專利名稱：包含能夠增強(qiáng)屏障功能的肽水解產(chǎn)物的化妝品組合物和/或藥物組合物的制作方法
包含能夠增強(qiáng)屏障功能的肽水解產(chǎn)物的化妝品組合物和/
或藥物組合物本發(fā)明屬于化妝品和藥學(xué)領(lǐng)域，更特別地是皮膚病學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物，其能夠增強(qiáng)皮膚屏障功能和刺激表皮分化。所述生物活性肽的特征在于其包含4-6個(gè)氨基酸，所述氨基酸包括至少一個(gè)甘氨酸殘基、一個(gè)亮氨酸殘基和一個(gè)谷氨酸殘基。優(yōu)選地，所述活性成分來(lái)自選自單粒小麥、馬鈴薯、玉米、豌豆、大豆的植物蛋白或來(lái)自酵母菌屬的酵母蛋白的水解。本發(fā)明還涉及組合物，所述組合物包含富含生物活性肽的作為能夠增強(qiáng)表皮的屏障功能的活性成分的肽水解產(chǎn)物，所述肽水解產(chǎn)物在生理學(xué)可接受的介質(zhì)中。本發(fā)明還涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含作為藥物的該新活性成分。最后，本發(fā)明涉及作為活性成分的所述肽水解產(chǎn)物激活HMG-CoA還原酶的用途。本發(fā)明還涉及作為活性成分的所述肽水解產(chǎn)物增強(qiáng)皮膚屏障功能和刺激表皮分化的用途。本發(fā)明還適于用于預(yù)防和/或抵抗外界應(yīng)激和皮膚老化跡象的化妝品治療方法。表皮的首要功能是構(gòu)建外界環(huán)境和內(nèi)部環(huán)境之間的屏障。表皮的最外層即表皮的角質(zhì)層確保了這一功能。它是由處于分化末期的角質(zhì)形成細(xì)胞即角質(zhì)層細(xì)胞組成的，這些細(xì)胞通過(guò)彈性的且不可滲透的厚細(xì)胞間粘合質(zhì)相互密封。因此，排列成多層結(jié)構(gòu)的由角質(zhì)層細(xì)胞組成的細(xì)胞區(qū)室和主要由脂質(zhì)組成的胞外區(qū)室在角質(zhì)層中非常明顯。人類角質(zhì)層的脂質(zhì)含量約為15%膽固醇酯、16%游離長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸、32% 膽固醇和37 %神經(jīng)酰胺，然而個(gè)體間的差異較為顯著(Norlen L.等人，J. Invest. Dermatol. 1999 ；112 (1)第72-77頁(yè))。這些脂質(zhì)由來(lái)自表皮中層的角質(zhì)形成細(xì)胞合成并且分泌在被稱作“板層小體”或Odland體的專門的細(xì)胞器中。特別地，表皮合成膽固醇非?；钴S的部位。該合成的限速步驟并且也是最精細(xì)的調(diào)控步驟為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸。該步驟是由被稱作HMG-CoA還原酶(E. C. 1. 1. 1. 34)的膜結(jié)合酶催化的。人基因組測(cè)序數(shù)據(jù)表明HMG-CoA還原酶至少存在兩種同工酶，它們由位于染色體 5 上的唯一的基因編碼(Luskey 等人，J Biol Chem.，1985 260(18)，p. 10271-7)。在皮膚中，膽固醇在膜的流動(dòng)性中起作用，特別是它表現(xiàn)出確保脂質(zhì)雙層中烴鏈的活動(dòng)性(Martini Μ. C. , Pathol. Biol. 2003, (51)，267-270)。因此，在生理?xiàng)l件下，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定必需的水平合成膽固醇。另一方面，在皮膚屏障發(fā)生突然改變后，觀察到顯著且快速的膽固醇合成增加，這與HMG-CoA還原酶的表達(dá)和活性的增加相關(guān)(Menon G. K.等人，J. Lipid, Res.，1985，(26)，P. 418-427)。HMG-CoA還原酶的關(guān)鍵作用使其成為調(diào)節(jié)有機(jī)體中膽固醇表達(dá)的主要靶點(diǎn)。因此，開(kāi)發(fā)了一類用于抑制HMG-CoA還原酶的被稱作他汀類的藥理學(xué)化合物，其目的是降低循環(huán)膽固醇。他汀類的這一抑制劑作用還體現(xiàn)于人類皮膚中。事實(shí)上，通過(guò)局部途徑實(shí)驗(yàn)性給藥他汀類破壞皮膚的屏障功能(Proksch E.等人，British J. Dermatol. , 1993, (128), p. 473-482)。這些結(jié)果驗(yàn)證了膽固醇在表皮屏障功能中的重要性以及HMG-CoA還原酶在調(diào)節(jié)膽固醇合成中的重要作用。