專利名稱：分離自猿腺病毒血清型19的六鄰體、其高變區(qū)和使用其的嵌合型腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離自猿腺病毒血清型19(“SAdl9”)的新六鄰體，其高變區(qū)(“HVR”)，使用其的嵌合型腺病毒及其治療用途。
背景技術(shù)：
腺病毒屬于腺病毒科(Adenoviridae)，其于1953年首次分離。根據(jù)基因組的相似性、致癌性和血液凝固特性，將人腺病毒分為六(6)個(gè)亞屬(A至F)。腺病毒感染大多數(shù)非分裂細(xì)胞如肌肉細(xì)胞、肺細(xì)胞、腦細(xì)胞和心臟細(xì)胞，其分子生物學(xué)特征為本領(lǐng)域所熟知。腺病毒基因組由35kb的線性、雙鏈DNA組成，其在宿主細(xì)胞中的復(fù)制依賴于病毒蛋白E1A。通過使用將其ElA刪除后的非復(fù)制性載體，可對(duì)上述腺病毒的特征加以利用。由于插入有腺病毒El基因的HEK293細(xì)胞系的研制，腺病毒載體系統(tǒng)已經(jīng)應(yīng)用于許多研究中，其導(dǎo)致了利用宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性的病毒療法的發(fā)展。2005年在中國(guó)商業(yè)化的融瘤病毒治療劑安柯瑞(Oncorine' )是E1B55-缺失型腺病毒，其用于在p53-缺失型腫瘤中選擇性誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡。在開發(fā)選擇性復(fù)制的腺病毒治療劑的過程中，最重要的是ElA蛋白的選擇性表達(dá)，已經(jīng)有很多案例表明使用腫瘤選擇性表達(dá)啟動(dòng)子與可能的腫瘤-選擇性腺病毒基因治療劑有關(guān)。大多數(shù)腫瘤-選擇性腺病毒是使用通常發(fā)現(xiàn)的人腺病毒血清型5( “HAd5”)制備的。據(jù)報(bào)道，由于HAd5占80%的普遍性，因此人具有高水平的腺病毒中和抗體(Appaiahgari, M. B.等人，(2007)臨床及疫苗免疫學(xué)(Clinical and VaccineImmunol.) 14，1053-1055)。針對(duì)腺病毒衣殼蛋白的這些中和抗體影響腺病毒系統(tǒng)用藥的藥效和毒性(Chen, Y.等人，(2000)人類基因治療(Hum. Gene Ther.) 11，1553-1567)。病毒衣殼由三(3)種蛋白即六鄰體、纖毛和五鄰體組成，其包括具有由240個(gè)六鄰 體和12個(gè)五鄰體組成的對(duì)稱二十面體結(jié)構(gòu)的殼粒(capsomere)。每個(gè)五鄰體均結(jié)合突出的7(Tl00nm的三聚體纖毛。當(dāng)被腺病毒感染時(shí)，三聚體纖毛在腺病毒感染過程中附著于宿主細(xì)胞表面膜上的柯薩奇腺病毒受體(CAR)。五鄰體的R⑶區(qū)結(jié)合至整合蛋白，其導(dǎo)致病毒吸附并侵入至宿主細(xì)胞內(nèi)。據(jù)報(bào)道，六鄰體蛋白的環(huán)I (LI)和環(huán)2(L2)暴露于病毒殼粒結(jié)構(gòu)的外部。LI和L2分別含有六鄰體蛋白的六(6)個(gè)高變區(qū)(HVRs)，即在第132至320個(gè)氨基酸內(nèi)的HVR-I至HVR-6,以及第408至459個(gè)氨基酸內(nèi)的第7個(gè)HVR(HVR_7)。腺病毒提供了優(yōu)良且有效的將治療基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方式。然而，使用腺病毒載體進(jìn)行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的一個(gè)問題是會(huì)產(chǎn)生針對(duì)腺病毒衣殼蛋白上抗原表位的抗體。當(dāng)腺病毒施用于人體時(shí)，形成了針對(duì)六鄰體蛋白的中和抗體，該抗體主要靶向顯性HVR區(qū)。也已知該抗體通過抑制宿主細(xì)胞感染而降低病毒復(fù)制效率(Wohlfart，C. (1988)J. Virol. 62，2321-2328 ；Toogood, C. I. A.等人，(1992) J. Gen. Virol. 73，1429-1435 ；Sumida, S. M.等人，(2005) J. Immunol. 174，7179-7185)。
當(dāng)使用病毒基因遞送載體和病毒治療劑而施用腺病毒時(shí)，必須解決由針對(duì)人HAd5的人中和抗體占多數(shù)導(dǎo)致的問題。除了上述與中和抗體相關(guān)的問題，也有報(bào)道說當(dāng)全身接觸時(shí)腺病毒感染肝臟。在這方面，有報(bào)道說腺病毒具有嗜肝性，當(dāng)通過靜脈途徑施用腺病毒時(shí)，24小時(shí)內(nèi)其90%轉(zhuǎn)移至肝臟中(Worgall1S.等人，(1997)人類基因治療(Hum. GeneTher. )8, 37-44)。由于腺病毒的這種肝選擇性，1999年年輕患者Jessie Gelsinger在施用腺病毒基因治療劑的臨床試驗(yàn)中發(fā)生了急性肝中毒。此后，腺病毒劑量一直被限制在不超過1Χ1013νρ。