專利名稱：用于評估作為疾病早期標(biāo)志物的糖形的凝集素測定的制作方法
用于評估作為疾病早期標(biāo)志物的糖形的凝集素測定交叉引用本申請要求保護(hù)于2009年8月5日提交的美國臨時申請?zhí)?1/231400優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，其通過引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
多種蛋白以兩種或更多種不同的同工型存在，其差異僅在于糖基化模式。這種差異，或差異糖基化的同工型的相對比例，可為疾病或病癥的指征并且因而需要能夠區(qū)分差異糖基化的同工型的測定系統(tǒng)。抗體用于區(qū)分內(nèi)源性蛋白的差異糖基化同工型的應(yīng)用是有問題的，因?yàn)楫a(chǎn)生特異性結(jié)合或優(yōu)先結(jié)合內(nèi)源性糖基化蛋白的特定同工型的抗體的成功率相對低。此外，已顯示對內(nèi)源性蛋白差異糖基化同工型的相對濃度的測定在臨床上是重要的。Keir等論述 了患有糖蛋白糖鏈缺陷綜合征(carbohydrate deficient glycoprotein syndrome)或先天性糖蛋白糖基化缺陷(congenital disorder of glycosylation)的患者中轉(zhuǎn)移糖基化同工型的相對豐度異常(Keir等· Ann. Clin. Biochem. 36 :20-36 (1999)。具有翻譯后糖基化的任何蛋白質(zhì)可潛在地以不同糖基化同工型存在。因此臨床相關(guān)蛋白質(zhì)可以不同糖基化同工型存在，包括癌癥和其它疾病的糖基化標(biāo)志物，所述標(biāo)志物包括堿性磷酸酶、甲胎蛋白、人絨膜促性腺激素以及可能包括朊病毒蛋白(CD230)。本發(fā)明中其它與病癥相關(guān)并認(rèn)為是用于開發(fā)測定法的潛在靶標(biāo)的糖蛋白包括但不限于，α-l-酸糖蛋白、α-l-抗胰蛋白酶、觸珠蛋白、甲狀腺球蛋白、前列腺特異性抗原、 HEMPAS紅細(xì)胞帶3 (與先天性紅細(xì)胞生成異常II型貧血相關(guān))、PC-I漿細(xì)胞膜糖蛋白、⑶41 糖蛋白IIb、CD42b糖盞蛋白(glyCOCaliCin)、CD43白細(xì)胞唾液酸糖蛋白、CD63溶酶體膜相關(guān)糖蛋白3、⑶66a膽汁糖蛋白、⑶66f妊娠特異性bl糖蛋白、⑶164多-糖基化核心蛋白 24以及Cd235血型糖蛋白家族。橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(Aleuria aurantia lectin) (AAL)為312個氨基酸的蛋白質(zhì)，其不含糖鏈而含有5個針對L-巖藻糖或L-巖藻糖-連接的寡糖的結(jié)合位點(diǎn)。與其它凝集素相比，AAL的多價性質(zhì)賦予其針對糖類配體異常高的結(jié)合親和力(微摩爾)。商業(yè)化制備AAL基于通過與巖藻糖-淀粉柱的結(jié)合來分離并純化凝集素。用50mM L-巖藻糖將 AAL從柱洗脫出來(Fujihashi等)。然而,結(jié)構(gòu)和生化分析顯示，由于此制備過程，市售AAL 的5個配體結(jié)合位點(diǎn)中的3至5個被巖藻糖占據(jù)(Olausson等，Amano等，F(xiàn)ujihashi等和 Wimmerova等)。因此，通過這些方法產(chǎn)生的AAL缺乏摻入到臨床顯著性診斷測定中所需的特異性和親和力。因此，需要可選擇性區(qū)分兩種或更多種具有不同糖基化模式的糖蛋白同工型的測定法，所述方法包括使用具有針對特定巖藻糖基化寡糖高親和力識別的重組形式AAL，接觸含有表達(dá)兩種或更多種糖形的糖蛋白的樣品，并且直接或間接檢測糖形差異作為疾病狀態(tài)的指示。發(fā)明概述本發(fā)明包括高親和力凝集素用于檢測蛋白質(zhì)上靶糖部分中變化的用途并且提供用于在疾病早期檢測中自動診斷測定的方法。