專利名稱：一種從水稻種子中分離純化重組人血清白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從水稻種子中規(guī)模化分離純化重組人血清白蛋白(rHSA)的方法。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是由585個(gè)氨基酸組成的單鏈無糖基化的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為66. 5kD，等電點(diǎn)在4. 7-4. 9之間。它是人體血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的60%左右。每升人血含有HSA約40g。HSA除存在于血漿中外，還存在于組織、身體的分泌液、皮膚和淋巴腔中。在人的正常生理?xiàng)l件下，HSA具有維持血漿膠體滲透壓、營養(yǎng)和促進(jìn)傷口愈合的作用，而且其作為載體物質(zhì)，參與諸多疏水性生物分子如激素、生物學(xué)活性物質(zhì)及藥物在血液中的運(yùn)輸。因此，HSA是一種重要的醫(yī)用蛋白質(zhì)，在臨床上主要用于治療因失血、燒傷、燙傷、整形外科手術(shù)及腦損傷引起的低蛋白血癥以及肝硬化、腎水腫等。目前，臨床上使用的HSA主要是從人源血漿中提取和分離制得。然而，這種制備途徑存在以下缺點(diǎn)一方面血漿來源受到限制，即有限的血液來源難以滿足生產(chǎn)HSA和其相關(guān)制劑的需求；另一方面血液自身也可能存在問題，例如可能含有危險(xiǎn)的傳染病原體如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人們對(duì)于使用血漿中提取的HSA存在巨大的擔(dān)憂。因此，利用DNA 重組技術(shù)生產(chǎn)人血清白蛋白成為當(dāng)務(wù)之急。隨著現(xiàn)代DNA重組和合成技術(shù)的發(fā)展，研究人員對(duì)重組人血清白蛋白(rHSA)的生產(chǎn)和應(yīng)用產(chǎn)生了極大的興趣。迄今為止，人們已經(jīng)試圖利用各種不同的表達(dá)系統(tǒng)來大批量生產(chǎn)rHSA，例如利用原核生物如大腸桿菌(Latta，Μ. et al.，Bio/Technology, 5 1309-1314，(1987))、枯草芽孢桿菌(Saunders, C. W. et al, J. Bacteriol. 169 :2917-2925, (1987))，真核生物如酵母(W0 00/44772，EP0683233A2，US 5612196)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等生產(chǎn) rHSA。但這些方法因表達(dá)水平較低或生產(chǎn)成本較高，不能用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明人的中國專利申請(qǐng)No. 200510019084公開了一種利用水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)rHSA的方法，包括利用水稻胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，介導(dǎo)rHSA 進(jìn)入水稻胚乳細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)，并儲(chǔ)存到水稻胚乳的蛋白體中，從而使rHSA能在水稻種子內(nèi)大量積累，最終達(dá)到較高的表達(dá)水平。所得的rHSA的表達(dá)水平至少達(dá)到水稻種子重量的 0.3%以上。該方法具有表達(dá)量高、成本低的優(yōu)勢，為蛋白藥物的生產(chǎn)開辟了一條新途徑。利用任何表達(dá)體系生產(chǎn)重組蛋白在進(jìn)入市場之前需要純化，而純化工藝的優(yōu)劣不僅影響產(chǎn)品質(zhì)量，還影響生產(chǎn)成本，在純化與加工步驟的成本是整個(gè)成本的80-90%，尤其是從水稻種子中純化重組人血清白蛋白還沒有純化工藝。因此，研究從水稻種子中純化人血清白蛋白的簡單純化工藝和工藝流程，具有很大的技術(shù)難度和風(fēng)險(xiǎn)。目前，國際上還沒有從轉(zhuǎn)基因水稻種子中提取rHSA的工藝，盡管有從酵母和植物懸浮細(xì)胞提取重組人血清白蛋白的技術(shù)，例如中國專利申請(qǐng)CN101768206A公開了一種畢赤酵母表達(dá)的rHSA的純化方法，包括rHSA的發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜處理，依次經(jīng)過陽離子交換層析、疏水層析和弱陰離子交換層析，得到純化的rHSA。然而，由于種子的雜蛋白與酵母和植物懸浮細(xì)胞存在很大差別，這些技術(shù)不能直接用于水稻種子的rHSA的分離與純化，因此有必要研究和開發(fā)一種簡單、高效地從水稻種子中分離純化rHSA的工藝與流程，獲得較高得率、高純度的rHSA，為工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種規(guī)?；膹乃痉N子中分離純化重組人血清白蛋白 (rHSA)的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一種從水稻種子中分離純化重組人血清白蛋白的方法，依次包括步驟1)將重組人血清白蛋白粗提取物經(jīng)陽離子交換層析，得到初級(jí)產(chǎn)物I ；2)將初級(jí)產(chǎn)物I經(jīng)陰離子交換層析，得到中級(jí)產(chǎn)物II ；3)將中級(jí)產(chǎn)物II經(jīng)疏水層析，得到純化的重組人血清白蛋白。步驟1)中，陽離子交換層析的填料可以選自UNO Sphere S,Nuvia S.Capto MMC, MacroPr印-CM等強(qiáng)陽離子層析樹脂。優(yōu)選使用UNO Sphere S。