因此，通常肝中毒被認(rèn)為是使用腺病毒的許多基因治療劑進(jìn)行非臨床/臨床試驗(yàn)的劑量限制因素(Alemany，R.等人(2001)基因治療(Gene Ther.)，8 (17)，1347-1353 ；Christ, Μ·等人，(2000)人類基因治療(Hum. Gene Ther.), Π (3), 415-427 ；Lieber, A.等人，(1997) J. Virol. ,7(11), 8798-8807) 0這種肝選擇性是腺病毒治療劑進(jìn)行系統(tǒng)用藥時(shí)實(shí)現(xiàn)有效治愈的主要問題(Worgall，S.等人，(1997) 人類基因治療(Hum. GeneTher.)，8，37-44)。在這方面，Waddington等人近期報(bào)道，Gla域、凝血因子在血液中結(jié)合腺病毒六鄰體蛋白，其促進(jìn)了腺病毒轉(zhuǎn)移至肝臟(Waddington, S. N.等人，(2008)細(xì)胞(Cell)，132，397-409)。據(jù)推測(cè)六鄰體的HVR-3、HVR_5或HVR-7可與凝血因子、Gla域結(jié)合(Kalyuzhniy, O.等人，(2008) Proc. Nat，I Acd. Sci. 105，5483-5488)。HVR 根據(jù)腺病毒的血清型而變化，目前還不清楚對(duì)于凝血因子的結(jié)合親和力的關(guān)鍵因素是什么。據(jù)報(bào)道，通過插入特定的蛋白如RGD、RFP和BAP(生物素受體肽)以大大消弱對(duì)于凝血因子的結(jié)合親和力從而降低嗜肝性，腺病毒的最大耐受劑量可提高10倍(Shashkova，E. V.等人，(2009)Mol.Ther.17，2121-2130)。目前已知了六鄰體蛋白的許多功能，當(dāng)前進(jìn)行了許多修飾六鄰體蛋白的研究，以克服肝中毒和抗腺病毒免疫力的問題。有4種修飾六鄰體蛋白的策略1)用其他腺病毒血清型的對(duì)應(yīng)六鄰體基因代替所述六鄰體基因，2)將肽插入至HVR中，3)用編碼其他腺病毒血清型HVR的對(duì)應(yīng)基因代替編碼六鄰體蛋白HVR的基因，以及4)將結(jié)合凝血因子與中和抗體的區(qū)域從HVR中去除。至今，對(duì)六鄰體修飾使用的是將肽插入至HVR中的方法，以及用編碼其他腺病毒血清型HVR的對(duì)應(yīng)基因代替編碼HVR的基因的方法。在上述4種策略中，完全的六鄰體置換是改變病毒免疫原性的最顯而易見的方法。然而，由于結(jié)合六鄰體與五鄰體和纖毛的微小結(jié)構(gòu)差異會(huì)導(dǎo)致腺病毒衣殼結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，因此將完全的六鄰體替換為修飾的六鄰體蛋白的方法所帶來的問題是產(chǎn)能退化(Roberts，D. M.等人，(2006)自然(Nature), 441，p239-243;Youil, R.等人，(2002)人類基因治療(Hum. GeneTher.) 13，p311-320; Shashkova, Ε·等人，(2009) Mol. Ther. 17,2121-2130)。而且，使用異源腺病毒和人腺病毒血清型對(duì)衣殼蛋白的修飾也在深入的研究中。據(jù)報(bào)道，針對(duì)黑猩猩腺病毒pan 5、6、7和9(分別劃分為猿腺病毒血清型22至25)的中和抗體的發(fā)生率小于6%，因此，包括黑猩猩腺病毒的猿腺病毒載體系統(tǒng)可用作基因治療載體(Roy’S.等人(2004)人類基因治療(Hum. Gene Ther.) 15，p519_530)。國(guó)際專利申請(qǐng)No. WO2006/040330 和 No. WO 2002/083902 教導(dǎo)了使用人血清型 11、24、26、30、34、35、48、49 和 50的纖毛或六鄰體蛋白抑制重組嵌合型腺病毒中由中和抗體引起的免疫應(yīng)答，其中用其他血清型的對(duì)應(yīng)區(qū)域代替結(jié)合至CAR或六鄰體蛋白的腺病毒突起結(jié)構(gòu)域。關(guān)于猿腺病毒血清型，國(guó)際專利申請(qǐng)No. WO 2005/001103公開了使用猿腺病毒血清型18的嵌合型腺病毒。
然而，人們強(qiáng)烈需要開發(fā)一種具有較低免疫原性和較低毒性的腺病毒。因而，本發(fā)明人確定了一種新的分離自狒狒排泄物的SAdl9六鄰體基因，發(fā)現(xiàn)其具有很高的避免針對(duì)HAd5的中和抗體的能力且其具有低毒性。發(fā)明概述因而，本發(fā)明目的是提供一種用于制備嵌合型腺病毒的新六鄰體蛋白和編碼其的DNA。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種包括所述新六鄰體蛋白的嵌合型腺病毒。本發(fā)明還一個(gè)目的是提供一種包括所述嵌合型腺病毒的組合物。本發(fā)明又一個(gè)目的是提供一種使用所述嵌合型腺病毒的基因治療方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供分離自SAdl9的一種六鄰體和編碼所述六鄰體的DNA。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)方面，提供分離自SAdl9的六鄰體的HVR和編碼所述HVR的DNA。根據(jù)本發(fā)明還一個(gè)方面，提供一種在六鄰體中用分離自SAdl9的六鄰體蛋白或七