本發(fā)明的一個實(shí)施方案是針對患有炎性病癥、自身免疫病癥、癌癥、感染或其它病癥的個體的血試驗(yàn)，其中特定蛋白質(zhì)的糖基化模式的改變用作血清中的生物標(biāo)志或用作在細(xì)胞表面上表達(dá)的生物標(biāo)志。通過鑒定糖形或?qū)Ρ磉_(dá)這些糖形的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量來對這些蛋白質(zhì)水平進(jìn)行分析，這提供了用于檢測患有疾病的人或處于疾病進(jìn)展風(fēng)險的人的簡單血試驗(yàn)。包括將高親和力凝集素用作測定平臺 (例如但不限于基于板或基于珠的形式)中檢測物的測定法可容易地自動化用于臨床或現(xiàn)場護(hù)理(point-of-care)環(huán)境。
附圖
簡述
圖I :具有blade I至6的AAL單體的整體結(jié)構(gòu)。橢圓體表明巖藻糖結(jié)合位點(diǎn)I至 5和相應(yīng)位點(diǎn)6。在位點(diǎn)1、2和4的3個棍棒模式(stick mode)顯示巖藻糖分子。
圖2 :使用鎳NTA板用于IgGO配體的親和カ比較。
圖3 :使用與市售AAL蛋白競爭的重組AAL蛋白的間接ELISA。
發(fā)明詳述
本發(fā)明基于最近的發(fā)現(xiàn)(I)某些蛋白質(zhì)的巖藻糖基化糖形的血清水平增加作為疾病例如癌癥的早期生物標(biāo)志和⑵免疫球蛋白G的a半乳糖基化糖形 (agalactosylated glycoform)(稱作a-gal IgGO)的血清水平增加與肝病診斷相關(guān)(參見實(shí)施例I)。因此，與本 領(lǐng)域已知的任何報(bào)告分子(例如放射標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán))連接的重組或突變體形式的凝集素(AAL)用作a-gal IgGO檢測分子，所述分子對血液中巖藻糖基化蛋白是特異性的。并入ELISA或基于珠的測定系統(tǒng)提供了自動化平臺的基礎(chǔ)以測定患者疾病狀態(tài)。
本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及大腸桿菌細(xì)菌和/或酵母中重組野生型AAL蛋白的制備和分離。提供的方法包括通過定點(diǎn)誘變或隨機(jī)誘變而改變并且隨后選擇突變體AAL 蛋白產(chǎn)生和制備突變體AAL蛋白。這些AAL蛋白對外臂L-卩比喃巖藻糖基連接(outerarm L-fucopyranosyl linkage)具有高親和力，更具體而言突變AAL蛋白對a 1-2外臂L-卩比喃巖藻糖基連接、ct 1-3外臂L-批喃巖藻糖基連接或a 1-4外臂L-批喃巖藻糖基連接具有高親和力，所述連接存在于患有疾病例如但不限于癌癥的患者的血清蛋白生物標(biāo)志中。
本發(fā)明的又一實(shí)施方案包括單獨(dú)的或與外臂連接聯(lián)合的核心巖藻糖(a 1-6連接的)糖形作為凝集素靶標(biāo)的用途。核心連接的巖藻糖是癌癥的許多血清生物標(biāo)志中主要的疾病指示物并且特異性檢測與外臂連接相反的a 1-6提供顯著的生物標(biāo)志。N224Q突變體對1-6連接比對外臂更具選擇性。這提供了與現(xiàn)有技術(shù)相比顯著的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明的 AAL蛋白對核心a 1-6L-吡喃巖藻糖基連接具有高親和力，所述連接存在于患有疾病例如但不限于癌癥的患者的血清蛋白生物標(biāo)志中。
AAL為312個氨基酸的蛋白質(zhì)，其含有5個針對L-巖藻糖或L-巖藻糖-連接的寡糖的結(jié)合位點(diǎn)。與其它凝集素相比，AAL的多價性質(zhì)賦予其針對糖類配體異常高的結(jié)合親和力(微摩爾)。AAL的商業(yè)化制備通過與巖藻糖-淀粉柱的結(jié)合來分離并純化。用50mM L-巖藻糖將AAL從柱洗脫出來(Fujihashi等)。結(jié)構(gòu)和生化分析顯示，由于此制備過程，市售AAL的5個配體結(jié)合位點(diǎn)中的3至5個被巖藻糖占據(jù)(Olausson等,Amano等,Fujihashi 等和 Wimmerova 等)。