陽離子交換層析可以采用 PH梯度洗脫或者氯化鈉濃度梯度洗脫，優(yōu)選pH梯度洗脫。在一種實(shí)施方式中，陽離子交換層析的洗脫緩沖液包括醋酸鹽緩沖液，0. 25M氯化鈉，pH5. 2。步驟2)中，陰離子交換層析的填料可以選自UNOsphere Q、Q Sepharose FF和DEAE sepharose FF等強(qiáng)陰離子層析樹脂。優(yōu)選使用Q Sepharose FF。在一種實(shí)施方式中，陰離子交換層析的洗脫緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，0. 2M氯化鈉，pH7. 5。步驟3)中，疏水層析的填料可以選自Phenyl sepharose HP、Phenyl sepharoseFF、macro_prep t-butyl 禾口 macro-prep methyl 等。優(yōu)選使用 Phenyl sepharose HP。經(jīng)疏水層析獲得的目標(biāo)洗脫組分可用已知的方法，例如超濾濃縮、冷凍干燥等方法制成成品。在陽離子交換層析中，使用的上樣緩沖液包括醋酸鹽緩沖液，其pH小于5. O。陽離子交換層析中使用的目標(biāo)物(即重組人血清白蛋白)的洗脫緩沖液包括醋酸鹽緩沖液和氯化鈉，或者磷酸鹽緩沖液和氯化鈉；緩沖液的pH為5. 0 pH6. 7。優(yōu)選的氯化鈉的濃度為0. 25M，緩沖液的pH為5. 2。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)陽離子交換層析的填料為UNO Sphere S時(shí)，使用的緩沖液包括醋酸鹽緩沖液、0. 25M氯化鈉，pH5. 2。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)陽離子交換層析的填料為nuvia S時(shí)，洗脫緩沖液包括醋酸鹽緩沖液、0. 25M氯化鈉，pH5. 0。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)陽離子交換層析的填料為Capto MMC時(shí)，洗脫雜質(zhì)使用的緩沖液包括醋酸鹽緩沖液、IM氯化鈉，pH4. 7 ；洗脫目標(biāo)物使用的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液， IM氯化鈉，pH6. 7。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)陽離子交換層析的填料為MacroPrep-CM時(shí)，洗脫雜質(zhì)使用的緩沖液包括醋酸鹽緩沖液、IM氯化鈉，pH4. 7 ；洗脫目標(biāo)物使用的磷酸鹽緩沖液，0. IM氯化鈉，pH6. 5。
在一種實(shí)施方式中，當(dāng)陰離子交換層析的填料為Q Sepharose FF時(shí)，使用的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，0. 25M氯化鈉。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)陰離子交換層析的填料為DEAE sepharose FF時(shí)，洗脫雜質(zhì)使用的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，0. IM氯化鈉，洗脫目標(biāo)物使用的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，0. 25M氯化鈉。在疏水層析中，待純化的含有重組人血清白蛋白的樣品中硫酸銨的濃度為 0. IM IM0在一種實(shí)施方式中，當(dāng)疏水層析的填料為Wienyl s印harose HP時(shí)，待純化的含有重組人血清白蛋白的樣品中硫酸銨的濃度為0. 4M。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)疏水層析的填料為Wienyl s印harose FF時(shí)，待純化的含有重組人血清白蛋白的樣品中硫酸銨的濃度為0. 1M。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)疏水層析的填料為MacroPr印-t-Butyl時(shí)，待純化的含有重組人血清白蛋白的樣品中硫酸銨的濃度為0. 6 1. 0M。本發(fā)明的所述重組人血清白蛋白可以通過本申請(qǐng)人的中國專利申請(qǐng) No. 200510019084. 4中公開的方法利用水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)。在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)的重組人血清白蛋白可以通過本發(fā)明人于2010年12月20日提交的中國專利申請(qǐng)No. 201010597544. 2中公開的方法提取，優(yōu)選地包括步驟i)將含有重組人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因稻米與提取緩沖液按重量/體積比(kg/ 1)1 5混合，在55 60°C下提取1 1. 5小時(shí)；提取緩沖液包含10 30mM磷酸鹽緩沖液、10 20mM醋酸鈉、15 30mM硫酸銨與5 20mM辛酸鈉，其pH為6. 5 8 ；ii)將步驟i)的提取混合物的pH用醋酸調(diào)節(jié)至4. 0 4. 5，并沉淀3 12小時(shí)；iii)過濾步驟ii)的混合物，通過壓濾或等同方法去除淀粉，然后收集濾液，獲得含有高濃度重組人血清白蛋白的粗提溶液。在一種實(shí)施方式中，步驟iii)的過濾包括用濾布式板框壓濾機(jī)壓濾，接著用中空纖維膜微濾。所述中空纖維膜為孔徑0. 20 μ m 0. 45 μ m的聚醚砜材質(zhì)中空纖維膜，優(yōu)選為孔徑0. 20 μ m的聚醚砜中空纖維膜。