8補料分批方法的增強型培養(yǎng)基1常規(guī)用于細(xì)胞系培養(yǎng)的補料分批方法有一些缺點，包括補料所必需的時間及精力，以及大規(guī)模生物反應(yīng)器所需要的特別設(shè)施。本實施例的目的是開發(fā)一種需要最小補料的在大規(guī)模生物反應(yīng)器中生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的分批培養(yǎng)基。
材料與方法株系和培養(yǎng)基設(shè)計中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)針對生長分化因子8的單克隆抗體(抗GDF-8細(xì)胞)(見Veldman等人，Neutralizing AntibodiesAgainst GDF-8 and Uses Therefor，US20040142382 A1)?？笹DF-8細(xì)胞用于測試新的分批培養(yǎng)基。比較培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2支持高細(xì)胞密度和存活力的能力。表1中列出了這些培養(yǎng)基和培養(yǎng)基3的成分。加入除FeSO4·7H2O以外的所有成分配制培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH 7.25，記錄摩爾滲透壓濃度，然后加入FeSO4·7H2O。
培養(yǎng)條件對于燒瓶實驗，使抗GDF-8細(xì)胞在振蕩的燒瓶中生長并傳代三次。對于生物反應(yīng)器實驗，抗GDF-8細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長12天，第5天后每日補充2％體積的20×培養(yǎng)基4的補料培養(yǎng)基(表3)或3％體積的16×培養(yǎng)基4(表4)。對于頭4天而言，于37℃培養(yǎng)細(xì)胞。在第5天時將細(xì)胞移至31℃。
樣品分析每天從培養(yǎng)物中取出樣品，分析氨基酸、維生素、鐵、磷酸鹽、葡萄糖和谷氨酰胺的水平。
表1.培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3的成分
結(jié)果與結(jié)論圖1顯示，在燒瓶實驗中，抗GDF-8細(xì)胞在培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2中的生長速率相似。
圖2顯示生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)基1的最終細(xì)胞密度和存活度相對于培養(yǎng)基3顯著增加。最終滴度也顯著增加，從平臺過程的551mg/L到培養(yǎng)基1的976mg/L(數(shù)據(jù)未示)。第5天時將溫度由37℃變?yōu)?1℃。由于未預(yù)料的高速細(xì)胞生長，在第5天后每日向培養(yǎng)物加入2％體積的20×培養(yǎng)基4或3％體積的16×培養(yǎng)基4。因此，這并非初始計劃的真正分批實驗。從第10天開始向補料培養(yǎng)基中補充天冬酰胺和硫胺素。
開發(fā)濃縮分批培養(yǎng)基時需要考慮幾個可能的問題。第一，濃縮的營養(yǎng)物可能對細(xì)胞有毒。本實施例開發(fā)的培養(yǎng)基中，已確認(rèn)所有營養(yǎng)物和成分都在毒性限度下(數(shù)據(jù)未示)。
第二，濃縮的分批培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度必定高于非濃縮培養(yǎng)基，會對細(xì)胞生長和存活力產(chǎn)生有害影響。可以通過降低起始培養(yǎng)基中的NaCl含量來解決這一問題。此外，濃縮分批培養(yǎng)基含有的葡萄糖水平不足以維持整個培養(yǎng)時期的生長。因此在第5天后，每天向培養(yǎng)物中補充葡萄糖補料。
第三，胰島素和谷氨酰胺容易在12天培養(yǎng)期間降解。因此，除葡萄糖之外還要向培養(yǎng)物補充這些成分。
最后，鐵在高pH值會從含高濃度磷酸鹽的溶液中沉淀出來。在培養(yǎng)基制備過程的最后，即pH值已調(diào)節(jié)至合適水平后，再加入鐵，可以解決這一問題。
實施例2補料分批方法中抗GDF-8細(xì)胞的濃縮補料培養(yǎng)基(培養(yǎng)基5)的開發(fā)實施例1開發(fā)了用培養(yǎng)基1培養(yǎng)抗GDF-8細(xì)胞的分批方法。由于此過程中產(chǎn)生了較高細(xì)胞密度，認(rèn)為補充除葡萄糖和谷氨酰胺以外的營養(yǎng)物仍然是有利的。然而，向分批培養(yǎng)基中添加8×補料培養(yǎng)基4會導(dǎo)致培養(yǎng)物的過度稀釋。為克服這一問題，開發(fā)了一種更為濃縮的補料培養(yǎng)基。
材料、方法與結(jié)果表2列出了用于表3-7的配方的培養(yǎng)基4A-1、培養(yǎng)基4B、微量元素B和微量元素D的成分。
表2.用于表3-7配方的培養(yǎng)基4A-1、培養(yǎng)基4B、微量元素B和微量元素D成分。
1.20×培養(yǎng)基4第一種開發(fā)的濃縮培養(yǎng)基是20×培養(yǎng)基4。表3中提供了20×培養(yǎng)基4的配方。
表3.20×補料培養(yǎng)基4的工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松、1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
該培養(yǎng)基配方由3個部分組成I、II、III。部分I為含有除葉酸以外培養(yǎng)基4B各個成分(考慮到該維生素的溶解性)的濃縮形式的8×培養(yǎng)基4。部分II為鐵貯存液、微量元素D和酸性半胱氨酸，以避免加入部分I中可能出現(xiàn)的鐵沉淀。部分III是葉酸貯存液。從第5天開始，每日添加2％體積的部分I，而部分II和部分III則在第5天時與部分I一同添加一次。
調(diào)節(jié)補料培養(yǎng)基的最終pH值為7.0，摩爾滲透壓濃度約為1064mOsm。2％的補料將導(dǎo)致培養(yǎng)物的葡萄糖升高2g/L，谷胺酰胺升高2mM以及摩爾滲透壓濃度升高14mOsm。
2.16×培養(yǎng)基4為減少摩爾滲透壓濃度的升高，補料培養(yǎng)基從20×培養(yǎng)基4(每日加入2％體積)變?yōu)?6×培養(yǎng)基4(每日加入3％體積)。16×培養(yǎng)基4的配方見表4。
表4.16×培養(yǎng)基4補料培養(yǎng)基工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松、1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
在此改良的16×培養(yǎng)基4中，也除去葡萄糖以進(jìn)一步降低摩爾滲透壓濃度并賦予葡萄糖補料的機動性。補料培養(yǎng)基的總摩爾滲透壓濃度現(xiàn)在為295mOsm。
3.16×培養(yǎng)基4對16×培養(yǎng)基4的配方進(jìn)行改變。向補料培養(yǎng)基中加入鐵貯存液使每次補料增加0.45μM。此外，又加回葡萄糖使每次補料增加1.5g/L。改良的16×培養(yǎng)基4的培養(yǎng)基配方見表5。
表5.16×培養(yǎng)基4補料培養(yǎng)基工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松、1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
4.16×培養(yǎng)基4此處，制備補料培養(yǎng)基(16×培養(yǎng)基4)為混合培養(yǎng)基，代替最近幾批中3種獨立的補料。測試以確保葉酸可以以所需濃度溶解，且在4℃或室溫存貯6天后，無論鐵還是葉酸都不會從溶液中沉淀。組合16×培養(yǎng)基4的培養(yǎng)基配方見表6。
表6.16×培養(yǎng)基4的補料培養(yǎng)基工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松，1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
該培養(yǎng)基的最終摩爾滲透壓濃度為724mOsm，每日加入2g/L葡萄糖和1.5mM的谷氨酰胺。