當(dāng)皮膚老化時(shí)，皮膚屏障的完整性及其修復(fù)能力發(fā)生改變。觀察到脂質(zhì)的整體缺乏，這導(dǎo)致角質(zhì)層胞外區(qū)室的脂質(zhì)多層減少。這些功能性改變與老化皮膚對(duì)外界應(yīng)激的敏感性增加相關(guān)(Ghadially R.等人，J Clin Invest.，1995 (95 (5)，p. 2281-90)。在外界應(yīng)激過(guò)程中可不依賴于內(nèi)因性老化或光誘導(dǎo)老化而產(chǎn)生皮膚屏障的改變。在這一背景下，需要盡力防止改變或者重建表皮的屏障功能。在這一具體領(lǐng)域中， 已大量記載了脂質(zhì)組分例如神經(jīng)酰胺(EP 1272148，US2007576937)或一些膽固醇衍生物 (FR 2 789 312)的直接提供。另一方面，還記載了使用植物油活化皮膚脂質(zhì)的合成。(EP 1 707 189)。在化妝品領(lǐng)域中，為了獲得抗衰老作用，已開(kāi)發(fā)了 HMG-CoA還原酶的分子靶向以抑制該關(guān)鍵酶，例如通過(guò)使用已知具有HMGCOA-抑制活性的他汀類(EP 0738510)。但是，迄今為止，無(wú)任何文件描述或暗示本發(fā)明的目的，即，本發(fā)明的富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物可以具有增強(qiáng)皮膚屏障功能和刺激表皮分化的令人感興趣的性質(zhì)。通過(guò)這一作用，還可改善與屏障功能相關(guān)的一些病理學(xué)功能障礙(過(guò)敏性、受刺激的或反應(yīng)性的皮膚、特應(yīng)性濕疹)。本發(fā)明的第一個(gè)目的是富含生物活性肽的能夠增強(qiáng)表皮的屏障功能的肽水解產(chǎn)物，其特征在于所述水解產(chǎn)物包含4-6個(gè)氨基酸，所述氨基酸包括至少一個(gè)甘氨酸殘基、一個(gè)亮氨酸殘基和一個(gè)谷氨酸殘基。事實(shí)上，本發(fā)明人已證明了包含一些特殊的肽(在下文中被稱作生物活性肽)的肽水解產(chǎn)物在化妝品和治療、特別是皮膚病學(xué)方面的活性。具體而言，本發(fā)明人已證明了當(dāng)將富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物施用至皮膚時(shí)， 其增強(qiáng)表皮的屏障功能和刺激表皮分化。這些性質(zhì)以通過(guò)更好地防護(hù)皮膚組織免受外界應(yīng)激的侵害和組成表皮角質(zhì)層的脂質(zhì)形成增加得到證明。根據(jù)本發(fā)明，“生物活性肽”應(yīng)理解為至少四個(gè)氨基酸的連接，所述氨基酸由肽鍵或修飾的肽鍵相互連接并且具有以本發(fā)明的活性成分的活性為特征的體內(nèi)或體外活性。本發(fā)明的特征性生物活性在體外被定義為所述肽通過(guò)以下方式激活HMG-CoA還原酶的能力增加HMG-CoA還原酶的蛋白質(zhì)合成(直接或間接調(diào)節(jié)HMG-CoA還原酶的基因表達(dá))，或者增加HMG-CoA還原酶的酶活性，或者其它生物過(guò)程例如使HMG-CoA還原酶蛋白穩(wěn)定或使信使RNA轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定。皮膚應(yīng)理解為指構(gòu)成皮膚和粘膜的所有覆蓋組織，包括上皮附件(毛發(fā)、眼睫毛、 體毛、眉毛)ο“肽水解產(chǎn)物”應(yīng)理解為指主要以肽或寡肽為代表的化合物的混合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“肽水解產(chǎn)物”或“活性成分”等同使用?！半男曰衔铩睉?yīng)理解為指存在于本發(fā)明的肽水解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)片段、肽或游離
氨基酸。“局部施用”應(yīng)理解為指將本發(fā)明的活性成分或包含它的組合物施用至或涂抹至皮膚或粘膜表面的行為。“生理學(xué)可接受的”應(yīng)理解為表示本發(fā)明的肽水解產(chǎn)物或包含它的組合物適合與皮膚或粘膜接觸而不會(huì)引起毒性或不耐受反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的特別有利的方法，包含于所述水解產(chǎn)物中的生物活性肽具有通式⑴的序列X1-[Gly，Glu, Leu] -X2-X3其中，X1是丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸，或無(wú)氨基酸，