(7)個(gè)或以上其中的連續(xù)的殘基進(jìn)行替換從而具有非天然氨基酸序列的嵌合型腺病毒。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)方面，提供一種包括本發(fā)明嵌合型腺病毒的組合物。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)方面，提供一種將治療性轉(zhuǎn)基因遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括將本發(fā)明的嵌合型腺病毒引入所述細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)方面，提供一種治療癌癥的方法，包括將本發(fā)明的嵌合型腺病毒施用于個(gè)體。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)方面，提供一種制備用于基因治療的腺病毒載體的方法，包括將人腺病毒六鄰體的七(7)個(gè)或以上氨基酸殘基替換為本發(fā)明六鄰體蛋白的七(7)個(gè)或以
上氣基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)方面，提供包括本發(fā)明嵌合型腺病毒的分離的宿主細(xì)胞。


參考附圖并結(jié)合以下對(duì)本發(fā)明的描述，本發(fā)明上述及其他目的和特征將變得顯而易見，附圖所示分別為圖I :人腺病毒(HAd)血清型5 (A)、41⑶和SAdl9的六鄰體蛋白的氨基酸序列；圖2 pHex-SAdl9 六鄰體載體⑷、pAd H5/S19_8DS 載體⑶、pAd328H5/S19_DS 載體(C)和 pAd328 H5/S19_DS Δ 19k(D)的裂解圖；圖3 :蛋白質(zhì)印跡分析(western blot analysis)結(jié)果表明，腫瘤特異性ElA的表達(dá)水平與Ad H5_8DS和Ad H5/S19_8DS的感染單位成正比；圖4 :測(cè)量人凝血因子X和Ad H5/S19_8DS(A)之間結(jié)合親和力的SPR結(jié)果，以及人凝血因子 IX 或 X 與 Ad H5_8DS、Ad H5/S19_8DS、Ad328 H5/S19_DS 或 Ad328 H5/S19_DSA 19k(B-D)進(jìn)行免疫共沉淀后的人凝血因子和腺病毒纖毛蛋白的蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果；圖5 :瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示了靜脈注射Ad H5_8DS和Ad H5/S19_8DS后各器官中的腺病毒纖毛基因的PCR擴(kuò)增DNA條帶；圖6 :蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果表明了通過使用針對(duì)HAd5的中和抗體，具有猿腺病毒血清型 19、Ad H5/S19_8DS(A)、Ad328 H5/S19_DS 和 Ad328 H5/S19_DS Δ 19k (B)的六鄰體的嵌合型腺病毒免于感染的能力；圖7 :免疫染色圖和柱形圖表明了通過使用針對(duì)HAd5的中和抗體，具有SAdl9、AdH5/S19_8DS(A)、Ad328H5/S19_DS 和 Ad328H5/S19_DS Λ 19k (B)的六鄰體的嵌合型腺病毒的免于感染能力；圖8:該圖顯示了施用于通過HAd5免疫的敘利亞倉(cāng)鼠的Ad H5/S19_8DS和AdH5_8DS所轉(zhuǎn)移的血液中LK8基因的表達(dá)方式；圖9 :對(duì)小鼠劑量依賴性地靜脈施用Ad H5_8DS和Ad H5/S19_8DS后，從解剖的小鼠中切離的各器官照片；圖10 :靜脈施用Ad H5_8DS的小鼠血液分析數(shù)據(jù)；圖11 :靜脈施用Ad H5/S19_8DS的小鼠血液分析數(shù)據(jù)；圖12 :靜脈注射Ad H5/S19_8DS后H460非小細(xì)胞肺癌的動(dòng)物模型中的腫瘤生長(zhǎng)曲線；圖13 :根據(jù)針對(duì)HAd5的免疫，注射腫瘤特異性嵌合型腺病毒、Ad H5/S19_8DS后的H2172原位肺癌解剖的動(dòng)物模型的肺部照片；以及圖14 :圖13的肺部腫瘤的體積、重量、數(shù)目和大小的分析結(jié)果。發(fā)明詳述除非另有定義，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的同樣含義。而且，本文提到的所有文獻(xiàn)均以全文引用的方式并入本文。本文所用的術(shù)語(yǔ)“腺病毒”是指具有約36kb的線性基因組的無包膜二十面體雙鏈
DNA病毒。本文所用的術(shù)語(yǔ)“嵌合型腺病毒”是指其核酸序列由至少2個(gè)腺病毒血清型核酸序列組成的腺病毒。本文所用的“替換”是指一個(gè)或多個(gè)多核苷酸或氨基酸分別被不同的多核苷酸或