本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下有益效果1、本發(fā)明針對(duì)水稻種子中具有較高含量色素和多糖類物質(zhì)，在第一步使用陽離子交換層析，能有效地提高了捕獲重組人血清白蛋白的載量，提高了層析效率，若使用陰離子作為第一步層析，捕獲重組人血清白蛋白的載量是理論載量的20%左右；同時(shí)由于在UNO Sphere S在氫氧化鈉中具有極高的穩(wěn)定性和很長的壽命，延長了填料的折舊期和簡化了清洗操作，進(jìn)一步降低了目標(biāo)產(chǎn)品的成本。2、本發(fā)明在第二步使用陰離子交換層析，加之洗脫的優(yōu)化條件，可以去除80%以上的水稻種子的雜蛋白，能有效地去除雜蛋白質(zhì)和回收重組人血清白蛋白；種子中色素和多糖類物質(zhì)通過第一步陽離子交換層析給予去除，消除了種子中色素和多糖類物質(zhì)在第二步陰離子層析的載量和純度的影響。3、本發(fā)明在第三步使用疏水介質(zhì)層析，通過三步層析法，使純化的目標(biāo)產(chǎn)品的 HPLC純度達(dá)到99. 0%以上。


圖1 以陽離子交換層析作為初級(jí)純化，用不同填料進(jìn)行層析時(shí)的電泳圖譜，其中 A 為 UNOsphere S 填料，B 為 Nuvia S 填料，C 為 Capto MMC 填料，D 為 MacroPr印-CM 填料。圖 2 =Nuvia S 和 UNO Sphere S ±真料在不同流速下(300cm/h 和 600cm/h)對(duì) rHSA 提取液樣品的載量比較圖；圖3 以陰離子交換層析作為初級(jí)純化，用不同填料進(jìn)行層析時(shí)的電泳圖譜，其中 A 為 UNO Sphere Q 填料；B 為 Q Sepharose FF 填料；圖4:透析前后Q Sepharose FF填料對(duì)rHSA提取液的載量變化和提取液樣品的多糖含量變化圖；圖5 以陰離子交換層析作為中級(jí)純化，用不同填料進(jìn)行層析時(shí)的電泳圖譜，其中 A 為 Q Sepharose FF 填料；B 為 DEAE sepharose FF 填料；圖6:以疏水層析作為末級(jí)純化，用不同填料進(jìn)行層析時(shí)的電泳圖譜，其中A為 Phenyl Sepharose HP 填料，B 為 Phenyl Sepharose FF 填料，C 為 MacroPr印-t-Butyl 填料；圖7 含有rHSA的粗提取液依次經(jīng)陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水層析進(jìn)行純化的電泳圖譜，其中使用的填料依次為UNOsphere S、Q kpharoseFF和Wienyl Sepharose HP ；圖8 純化后獲得的rHSA產(chǎn)品的HPLC純度圖譜(HPLC-SEC)；上述附圖中，S 上樣樣品，F(xiàn)T 穿透峰，Elu :rHSA洗脫峰，Elul 雜質(zhì)洗脫峰，Elu2 rHSA洗脫峰，CIP 在位清洗。
具體實(shí)施例方式通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的舉例說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。^ ？ 本發(fā)明人將所需要篩選的填料限定為具有較高工作流速的陽離子交換樹脂，包括伯樂公司生產(chǎn)的UNO Sphere S, Nuvia S、Capto MMC等填料。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Capto MMC蛋白純化效果最好；Nuvia S與UNO Sphere S次之， Nuvia S與UNO Sphere S對(duì)白蛋白純化無明顯區(qū)別，三者均可用于重組人血清白蛋白的純化。但是，在工作流速下UNO Sphere S的載量是Capto MMC的1. 5倍；UNO Sphere S的工作流速與Capto MMC相同；該填料比即使在高濃度的氫氧化鈉中也具有極佳的穩(wěn)定性，清洗工藝、使用壽命和價(jià)格優(yōu)于CaptoMMC。Nuvia S和UNO Sphere S是性質(zhì)極為接近的兩種填料，區(qū)別在于配基延伸的長度和基質(zhì)顆粒大小。在各自最佳工作流速下Nuvia S的載量為UNO S的1. 4倍；但是Nuvia S工作流速為UNO Sphere S的一半，UNO Sphere S在同樣流速下載量反而比Nuvia S大； 且兩者之間純化能力相當(dāng)。綜合各種因素，將UNO Sphere S作為優(yōu)選的陽離子層析介質(zhì)。將含有rHSA的提取液以較低的pH值(pH = 4. 4)上樣于裝有UNO SphereS的層析柱上，以確保rHSA能夠完全被吸附在柱子上，然后分別采用pH梯度和氯化鈉梯度兩種方法經(jīng)行洗脫，了解基本的洗脫條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH梯度洗脫中，吸附在UNO Sphere S層析柱上的rHSA，當(dāng)pH大于 5. 5時(shí)開始微弱地解吸附，預(yù)示料液的上樣pH不能大于5. 5 ；當(dāng)洗脫液pH為5. 68時(shí)，rHSA 完全從柱上被洗脫下來。因此rHSA在UNO Sphere S層析柱上對(duì)pH洗脫十分敏感。在氯化鈉濃度梯度洗脫中，目標(biāo)蛋白rHSA在35%氯化鈉濃度到60% IM氯化鈉濃度梯度范圍內(nèi)都有rHSA被洗脫下來，據(jù)此認(rèn)為rHSA在UNO Sphere S層析柱上對(duì)氯化鈉濃度梯度洗脫并不敏感。結(jié)果證明PH梯度和氯化鈉梯度均可用于洗脫rHSA :pH梯度能夠較快洗脫rHSA， 洗脫體積小，而氯化鈉梯度則不易洗脫rHSA，所需氯化鈉濃度較高，而且洗脫體積大。綜合考慮純化效果和回收率，以0. 25M氯化鈉，pH 5. 2作為優(yōu)選的洗脫條件。