X2是絲氨酸或蘇氨酸，X3是亮氨酸、異亮氨酸，或無(wú)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的特別優(yōu)選的方法，所述生物活性肽具有如下序列(SEQ ID No. DAla-Glu-Gly-Leu-Ser-Ile(SEQ ID No. 2)Leu-Gly-Glu-Ser-Leu(SEQ ID No. 3)Val-Gly-Glu-Leu-Thr(SEQ ID No. 4)Ile-Gly-Glu-Leu-Ser(SEQ ID No. 5)Ala-Gly-Glu-Leu-Ser(SEQ ID No. 6)Gly-Glu-Leu-Thr-Ile(SEQ ID No. 7)Gly-Glu-Leu-Ser0根據(jù)特別令人感興趣的實(shí)施方案，所述生物活性肽對(duì)應(yīng)SEQ ID No. 5序列?？赏ㄟ^(guò)提取植物源或酵母源的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行釋放其中存在生物活性肽的肽性化合物的受控水解(controlled hydrolysis)來(lái)獲得本發(fā)明的活性成分。肽水解產(chǎn)物特別是低分子量的肽水解產(chǎn)物的使用在化妝品領(lǐng)域中具有許多優(yōu)點(diǎn)。 除了生成原本不存在于起始蛋白質(zhì)混合物中的肽性化合物之外，水解和純化使得能夠獲得容易標(biāo)準(zhǔn)化且不引起皮膚病學(xué)或化妝品過(guò)敏反應(yīng)的更穩(wěn)定的混合物。還可能無(wú)需純化對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的生物活性肽的肽性化合物，但是通過(guò)適合的分析方法確保所述肽的存在來(lái)使用一些水解的提取物。非常多的存在于植物和酵母中的蛋白質(zhì)很可能在它們的結(jié)構(gòu)中包含生物活性肽。 受控水解使這些特定的肽性化合物能被釋放。有可能但不一定通過(guò)以下方式實(shí)施本發(fā)明 首先提取相關(guān)的蛋白質(zhì)然后將它們水解，或者首先對(duì)粗提取物進(jìn)行水解然后純化所述肽性化合物。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性成分來(lái)自選自單粒小麥、馬鈴薯、玉米、豌豆、大豆的植物蛋白或酵母菌屬種的酵母蛋白的水解。優(yōu)選地，所使用的植物不進(jìn)行預(yù)先發(fā)酵。因此，可通過(guò)使用小單粒小麥種子(Triticum monococcum)實(shí)施本發(fā)明，所述單粒小麥為包含特別高的蛋白質(zhì)水平的非常古老的二倍體小麥(Vallega 1992)。還可通過(guò)使用茄屬并且更特別的是馬鈴薯(Solanum tuberosum)種的馬鈴薯塊莖實(shí)施本發(fā)明。所述塊莖不屬于植物的根而是屬于它的地下莖，從其伸展出被稱作根莖的更細(xì)的分枝，在其末端形成塊莖。還可通過(guò)使用來(lái)自玉蜀黍?qū)俨⑶覂?yōu)選玉米(Zea mays L)種的許多植物之一的種子實(shí)施本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明，所使用的植物材料為種子，并且優(yōu)選通過(guò)去殼步驟去除所述種子的殼。還可通過(guò)使用來(lái)自豆科(Fabaceae)的許多植物之一實(shí)施本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明， 使用來(lái)自豌豆種豌豆(Pisum sativum L)的植物。術(shù)語(yǔ)豌豆也指種子，其本身富含蛋白質(zhì) (25%)。還可通過(guò)使用大豆屬(大豆)的豆科種子或者豆粕，并且優(yōu)選大豆種(Glycine Max L.)的豆科種子實(shí)施本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明，所使用的植物材料為種子，并且優(yōu)選通過(guò)去殼步驟去除所述種子的殼。還可通過(guò)使用酵母菌屬并且優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)種的酵母實(shí)施本發(fā)明。