氨基酸代替。本文所用的術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”或“HVR”是指其序列為高度可變、形成結(jié)構(gòu)限制環(huán)的可變域。本文所用的術(shù)語(yǔ)“非天然氨基酸序列”是指腺病毒在給定血清型的天然六鄰體蛋白中未被發(fā)現(xiàn)的任何氨基酸序列，其在基因表達(dá)水平上被引入至所述六鄰體蛋白(即，產(chǎn)生編碼所述非天然氨基酸序列的核酸序列)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療性轉(zhuǎn)基因”是指被轉(zhuǎn)入至細(xì)胞中并且在合適條件下能被翻譯和/或表達(dá)的多核苷酸，其賦予所引入的細(xì)胞所需的特性或帶來所需的治療結(jié)果。本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的用于基因轉(zhuǎn)移的工具，包括
病毒、質(zhì)粒等。本文所用的術(shù)語(yǔ)“中和抗體”是指能夠抑制腺病毒感染(即，進(jìn)入細(xì)胞)或由腺病毒控制基因表達(dá)的抗體。所述中和抗體可為從血清中純化的或其中存在的抗體。下面詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明提供分離自SAdl9的六鄰體、其HVR和編碼所述六鄰體的DNA。本發(fā)明的SAdl9可通過從狒狒排泄物中分離提供，其被分類為F亞組。SAdl9六鄰體具有如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列，其與人腺病毒血清型41 ( “HAd41”)六鄰體的氨基酸序列具有85%的同源性，與HAd5六鄰體的氨基酸序列具有76%的同源性。而且，編碼SAdl9六鄰體的核苷酸序列與編碼HAd41六鄰體的核苷酸序列具有76%的同源性,并與編碼HAd5六鄰體的核苷酸序列具有70%的同源性。優(yōu)選地，本發(fā)明所述SAdl9六鄰體具有如SEQ ID NO: 3所示的DNA序列。所述SAdl9六鄰體或其七(7)個(gè)或以上氨基酸殘基可通過替換而被整合至腺病毒的各種類型中以提供嵌合型腺病毒。相應(yīng)地，提供在六鄰體中具有非天然氨基酸序列的嵌合型腺病毒，其通過本發(fā)明的SAdl9六鄰體蛋白或其一個(gè)或多個(gè)殘基的替換而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，所述嵌合型腺病毒可在六鄰體中通過用具有如SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的六鄰體的七(7)個(gè)或以上殘基進(jìn)行替換從而具有非天然氨基酸序列。所述SAdl9六鄰體的七(7)個(gè)或以上殘基可為HVR。所述HVR可具有如SEQ ID N0:21所示的氨基酸序列，并可由如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列編碼。更優(yōu)選地，所述嵌合型腺病毒可在六鄰體中具有非天然氨基酸序列，其通過替換為HVR片段而實(shí)現(xiàn)，即HVR-I至_7，分別對(duì)應(yīng)于 SEQ ID N0:21 的氨基酸殘基 11-41、46_52、69_78、106-119、126-138、160-173 和 275-303。具有SAdl9的六鄰體或其七(J)個(gè)或以上殘基的嵌合型腺病毒顯示出很小的由中和抗體引起的免疫抑制和肝中毒。腺病毒的各種類型，優(yōu)選地，人腺病毒血清型，更優(yōu)選地，人腺病毒血清型5、11、
24、26、30、34、35、48、49和50可用于制備本發(fā)明的嵌合型腺病毒。腫瘤特異性可復(fù)制的腺病毒或腫瘤特異性限制復(fù)制的腺病毒可用作腺病毒治療劑。本發(fā)明的嵌合型腺病毒具有非天然氨基酸序列，以克服免疫應(yīng)答和肝中毒的問題。具體地，通過將野生型腺病毒的六鄰體區(qū)替換為SAdl9的六鄰體區(qū)來制備本發(fā)明的非天然氨基酸序列。優(yōu)選地，所得的非天然氨基酸序列為使得用于中和直接針對(duì)相應(yīng)野生型腺病毒六鄰體蛋白抗體的七(7)個(gè)或以上的現(xiàn)有抗原表位沒有免疫原性的非天然氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，嵌合型腺病毒包括七(7)個(gè)或以上氨基酸的六鄰體修飾物，該六鄰體修飾在七(7)個(gè)或以上的區(qū)進(jìn)行。最優(yōu)選的嵌合型腺病毒可為Ad H5/S19_8DS，其制備方法為將腺病毒載體pAd H5/S19_8DS轉(zhuǎn)入至人肺腺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549，從而將人腺病毒六鄰體替換為SAdl9的六鄰體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合型腺病毒還可含有治療性轉(zhuǎn)基因。所述治療性轉(zhuǎn)基因的非限制性實(shí)例包括腫瘤抑制基因、抗原基因、細(xì)胞毒素基因、細(xì)胞抑制基因、自殺基因、抗血管生成基因和免疫調(diào)節(jié)基因。具體地，所述“腫瘤抑制基因”為其在靶細(xì)胞中的表達(dá)能夠抑制腫瘤表現(xiàn)型和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核苷酸序列。