議種·豐斤Φ··聽膽·白句·和陽離子一樣，陰離子也可以用于重組人血清白蛋白的純化，本發(fā)明限定流速和載量都很高的陰離子填料，包括UNOsphere Q、Q Sepharose FF和DEAE sepharose FF等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，它們均可用于純化重組人血清白蛋白，UNOsphere Q比Q Sepharose FF流速更大， 但Q Sepharose FF 比 UNOsphere Q 的純化效果更好；而DEAE Sepharose FF 與 Q Sepharose FF純化效果相似，但是流速較慢。如前所述，UNO-sphere S作為陽離子交換層析中的介質(zhì)，其具有純化能力相對(duì)于 Capto MMC略顯不足的缺點(diǎn)，然而，通過實(shí)驗(yàn)證明，這種不良影響可以被系統(tǒng)純化能力的提升所消除。UNO-sphere S不會(huì)對(duì)下一步陰離子交換層析造成其他不良影響。在陰離子交換層析中，優(yōu)選用Q sepharose FF作為層析介質(zhì)；例如，洗脫目標(biāo)物的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液和0. 2M氯化鈉，pH6. 8。陰陽離子交換層析順序的確定陰陽離子交換層析均可以用于重組人血清白蛋白的初步純化，但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 陰離子交換層析Q Sepharose FF用于初步純化時(shí)，載量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于理論載量，疑為水稻中大量可溶性多糖和核酸有關(guān)，因?yàn)榭扇苄远嗵呛秃怂釒ж?fù)電荷，可以與陰離子交換層析Q Sepharose FF結(jié)合而降低其載量，實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過透析可以降低提取液中的可溶性多糖的含量，而提高Q Sepharose FF的載量。而陽離子交換層析填料UNOsphere S，Nuvia S和Capto MMC則不與可溶性多糖和核酸相互結(jié)合，不出現(xiàn)載量下降的情況。因此確定陽離子交換層析作為初步純化，而陰離子交換層析作為中度純化。疏水層析中層析介質(zhì)的篩選本發(fā)明分別用多種具有相近性質(zhì)的疏水性填料來進(jìn)行該純化步驟，包括Wienyl sepharose HP> Phenyl sepharose FF(LS)、macro-prep t-butyl 禾口 macro-prep methyl。Phenyl sepharose HP疏水填料的疏水性較強(qiáng)；純化能力突出，能夠去除相當(dāng)部分的雜蛋白和原料中的非蛋白質(zhì)成分，是決定工藝純化效果的最重要步驟。但是由于該填料顆粒較細(xì)、流速低，工作模式特殊，在應(yīng)用上也帶來了不便。Phenyl sepharose FF(LS)與 Phenyl sepharose HP 相比，具有相同的配基和基質(zhì)，不同之處在于球狀基質(zhì)的直徑和配基的密度。前者的基質(zhì)平均粒徑比后者大3倍左右， 因此具備較高的工作流速。應(yīng)用于rHSA生產(chǎn)，則可以縮短生產(chǎn)周期。MacroPr印-Butyl則比 Phenyl sepharose FF, Phenyl sepharose HP 疏/Jcj"生更i看。而 Macro—prep methyl 白勺疏7jCt生比 MacroPrep—Butyl 尋看。Phenyl sepharose FF擬采用禾口 Phenyl sepharose HP相同的收集穿透的工作方式。在上樣鹽濃度的篩選中，當(dāng)以25mM ΡΒ+0. 5M(NH4)2S04PH6. 8的平衡液上樣，以100%水洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)有超過50%的rHSA都掛在柱上，平衡液的鹽濃度需要調(diào)低。將經(jīng)過UNOsphere S和Q sepharose FF處理后的樣品調(diào)整硫酸銨濃度分別為 0. 2M和0. IM后，上樣于裝有Wienyl sepharose FF (U)的層析柱上，收集穿透液和純水洗脫液，并進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Phenyl sepharose FF(LS)和Phenyl sepharose HP 相比具有更高的疏水性，在上樣料液中硫酸銨濃度低至0. IM時(shí)仍然對(duì)樣品的雜蛋白具有較好的去除效果，得到純度為93. 5%的樣品，但經(jīng)檢測，仍有30% rHSA左右的樣品損失于 Phenyl sepharose FF(U)。用氯化鈉取代硫酸銨進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，得到與硫酸銨相似的結(jié)果，吸附在柱子上而損失的rHSA有所減少，但是HPLC純度93%。將經(jīng)過UNO sphere S和Q sepharose FF處理后的樣品調(diào)整硫酸銨濃度分別為1M、 0. 8M或0. 6M后，上樣于分別裝有macro-pr印t-butyl禾口 macro-pr印methyl的層析柱上， 收集穿透液和純水洗脫液，并進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，macro-pr印t-butyl和macro-pr印 methyl的疏水性較差。兩者對(duì)rHSA的純化能力均較差，純化的得到的rHSA經(jīng)HPLC檢測結(jié)果純度為90%。綜上所述，其他填料與Wienyl sepharose HP相比的優(yōu)點(diǎn)是可以在高流速下工作， 然而它們都不能達(dá)到與Phenyl sepharose HP相當(dāng)?shù)募兓Ч?。Phenyl sepharose HP的處理速度較慢，但可以確保目標(biāo)蛋白質(zhì)有大于98%的純度，優(yōu)選用Wienyl sepharose HP作為疏水層析介質(zhì)。