意想不到地發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌中產(chǎn)生并且采用鎳親和色譜從細(xì)菌分離的重組(r)AAL，與市售制備的AAL相比，具有對巖藻糖基化寡糖顯著更高的結(jié)合親和力，這通過表面等離振子共振研究、色氨酸熒光研究和酶聯(lián)凝集素測定法來測定。本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供用于產(chǎn)生和制備高親和力(重組)rAAL和/或突變 rAAL的方法,這使得所有配體結(jié)合位點(diǎn)均可用于結(jié)合特定L-卩比喃巖藻糖基連接,所述連接存在于α-gal IgGO中以及疾病和癌癥的血清蛋白生物標(biāo)志中。本發(fā)明的另一實(shí)施方案將作為檢測分子的高親和力rAAL并入靈敏和特異性的基于血液的測定中，以對處于疾病例如但不限于癌癥風(fēng)險中的人進(jìn)行測定。產(chǎn)牛并詵擇高親和力誘奪AAL通過遵循制造商的實(shí)驗(yàn)方案將AAL-pUC57質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到XLl Red大腸桿菌增變株 (Strategene)來獲得隨機(jī)誘變的AAL。定點(diǎn)誘變集中在AAL中5個巖藻糖結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)個的配體結(jié)合親和力改變。β -螺旋槳基序在AAL中重復(fù)6次。該基序在凝集素中普遍保守并且構(gòu)成配體結(jié)合域。已描述基序中五(5)個巖藻糖結(jié)合位點(diǎn)(參見圖I)，并且每一位點(diǎn)對巖藻糖基化配體具有不同的親和力。如圖I所示，位點(diǎn)2和4是高親和力配體結(jié)合位點(diǎn)，而位點(diǎn)1、3和5的結(jié)合親和力較弱。每一 β折疊包含 具體參與巖藻糖結(jié)合的高度保守殘基。具體而言，位點(diǎn)2和4在Q22 和Q75的位置分別具有保守谷氨酰胺殘基，這使巖藻糖結(jié)合位點(diǎn)保持巖藻糖可接近的開放狀態(tài)。位點(diǎn)3和5的相應(yīng)殘基是天冬酰胺Ν129和Ν224。因?yàn)檫@些天冬酰胺殘基(N)比谷氨酰胺(Q)少一個碳，所以它們不與鄰近的保守殘基發(fā)生必需的氫鍵接觸以使這些位點(diǎn)保持能量穩(wěn)定的開放構(gòu)型。開發(fā)了突變體AAL分子，Ν129和Ν224殘基分別和組合地?fù)Q成谷氨酰胺(N129Q，N224Q)，即AALN129Q、AALN224Q以及AALN129Q，N224Q以使這些位點(diǎn)結(jié)構(gòu)上類似高親和力結(jié)合位點(diǎn)。競爭實(shí)驗(yàn)顯示，與野生型蛋白質(zhì)相比，這些蛋白質(zhì)對IgGO配體具有更高的親和力 (參見圖2)。這些結(jié)果表明隨機(jī)誘變方法將確定L-吡喃巖藻糖基連接的特異性且高親和力配體結(jié)合物，用于選擇突變體。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及開發(fā)凝集素的突變體文庫，用于選擇本文特別提及的那些之外的其它糖結(jié)構(gòu)。將基于酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的展不和選擇系統(tǒng)用于篩選及選擇與特定L-吡喃巖藻糖基連接具有反應(yīng)性的突變體AAL蛋白。簡言之，挑選用 AAL-pUC57 轉(zhuǎn)化并對其進(jìn)行增變實(shí)驗(yàn)方案(mutator protocol) (Strategene)的 200-400 XLl紅色菌落庫并制備質(zhì)粒DNA。