5.12X培養(yǎng)基4此處，對補料培養(yǎng)基進(jìn)行幾處改進(jìn)。采用培養(yǎng)基4B粉末代替加入培養(yǎng)基4B中的各單獨成分。將培養(yǎng)基4B粉末與葡萄糖混合，并通過滴定調(diào)節(jié)溶液pH為10.25，在堿性條件下分別溶解之。由于氨基酸和維生素分析結(jié)果顯示，天冬酰胺和硫胺素在補料分批方法的最后已經(jīng)耗盡，因此還要加入額外的這兩種成分。使用12X培養(yǎng)基4進(jìn)一步降低了向培養(yǎng)物補料時摩爾滲透壓濃度的升高。12X培養(yǎng)基4的培養(yǎng)基配方見表7。
表7.12X培養(yǎng)基4的補料培養(yǎng)基工作表
注NucellinTM由Eli Lilly(Indianapolis，IN，USA)制造；H/P貯存液＝0.036mg/mL氫化可的松，1.08mg/mL二鹽酸腐胺。
最終的摩爾滲透壓濃度為566mOsm。每日加入4％體積補料使摩爾滲透壓濃度提高約8.6，葡萄糖提高2g/L，谷氨酰胺提高1.5mM。12X培養(yǎng)基4配方即為培養(yǎng)基5。培養(yǎng)基5相對于20X培養(yǎng)基4或16X培養(yǎng)基4更易配制，且在室溫或4℃貯存10天以上保持穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未示)。
實施例3培養(yǎng)抗GDF-8細(xì)胞的谷氨酰胺饑餓的補料分批方法在起始培養(yǎng)基中CHO細(xì)胞需要谷氨酰胺才能存活。初始谷氨酰胺水平通常較高，且在第5天后每日都補料直至補料分批法結(jié)束。常規(guī)補料分批方法通常會造成細(xì)胞培養(yǎng)物中高水平的乳酸鹽和銨鹽，已知這會抑制細(xì)胞生長、細(xì)胞密度和重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。緩慢將葡萄糖加入培養(yǎng)物的補料分批方法，能夠減少乳酸鹽產(chǎn)生，并提高細(xì)胞生長、細(xì)胞密度和重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。然而，操作葡萄糖加入的該領(lǐng)域現(xiàn)有方法并不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。此處，通過采用含有較低起始水平谷氨酰胺的培養(yǎng)基并從補料中除去谷氨酰胺，顯示出能產(chǎn)生較低水平的銨鹽和乳酸鹽，從而增強細(xì)胞存活力。此外，谷氨酰胺饑餓的培養(yǎng)物中重組蛋白質(zhì)的表達(dá)提高，且最終的摩爾滲透壓濃度降低。
材料與方法株系和培養(yǎng)基以補料分批方式，于1L生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基1中培養(yǎng)抗GDF-8細(xì)胞。
培養(yǎng)條件在1L生物反應(yīng)器中使細(xì)胞生長12天。根據(jù)細(xì)胞生長狀況，在第4或第5天將溫度從37℃調(diào)為31℃。測試了三種補料分批方法正常(對照)方法、無谷氨酰胺補料方法和谷氨酰胺饑餓方法。這些方法的相關(guān)細(xì)節(jié)如表8和表9所列。
表8.在1L生物反應(yīng)器中無谷氨酰胺補料方法的補料分批方法
表9.在1L生物反應(yīng)器中谷氨酰胺饑餓方法的補料分批方法
樣品分析每日從培養(yǎng)物中取出樣品，并分析細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力、乳酸鹽、谷氨酰胺和銨鹽水平。每日也測定表達(dá)的抗GDF-8抗體滴度。
結(jié)果與結(jié)論圖3顯示了在無谷氨酰胺補料或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物的細(xì)胞密度。這兩種情況下，實驗過程中的細(xì)胞密度相近。
圖4顯示了在無谷氨酰胺補料或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物的細(xì)胞存活力百分?jǐn)?shù)。從第6天起到實驗結(jié)束，無谷氨酰胺補料的培養(yǎng)物的細(xì)胞存活度明顯增加。
圖5顯示了在無谷氨酰胺補料或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物的銨鹽水平。從第4天起到實驗結(jié)束，無谷氨酰胺補料的培養(yǎng)物的銨鹽水平明顯降低。
圖6顯示了在無谷氨酰胺補料或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。整個實驗過程中，無谷氨酰胺補料的培養(yǎng)物中乳酸鹽水平較低。
圖7顯示了在無谷氨酰胺補料或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物中的抗GDF-8抗體滴度。無谷氨酰胺補料的培養(yǎng)物中最終的抗GDF-8抗體滴度較高。
圖8顯示了在谷氨酰胺饑餓或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物的細(xì)胞密度。在這兩種情況下，實驗過程中的細(xì)胞密度相似。
圖9顯示了在谷氨酰胺饑餓或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物的細(xì)胞存活力。在這兩種情況下，實驗過程中細(xì)胞的存活力相似。
圖10顯示了在谷氨酰胺饑餓或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物的銨鹽水平。在實驗過程中谷氨酰胺饑餓培養(yǎng)物的銨鹽水平明顯降低。
圖11顯示了在谷氨酰胺饑餓或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。從第4天起到實驗結(jié)束，谷氨酰胺饑餓培養(yǎng)物的乳酸鹽水平明顯降低。
圖12顯示了在谷氨酰胺饑餓或?qū)φ昭a料分批條件下生長的培養(yǎng)物的抗GDF-8抗體滴度。谷氨酰胺饑餓的培養(yǎng)物中的最終抗-GDF-8抗體滴度較高。
綜合這些結(jié)果提示，谷氨酰胺水平的降低通過減少銨鹽產(chǎn)生量、提高細(xì)胞存活力、并增加表達(dá)的抗GDF-8抗體滴度，而對細(xì)胞培養(yǎng)物有利。此外，谷氨酰胺饑餓培養(yǎng)物中觀測到低乳酸鹽水平，可能是葡萄糖的消耗速率降低所致。降低的銨鹽和乳酸鹽水平也對減少總摩爾滲透壓濃度有效。已知摩爾滲透壓濃度的升高對細(xì)胞生長和存活有抑制作用。低起始水平谷氨酰胺加上除去谷氨酰胺的補料，對減少在貯存培養(yǎng)基中非酶解的谷氨酰胺降解導(dǎo)致的銨鹽產(chǎn)生，也具有正面效果。在補料中除去谷氨酰胺也簡化了抗GDF-8細(xì)胞的培養(yǎng)流程。
實施例4.培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2中抗GDF-8細(xì)胞的鐵劑量應(yīng)答培養(yǎng)基1的營養(yǎng)成分比培養(yǎng)基2濃很多。為避免在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的缺鐵問題，確定培養(yǎng)基1中細(xì)胞生長最佳的鐵水平。
材料與方法將抗GDF-8細(xì)胞在含有培養(yǎng)基1或培養(yǎng)基2的平皿上培養(yǎng)一代。通過加入不同量的鐵貯存溶液，操控這些培養(yǎng)基中的鐵濃度。用CEDEX測定最終細(xì)胞密度。
結(jié)果與結(jié)論圖13顯示了在含有不同鐵濃度的培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2中，抗GDF-8細(xì)胞的鐵劑量應(yīng)答。在培養(yǎng)基2中，鐵濃度在3μM至15μM間時細(xì)胞密度相對恒定。在培養(yǎng)基1中，細(xì)胞密度隨著鐵濃度增加，但在約5μM時達(dá)到最大。這種差異可能是由于培養(yǎng)基1中高濃度的營養(yǎng)物含量可能降低了細(xì)胞對鐵的利用度(鐵在培養(yǎng)基中被鰲合所致)。這些結(jié)果提示應(yīng)保持鐵水平大于5μM，以避免在培養(yǎng)基1中鐵缺乏的問題。
實施例5.在生物反應(yīng)器方法中用谷氨酸替代谷氨酰胺進(jìn)行三個實驗，測試在抗Lewis Y細(xì)胞培養(yǎng)過程中，用谷氨酸替代谷氨酰胺的效果。