實(shí)施例材料及儀器濾布式板框壓濾機(jī)，型號(hào)XMS4/500-UB，制造商上海天立壓濾機(jī)技術(shù)有限公司0. 20 μ m中空纖維柱，購自湖州科濾膜技術(shù)有限公司UNO Sphere S、nuvia S、Capto MMC, MacroPrep-CM, MacroPrep-methyl, MacroPr印-Butyl ±真料，生產(chǎn)商是伯樂(BIO-RAD)公司Q sepharose, Phenyl sepharose HP, Phenyl sepharose FF, DEAE-sepharoseFF 填料，生產(chǎn)商是通用電氣(GE Healthcare)公司C10//10, XK 16/20 層析柱，購自通用電氣(GE Healthcare)公司Biological 15/200 層析柱，購自伯樂(BI0-RAD)公司實(shí)施例1從轉(zhuǎn)基因稻米中提取rHSA參考本發(fā)明人的中國專利申請(qǐng)No. 200510019084的方法制備含有rHSA的轉(zhuǎn)基因水稻。將轉(zhuǎn)基因稻谷脫殼成半精米，研磨成80 100目的米粉。將米粉與提取緩沖液以 1 5(重量/體積，kg/Ι)的比例混合，于60°C提取1.5小時(shí)。提取緩沖液的成分為25mM 磷酸鹽緩沖液、20mM醋酸鈉、IOmM硫酸銨、IOmM辛酸鈉，pH7. 5。將上述得到的混合物用醋酸調(diào)節(jié)PH至4. 5，并放置沉淀至少3小時(shí)，依次經(jīng)濾布式板框壓濾機(jī)壓濾和孔徑0. 20μπι的聚醚砜中空纖維柱過濾，得到澄清的rHSA提取液。目標(biāo)蛋白rHSA的濃度約為0. 66mg/ml。實(shí)施例2通過陽離子交換層析進(jìn)行初級(jí)純化1、利用UNO Sphere S進(jìn)行陽離子交換層析
將UNO Sphere S填料約8. 7ml裝于XK16/100層析柱上，用200ml緩沖液(無水醋酸鈉28/1，醋酸調(diào)節(jié)？!1為4.5)以300cm/h的流速平衡柱子，直到其pH值無變化。將實(shí)施例1中獲得的含有rHSA的提取液樣品250ml以600cm/h的流速上柱。樣品電導(dǎo)為6. Ims/ cm。樣品的pH為4. 53。上樣結(jié)束后，用緩沖液(醋酸鈉2g/L、醋酸pH 5. 2、氯化鈉14. 61g/ L)以300cm/h的流速洗脫樣品，收集洗脫液，得到含有rHSA的組分。電泳圖譜如圖IA所
7J\ ο2、利用Nuvia S進(jìn)行陽離子交換層析將Nuvia S填料約9. 3ml裝于XK16/100層析柱上，用200ml緩沖液(無水醋酸鈉 2g/L，以醋酸調(diào)節(jié)至pH 4.5)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH值穩(wěn)定。將實(shí)施例1中獲得的含有rHSA的提取液樣品250ml以300cm/h的流速上柱。樣品電導(dǎo)為6. !Ms/cm。樣品的PH為4. 56。上樣結(jié)束后，用緩沖液(醋酸鈉2g/L、醋酸pH5.0、氯化鈉14.61g/L)以 300cm/h的流速洗脫樣品，收集洗脫液，得到含有rHSA的組分。電泳圖譜如圖IB所示。3、利用Capto MMC進(jìn)行陽離子交換層析將Capto MMC填料約15. Iml裝于XK16/100層析柱上，用200ml緩沖液(無水醋酸鈉2g/L，以醋酸調(diào)節(jié)至pH4. 5)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH達(dá)到4. 5左右，并穩(wěn)定。將實(shí)施例1中獲得的含有rHSA的提取液樣品250ml以600cm/h的流速上柱。樣品電導(dǎo)為6.;3mS/Cm。樣品的pH為4. 56。上樣結(jié)束后，用緩沖液(醋酸鈉2g/L、醋酸pH4. 7、氯化鈉58.44g/L)以300cm/h的流速洗脫雜質(zhì)，雜質(zhì)峰洗脫完畢之后，用洗脫緩沖液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L、氯化鈉58. 44g/L，pH6. 7)洗脫樣品，得到含有rHSA的組分。電泳圖譜如圖IC所示。4、MacroPr印-CM進(jìn)行陽離子交換層析將MacroPr印-CM填料約IOml裝于16/100層析柱上，用300ml緩沖液(無水醋酸鈉2g/L，以醋酸調(diào)節(jié)至pH4. 5)以流速200cm/h平衡柱子，直到其pH達(dá)到4. 5左右，并穩(wěn)定。 將實(shí)施例1中獲得的含有rHSA的提取液樣品250ml以300cm/h的流速上柱。樣品電導(dǎo)為 6. 3ms/cm0樣品的pH為4. 56。上樣結(jié)束后，用緩沖液(醋酸鈉2g/L、醋酸pH4. 7、氯化鈉 58. 44g/L)以200cm/h的流速洗脫雜質(zhì)，雜質(zhì)峰洗脫完畢之后，用洗脫緩沖液(磷酸二氫鈉 0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L、氯化鈉5. 84g/L，pH6. 5)洗脫樣品，得到含有rHSA的組分。電泳圖譜如圖ID所示。5、Nuvia S和UNO Sphere S對(duì)提取液的載量比較將Nuvia S, UNO Sphere S填料約5ml分別裝于C10/100層析柱上，用200ml緩沖液(無水醋酸鈉2g/L，以醋酸調(diào)節(jié)至pH4. 5)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH達(dá)到4. 5 左右，并穩(wěn)定，將實(shí)施例1獲得的含有rHSA的提取液樣品以300cm/h分別上到Nuvia S和 UNO Sphere S上，記錄上樣過程的UW80，直到UV280超過平臺(tái)期10%為止，記錄上樣量，計(jì)算出300cm/h流速下，每毫升Nuvia S，UNO Sphere S的實(shí)際載量。同時(shí)，再用緩沖液(無水醋酸鈉2g/L，以醋酸調(diào)節(jié)至pH 4.5)以流速300cm/h平衡UNO Sphere S，直到其pH達(dá)到 4. 5左右，并穩(wěn)定，將實(shí)施例1獲得的含有rHSA的提取液樣品以600cm/h上到UNOSphere S 上，記錄上樣過程的UW80，直到UV280超過平臺(tái)期10%為止，記錄上樣量，計(jì)算出600cm/h 流速下，每毫升UNO Sphere S的實(shí)際載量。載量比較如圖2所示。實(shí)施例3通過陰離子交換層析進(jìn)行初級(jí)純化