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將突變的AAL序列亞克隆到一種酵母展不載體PCT302中。該系統(tǒng)和載體在Broder和Wittrup and(2000)Methods Enzymology.第328卷,430-444中詳述。將含有突變體AAL文庫的酵母展示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到單倍體酵母株EB Y100中并且如所述的培養(yǎng)。突變體AAL蛋白為誘導(dǎo)型表達(dá)并且在酵母的細(xì)胞表面上展示。根據(jù)在選擇條件下與含有特定L-吡喃巖藻糖基連接的生物素化配體的結(jié)合，對酵母展示突變體AAL文庫進(jìn)行針對高親和力結(jié)合的富集(Bergan, L. , J. A. Gross, B. Nevin, N. Urban, N. Scholler. Cancer Lett 255，263-74 (2007))。對結(jié)合配體的細(xì)胞進(jìn)行2輪鏈霉抗生物素磁珠富集(Miltenyi Macs),隨后進(jìn)行3輪流式分選(Scholler等， Feldhaus等，Broder和Wittrup)。已顯示該系統(tǒng)消除了在卩遼菌體展示文庫中常見的表達(dá)偏袒和生長選擇，并且一致地產(chǎn)生對所選克隆的快速富集，IO5 (Feldhaus等)。
如Scholler等描述的，將展示文庫轉(zhuǎn)換成分泌的突變體AAL文庫。將突變體AAL DNA從富集的展示文庫分離并且通過缺ロ修復(fù)克隆到pTOR中以使突變體AAL蛋白分泌到培養(yǎng)基中。pTOR載體的特征包括；引導(dǎo)重組蛋白分泌的a前導(dǎo)序列(alpha prepro leader) 和符合讀框的6X His-標(biāo)簽添加以及在突變體蛋白C-末端的Avitag序列(Scholler 等)。Avitag是生物素受體位點(diǎn)并且當(dāng)用突變體AAL pTOR文庫轉(zhuǎn)化的單倍體細(xì)胞與表達(dá)大腸桿菌生物素連接酶基因(BirA)的相反交配型單倍體細(xì)胞交配時，其在特定賴氨酸殘基處被生物素化。在固體培養(yǎng)基上選擇分泌His-標(biāo)簽的生物素化突變體AAL蛋白的二倍體細(xì)胞并且在誘導(dǎo)分泌所述蛋白的條件下于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案，將二倍體細(xì)胞培養(yǎng)物上清液脫鹽、濃縮并經(jīng)緩沖液調(diào)節(jié)，用于鎳-瓊脂糖柱純化 AAL-His (His-Trap, Amersham)。隨后可純化His-標(biāo)簽的生物素化重組突變體AAL并且用于后續(xù)配體結(jié)合研究。
用于選擇配體和其它L-吡喃巖藻糖基寡糖的突變體和野生型AAL的定量平衡結(jié)合通過BIAcore分析和酶聯(lián)凝集素測定法來測定(Olausson等)。
突變體AAL蛋白對IgGO配體的高親和カ識別
將含有IOX組氨酸標(biāo)簽的等量重組AAL (野生型或突變體)包被到鎳NTA板并且用漸增量IgGO配體(X軸)孵育。將無標(biāo)簽的市購AAL(AAL-V)亦包被到鎳NTA板或到高親和カ結(jié)合ELISA板上(AAL-Vc)并且用漸增量IgGO配體孵育。將板洗滌并且用熒光標(biāo)記的杭-人IgG孵育，洗滌并在熒光檢測器中讀數(shù)。漸增的相對熒光表明更高的結(jié)合親和力。 結(jié)果顯示在未飽和情況下，突變體AALmi(N129Q)展示最高信噪比，將檢測限提高10-100倍至 10ng/mL,并且將動態(tài)范圍從10ng/mL增加至100ug/mL(參見圖2)。這些結(jié)果表明重組突變體AAL蛋白將增加基于血液的測定的靈敏度和特異性從而檢測血清IgGO水平中的細(xì)微變化。