材料與方法于10L生物反應(yīng)器中進(jìn)行這些實驗，pH 7.1、30％溶解氧、起始溫度為37℃，且在第5天變?yōu)?1℃。噴射和頂部氣體為88％的混合氣體(93％空氣/7％CO2)和12％氧氣。所有實驗中起始培養(yǎng)基均為含谷氨酰胺的培養(yǎng)基1。補料培養(yǎng)基和補料方案，包括補充的葡萄糖和谷氨酰胺補料見表10。標(biāo)記“谷氨酸”的欄以改良的培養(yǎng)基5補料，所述改良的培養(yǎng)基5不含谷氨酰胺，但含有與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基5中等摩爾濃度的谷氨酸。標(biāo)記谷氨酰胺的欄以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基5補料。
表10.補料方案
結(jié)果與結(jié)論如圖14所示，每一實驗中的細(xì)胞密度相似。由于實驗第3天的pH值偏離至約6.7，谷氨酰胺2和谷氨酸2實驗中的細(xì)胞密度較低。由于在第6天補入29％的培養(yǎng)基，導(dǎo)致谷氨酰胺3和谷氨酸3實驗在第6天和第7天之間細(xì)胞密度下降。
圖15顯示了在谷氨酸和谷氨酰胺補料培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活力。在含有谷氨酸補料培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中細(xì)胞的存活力在后半程中維持較高。
在實驗1中，谷氨酸和谷氨酰胺補料培養(yǎng)物中的抗Lewis Y滴度相似。圖16顯示了在實驗2和3中，谷氨酰胺補料反應(yīng)器中的抗Lewis Y滴度較低。觀察到的這些反應(yīng)器中較低的抗Lewis Y滴度，可能是由于產(chǎn)生了高水平的乳酸鹽，如圖17所示。
含有谷氨酸的補料培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中銨鹽濃度(圖18)和摩爾滲透壓濃度(圖19)較低。
利用結(jié)合ELISA測定檢測谷氨酰胺1和谷氨酸1實驗中樣品的活性。其活性相似谷氨酰胺1樣品為參照的110％，而谷氨酸1樣品為參照的122％(數(shù)據(jù)未示)。
在這些實驗中用谷氨酸代替谷氨酰胺，對于細(xì)胞密度沒有明顯影響。但是，細(xì)胞存活力在以谷氨酰胺補料的生物反應(yīng)器中較低。以谷氨酸補料的生物反應(yīng)器相對于以谷氨酰胺補料者，其中銨鹽、乳酸鹽和摩爾滲透壓濃度較低。平均而言，以谷氨酸補料的生物反應(yīng)器中抗Lewis Y滴度較高，而在兩種條件下活性基本相同。
實施例6.抗Lewis Y細(xì)胞培養(yǎng)過程中葡萄糖和谷氨酰胺的替換本實驗的目的在于，測試在培養(yǎng)抗Lewis Y細(xì)胞時以下表11列出的補料培養(yǎng)基的葡萄糖和谷氨酰胺進(jìn)行替換的效果(見Bogheart等人，Antibody-targeted chemotherapy with the calicheamicin conjugatehu3S193-N-acetyl gamma calicheamicin dimethyl hydrazide targets Lewisyand eliminates Lewisy-positive human carcinoma cells and xenografts，Clin.Can.Res.104538-49(2004))。測定細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力、抗Lewis Y滴度和銨鹽水平。
材料與方法于250ml搖瓶中進(jìn)行本實驗，起始體積75ml。所有搖瓶中都以0.25×106細(xì)胞/ml接種培養(yǎng)基2。于37℃含7％CO2的溫箱里溫育這些搖瓶14天。在第3天和第4天，向搖瓶中補入5％體積的補料培養(yǎng)基6。表11中列出了培養(yǎng)基6的成分。在第5-13天，向搖瓶中補入5％體積的表12中列出的補料溶液之一。每個條件進(jìn)行一式兩份重復(fù)。每日取樣品用CEDEX進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并檢測銨鹽、葡萄糖和乳酸鹽。
表11.培養(yǎng)基6的組成
表12.第5-13天的補料。不含葡萄糖和谷氨酰胺的改良培養(yǎng)基6。
結(jié)果與結(jié)論補料培養(yǎng)基中存在葡萄糖或半乳糖時，用谷氨酸或甘氨酰谷氨酰胺替代谷氨酰胺，細(xì)胞密度最高。一般在以葡萄糖/谷氨酰胺、半乳糖/谷氨酰胺、或僅葡萄糖為補料的培養(yǎng)物中細(xì)胞密度較低(圖20)。最終存活力在僅補料葡萄糖的培養(yǎng)物中最高，其次是以葡萄糖/谷氨酸補料的培養(yǎng)物。在補入與葡萄糖或半乳糖組合的谷氨酰胺或天冬酰胺的培養(yǎng)物中存活力最低(圖21)。
葡萄糖/甘氨酰谷氨酰胺和葡萄糖/谷氨酸補料培養(yǎng)物中，第14天的滴度最高，約為700μg/ml。在半乳糖/甘氨酰谷氨酰胺和半乳糖/天冬酰胺補料的培養(yǎng)物中滴度最低，約為500μg/ml。在葡萄糖/谷氨酰胺對照中滴度約為570μg/ml(圖22)。
在以葡萄糖/谷氨酸補料或僅以葡萄糖補料的搖瓶中銨鹽水平最低。半乳糖/谷氨酸、葡萄糖/谷氨酰胺、葡萄糖/甘氨酰谷氨酰胺和葡萄糖/天冬酰胺補料的搖瓶中銨鹽水平居中。以半乳糖/天冬酰胺、半乳糖/甘氨酰谷氨酰胺、和半乳糖/谷氨酰胺補料的搖瓶中銨鹽水平最高(圖23)。
直至第11天，所有補入半乳糖的搖瓶中葡萄糖水平均高于1g/L。從第11天到第14天，這些培養(yǎng)物中的葡萄糖從未被完全耗盡，保持在0.6-1g/L之間，在不同培養(yǎng)物之間無明顯差異。
直至第10天，以葡萄糖補料或與另一底物組合的葡萄糖補料的所有搖瓶中的葡萄糖水平均在增加。從第10天到第14天，這些培養(yǎng)物中的葡萄糖水平相當(dāng)恒定，且彼此類似。第14天時，在葡萄糖/谷氨酰胺補料培養(yǎng)物中還剩約8.4g/L葡萄糖，而在僅葡萄糖補料的培養(yǎng)物中，葡萄糖約為10.8g/L。
所有細(xì)胞的條件都相同時，乳酸鹽水平在第5天達(dá)到最高約2.4g/L，至第14天時所有培養(yǎng)物中均下降至接近零。葡萄糖/谷氨酰胺對照中的乳酸鹽水平從第10天至第14天最高，但在此期間低于1g/L(數(shù)據(jù)未示)。
該實驗中測試的所有條件都導(dǎo)致細(xì)胞密度高于葡萄糖/谷氨酰胺對照條件。除半乳糖/天冬酰胺條件外，所有測試條件都導(dǎo)致最終存活力高于葡萄糖/谷氨酰胺對照條件或半乳糖/谷氨酰胺補料條件。葡萄糖/谷氨酰胺對照中的滴度約為570μg/ml，相比而言，葡萄糖/甘氨酰谷氨酰胺補料條件和葡萄糖/谷氨酸補料條件的滴度較高，約為700μg/ml。
實施例7.對用谷氨酰胺饑餓的分批方法生產(chǎn)抗GDF-8的評估一般的補料分批生產(chǎn)方法需要在培養(yǎng)期間多步補料。這些補料旨在取代培養(yǎng)基中可能被細(xì)胞消耗或可能在分批(培養(yǎng))過程中降解的營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)此方法擴大用于較大反應(yīng)器時，這些補料可能會使情況復(fù)雜化，如需要葉輪竄動(見圖24)。此外，這些補料稀釋了已分泌到培養(yǎng)物中的抗GDF-8的量，從而影響收集滴度。使用分批方法，可以用全部體積而非部分體積的生物反應(yīng)器來接種以容納補料，從而不必使用葉輪竄動，并大幅減少對生產(chǎn)率的任何稀釋作用。
谷氨酰胺是采用補料分批方法的最重要的原因之一，因為它在37℃不穩(wěn)定，且被認(rèn)為需要在分批培養(yǎng)過程中進(jìn)行補充。然而測試谷氨酰胺饑餓策略的實施例2、5和6的結(jié)果顯示，相對于與谷氨酰胺補料的對照反應(yīng)器，生產(chǎn)率明顯提高。將本結(jié)果與分批方法組合，產(chǎn)生了本實施例測試的谷氨酰胺饑餓的分批方法。
材料與方法根據(jù)以下四個生長條件，使抗GDF-8細(xì)胞在1L生物反應(yīng)器中生長12天。設(shè)置所有條件下的生物反應(yīng)器參數(shù)都相同。利用空氣噴射維持溶解氧不低于23％的空氣飽和度，通過加入含有0.58M碳酸氫鈉和0.71M碳酸鈉的溶液，維持pH值為7.00。在前4天分批培養(yǎng)時所有培養(yǎng)物的溫度都維持在37℃。分批培養(yǎng)的第4天，將所有生物反應(yīng)器的溫度降為31℃，且整個分批培養(yǎng)期間維持此溫度。分別在第5、7和10天向?qū)φ张囵B(yǎng)物和補料分批培養(yǎng)物加入占總反應(yīng)器體積8％、12％和8％的相應(yīng)補料培養(yǎng)基。
1)對照.