可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何提取或純化方法制備本發(fā)明的水解產(chǎn)物。在第一步中，使用植物碾磨機(jī)碾磨種子或植物的特定部分(葉、塊莖、根等)。接著可以通過(guò)使用常規(guī)的有機(jī)溶劑(例如乙醇、己烷或丙酮)將由此獲得的粉末“脫脂”。對(duì)于酵母而言，在第一步中，在適合它們生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，優(yōu)選在乳糖存在下常規(guī)培養(yǎng)所述酵母。通過(guò)離心收集所述酵母，然后將其懸浮在緩沖液、優(yōu)選磷酸鹽緩沖液中。在第二步中，使用弗氏細(xì)胞壓碎器或者使用球磨機(jī)使細(xì)胞破碎，通過(guò)離心或過(guò)濾分離大部分的不溶性膜組分。然后，按照改良的常規(guī)方法(Osborne，1924)提取蛋白質(zhì)；將植物研磨材料或酵母裂解物懸浮于包含不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)型吸附劑產(chǎn)品(0.01-20%)的堿性溶液中；確實(shí)觀察到該方法有助于后續(xù)的水解和純化操作。特別是顯著降低了與蛋白質(zhì)相互作用的酚類物質(zhì)的濃度。在離心和過(guò)濾步驟之后收集包含蛋白質(zhì)、碳水化合物以及可能存在的脂質(zhì)的可溶性組分。然后在受控條件下水解該粗溶液以生成可溶性肽。水解被定義為涉及通過(guò)水將分子裂解的化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)可在中性、酸性或堿性介質(zhì)中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，以化學(xué)方式和/ 或有利地通過(guò)蛋白質(zhì)水解酶進(jìn)行水解。接著可利用植物源的內(nèi)切蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶)和微生物(曲霉菌屬、根霉菌屬、芽孢桿菌屬等)。選擇水解條件以促進(jìn)生物活性肽的富集。由于如上文所述的相同原因，即除去多酚類物質(zhì)，在該受控水解步驟中向反應(yīng)介質(zhì)中加入一定量的聚乙烯聚吡咯烷酮。過(guò)濾、除去酶和聚合物后，所得濾液(溶液)構(gòu)成了本發(fā)明活性成分的最初形式?？稍偌兓谠撾A段獲得的水解產(chǎn)物以選擇低分子量部分，優(yōu)選低于6kDa的部分， 并且根據(jù)它們的性質(zhì)選擇生成的肽。通過(guò)孔隙率不斷降低的濾器進(jìn)行連續(xù)的超濾步驟，保留每一步驟的濾液，和/或通過(guò)色譜型方法，可有利地進(jìn)行分級(jí)分離，從而特異性地使所述水解產(chǎn)物富含生物活性肽。本發(fā)明進(jìn)行在水中或在任何包含水的混合物中稀釋的步驟，然后通過(guò)超濾滅菌以獲得特征是蛋白質(zhì)含量為0. 5-5. 5g/l的肽水解產(chǎn)物。該肽水解產(chǎn)物對(duì)應(yīng)本發(fā)明的活性成分的最高純化形式。在高壓液相色譜法(HPLC)中對(duì)根據(jù)本發(fā)明獲得的肽水解產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，使得能夠分析分子量為0. 2-25kDa(根據(jù)適合溶劑的梯度)的蛋白質(zhì)。然后分析可被分離的不同的肽部分的生物學(xué)效應(yīng)。然后通過(guò)質(zhì)譜法分析這些不同的部分以特異性鑒定每一個(gè)峰的肽的氨基酸含量。還進(jìn)行了測(cè)序分析以確定所述生物活性肽的肽序列。所得水解產(chǎn)物由分子量低于6kDa，優(yōu)選低于6kDa的肽組成，并且富含4_6個(gè)氨基酸的生物活性肽，所述氨基酸包括至少一個(gè)甘氨酸殘基、一個(gè)亮氨酸殘基和一個(gè)谷氨酸殘基。本發(fā)明的第二個(gè)目的是組合物，所述組合物包含作為能夠增強(qiáng)表皮的屏障功能的活性成分的本發(fā)明的富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物，所述肽水解產(chǎn)物在生理學(xué)可接受的介質(zhì)中。根據(jù)本發(fā)明的有利的實(shí)施方案，以最終組合物的總重計(jì)，本發(fā)明的活性成分以約 0. 0001% -20%的濃度，優(yōu)選約0. 05% -5%的濃度存在于本發(fā)明的組合物中。
根據(jù)本發(fā)明的有利的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性成分溶解于本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的一種或多種生理學(xué)可接受的溶劑中，所述溶劑例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、雙丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、環(huán)狀多元醇、白凡士林、植物油或這些溶劑的任意混合物。