實(shí)施例I :對肝硬化患者具有選擇性的rAAL蛋白
與市售AAL相比，重組凝集素(rAAL)對IgGO配體顯示更高的親和カ。在基于競爭ELISA的實(shí)驗(yàn)中 使用血清樣品，在肝硬化患者中與對照相比，rAAL具有顯著更高的親和力(參見圖3)。
實(shí)驗(yàn)方案
將96孔板用經(jīng)高碘酸鈉(NaIO4)處理的小鼠IgG(l. Oug/孔)包被。將3uL來自肝硬化患者的血清(Gish 342)或來自正常供體的血清(Sigma)稀釋至IOOuL并且將其加入抗體包被的孔中。將板洗滌并且隨后在振搖下，用等量的未生物素化市售(Vector)AAL,未生物素化重組IOX-His標(biāo)簽的(rAAL 10X)、未生物素化重組IOX-His標(biāo)簽突變體AAL(rAAL N129Q, N224Q))室溫孵育30分鐘。隨后向每孔加入等量生物素化AAL并且在振搖下室溫孵育I小吋。如先前所述，將板洗滌并且用鏈霉抗生物素-800-IRDye孵育。將板洗滌并且使用LiCor Odyssey設(shè)備進(jìn)行熒光定量。在不存在未生物素化AAL下，測量對照樣品中生物素化AAL與IgGO的結(jié)合。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
競爭實(shí)驗(yàn)提供間接ELISA以測量未生物素化市售(Vector)蛋白和未生物素化 rAAL蛋白干擾生物素化AAL與IgGO配體結(jié)合的能力。這定性表明未標(biāo)簽的AAL蛋白對IgGO配體的相對親和力。如圖3所示，在基于競爭ELISA的形式中，與市購(Vector)AAL相比，rAAL蛋白在更大程度上降低信號強(qiáng)度。在來自肝硬化患者(Gish 342)的血清樣品中，未生物素化市售 (Vector)AAL與生物素化AAL競爭而導(dǎo)致與對照相比信號強(qiáng)度降低(信號輸出從約35降至約20)。未生物素化野生型rAAL IOX和突變體rAAL(N129Q，N224Q)蛋白導(dǎo)致信號輸出更大地降低(對比對照)，表明在來自肝硬化患者的血清中對IgGO的親和力更高。Sigma = 陰性對照血清(來自未患肝病個體的血清)。本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供用于本發(fā)明測定方法的試劑盒，所述試劑盒包括對特定巖藻糖基化寡糖具有高親和力識別的重組或突變體形式的AAL。盡管通過提及特定實(shí)施方案來描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人 員認(rèn)識到可對其作出多種改變，例如改變本文描述的與AAL連接的檢測分子的具體選擇，并且將領(lǐng)會和理解的是，本發(fā)明的公開內(nèi)容在不違背本發(fā)明更寬范圍和精神下僅顯示本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)。將領(lǐng)會和理解的是，本發(fā)明的這些發(fā)現(xiàn)僅僅是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可預(yù)期的許多另外潛在應(yīng)用中說明性的那些，并且因此絕不以任何方式限制本發(fā)明。因此，根據(jù)詳細(xì)的說明書連同權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言清楚明了。
權(quán)利要求
1.用于制備對巖藻糖基化蛋白具有高親和カ的凝集素的方法，所述方法包括a.獲得含有至少ー個針對L-巖藻糖或L-巖藻糖-連接的寡糖的結(jié)合位點(diǎn)的凝集素；b.在至少ー個所述結(jié)合位點(diǎn)中使凝集素突變；和c.富集所述突變的凝集素，其中所述凝集素具有對巖藻糖基化蛋白提高的結(jié)合親和力。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述凝集素為AAL。