-在培養(yǎng)基7上接種(見表13)。
-第5、7、10天時加入培養(yǎng)基8(見表13)。
-第4天時加入5mM谷氨酰胺。
-第4天將溫度降至31℃。
2)谷氨酰胺饑餓的分批補料-在僅含4mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基7上接種(見表13)。
-第5、7、10天時加入不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基8(見表13)。
-第4天不添加谷氨酰胺。
-第4天將溫度降至31℃。
3)分批谷氨酰胺饑餓-在僅含4mM谷氨酰胺的新分批培養(yǎng)基上接種(見表13)。
-無補料培養(yǎng)基。
-不添加谷氨酰胺。
-第4天將溫度降至31℃。
-第8天時加入5g/L葡萄糖。
4)在第8天補充的分批谷氨酰胺饑餓-在僅含4mM谷氨酰胺的新分批培養(yǎng)基上接種(見表13)。
-無補料培養(yǎng)基。
-不添加谷氨酰胺。
-第4天將溫度降至31℃。
-第8天時加入4g葡萄糖、375mg天冬酰胺、1mM FeSO4貯存溶液3mL、5g/L NucellinTM溶液3.33mL、36mg/L氫化可的松2.57mL和1.0g/L腐胺貯存溶液、50mg/L亞硒酸鈉貯存溶液0.23mL，以及13.1mg的硫胺素。
表13.所用培養(yǎng)基的成分
結(jié)果與結(jié)論對照和分批方法中前4天的細(xì)胞生長相似，而谷氨酰胺饑餓的分批補料方法中細(xì)胞密度稍低，并且在其后的分批過程中保持稍低。兩種分批方法在分批期間都維持了較高的細(xì)胞密度，可能是由于不存在任何明顯的稀釋作用(見圖25)。直到第8天，所有培養(yǎng)物的存活力相同。然而有意思的是，未補充的分批方法在第11天時的存活力低于其它三個生物反應(yīng)器，且至最后一天時顯著偏低。這提示還能最優(yōu)化分批培養(yǎng)基，因為補充的分批方法具有和補料分批的生物反應(yīng)器相同的存活力(見圖26)。
谷氨酰胺饑餓的分批方法或谷氨酰胺饑餓的補料分批方法中培養(yǎng)的細(xì)胞，生產(chǎn)率都比在對照補料分批方法培養(yǎng)的相同細(xì)胞要高。對照補料分批方法的日收集滴度如預(yù)期為685μg/mL，而谷氨酰胺饑餓的補料分批方法的日收集滴度為1080μg/mL，比對照高出約58％。這與前面所見到的結(jié)果類似。谷氨酰胺饑餓的非補充分批方法的日收集滴度為960μg/mL，比對照高40％，與谷氨酰胺饑餓的補料分批方法相似，而補充的谷氨酰胺饑餓的分批方法具有最高滴度1296μg/mL。比對照高出89％(見圖27)。
分析四種條件下抑制劑的水平，結(jié)果顯示所有三種谷氨酰胺饑餓的方法中，乳酸鹽和銨鹽水平都明顯低于對照。事實上，這三個條件在第4天后都不再產(chǎn)生或者開始消耗乳酸鹽，而對照還在分批過程中繼續(xù)產(chǎn)生乳酸(見圖28)。如預(yù)期的那樣，谷氨酰胺饑餓方法中的銨鹽水平低得多并在4天后下降，而對照則持續(xù)產(chǎn)生銨鹽(見圖29)。
本實施例中，將谷氨酰胺饑餓的策略與分批方法相結(jié)合，可使抗GDF-8細(xì)胞生產(chǎn)率比對照的補料分批方法提高40％。數(shù)據(jù)也提示，對分批培養(yǎng)基做一些優(yōu)化，可以獲得幾乎2倍提高的生產(chǎn)率。生產(chǎn)率的提高可以歸于兩個因素。第一，谷氨酰胺饑餓可直接或通過控制銨鹽和乳酸鹽于低水平而提高生產(chǎn)率。第二，由于缺乏補料，分批過程中的滴度沒有被稀釋。生產(chǎn)率的提高以及分批過程本身的易于操作，使其成為生產(chǎn)重組多肽的有利選擇。
實施例8.抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)過程中，分批培養(yǎng)基中谷氨酰胺和天冬酰胺濃度的效果在實施例2、5和6中，已經(jīng)證實谷氨酰胺的饑餓對于兩種細(xì)胞系的補料分批培養(yǎng)有益，包括促進(jìn)細(xì)胞生長、細(xì)胞存活力和滴度，以及降低乳酸鹽和銨鹽的產(chǎn)生。天冬酰胺似乎也在分批培養(yǎng)基中發(fā)揮作用。
材料與方法在1L生物反應(yīng)器中含不同濃度谷氨酰胺和天冬酰胺的改良培養(yǎng)基9內(nèi)培養(yǎng)抗GDF-8細(xì)胞。表14列出了培養(yǎng)基9的基本成分。表15列出了這些基本成分的實驗變量。除了4號反應(yīng)器的溫度在第一天因溫度控制問題為30℃外，前5天在37℃溫育培養(yǎng)物。第6天時將培養(yǎng)物變至31℃。第7天時，向培養(yǎng)物中一次補加5％體積的不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基5。每日測定培養(yǎng)物的細(xì)胞密度、抗GDF-8滴度、乳酸鹽和銨鹽水平。
表14.培養(yǎng)基9的成分
表15.測試的谷氨酰胺和天冬酰胺條件
結(jié)果與結(jié)論圖30、31、32和33分別顯示了在多種實驗條件下，整個實驗過程中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長、抗GDF-8滴度、乳酸鹽水平和銨鹽水平。
在所有實驗條件中，所有測試的天冬酰胺水平下，4mM谷氨酰胺都優(yōu)于1mM谷氨酰胺。谷氨酰胺水平相當(dāng)時，12mM和20mM天冬酰胺條件優(yōu)于8mM的天冬酰胺條件。在培養(yǎng)終末期，可見所有測試條件下乳酸鹽和NH4水平都降低。
實施例9.分批培養(yǎng)基中谷氨酰胺和天冬酰胺的濃度對抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)方法的作用實施例8證實了無論天冬酰胺的水平如何，谷氨酰胺初始濃度為4mM的培養(yǎng)基9優(yōu)于含谷氨酰胺1mM的培養(yǎng)基。本實施例說明了含13mM谷氨酰胺和不同水平天冬酰胺的培養(yǎng)基的效果。
材料與方法如表16中所列，于1L生物反應(yīng)器含不同濃度的谷氨酰胺和天冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中，培養(yǎng)抗GDF-8細(xì)胞12天。最初3天在37℃溫育培養(yǎng)物。然后第4天將培養(yǎng)物變?yōu)?1℃。第7天時向培養(yǎng)物中一次補加5％體積的不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基5。定期測量培養(yǎng)物的細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力、乳酸鹽、銨鹽水平和谷氨酰胺水平、抗GDF-8滴度和摩爾滲透壓濃度。
表16.測試的谷氨酰胺和天冬酰胺條件
結(jié)果與結(jié)論圖34、35、36、37、38、39和40分別顯示了在多種實驗條件下，整個實驗期間抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長、抗GDF-8細(xì)胞的存活力百分比、乳酸鹽水平、銨鹽水平、谷氨酰胺水平、抗GDF-8滴度和摩爾滲透壓濃度。
在所有測試的條件下，只有含13mM谷氨酰胺和20mM天冬酰胺的培養(yǎng)基9，對細(xì)胞生長和滴度具有顯著的負(fù)作用。無論培養(yǎng)物起始谷氨酰胺是4mM還是13mM，所有培養(yǎng)物中的谷氨酰胺都約同時耗盡。含13mM谷氨酰胺和12mM天冬酰胺的培養(yǎng)物中抗GDF-8的滴度最高。所有培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)末期的乳酸鹽和銨鹽水平都降低。含有13mM谷氨酰胺和20mM天冬酰胺的培養(yǎng)物中的銨鹽水平最高。
實施例10.天冬酰胺和半胱氨酸的水平對在培養(yǎng)基9中培養(yǎng)的抗GDF-8細(xì)胞中觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平降低的影響實施例2、5和6中，發(fā)現(xiàn)在谷氨酰胺饑餓條件下生長的培養(yǎng)物，培養(yǎng)末期乳酸鹽和銨鹽的水平降低。但在非谷氨酰胺饑餓條件生長于培養(yǎng)基9的培養(yǎng)物，在培養(yǎng)過程末期仍然有乳酸鹽和銨鹽水平的降低。在其他培養(yǎng)基如培養(yǎng)基1中沒有觀察到這一效應(yīng)，似乎谷氨酰胺饑餓對于乳酸和銨鹽水平的降低是必需的。培養(yǎng)基9和培養(yǎng)基1的天冬酰胺(培養(yǎng)基9為20mM，而培養(yǎng)基1含補料共計為11mM)和酸性胱氨酸(培養(yǎng)基9為1.5mM，而培養(yǎng)基1為0.95mM)的水平不同。本實施例測試了這兩種成分是否與在培養(yǎng)末期觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平的降低有關(guān)。
材料與方法將抗GDF-8細(xì)胞在1L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)12天。最初在37℃培養(yǎng)細(xì)胞，第4天或第5天在8-10×106/ml時變?yōu)?1℃。表17列出了測試的多種實驗條件。每日取出樣本，留作蛋白質(zhì)A HPLC滴度分析。
表17.測試的天冬酰胺和半胱氨酸條件
注培養(yǎng)基5-Gln＝不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基5.
結(jié)果與結(jié)論無論培養(yǎng)物中的起始谷氨酰胺濃度是4mM或13mM，培養(yǎng)基9中生長的抗GDF-8細(xì)胞在培養(yǎng)過程末期的乳酸鹽和銨鹽的水平都有降低(見圖42和圖43)。與之相反，僅當(dāng)培養(yǎng)物中起始谷氨酰胺為4mM時，培養(yǎng)基1才在培養(yǎng)過程末期出現(xiàn)乳酸鹽和銨鹽水平的降低(見圖42和圖43)。向培養(yǎng)基1中添加額外的天冬酰胺和半胱氨酸，不會造成培養(yǎng)末期乳酸鹽和銨鹽水平的降低(見圖42和圖43)。
在培養(yǎng)過程末期出現(xiàn)乳酸鹽和銨鹽水平降低的培養(yǎng)物(含4mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基1，含4mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基9和含13mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基9)，在培養(yǎng)過程末期也具有較低的總摩爾滲透壓濃度(見圖47)。