根據(jù)本發(fā)明的另一有利的實(shí)施方案，預(yù)先將本發(fā)明的活性成分溶解于化妝品或藥物載體例如脂質(zhì)體中或吸附至粉狀有機(jī)聚合物、無(wú)機(jī)載體例如滑石和膨潤(rùn)土，更概括而言， 將其溶解于在任何生理學(xué)可接受的載體中或固定在任何生理學(xué)可接受的載體上。本發(fā)明的可用組合物可具體地由用于毛細(xì)血管護(hù)理的組合物組成，并且特別地可由香波、護(hù)發(fā)素、治療洗液、煽油膏或凝膠、頭發(fā)修復(fù)洗液、面膜等組成。所述組合物還可以染發(fā)劑或睫毛膏的形式存在，以通過(guò)刷子或梳子施用，特別是施用于睫毛、眉毛或頭發(fā)上。可通過(guò)任何適合的途徑施用本發(fā)明的可用組合物，特別是口服、腸胃外或局部途徑，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)調(diào)節(jié)所述組合物的制劑，特別是針對(duì)化妝品或皮膚病組合物。有利的是，本發(fā)明的組合物旨在用于局部給藥。因此，這些組合物必須包含生理學(xué)可接受的介質(zhì)(即與皮膚和上皮附件相容的介質(zhì))，并且必須包括所有化妝品或皮膚病學(xué)形式。應(yīng)理解本發(fā)明的活性成分可單獨(dú)使用或與其它活性成分組合使用。有利的是，本發(fā)明的可用組合物還可包含用于提高和補(bǔ)充所述活性成分的作用的各種保護(hù)性或抗老化的活性成分。以非限制性方式列舉以下成分結(jié)瘢劑、抗老化劑、抗皺劑、潤(rùn)膚劑、抗自由基劑、抗UV劑、刺激皮膚大分子合成或能量代謝的藥劑、保濕劑、抗菌齊 、抗真菌劑、抗炎劑、麻醉劑、調(diào)節(jié)皮膚分化的藥劑、著色劑或脫色劑、刺激指甲或毛發(fā)生長(zhǎng)的藥劑。優(yōu)選使用表現(xiàn)出抗皺活性的藥劑(例如抗自由基劑或抗氧化劑)，或者刺激皮膚大分子合成的藥劑、刺激能量代謝的藥劑、金屬蛋白酶抑制劑。例如，可加入選自維生素C、維生素Ε、輔酶QlO和多酚植物提取物、類視黃醇的具有抗自由基或抗氧化作用的其它活性成分。本發(fā)明組合物還可將刺激皮膚大分子(層粘連蛋白、纖維連接蛋白、膠原蛋白)的合成的其它活性成分，例如Vincience公司出售的名為“Collaxyl ”的膠原肽與本發(fā)明的活性成分組合。本發(fā)明組合物還可將刺激能量代謝的其它活性成分，例如Vincience公司出售的名為“GP4G ”的活性成分與本發(fā)明的活性成分組合。當(dāng)然，明顯的是本發(fā)明一般針對(duì)哺乳動(dòng)物，并且更特別的是人類。這些組合物可特別地以如下形式存在水溶液、水醇溶液或油溶液；水包油乳劑、 油包水乳劑或復(fù)合型乳劑；它們還可以適合施用至皮膚、粘膜、唇和/或上皮附件的乳膏、 混懸劑或散劑的形式存在。這些組合物可或多或少具有流動(dòng)性并且具有乳膏、洗劑、乳劑、 精華液(s6rum)、潤(rùn)發(fā)脂、凝膠劑、糊劑或泡沫劑的外觀。它們還可以固體形式存在，例如棒劑(stick)，或者可以氣霧劑的形式施用至皮膚?？蓪⑺鼈冇米髯o(hù)理產(chǎn)品和/或皮膚化妝品。所有這些組合物還包含常用于所設(shè)想的應(yīng)用領(lǐng)域的任何添加劑以及它們的制劑所必須的輔劑，例如溶劑、增稠劑、稀釋劑、抗氧化劑、著色劑、遮光劑、自曬黑劑、色素、填充齊U、防腐劑、香精、除臭劑、其它化妝品活性成分、精油、維生素、必需脂肪酸、表面活性劑、成膜聚合物等。
在所有情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)確保選擇這些輔劑以及它們的比例從而不會(huì)破壞本發(fā)明組合物的期望的有利性質(zhì)。這些輔劑可對(duì)應(yīng)于例如所述組合物總重的0. 01-20% 的濃度。當(dāng)本發(fā)明所述組合物是乳劑時(shí)，以所述組合物的總重計(jì)，脂肪相可為5-80重量％ 并且優(yōu)選5-50重量％。用于所述組合物中的乳化劑和共乳化劑選自所考慮領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)使用的那些。例如，以所述組合物的總重計(jì)，它們的使用比例可為0. 3-30重量％。本發(fā)明的第三個(gè)目的是包含有效量的作為藥物的本發(fā)明的肽水解產(chǎn)物的藥物組合物。例如，所述藥物組合物可用于預(yù)防或治療特征是屏障功能改變的疾病，例如過(guò)敏性、 受刺激的或反應(yīng)性的皮膚以及特應(yīng)性濕疹。根據(jù)本發(fā)明的這一形式，所述組合物會(huì)適于藥物用途的口服給藥。因此，所述組合物可特別地以片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、咀嚼糊劑、在使用時(shí)或在臨使用前與液體混合以施用的散劑、糖漿、凝膠劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它形式存在。