3.權(quán)利要求I的方法，其中所述突變通過隨機(jī)誘變來進(jìn)行。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述突變通過定點(diǎn)誘變來進(jìn)行。
5.權(quán)利要求I的方法，其中所述提高的結(jié)合親和力針對所述巖藻糖基化蛋白上的外臂或核心L-批喃巖藻糖基連接。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述連接選自a1-2外臂L-吡喃巖藻糖基連接、a 1-3外臂レ批喃巖藻糖基連接、a 1-4外臂L-批喃巖藻糖基連接、核心a 1_6L_批喃巖藻糖基連接及其組合。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述凝集素獲自細(xì)菌。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述富集通過鎳色譜來進(jìn)行。
9.權(quán)利要求I的方法，其中所述凝集素還與10個或更多個組氨酸殘基連接。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述凝集素還與報(bào)告分子連接。
11.用于區(qū)分兩種或更多種糖蛋白同エ型的方法，所述方法包括a.獲取含有糖蛋白的樣品；b.使所述糖蛋白與權(quán)利要求I的重組凝集素結(jié)合，其中所述凝集素對糖蛋白同エ型具有高親和カ并且其中所述凝集素與報(bào)告分子連接；和c.檢測所述報(bào)告分子的存在情況，存在所述報(bào)告分子表明存在所述同エ型。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述重組凝集素為與10個或更多個組氨酸殘基符合讀框連接的重組AAL。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述重組凝集素為具有與C-末端符合讀框連接的10個或更多個組氨酸殘基并且在第129或224位具有天冬酰胺或谷氨酰胺的用于檢測所述同エ 型的重組AAL。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述同エ型具有a-I，6連接的巖藻糖殘基。
15.權(quán)利要求14的方法，還具有在以下位點(diǎn)中的至少ー個突變結(jié)構(gòu)域2中的R24A、 E36A、R77A、結(jié)構(gòu)域2中的E898A、結(jié)構(gòu)域4中的R179A、結(jié)構(gòu)域4中的E191A及其組合。
16.用于檢測患者疾病的方法，所述方法包括a.從含有巖操糖基化糖形祀蛋白的患者獲取血清樣品；b.使權(quán)利要求I的重組凝集素與具有巖藻糖基化糖形的靶蛋白結(jié)合；c.檢測巖藻糖基化糖形的存在情況，其中存在的巖藻糖基化糖形的量改變表明存在疾病。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述疾病為癌癥。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述重組凝集素為與10個或更多個組氨酸殘基符合讀框連接的重組AAL。
全文摘要
本發(fā)明提供用于評估作為疾病的生物標(biāo)志的蛋白糖形的方法、組合物、裝置和試劑盒。將純化的重組形式凝集素用作檢測分子以特異性標(biāo)記在疾病狀態(tài)中表達(dá)的靶糖類。重組凝集素的高親和力使用于疾病例如但不限于癌癥或肝病診斷的測定得以自動化。
文檔編號C07K1/00GK102725417SQ201080044720
公開日2012年10月10日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日
發(fā)明者A·梅塔, P·R·羅馬諾, T·M·布洛克 申請人:肝炎和病毒研究所