所述腫瘤抑制基因的實(shí)例包括P53-基因、APC-基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-I基因、BRCA-2基因、WT-I基因、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(Lee等人，自然(Nature)，1987，329，642)、MMAC-I基因、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白(美國(guó)專利No. 5，783，666)、DCC(在結(jié)腸直腸癌中除去的)基因、MMSC-2基因、位于染色體3p21. 3上的鼻咽癌抑制基因(Cheng 等人，Proc. Nat. Acad. Sci.，1998，95，3042-3047) ,MTSl 基因、CDK4基因、NF-I基因、NF-2基因、VHL基因等。所述“抗原基因”為其在靶細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別的細(xì)胞表面抗原蛋白的核苷酸序列?？乖虻膶?shí)例包括癌胚抗原(CEA)、CD3、CD133、CD44和P53(國(guó)際申請(qǐng)No. W094/02167)。為了易于被免疫系統(tǒng)識(shí)別，所述抗原基因可與MHC-I型抗
原結(jié)合。所述“細(xì)胞毒素基因”為其在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)表現(xiàn)出毒性作用的核苷酸序列。細(xì)胞毒素基因的實(shí)例包括編碼綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒素、白喉毒素等的核苷酸序列。所述“細(xì)胞抑制基因”為其在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞周期終止的核苷酸序列。細(xì)胞抑制基因的非限制性實(shí)例包括P21、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的基因(例如，Pl6、pl5、pl8和pl9)、生長(zhǎng)終止特異性同源盒(GAX)基因(國(guó)際專利申請(qǐng)公開NO.W097/16459和No. WO 96/30385)等。所述“自殺基因”為其在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)通過細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的核苷酸序列。自殺基因的非限制性實(shí)例包括編碼單純皰疹病毒胸苷激酶、水痘胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、 嘌呤核苷磷酸化酶、內(nèi)酰胺酶、羧肽酶G2、細(xì)胞色素P450-2B1、硝基還原酶、β -葡糖醛酸酶、TRAIL (腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)等的基因。所述“抗血管生成基因”為其表達(dá)導(dǎo)致向細(xì)胞外分泌抗血管生成因子的核苷酸序列?？寡苌梢蜃影ㄑ苌梢种扑?、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)如可溶性 VEGFRl (sFLT-1)的抑制劑(PNAS (美國(guó))，1998，95，8795-800)、內(nèi)皮抑制素和載脂蛋白(a)三環(huán)結(jié)構(gòu)域(LK8)。優(yōu)選的抗血管生成基因?yàn)榫幋aLK8的基因。LK8直接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制上皮細(xì)胞遷移(Kim JS等人，J.Biol.Chem.，(2003)278:29000)。具體地，據(jù)報(bào)道，腺病毒介導(dǎo)的LK8表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌在小鼠中的生長(zhǎng)(Lee K.等人，肝臟學(xué)Ofepatology) (2006)43:1063)。因此，預(yù)期腺病毒的溶瘤作用可通過引入LK8而改善。所述“免疫調(diào)節(jié)基因”為其在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的核苷酸序列。免疫調(diào)節(jié)基因的非限制性實(shí)例包括編碼⑶16、CTLA-4、IL24、GM-CSF等的基因。所述治療性轉(zhuǎn)基因可通過本領(lǐng)域已知的各種DNA重組技術(shù)插入至本發(fā)明的嵌合型腺病毒中。 本發(fā)明還提供本發(fā)明嵌合型腺病毒在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，以及在制備腺病毒載體以遞送用于治療腫瘤和其他疾病的治療性轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供一種將治療性轉(zhuǎn)基因遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其包括向所述細(xì)胞引入本發(fā)明的嵌合型腺病毒；一種治療癌癥的方法，其包括向個(gè)體施用所述腺病毒；以及一種制備用于基因治療的腺病毒載體的方法，其包括將人腺病毒六鄰體的七(7)個(gè)或以上氨基酸殘基替換為SAdl9六鄰體蛋白的七(7)個(gè)或以上殘基。