含4mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基9抗GDF-8滴度最高，其次為在第4天加入13mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基9(見圖46)?？紤]到補料的稀釋效應(yīng)，含4mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基9與含有13mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基9具有相同的抗GDF-8滴度。
實施例11.氨基酸和維生素水平對培養(yǎng)基9培養(yǎng)的抗GDF-8細(xì)胞中觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平下降的影響實施例10測試了培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基9間天冬酰胺和半胱氨酸水平的差別是否造成了非谷氨酰胺饑餓的培養(yǎng)基9在培養(yǎng)過程末期乳酸鹽和銨鹽水平的降低。已經(jīng)確定這些因素并不會造成所觀測的降低。培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基9的氨基酸和維生素濃度也有差異。本實施例測試了這兩種培養(yǎng)基間氨基酸和維生素濃度的差別是否造成了觀察到的降低。
材料與方法將抗GDF-8細(xì)胞在1L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)12天。最初在37℃培養(yǎng)細(xì)胞，第4天在8-10×106細(xì)胞/ml時變?yōu)?1℃。表18列出了測試的多種實驗條件。在多種實驗條件下的培養(yǎng)基1中添加氨基酸、維生素、氫化可的松和腐胺、微量元素E(表19列出的成分)和鐵，使這些成分的水平與培養(yǎng)基9中相同。每日取出樣本，留作蛋白質(zhì)A HPLC滴度分析。
表18.測試的氨基酸和維生素條件
注AA＝氨基酸，H/P＝0.036mg/mL氫化可的松、1.08mg/mL二鹽酸腐胺、E微量元素E。
表19.微量元素E的成分
結(jié)果與結(jié)論除了含有添加氨基酸的培養(yǎng)基1，所有測試條件都出現(xiàn)了培養(yǎng)過程末期乳酸鹽和銨鹽水平的降低，說明與培養(yǎng)基1相比，培養(yǎng)基9中升高的氨基酸水平可能不是造成乳酸鹽和銨鹽水平下降的原因(見圖49和50)。然而，含有添加維生素、氫化可的松和腐胺、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基1，相對于含有添加了氨基酸的培養(yǎng)基1，培養(yǎng)過程末期乳酸鹽和銨鹽水平更低(見圖49和50)。說明這些成分可能造成了培養(yǎng)基9中觀察到的降低。
在含有添加維生素、氫化可的松和腐胺、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基1中生長的培養(yǎng)物，在實驗過程中的銨鹽水平最低，因為在初始培養(yǎng)基中天冬酰胺和谷氨酰胺的總量較低(見圖50)。
實施例12.維生素、微量元素E和鐵水平對培養(yǎng)基9中培養(yǎng)的抗GDF-8細(xì)胞中觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平下降的影響實施例11確定了培養(yǎng)基9中相對培養(yǎng)基1升高的維生素、氫化可的松和腐胺、微量元素E和鐵可能造成了培養(yǎng)過程末期觀察到的乳酸鹽和銨鹽水平的降低。此處，對這些成分進(jìn)行獨立和組合測試，以確定哪個或哪些成分導(dǎo)致了觀察到的降低。
材料與方法將抗GDF-8細(xì)胞在1L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)12天。細(xì)胞最初培養(yǎng)于37℃，并于第4天8-10×106細(xì)胞/ml時變?yōu)?1℃(除了含有微量E元素的培養(yǎng)基1，其在第4天6×106細(xì)胞/ml時改變)。表20列出了測試的多種實驗條件。在所有實驗條件的培養(yǎng)基1中添加氫化可的松和腐胺，使得這些成分的水平與培養(yǎng)基9中相同。向多種實驗條件的培養(yǎng)基1中添加維生素、微量元素E(表19列出的成分)和鐵，使得這些成分的水平與培養(yǎng)基9中相同。每日取出樣本，留作蛋白質(zhì)A HPLC滴度分析。
表20.測試的氨基酸和維生素條件
注E微量元素E。
結(jié)果與結(jié)論在所有測試的條件下，只有含有13mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基9和含有微量元素E的培養(yǎng)基1，在培養(yǎng)過程末期乳酸鹽和銨鹽水平降低(見圖54和圖55)。應(yīng)當(dāng)注意的是，含有微量元素E的培養(yǎng)基1中觀察到的水平降低實際上可能是由于溫度改變時該培養(yǎng)物的細(xì)胞為6×106細(xì)胞/ml。
含有13mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基9的抗GDF-8滴度比任何配方的培養(yǎng)基1都高。
實施例13.培養(yǎng)基1、3和9在細(xì)胞生長和抗GDF-8滴度方面的比較進(jìn)行本實驗測量培養(yǎng)基1、3和9在細(xì)胞生長和抗GDF-8滴度方面的差異。
材料與方法在如表21所列的不同培養(yǎng)基和補料條件下培養(yǎng)抗GDF-8細(xì)胞。表22列出了相關(guān)培養(yǎng)基信息。在1L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞12天，第4天時將其從37℃轉(zhuǎn)變至31℃。
表21.測試的培養(yǎng)基和補料條件
注培養(yǎng)基5-Gln＝不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基5表22.培養(yǎng)基概述
注培養(yǎng)基5-Gln＝不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基5結(jié)果與結(jié)論培養(yǎng)基9中培養(yǎng)的抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞密度和抗GDF-8滴度最高，而培養(yǎng)基3中培養(yǎng)的抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞密度和抗GDF-8滴度最低(見圖57和圖58)。培養(yǎng)基9比培養(yǎng)基1的結(jié)果更好，提示在起始培養(yǎng)基中提供培養(yǎng)基成分優(yōu)于通過多步補料提供。此外，培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基9優(yōu)于培養(yǎng)基3，提示提供氨基酸濃度高于約70mM產(chǎn)生的效果優(yōu)于提供氨基酸濃度低于約70mM。最后，在起始培養(yǎng)基中提供氨基酸濃度高于約70mM，能產(chǎn)生最高的細(xì)胞密度和滴度(對比培養(yǎng)基9和培養(yǎng)基1)。
實施例14.用于生物反應(yīng)器中培養(yǎng)抗GDF-8細(xì)胞的培養(yǎng)基9的最佳谷氨酰胺和天冬氨?？偹降慕y(tǒng)計分析材料與方法使抗GDF-8細(xì)胞生長于1L生物反應(yīng)器，并于表23中所述的天數(shù)時將其從37℃變?yōu)?1℃。對最終滴度進(jìn)行T檢驗，以確定僅谷氨酰胺的最佳水平和谷氨酰胺與天冬酰胺組合的最佳總水平。表23總結(jié)了在培養(yǎng)基9中生長的抗GDF-8細(xì)胞的一些相關(guān)實驗條件和最終結(jié)果。
表23.培養(yǎng)基9中生長的抗-GDF-8細(xì)胞的相關(guān)實驗條件和最終結(jié)果
注培養(yǎng)基5-Gln＝不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基5結(jié)果與結(jié)論圖59顯示了僅谷氨酰胺和谷氨酰胺與天冬酰胺總組合的多種水平下的外推抗GDF-8滴度。表24為比較谷氨酰胺水平為2至15mM間以及此范圍外的標(biāo)準(zhǔn)化滴度的T檢驗結(jié)果。表25為比較組合谷氨酰胺和天冬酰胺水平為16至36mM之間以及此范圍外的標(biāo)準(zhǔn)化滴度的T檢驗結(jié)果。
兩次T檢驗結(jié)果均顯示，比較的兩組間抗GDF-8滴度存在顯著差異。在含2-15mM濃度的谷氨酰胺且16-36mM濃度的組合谷氨酰胺和天冬酰胺的培養(yǎng)基9中生長的培養(yǎng)物，相對于在含谷氨酰胺及組合谷氨酰胺和天冬酰胺水平在此范圍外培養(yǎng)基中生長的培養(yǎng)物，抗GDF-8滴度較高。在所有實驗中天冬酰胺的水平都高于9mM。
表24.比較2mM＜Gln＜15mM和Gln＞15mM、Gln＜2mM條件下標(biāo)準(zhǔn)化滴度的T檢驗結(jié)果
表25.比較16mM＜Gln+Asn＜36mM和Gln+Asn＞36mM、Gln+Asn＜16mM條件下標(biāo)準(zhǔn)化滴度的T檢驗結(jié)果
實施例15.培養(yǎng)基對細(xì)胞培養(yǎng)的影響該實施例研究了在中等規(guī)模下，用高密度接種培養(yǎng)的三種細(xì)胞培養(yǎng)基變量的表現(xiàn)?；谛∫?guī)模的生物反應(yīng)器數(shù)據(jù)，預(yù)期所有測試培養(yǎng)基都比1期培養(yǎng)基(添加了11號補料培養(yǎng)基的培養(yǎng)基10)有所改進(jìn)。
材料與方法如表26所示，在不同的培養(yǎng)基中測試表達(dá)人源化抗Aβ肽IgG1單克隆抗體的CHO細(xì)胞(“抗Aβ細(xì)胞”)(見Basi等人，Humanized Antibodiesthat Recognize Beta Amyloid Peptide，WO02/46237)。pH值的低端設(shè)置點為7.0，除1期中由含0.58M碳酸氫鈉和0.71M碳酸鈉控制外，均通過0.95M Na2CO3和0.05M K2CO3控制。根據(jù)需要利用空氣噴射控制溶解氧為30％；以60rpm攪拌，補料培養(yǎng)基為培養(yǎng)基5(如所示，含或不含谷氨酰胺)。所有培養(yǎng)物都以130L的規(guī)模生長，僅03P49B501以500L規(guī)模生長。簡言之，培養(yǎng)基1富集了各種營養(yǎng)物質(zhì)而不考慮相對吸收率，而培養(yǎng)基12從不加選擇的富集形式中去除了顯然為非必需的營養(yǎng)物而達(dá)到平衡。