10
1、利用UNO Sphere Q進(jìn)行陰離子交換層析將UNO Sphere Q 填料約 IOml 裝于 Biological 15/200 層析柱上，用 200ml 緩沖液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，用氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)其pH為7. 5)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH達(dá)到7.0左右，并穩(wěn)定。將實(shí)施例1中的提取液pH調(diào)至 7. 5，并用緩沖液稀釋直到其電導(dǎo)低于10. 0ms，將該樣品以300cm/h的流速上到UNO Sphere Q上，用洗脫液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，氯化鈉11. 68g/L)洗脫雜質(zhì)，雜質(zhì)峰洗脫完畢后，再用洗脫液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，氯化鈉23. 36g/L)洗脫并收集，得到含rHSA組分。電泳圖譜如圖3A所示。2、利用Q Sepharose FF進(jìn)行陰離子交換層析將Q Sepharose FF ±真料約 IOml 裝于 Biological 15/200 層析柱上，用 200ml 緩沖液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，用氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)其pH為7. 0)以流速 300cm/h平衡柱子，直到其pH達(dá)到7.0左右，并穩(wěn)定。將實(shí)施例1中的提取液pH調(diào)至6. 8， 并用緩沖液稀釋直到其電導(dǎo)低于10. 0ms，將該樣品以300cm/h的流速上到Q Sepharose FF 上，用洗脫液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，氯化鈉5. 84g/L)洗脫并收集，得到含rHSA的組分。電泳圖譜如圖:3B所示。3、Q Sepharose FF的實(shí)際載量測試將Q Sepharose FF填料約5ml裝于10/100層析柱上，用200ml緩沖液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，用氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)其pH為7. 0)以流速300cm/h平衡柱子，直到其PH達(dá)到7. 5左右，并穩(wěn)定。將實(shí)施例1中的提取液pH調(diào)至7. 5，并用緩沖液稀釋直到其電導(dǎo)低于10. 0ms，總體積1000ml，將該樣品以300cm/h的流速上到Q Sepharose FF 上，記錄上樣過程的UW80，直到UV280超過平臺(tái)期10%為止，記錄上樣量，計(jì)算出300cm/h 流速下，每毫升Q Sepharose FF的對(duì)提取液實(shí)際載量；結(jié)束并再生樹脂。將實(shí)施例1中的提取液的PH調(diào)至7.0，并用緩沖液稀釋直到其電導(dǎo)低于10. 0ms，通過GE 30KD膜包濃縮到 400ml，用硫酸-苯酚法測定透析前后的多糖含量，再將該樣品上到平衡好的Q Sepharose FF填料中，記錄上樣過程的UW80，直到UV280超過平臺(tái)期10%為止，記錄上樣量，計(jì)算出 300cm/h流速下，每毫升Q Sepharose FF的對(duì)透析后提取液的實(shí)際載量。載量變化和提取液中多糖含量的變化如圖4所不。實(shí)施例4通過陰離子交換層析進(jìn)行中級(jí)純化將實(shí)施例2中得到的含有rHSA的組分，平均分成兩等分，作為料液。1、利用Q Sepharose FF進(jìn)行陰離子交換層析將Q Sepharose FF填料約7ml裝于15/200層析柱上，用200ml緩沖液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，用氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)其pH為7. 0)以流速300cm/h 平衡柱子，直到其PH達(dá)到7. 0左右，并穩(wěn)定。將上述其中一份料液的pH調(diào)至7. 0，并用緩沖液稀釋直到其電導(dǎo)低于10. 0ms，將該樣品以300cm/h的流速上到Q Sepharose FF上，用洗脫液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，氯化鈉5. 84g/L)洗脫雜質(zhì)，雜質(zhì)峰洗脫完畢后，再用洗脫液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，氯化鈉11.68g/L)洗脫并收集，得到含rHSA的組分。電泳圖譜如圖5A所示。2、利用DEAE Sepharose FF進(jìn)行陰離子交換層析將DEAE Sepharose FF ±真料約 8ml 裝于 Biological 15/200 層析柱上，用 200ml 緩沖液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，用氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)其pH為7. 