本發(fā)明還提供一種包括本發(fā)明的嵌合型腺病毒的組合物。本發(fā)明組合物用于基因治療或病毒治療，優(yōu)選用于癌癥治療。本發(fā)明組合物可進(jìn)行配制以提供各種連同藥用載體和/或賦形劑的制劑。因而，所述制劑的形式可為在油或水介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳液、提取物、粉劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑。對(duì)于口服制劑，可使用各種制備方法包括特別為腺病毒釋放設(shè)計(jì)的方法，例如，通過使用Eudragit或時(shí)間依賴型釋藥系統(tǒng)(timeclock release system) (Lubeck等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(17)，6763-6767(1989)；以及 Chourasia 和 Jain, J. Pharm.Pharm. Sci. ,6(1), 33-66 (2003))。如上所述，所述嵌合型腺病毒可通過本領(lǐng)域已知的任何基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。許多基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)如[Rolland(1998)Crit. Rev. Therap.藥物載體系統(tǒng)(Drug CarrierSystems) 15:143-198]以及其中引用的參考文獻(xiàn)中公開的系統(tǒng)，均為本領(lǐng)域所熟知。因此，本發(fā)明組合物可制備為適合于這些基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。本發(fā)明的組合物可包括本領(lǐng)域已知的任何藥用載體。合適的載體的實(shí)例為水、鹽水、酒精、脂、蠟、緩沖液，固體載體如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂，或可生物降解的微球(例如，聚乳酸(polylactate)、聚甘醇酸(polyglycolate))。本發(fā)明組合物的提供形式可以為單劑量或多劑量容器如密封安瓿或小瓶。優(yōu)選地，所述容器密封以保持使用前藥物制劑的無菌條件。通常，所述制劑可保存為懸浮液、流體和在油或水介質(zhì)中的乳液。而且，所述藥物制劑可在凍干條件下保存。
所述嵌合型腺病毒和包括其的組合物可通過位點(diǎn)特異性注射或靜脈注射而施用。位點(diǎn)特異性注射包括，例如，腹腔內(nèi)注射，胸腔內(nèi)注射，鞘內(nèi)注射，動(dòng)脈內(nèi)注射，瘤內(nèi)注射或局部應(yīng)用。所述施用方法也可容易地應(yīng)用于使用腺病毒載體的治療和其他目標(biāo)疾病的治療的聯(lián)用。優(yōu)選的方法為靜脈注射。應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)際施用的活性成分的合適用量應(yīng)該根據(jù)各種相關(guān)因素而確定，包括治療條件、患者個(gè)體的年齡和體重、飲食、施用時(shí)間、排泄率、患者癥狀的嚴(yán)重度和反應(yīng)敏感性；因此，上述劑量并非旨在以任何形式限制本發(fā)明的范圍。通常，本發(fā)明組合物含有I X IO7至I X 1013pfu/ml本發(fā)明的嵌合型腺病毒，且本發(fā)明嵌合型腺病毒可以以每周一次I X IO11Pfu的用量注射3-5周。本發(fā)明的組合物可用作單一治療。但其可與其他抗腫瘤方案結(jié)合，如治療癌癥的常規(guī)化學(xué)療法或放射療法?？膳c本發(fā)明組合物聯(lián)用的化學(xué)療法藥物包括紫杉醇、順鉬、卡鉬、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、二甲磺酸-1，4- 丁二醇(bisulfan)、亞硝基脲、放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、博萊霉素、普卡霉素(plicomycin)、絲裂霉素、依托泊苷、三苯氧胺、紫杉酹、反鉬(transplatinum)、5_氟尿喃唳、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和氨甲喋呤?？膳c本發(fā)明組合物聯(lián)用的放射療法可為X-射線輻射和Y-射線輻射等。本發(fā)明的嵌合型腺病毒極少導(dǎo)致肝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，因?yàn)槠洳慌c凝血因子相互作用并表現(xiàn)出低的肝毒性。因此，由于其低風(fēng)險(xiǎn)的免疫應(yīng)答和肝毒性，可將高劑量的本發(fā)明嵌合型腺病毒施用于個(gè)體，因而，本發(fā)明嵌合型腺病毒可用于安全有效的基因治療和病毒治療。