表27列出了培養(yǎng)基10、11和12的成分。
表26.初步試驗的起始培養(yǎng)基、補料量和接種來源
*1期過程中添加不如培養(yǎng)基5富集的培養(yǎng)基12。
表27.培養(yǎng)基10、11和12的成分
結(jié)果與結(jié)論培養(yǎng)基的改變引發(fā)了實驗過程中的穩(wěn)步改善。就細(xì)胞生長、存活力、乳酸鹽水平的降低、銨鹽水平的降低和滴度而言，谷氨酰胺水平低的培養(yǎng)基優(yōu)于升高者(見圖60-64)，而平衡型(分批)的培養(yǎng)基優(yōu)于富集型培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1，見圖60-64)。高密度接種物起始的培養(yǎng)物相對于低密度接種物起始的培養(yǎng)物，最終滴度更高(見圖64)。
和小規(guī)模生物反應(yīng)器中觀察到的不同，第一種培養(yǎng)基(含高谷氨酰胺的培養(yǎng)基1)產(chǎn)生的滴度比原始過程低(見圖64)。改變溫度后乳酸鹽的攝取也不變(見圖62)。這提示該培養(yǎng)基可能具有規(guī)模敏感性。與這些中等規(guī)模實驗同時進(jìn)行的小規(guī)模(2L)平行實驗支持該結(jié)論(數(shù)據(jù)未示)。至少在這些實驗中，其后含有較少谷氨酰胺的培養(yǎng)基配方對規(guī)模不敏感(見圖60-65)。一式兩份重復(fù)的這些過程(分批2和3，以及分批5和6)顯示了良好的試驗重復(fù)性(見圖60-65)，提高了該實驗收集的數(shù)據(jù)的可靠性。
實施例16.用培養(yǎng)基9生產(chǎn)TNFR-Ig材料與方法將表達(dá)二聚體融合蛋白的CHO細(xì)胞(“TNFR-Ig細(xì)胞”)，從灌流式生物反應(yīng)器中以高密度接種至培養(yǎng)基9，并稀釋至3×106活細(xì)胞/ml，用于生產(chǎn)生物反應(yīng)器步驟；所述融合蛋白由人75千道爾頓(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)胞外配基結(jié)合部分連接至IgG1的Fc部分組成。
結(jié)果與結(jié)論圖66、67、68、69、70、71和72分別顯示了細(xì)胞生長、細(xì)胞存活力、殘留葡萄糖、谷氨酰胺水平、乳酸鹽濃度、銨鹽濃度和相對產(chǎn)物滴度。對該過程進(jìn)行較小修飾的范圍內(nèi)，所有條件都能得到較好的細(xì)胞生長、高細(xì)胞存活力和高最終總滴度。
對于本實驗的所有條件，抑制性代謝副產(chǎn)物乳酸鹽或被消耗，或濃度穩(wěn)定，提示乳酸鹽產(chǎn)生受抑。與之類似，抑制性代謝產(chǎn)物銨鹽起初水平上升，但溫度改變后一段時間，銨鹽開始被細(xì)胞消耗。在本實施例中，使TNFR-Ig細(xì)胞培養(yǎng)物置于化學(xué)誘導(dǎo)物丁酸鈉和HMBA中。
實施例17.大規(guī)模和小規(guī)模培養(yǎng)條件的比較材料與方法為確定培養(yǎng)物的規(guī)模是否影響相關(guān)的培養(yǎng)物特性，使抗GDF-8細(xì)胞在小規(guī)模1升生物反應(yīng)器或大規(guī)模6000升生物反應(yīng)器中生長。細(xì)胞在37℃生長并在第4天變?yōu)?1℃。
結(jié)果與結(jié)論如圖73、74、75和76所示(分別顯示了細(xì)胞密度、滴度、乳酸鹽水平和銨鹽水平)，這些特性在6000升大規(guī)模和1升小規(guī)模培養(yǎng)之間沒有相應(yīng)差異。第4天改變溫度后，乳酸鹽和銨鹽水平都開始下降。該實施例證實，當(dāng)培養(yǎng)物在相同的生長條件下時，培養(yǎng)物的規(guī)模并不影響細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力、乳酸鹽水平和銨鹽水平。
權(quán)利要求
1.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的培養(yǎng)基，其具有選自以下的培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(v)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
2.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM的培養(yǎng)基且所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項培養(yǎng)基特征及其組合(i)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(ii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iii)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
3.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2的培養(yǎng)基；且所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積培養(yǎng)基中含有累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iii)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
4.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2的培養(yǎng)基；且所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積培養(yǎng)基中含有累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
5.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1的培養(yǎng)基，且所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積培養(yǎng)基中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
6.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM的培養(yǎng)基；且所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積培養(yǎng)基中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述改變至少一個培養(yǎng)條件步驟中的所述細(xì)胞培養(yǎng)條件選自(i)溫度，(ii)pH，(iii)重量摩爾滲透壓濃度，(iv)化學(xué)誘導(dǎo)物水平，及其組合。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于13mM。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于10mM。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于7mM。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于4mM。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于13mM。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于10mM。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于7mM。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于4mM。
16.權(quán)利要求1的方法，其中僅在細(xì)胞培養(yǎng)初始向起始培養(yǎng)基提供谷氨酰胺。
17.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基中可溶性鐵的濃度大于5μM。
18.權(quán)利要求1的方法，其中周期性測量所述培養(yǎng)物中的活細(xì)胞密度。
19.權(quán)利要求1的方法，其中周期性測量所述培養(yǎng)物的存活力。
20.權(quán)利要求1的方法，其中周期性測量所述培養(yǎng)物中的乳酸鹽水平。
21.權(quán)利要求1的方法，其中周期性測量所述培養(yǎng)物中的銨鹽水平。
22.權(quán)利要求1的方法，其中周期性測量所述培養(yǎng)物的滴度。
23.權(quán)利要求1的方法，其中周期性測量所述培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。
24.權(quán)利要求18-23的方法，其中所述測量每日進(jìn)行。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞的起始密度至少為2×102細(xì)胞/mL。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞的起始密度至少為2×103細(xì)胞/mL。
27.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞的起始密度至少為2×104細(xì)胞/mL。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞的起始密度至少為2×105細(xì)胞/mL。
29.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞的起始密度至少為2×106細(xì)胞/mL。