0)以流速300cm/h平衡柱子，直到其pH達(dá)到7. 0左右，并穩(wěn)定。將上述另一份料液的pH調(diào)至7. 5， 并用緩沖液稀釋直到其電導(dǎo)低于10. 0ms，將該樣品以300cm/h的流速上到DEAE Sepharose FF上，用洗脫液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，氯化鈉5. 84g/L)洗脫雜質(zhì)，雜質(zhì)峰洗脫完畢后，再用洗脫液(磷酸二氫鈉0. 3g/L，磷酸氫二鈉3. 5g/L，氯化鈉11.68g/L)洗脫并收集，得到含rHSA的組分。電泳圖譜如圖5B所示。實(shí)施例5通過疏水層析講行末級(jí)純化1、利用Wienyl s印harose HP進(jìn)行疏水層析將Phenyl s印harose HP填料約8ml裝于XK16/100層析柱上，用200ml緩沖液 (無水醋酸鈉2. 32g/L，磷酸二氫鈉2. 81g/L，硫酸銨66g/L)以流速lOOcm/h平衡柱子。將上述實(shí)施例4 Sepharose FF)獲得的含有rHRA的洗脫餾分20ml加入硫酸銨(0. 4M)，使其電導(dǎo)為80. Oms,以lOOcm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有rHSA的組分。電泳圖譜如圖6A所示。2、利用Phenyl s印harose FF進(jìn)行疏水層析將Phenyl s印harose FF填料約IOml裝于XK16/100層析柱上，用200ml緩沖液 (無水醋酸鈉2. 32g/L，磷酸二氫鈉2. 81g/L，硫酸銨13. 2g/L)以流速150cm/h平衡柱子。 將上述實(shí)施例4 Sepharose FF)獲得的含有rHRA的洗脫餾分20ml加入硫酸銨(0. 1M)， 使其電導(dǎo)為80. 0ms,以150cm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有rHSA的組分。電泳圖譜如圖6B所示。3、利用MacroPr印-t-Butyl進(jìn)行疏水層析將Macroft·印-t-Butyl填料約6ml裝于15/200層析柱上，用200ml緩沖液(無水醋酸鈉2. 32g/L，磷酸二氫鈉2. 81g/L，硫酸銨13. 2g/L)以流速150cm/h平衡柱子。將上述實(shí)施例3 (Q Sepharose FF)獲得的含有rHRA的洗脫組分分別加入硫酸銨至1. 0,0. 8,0. 6M， 使其電導(dǎo)分別為130. 0,90. 0,70. 0ms,以150cm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有rHSA 的組分。電泳圖譜如圖6C所示。實(shí)施例6從含有rHSA的提取液中分離純化rHSA陽離子交換層析作為初級(jí)純化將UNO Sphere S填料約12ml裝于XK16/20層析柱上，用500ml緩沖液(無水醋酸鈉2g/L，以醋酸調(diào)節(jié)至pH 4. 5)以流速300cm/h平衡柱子。將實(shí)施例1中獲得的含有rHSA的溶液樣品300ml以600cm/h的流速上柱。樣品電導(dǎo)為6.5mS/cm。樣品的pH為4.5。上樣結(jié)束后，用緩沖液(醋酸鈉2g/L、醋酸pH 5. 0、氯化鈉14.61g/L)以200cm/h的流速洗脫樣品，收集洗脫液，獲得含有rHRA的洗脫液。電泳圖譜如圖7A所示。陰離子交換層析作為中級(jí)純化將Q s印harose FF填料約13ml裝于16/100層析柱上，用400ml緩沖液(無水醋酸鈉6. 51g/L，磷酸二氫鈉0. 72g/L，調(diào)至pH6. 8)以流速 300cm/h平衡柱子。將上述獲得的含有rHRA的洗脫餾分稀釋到電導(dǎo)小于10. 0ms，約200ml， 以300cm/h的流速上柱。樣品電導(dǎo)為8.;3mS/Cm。樣品的pH為6. 8。上樣結(jié)束后，用緩沖液 (磷酸氫二鈉6. 51g/L、磷酸二氫鈉0. 72g/L、氯化鈉11. 69g/L)以lOOcm/h的流速洗脫樣品，收集洗脫液，獲得含有rHRA的洗脫液。電泳圖譜如7B所示。疏水層析作為末級(jí)純化將Wienyl s印harose填料約12ml裝于XK16/100層析柱上，用200ml緩沖液(無水醋酸鈉2. 32g/L，磷酸二氫鈉2. 81g/L，硫酸銨66g/L)以流速 lOOcm/h平衡柱子。將上述獲得的含有rHRA的洗脫組分加入硫酸銨，使其電導(dǎo)為90ms，以 lOOcm/h的流速上柱。收集穿透液，得到含有rHSA的組分。電泳圖譜如圖7C所示。HPLC 檢測結(jié)果如圖8所示。rHSA的HPLC純度為99%。
權(quán)利要求
1.一種從水稻種子中分離純化重組人血清白蛋白的方法，依次包括步驟1)將重組人血清白蛋白粗提取物經(jīng)陽離子交換層析，得到初級(jí)產(chǎn)物I；2)將初級(jí)產(chǎn)物I經(jīng)陰離子交換層析，得到中級(jí)產(chǎn)物II；3)將中級(jí)產(chǎn)物II經(jīng)疏水層析，得到純化的重組人血清白蛋白目標(biāo)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中陽離子交換層析的填料選自UNOSphereS、Capto MMC、Nuvia S 和 MacroPr印-CM。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中陽離子交換層析的填料為UNOSphere S。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中陰離子交換層析的填料選自QSepharose FF、UN0 Sphere Q 禾口 DEAE sepharose FF0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中陰離子交換層析的填料為QSepharose FF。