這些組合物還包含所設(shè)想的應(yīng)用領(lǐng)域常用的任何添加劑以及它們的制劑所必需的輔劑，例如溶劑、增稠劑、稀釋劑、抗氧化劑、防腐劑、其它藥學(xué)活性成分、精油、維生素、必需脂肪酸等。本發(fā)明的第四個(gè)目的是有效量的作為激活人HMG-CoA還原酶的活性成份的肽水解產(chǎn)物在化妝品組合物中的用途。所述活性成分的有效量對(duì)應(yīng)于獲得期望的結(jié)果，即激活HMG-CoA還原酶以提高表皮的屏障功能和刺激表皮分化所必需的量。“增強(qiáng)皮膚的屏障功能和刺激表皮分化”應(yīng)理解為指表皮角質(zhì)層的保護(hù)能力的提高和生物學(xué)分化標(biāo)記例如角蛋白的表達(dá)的增加。因此，由于所述活性成分的特殊性質(zhì)，可將其用于旨在增強(qiáng)皮膚的屏障功能和刺激表皮分化的化妝品組合物中。另一方面，可有利地將所述肽水解產(chǎn)物作為活性成分用于旨在預(yù)防性和/或治療性地抵抗皮膚老化更特別的是光誘導(dǎo)皮膚老化(光老化)的跡象的化妝品組合物中。老化或光老化的皮膚跡象應(yīng)理解為指由老化引起的皮膚和上皮附件的外觀的任何改變，例如表皮角質(zhì)層表面粗糙、皺紋和細(xì)紋，但是還指未全身性地表現(xiàn)為改變的外觀的任何皮膚內(nèi)部改變，例如表皮變薄或暴露于紫外線(UV)照射后皮膚的任何其它內(nèi)部降解。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可有利地將所述肽水解產(chǎn)物作為活性成分用于旨在保護(hù)皮膚免受各種類型的外界應(yīng)激的侵害的化妝品組合物中?！巴饨鐟?yīng)激”這一表述應(yīng)理解為環(huán)境可能產(chǎn)生的應(yīng)激。舉例而言，可列舉如下應(yīng)激 污染、UV照射、或其它刺激性產(chǎn)品例如表面活性劑、防腐劑或芳香劑，或者物理應(yīng)力，例如摩擦、剃須或拔毛。污染應(yīng)理解為指由內(nèi)燃機(jī)顆粒、臭氧或重金屬引起的“外界”污染和特別是由油漆、粘合劑或壁紙溶劑(例如甲苯、苯乙烯、二甲苯或苯甲醛)的釋放或者吸煙引起的“內(nèi)部”污染?？諝飧稍镆彩瞧つw應(yīng)激的重要原因。這些外界應(yīng)激引起屏障功能的改變， 其導(dǎo)致皮膚不適、令人不愉快的感覺(jué)現(xiàn)象，例如撕裂痛或搔癢以及甚至是過(guò)度脆弱和發(fā)紅。具體而言，本發(fā)明的目的是本發(fā)明的水解產(chǎn)物在用于預(yù)防或治療皮膚的外界應(yīng)激對(duì)皮膚造成的損害的化妝品組合物中的用途，所述外界應(yīng)激選自機(jī)械處理例如剔須或拔毛、使用去污劑過(guò)度強(qiáng)烈地洗滌、極端氣候條件或溫度和濕度驟變。本發(fā)明的第五個(gè)目的是用于預(yù)防和/或抵抗老化和/或光老化的皮膚跡象的化妝品治療方法，根據(jù)該方法將包含有效量的本發(fā)明的肽水解產(chǎn)物的組合物施用至待治療的區(qū)
9域上。從之前的描述也得到該化妝品治療方法的具體實(shí)施方案。在閱讀了出于說(shuō)明而非限制的目的而提供的實(shí)施例后，本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和特征會(huì)變得更加清楚。


圖1 通過(guò)HPLC獲得的色譜圖實(shí)例，其中示出了對(duì)應(yīng)于單粒小麥水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。圖2 通過(guò)HPLC獲得的色譜圖實(shí)例，其中示出了對(duì)應(yīng)于馬鈴薯水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。圖3 通過(guò)HPLC獲得的色譜圖實(shí)例，其中示出了對(duì)應(yīng)于玉米水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。圖4 通過(guò)HPLC獲得的色譜圖實(shí)例，其中示出了對(duì)應(yīng)于豌豆水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。圖5 通過(guò)HPLC獲得的色譜圖實(shí)例，其中示出了對(duì)應(yīng)于大豆水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。圖6 通過(guò)HPLC獲得的色譜圖實(shí)例，其中示出了對(duì)應(yīng)于釀酒酵母水解產(chǎn)物中的生物活性肽的峰。