下列實(shí)施例旨在說明本發(fā)明而非限制其保護(hù)范圍。實(shí)施例I SAdl9六鄰體基因的確認(rèn)用PCR從SAdl9擴(kuò)增六鄰體基因，并克隆至pGEM_T Easy載體，用ABI自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序?！?-1>六鄰體基因的確認(rèn)用DNeasy組織試劑盒(QIAGEN，德國(guó))分離SAdl9的基因組，將其作為模板使用SEQ ID N0:1和2引物組通過PCR擴(kuò)增六鄰體基因。用Wizard SV凝膠和PCR純化系統(tǒng)(Promega公司，美國(guó)威斯康辛州)純化擴(kuò)增的六鄰體基因，并借助T4 DNA連接酶(Roche公司，瑞士)將其插入至pGEM-T Easy載體(Promega公司，美國(guó)威斯康辛州)。將所得的重組載體命名為pGEM-SAdl9六鄰體載體。用所述載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞后，從10個(gè)轉(zhuǎn)化子的克隆中提取載體DNA，用ABI自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。在10個(gè)堿基序列中挑選出與其他序列同源性最高的序列，從而確定SAdl9六鄰體基因的核苷酸序列(SEQ ID N0:3)。<1-2>人腺病毒血清型的堿基和氨基酸序列比較將SAdl9六鄰體基因的堿基和氨基酸序列與51份人血清型腺病毒的堿基和氨基酸序列進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)屬于F亞組的SAdl9六鄰體與HAd41最相似，它們之間的氨基酸序列具有85%的同源性。其顯示出與HAd5六鄰體具有76%的氨基酸同源性 。而且，發(fā)現(xiàn)SAdl9六鄰體與HAd41和HAd5的分別具有76%和70%的核苷酸序列同源性(圖I)。實(shí)施例2 :其中由SAdl9六鄰體替換而制備嵌合型腺病毒構(gòu)建用于交換六鄰體基因的穿梭載體并命名為PHex載體，其攜帶有用于同源重組的六鄰體基因左和右延伸區(qū)。將SAdl9六鄰體基因克隆至pHex載體的唯一酶切位點(diǎn)，位于六鄰體的左和右延伸臂之間以提供重組載體，命名為pHex-SAdl9六鄰體。將SphI-線性化的 pHex-SAdl9 六鄰體與 AsiSI-線性化的 pAd H5_8DS 在 BJ5183 (Stratagene 公司，美國(guó)加利福尼亞州)中進(jìn)行同源重組以產(chǎn)生攜帶SAdl9六鄰體的重組載體，命名為pAd H5/S19_8DS。經(jīng)PacI線性化后，將pAd H5/S19_8DS轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞以產(chǎn)生其中固定了 SAdl9六鄰體的新嵌合型腺病毒(Ad H5/S19_8DS)?！?-1>穿梭載體的構(gòu)建通過同源重組構(gòu)建適合于替換六鄰體基因的穿梭載體。為此，用SEQ ID N0:4和5引物組通過PCR擴(kuò)增HAd5六鄰體基因5’端上游的約Ikb-長(zhǎng)區(qū)。將所得PCR產(chǎn)物命名為六鄰體L,然后插入至pCR2. I Topo載體(Invitrogen公司，美國(guó)加利福尼亞州)。進(jìn)行DNA序列分析以選出無突變的克隆，將其命名為pCR2. I-六鄰體L。分別地，用SEQ ID NO:6和7引物組通過PCR擴(kuò)增HAd5六鄰體基因3’端下游的約Ikb-長(zhǎng)區(qū)。將所得PCR產(chǎn)物命名為六鄰體R，然后插入至pCR2. I Topo載體(Invitrogen公司，美國(guó)加利福尼亞州)。通過DNA測(cè)序分析選出無突變的克隆，并命名為pCR2. I-六鄰體R。使用XhoI和EcoRI對(duì)pCR2. 1_六鄰體L切離后，將六鄰體L插入至PENTR2B (Invitrogen公司，美國(guó)加利福尼亞州)(其此前用SalI和EcoRI酶切)以產(chǎn)生重組載體PENTR2B-六鄰體L。用HindIII消化pCR2. 1_六鄰體R，然后用Klenow片段處理以制成鈍末端(blunt ends)。用EcoRI消化以從鈍末端的pCR2. I-六鄰體R切割六鄰體R。將該六鄰體R插入至PENTR2B-六鄰體L載體的鈍化的XbaI和EcoRI位點(diǎn)。所得重組載體命名為pHex.,在pfu聚合酶(Stratagene公司，美國(guó)加利福尼亞州)存在下，使用SEQ IDNO: I和2引物組并以pGEM-SAdl9六鄰體為模板進(jìn)行PCR。將SAdl9的Mfe-I-限制性六鄰體基因克隆至PHex載體的EcoRI位點(diǎn)。所得重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)其在恰當(dāng)?shù)奈恢镁哂蠸Adl9六鄰體，并命名為pHex-SAdl9六鄰體(圖2A)。<2-2>通過同源重組用SAdl9六鄰體替換為了制備與SAdl9六鄰體重組的嵌合型腺病毒，首先用EcoRI處理pENTR2B載體(Invitrogen, CA)以去除其ccdB區(qū)。將此前由本發(fā)明人構(gòu)建的pAAV_CMV_LK8_UN載體(參見PCT公開NO.W02009/102085)用KpnI/Bglll處理以產(chǎn)生CMV_LK8片段(然后鈍化末端)，并將其插入至EcoRI-處理的pENTR2B的KpnI/XhoI位點(diǎn)(然后鈍化末端)以產(chǎn)生重組質(zhì)粒 pENTR-CMV_LK8。