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中疏水層析的填料選自Wienylsepharose HP、 Phenyl sepharose FF、macro-prep t-butyl 禾口 macro-prep methyl0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中疏水層析的填料為I^henylsepharose HP。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重組人血清白蛋白粗提取物是通過下述方法制備，包括步驟i)將含有重組人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因稻米與提取緩沖液按重量/體積比(kg/l)l 5 混合，在55 60°C下提取1 1. 5小時(shí)；提取緩沖液包含10 30mM磷酸鹽緩沖液、10 20mM醋酸鈉、15 30mM硫酸銨與5 20mM辛酸鈉，其pH為6. 5 8 ；ii)將步驟i)的提取混合物的PH調(diào)節(jié)至4.O 4. 5，并沉淀3 12小時(shí)；iii)過濾步驟ii)的混合物，收集濾液，獲得含有高濃度重組人血清白蛋白的粗提溶液；所述過濾包括用濾布式板框壓濾機(jī)壓濾，接著用中空纖維膜微濾；所述中空纖維膜為孔徑0. 20 μ m 0. 45 μ m的聚醚砜材質(zhì)中空纖維膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中陽離子交換層析中使用的上樣緩沖液包括醋酸鹽緩沖液，其PH小于5. O。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中陽離子交換層析中使用的洗脫目標(biāo)物的緩沖液包括醋酸鹽緩沖液和氯化鈉，或者磷酸鹽緩沖液和氯化鈉；緩沖液的pH為5. O 6. 7。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中當(dāng)陽離子交換層析的填料為UNOSphereS時(shí)，使用的緩沖液包括醋酸鹽緩沖液、0. 25M氯化鈉，pH5. 2。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中當(dāng)陽離子交換層析的填料為NuviaS時(shí)，洗脫緩沖液包括醋酸鹽緩沖液、0. 25M氯化鈉，pH5. O。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中當(dāng)陽離子交換層析的填料為CaptoMMC時(shí)，洗脫雜質(zhì)使用的緩沖液包括醋酸鹽緩沖液、IM氯化鈉，pH4. 7 ；洗脫目標(biāo)物使用的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，IM氯化鈉，pH6. 7。
14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中當(dāng)陽離子交換層析的填料為MacroPrep-CM時(shí)，洗脫雜質(zhì)使用的緩沖液包括醋酸鹽緩沖液、IM氯化鈉，pH4. 7 ；洗脫目標(biāo)物使用的磷酸鹽緩沖液，0. IM氯化鈉，pH6. 5。
15.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中當(dāng)陰離子交換層析的填料為QkpharoseFF時(shí)， 使用的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，0. 25M氯化鈉。
16.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中當(dāng)陰離子交換層析的填料為DEAEwpharoseFF時(shí)，洗脫雜質(zhì)使用的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，0. IM氯化鈉，洗脫目標(biāo)物使用的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，0. 25M氯化鈉。
17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在疏水層析中，待純化的含有重組人血清白蛋白的樣品中硫酸銨的濃度為0. IM 1M。
18.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中當(dāng)疏水層析的填料為WienyIs印haroseHP時(shí)，待純化的含有重組人血清白蛋白的樣品中硫酸銨的濃度為0. 4M。
19.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中當(dāng)疏水層析的填料為WienyIs印haroseFF時(shí)，待純化的含有重組人血清白蛋白的樣品中硫酸銨的濃度為0. 1M。
20.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中當(dāng)疏水層析的填料為MacroPr印-t-Butyl時(shí)，待純化的含有重組人血清白蛋白的樣品中硫酸銨的濃度為0. 6 1. 0M。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從轉(zhuǎn)基因水稻中分離純化重組人血清白蛋白的方法，依次包括步驟1)將重組人血清白蛋白粗提取物進(jìn)行陽離子交換層析，得到初級(jí)產(chǎn)物I；2)將初級(jí)產(chǎn)物I進(jìn)行陰離子交換層析，得到中級(jí)產(chǎn)物II；3)將中級(jí)產(chǎn)物II進(jìn)行疏水層析，得到純化的重組人血清白蛋白。該方法成本低，易于操作，并且獲得的rHSA達(dá)到99％以上的HPLC純度。
文檔編號(hào)C07K14/765GK102532254SQ20101060663
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者何洋, 李光飛, 楊代常 申請(qǐng)人:武漢禾元生物科技有限公司