實(shí)施例1 從單粒小壽(Triticum monococcum)制備肽水解產(chǎn)物在2 % POLYCLAR 10 (聚乙烯吡咯烷酮-PVPP-不溶性)存在下將單粒小麥種子 (Triticum monococcum)置于在10倍體積的水中的溶液中。用IM氫氧化鈉水溶液將混合物調(diào)節(jié)至PH 6-8。調(diào)節(jié)pH后向反應(yīng)介質(zhì)中加入淀粉酶(hasidase )和蛋白酶木瓜蛋白酶)。 于50°C攪拌2小時(shí)后實(shí)現(xiàn)水解。然后通過(guò)將所述溶液加熱至80°C并持續(xù)2小時(shí)使酶失活。 離心后，回收對(duì)應(yīng)于粗單粒小麥水解產(chǎn)物的上清水溶液。選擇水解條件使得能夠富集具有 4-6個(gè)氨基酸的生物活性肽，所述氨基酸包括Gly、Leu和谷氨酸殘基。使用孔隙率不斷降低(最高0. 2 μ m)的kitz-Orion濾板通過(guò)連續(xù)過(guò)濾開(kāi)始粗水解產(chǎn)物的純化過(guò)程以獲得澄明溶液，將其描述為水解產(chǎn)物1。在這一步驟中，單粒小麥水解產(chǎn)物1的特征是具有淺黃色以及干提取物為 20-25g/kg、蛋白質(zhì)水平為10-12g/l以及糖水平為5-8g/l。在NuPAGE Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen)聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分析后證明了水解產(chǎn)物1的蛋白質(zhì)性質(zhì)。在NuPAGE LDS樣品制備緩沖液中，在還原變性條件下，將單粒小麥蛋白水解產(chǎn)物加熱至70°C并持續(xù)10分鐘。將NuPAGE 抗氧化劑溶液加入內(nèi)槽(陰極)以防止被還原的蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中被重新氧化。在NuPAGE MES遷移緩沖液中進(jìn)行蛋白質(zhì)遷移，將標(biāo)準(zhǔn)的keBlue Plus2用作分子量標(biāo)記。使用考馬斯藍(lán) R-250進(jìn)行蛋白質(zhì)染色。在這些條件下，觀察到對(duì)應(yīng)于酶的MkDa處的條帶和小于6kDa的蛋白質(zhì)。然后使用Pellicon 2BiomaX 5kDa超濾膜包通過(guò)超濾純化水解產(chǎn)物1以除去任何微量的酶。在純化末期，獲得黃色-橙色、澄明的肽水解產(chǎn)物。進(jìn)行稀釋步驟以獲得特征是蛋白質(zhì)含量為1. 5-3. 5g/l的肽水解產(chǎn)物。該肽水解產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的活性成分。然后使用由Chen^tation軟件運(yùn)行的HPl 100儀器通過(guò)高壓液相色譜法(HPLC)分析該肽水解產(chǎn)物。在水解產(chǎn)物的洗脫過(guò)程中使用的柱是Nucleosil 300-5 C4 MPN(125x 4mn)柱，使得能夠在如下條件下對(duì)分子量為0. 2-25kDa的蛋白質(zhì)進(jìn)行色譜分析甲醇梯度-Uptisphere OPB 125x3mm 柱-溶劑A包含0. 1 %七氟丁酸(HFBA)的HPLC級(jí)水-溶劑B:HPLC級(jí)甲醇-梯度13min內(nèi) 100% -40 % 溶劑 A，然后在 5min 內(nèi) 40% -10%。在這些色譜條件下可分離幾種肽部分。圖1提供了通過(guò)HPLC (高壓下在液相中的色譜法)獲得的色譜圖的實(shí)例，其中顯示出對(duì)應(yīng)于所述生物活性肽的峰。然后通過(guò)質(zhì)譜法分析這些不同部分以具體鑒定每一個(gè)峰的肽的氨基酸含量。還進(jìn)行了測(cè)序分析以測(cè)定所述生物活性肽的肽序列。還進(jìn)行了本發(fā)明的活性成分的氨基酸組成的測(cè)定。這在進(jìn)行了酸水解和通過(guò)使用以PICT (異硫氰酸苯酯)進(jìn)行預(yù)衍生化的高壓液相色譜法進(jìn)行鑒定之后實(shí)現(xiàn)。所述水解產(chǎn)物的氨基酸組成的實(shí)例列于下表(％ )
權(quán)利要求
1.富含生物活性肽的能夠增強(qiáng)表皮的屏障功能的肽水解產(chǎn)物，其特征在于所述生物活性肽包含4-6個(gè)氨基酸，所述氨基酸包括至少一個(gè)甘氨酸殘基、一個(gè)亮氨酸殘基和一個(gè)谷氨酸殘基。
2.權(quán)利要求1的肽水解產(chǎn)物，其特征在于所述生物活性肽具有通式(I) Xr[Gly, Glu, Leu]-X2-X3其中，X1是丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸，或無(wú)氨基酸，X2是絲氨酸或蘇氨酸，X3是亮氨酸、異亮氨酸，或無(wú)氨基酸。