30.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞的起始密度至少為5×106細(xì)胞/mL。
31.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞的起始密度至少為10×106細(xì)胞/mL。
32.權(quán)利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約1000L培養(yǎng)物。
33.權(quán)利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約2500L培養(yǎng)物。
34.權(quán)利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約5000L培養(yǎng)物。
35.權(quán)利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約8000L培養(yǎng)物。
36.權(quán)利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約10,000L培養(yǎng)物。
37.權(quán)利要求1的方法，其中提供的步驟包括提供至少約12,000L培養(yǎng)物。
38.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為30至42攝氏度的第一溫度范圍。
39.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為32至40攝氏度的第一溫度范圍。
40.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為34至38攝氏度的第一溫度范圍。
41.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為36至37攝氏度的第一溫度范圍。
42.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一組條件包括約為37攝氏度的第一溫度范圍。
43.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為25至41攝氏度的第二溫度范圍。
44.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為27至38攝氏度的第二溫度范圍。
45.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為29至35攝氏度的第二溫度范圍。
46.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為29至33攝氏度的第二溫度范圍。
47.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為30至32攝氏度的第二溫度范圍。
48.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二組條件包括約為31攝氏度的第二溫度范圍。
49.權(quán)利要求1的方法，還包括繼第一次改變至少一個培養(yǎng)條件后的第二次改變步驟，包括改變至少一個培養(yǎng)條件，從而向培養(yǎng)物應(yīng)用第三組條件。
50.權(quán)利要求49的方法，其中第二次改變步驟包括改變選自以下的至少一個培養(yǎng)條件及其組合(i)溫度，(ii)pH，(iii)重量摩爾滲透壓濃度，(iv)化學(xué)誘導(dǎo)物水平。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為25至40攝氏度的第三溫度范圍。
52.權(quán)利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為27至37攝氏度的第三溫度范圍。
53.權(quán)利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為29至34攝氏度的第三溫度范圍。
54.權(quán)利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為30至32攝氏度的第三溫度范圍。
55.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一段時間為0-8天。
56.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一段時間為1-7天。
57.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一段時間為2-6天。
58.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一段時間為3-5天。
59.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一段時間為約4天。
60.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一段時間為約5天。
61.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一段時間為約6天。
62.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一段時間和所述第二段時間的總長度為至少5天。
63.權(quán)利要求1的方法，其中在維持所述培養(yǎng)物的第二段時間的步驟中，乳酸鹽水平繼培養(yǎng)物中乳酸鹽水平達(dá)到最大水平后下降。
64.權(quán)利要求1的方法，其中在維持所述培養(yǎng)物的第二段時間的步驟中，銨鹽水平繼培養(yǎng)物中銨鹽水平達(dá)到最大水平后下降。
65.權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)生多肽的總量比在除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下生產(chǎn)多肽總量高至少1.5倍。
66.權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)生多肽的總量比在除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下生產(chǎn)多肽總量高至少2倍。
67.權(quán)利要求1的方法，其中還向所述細(xì)胞培養(yǎng)物提供增補成分。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述增補成分于多個時間間隔加入。
69.權(quán)利要求67的方法，其中所述增補成分選自激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂質(zhì)或葡萄糖或其他能源。
70.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基具有至少兩項選自以下的培養(yǎng)基特征(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)無機離子與總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
71.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基具有至少三項選自以下的培養(yǎng)基特征(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)無機離子與總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
72.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基具有至少四項選自以下的培養(yǎng)基特征(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)無機離子與總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
73.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，其特征在于(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)無機離子與總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
74.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，且其每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM；將所述培養(yǎng)物在起始生長階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長的第一段時間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20％-80％范圍；改變至少一個培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
75.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包括含有谷氨酰胺的培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基具有選自以下的培養(yǎng)基特征及其組合(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)起始谷氨酰胺與起始天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)起始谷氨酰胺與起始總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)起始無機離子與起始總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合起始濃度大于約16mM。