3.權(quán)利要求2的肽水解產(chǎn)物，其特征在于所述生物活性肽具有如下序列 (SEQ ID No. DAla-Glu-Gly-Leu-Ser-Ile(SEQ ID No. 2)Leu-Gly-Glu-Ser-Leu (SEQ ID No. 3)Val-Gly-Glu-Leu-Thr (SEQ ID No. 4)Ile-Gly-Glu-Leu-Ser (SEQ ID No. 5)Ala-Gly-Glu-Leu-Ser (SEQ ID No. 6)Gly-Glu-Leu-Thr-Ile (SEQ ID No. 7)Gly-Glu-Leu-Ser0
4.前述權(quán)利要求之一的肽水解產(chǎn)物，其特征在于所述肽水解產(chǎn)物來(lái)自選自單粒小麥 (Triticum monococum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、玉米(Zea may ζ L·)、豌豆(Pi sum sativum)或大豆(Glycine Max. L.)的植物的水解。
5.權(quán)利要求1-3之一的肽水解產(chǎn)物，其特征在于所述肽水解產(chǎn)物來(lái)自酵母菌屬的酵母的水解，并且更特別地是來(lái)自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)種的酵母的水解。
6.前述權(quán)利要求之一的肽水解產(chǎn)物，其特征在于所述肽水解產(chǎn)物包含0.5-5.5g/l的肽性化合物。
7.化妝品組合物，所述組合物包含作為能夠增強(qiáng)表皮的屏障功能的活性成分的如前述權(quán)利要求之一定義的肽水解產(chǎn)物，所述肽水解產(chǎn)物在生理學(xué)可接受的介質(zhì)中，其量占所述組合物總重的0. 0001% -20%，并且優(yōu)選其量占所述組合物總重的0. 05% -5%。
8.權(quán)利要求7的組合物，其特征在于所述肽水解產(chǎn)物溶解于一種或多種生理學(xué)可接受的溶劑中，所述溶劑例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、雙丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、環(huán)狀多元醇、白凡士林、植物油或這些溶劑的任意混合物。
9.權(quán)利要求7或8的組合物，其特征在于所述組合物以適合于局部施用的形式存在。
10.權(quán)利要求7-9之一的組合物，其特征在于所述組合物還包含至少一種促進(jìn)所述肽水解產(chǎn)物的作用的其他活性成分。
11.藥物組合物，所述組合物包含作為藥物的如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)定義的肽水解產(chǎn)物，所述肽水解產(chǎn)物在生理學(xué)可接受的介質(zhì)中。
12.有效量的作為激活HMG-CoA還原酶的活性成分的肽水解產(chǎn)物諸如權(quán)利要求1-6之一定義的肽水解產(chǎn)物在化妝品組合物中的用途。
13.權(quán)利要求12的用途，其特征在于所述化妝品組合物用于增強(qiáng)表皮的屏障功能和刺激表皮分化。
14.權(quán)利要求12的用途，其特征在于所述化妝品組合物用于預(yù)防和對(duì)抗老化和光老化的皮膚跡象。
15.權(quán)利要求12的用途，其特征在于所述化妝品組合物用于保護(hù)皮膚免受外界應(yīng)激的侵害。
16.用于預(yù)防或治療老化和/或光老化的皮膚跡象的化妝品治療方法，其特征在于將包含有效量的肽水解產(chǎn)物諸如權(quán)利要求1-6之一定義的肽水解產(chǎn)物的組合物局部施用至待治療的皮膚或上皮附件。
全文摘要
本發(fā)明涉及富含生物活性肽的肽水解產(chǎn)物，其能夠增強(qiáng)皮膚屏障功能和刺激表皮分化。本發(fā)明還涉及化妝品和/或藥物組合物，其包含在生理學(xué)可接受的介質(zhì)中的作為活性成分的所述水解產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的活性成分在化妝品組合物中的用途，所述化妝品組合物用于活化皮膚細(xì)胞中的HMG-CoA還原酶以及用于預(yù)防和控制老化和光老化的皮膚跡象。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102459310SQ201080026811
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日
發(fā)明者C·達(dá)爾法拉, J-M·博托, N·東洛熱 申請(qǐng)人:Isp投資公司