76.權(quán)利要求1-6或70-75中任一項的方法，其中乳酸鹽水平低于除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下的觀測水平；銨鹽水平低于除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下的觀測水平；且產(chǎn)生多肽的總量至少與除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下所觀測的一樣高。
77.權(quán)利要求1的方法，其中在生產(chǎn)所述多肽的過程中不向所述培養(yǎng)物中添加額外成分。
78.權(quán)利要求1的方法，其中在生產(chǎn)所述多肽的過程中不向所述培養(yǎng)物中添加額外的谷氨酰胺。
79.權(quán)利要求1的方法，其中在轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙M培養(yǎng)條件的所述步驟前，所述培養(yǎng)物中谷氨酰胺濃度基本耗盡。
80.權(quán)利要求1的方法，其中大約在轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙M培養(yǎng)條件的所述步驟的同時，所述培養(yǎng)物中谷氨酰胺濃度基本耗盡。
81.權(quán)利要求1的方法，其中用甘氨酰谷氨酰胺替代所述培養(yǎng)物中的谷氨酰胺。
82.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基含有(i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iv)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(v)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM。
83.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基含有(i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2，(iii)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM。
84.權(quán)利要求1的方法，其中每單位體積所述培養(yǎng)基中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的累積總量大于約25mM。
85.權(quán)利要求1的方法，其中每單位體積所述培養(yǎng)基中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的累積總量大于約35mM。
86.權(quán)利要求1的方法，其中每單位體積所述培養(yǎng)基中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的起始總量大于約25mM。
87.權(quán)利要求1的方法，其中每單位體積所述培養(yǎng)基內(nèi)組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的起始總量大于約35mM。
88.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基具有選自以下的培養(yǎng)基特征(i)每單位體積中組氨酸累積總量大于約1.7mM；(ii)每單位體積中異亮氨酸累積總量大于約3.5mM；(iii)每單位體積中亮氨酸累積總量大于約5.5mM；(iv)每單位體積中甲硫氨酸累積總量大于約2.0mM；(v)每單位體積中苯丙氨酸累積總量大于約2.5mM；(vi)每單位體積中脯氨酸累積總量大于約2.5mM；(vii)每單位體積中色氨酸累積總量大于約1.0mM；(viii)每單位體積中酪氨酸累積總量大于約2.0mM；和(ix)每單位體積中脯氨酸累積總量大于約2.5mM。
89.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基具有選自以下的培養(yǎng)基特征(i)每單位體積中組氨酸起始量大于約1.7mM；(ii)每單位體積中異亮氨酸起始量大于約3.5mM；(iii)每單位體積中亮氨酸起始量大于約5.5mM；(iv)每單位體積中甲硫氨酸起始量大于約2.0mM；(v)每單位體積中苯丙氨酸起始量大于約2.5mM；(vi)每單位體積中脯氨酸起始量大于約2.5mM；(vii)每單位體積中色氨酸起始量大于約1.0mM；(viii)每單位體積中酪氨酸起始量大于約2.0mM；和(ix)每單位體積中脯氨酸起始量大于約2.5mM。
90.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積絲氨酸累積總量大于約7mM。
91.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積絲氨酸累積總量大于約10mM。
92.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積天冬酰胺累積總量大于約8mM。
93.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積天冬酰胺累積總量大于約12mM。
94.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積天冬酰胺起始總量大于約8mM。
95.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積天冬酰胺起始總量大于約12mM。
96.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積磷的累積總量大于約2.5mM。
97.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積磷的累積總量大于約5mM。
98.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積谷氨酸的累積總量小于約1mM。
99.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積泛酸鈣的累積總量大于約8mg/L。
100.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積泛酸鈣的累積總量大于約20mg/L。
101.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積煙酰胺的累積總量大于約7mg/L。
102.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積煙酰胺的累積總量大于約25mg/L。
103.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積吡哆醇和吡哆醛的累積總量大于約5mg/L。
104.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積吡哆醇和吡哆醛的累積總量大于約35mg/L。
105.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積核黃素的累積總量大于約1.0mg/L。
106.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積核黃素的累積總量大于約2.0mg/L。
107.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積鹽酸硫胺素的累積總量大于約7mg/L。
108.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積鹽酸硫胺素的累積總量大于約35mg/L。
109.權(quán)利要求1-23或權(quán)利要求25-75或權(quán)利要求77-108中任一項的方法，其中所述多肽為抗GDF-8。
110.權(quán)利要求1-23或權(quán)利要求25-75或權(quán)利要求77-108中任一項的方法，其中所述多肽為抗LewY。
111.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽為抗GDF-8。
112.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽為抗LewY。
113.權(quán)利要求76的方法，其中所述多肽為抗GDF-8。
114.權(quán)利要求76的方法，其中所述多肽為抗LewY。
全文摘要
(本發(fā)明)提供在細(xì)胞培養(yǎng)物中大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)和/或多肽的改良系統(tǒng)，特別是在具有下列一項或多項特征的培養(yǎng)基中i)累積氨基酸濃度大于約70mM；ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2；iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2；iv)累積無機離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1；或v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積濃度在約16mM和36mM之間。此類系統(tǒng)的應(yīng)用使能夠產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)，并減少某些不良因子如銨鹽和/或乳酸鹽的蓄積。此外，(本發(fā)明)還提供了包括溫度改變的培養(yǎng)方法，通常包括當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到其最大細(xì)胞密度約20－80％時降低溫度。備選地或額外地，本發(fā)明提供了使培養(yǎng)物中乳酸鹽和/或銨鹽水平達(dá)到峰值后降低的方法。
文檔編號C07K16/30GK101048511SQ200580036899
公開日2007年10月3日 申請日期2005年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者D·德拉波, Y-T·盧安, J·R·梅瑟, W·王, D·拉斯科 申請人:惠氏研究愛爾蘭有限公司