為了構(gòu)建攜帶ElA基因的腫瘤特異性表達(dá)單位的質(zhì)粒載體，從人基因組DNA中擴(kuò)增DNMT-I (DNA(胞嘧啶-5)-甲基轉(zhuǎn)移酶)基因(DS啟動(dòng)子)的近端啟動(dòng)子區(qū)，并克隆至pCR2. 1-T0P0 載體(Invitrogen, CA)以產(chǎn)生重組質(zhì)粒 pCR-DS。在 Ex-Taq 聚合酶(Takara 公司，日本)存在下，以人基因組DNA為PCR模板，用SEQ ID N0:8(5’ -CTT CTC GCTGCT TTATCC CCA TC-3，)和 SEQ ID NO: 9 (5，-CTC GGA GGC TTCAGC AGA CGC-3，)引物組通過 PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，所述引物組結(jié)合至DNMT-I基因的近端啟動(dòng)子區(qū)的兩端。首先于94° C變性5分鐘，再按如下進(jìn)行30次PCR循環(huán)94° C變性30秒，56° C退火30秒，72° C延伸I分鐘，然后72° C再延伸3分鐘。將用SacI 和 XhoI 從 pCR-DS 上切割的 DNA 片段插入至 pAElSplB-E2F_l Rb7 Δ 19k載體(Kim, J.等人，(2007)人類基因治療(Hum. Gene Ther.) 18，p773_786 ;mElA，韓國(guó)專利No. 746122 ; Λ E1B19K，韓國(guó)專利No. 432953)中突變ElA基因前面的ClaI和SalI位點(diǎn)以構(gòu)建重組質(zhì)粒 pSP72-DS_mElA_ Δ E1B19K。將用 BamHI 處理 pSP72_DS_mElA_ Δ E1B19K 所得的片段插入至pENTR-CMV_LK8的BglII位點(diǎn)以提供穿梭載體，命名為pENTR_CMV_LK8_DS_ι Ε1Α_ΛΕ1Β19Κ。 向IOOng的pAd-PL Dest (Invitrogen公司，美國(guó)加利福尼亞州)和500ng的pENTR-CMV_LK8-DS_mEIΑ_ Δ Ε1Β19Κ 的混合物中加入 16 μ L 的 Clonase I 反應(yīng)緩沖液(Invitrogen公司，美國(guó)加利福尼亞州)。將反應(yīng)混合物于室溫下用2 μ L的Clonase I孵育I小時(shí)，然后于37° C用2yL蛋白酶KOyg/yL)孵育10分鐘。取IOyL所得反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，再將其涂布至氨芐青霉素平板。將從限制酶圖譜的陽(yáng)性菌落中提取的質(zhì)粒DNA通過DNA測(cè)序分析確認(rèn)為目標(biāo)腺病毒載體，并命SSpAd H5-8DS。為了將pAd H5_8DS六鄰體基因替換為SAd19六鄰體，首先將500ng的pHex_SAdl9六鄰體和50ng的pAd H5_8DS分別用SphI和AsiSI進(jìn)行線性化并混合，再通過電穿孔法轉(zhuǎn)入至 E. coli BJ5183。使用 SEQ ID NO: 10 (5，-ATG CGC AAG GTG TAG CCA-3’ )和 SEQ IDNO: 11 (5，-AGC GTG CTG GCC AGC GTG-3，)引物組通過PCR篩選同源重組，所述引物組被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)同源重組。首先于94° C變性5分鐘，再按如下進(jìn)行30次PCR循環(huán)94° C變性30秒，55° C退火40秒，72° C延伸I. 5分鐘，然后72° C再延伸3分鐘。使用SEQID NO: 12 (5，-CCC GTTACA TAA CTT ACG-3，) (CMV 正義引物)和 SEQ ID NO: 13 (5，-TTATGGCCT GGG GCG TTT ACA G_3’ ) (ElA反義引物)引物組，通過PCR對(duì)篩選為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行二次篩選，所述引物組被設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增含有LK8和ElA基因的區(qū)。首先于94° C變性5分鐘，再按如下進(jìn)行30次PCR循環(huán)94° C變性30秒，55° C退火40秒，72° C延伸30秒，然后72° C再延伸5分鐘。從通過兩次PCR篩選為陽(yáng)性的菌落中分離出DNA，并在大腸桿菌(E. coli)DH5a中擴(kuò)增。與EcoRI、SpeI、XbaI和PshAI的酶切方式完全一致的克隆被確認(rèn)并命名為pAd H5/S19_8DS (圖2B)。DNA測(cè)序再次確認(rèn)pAd H5/S19_8DS含有SAdl9六鄰體。通過EcoRI消化將含有DS啟動(dòng)子的DNA片段從pCR_DS上切害I]，并克隆至phRL-null載體(Promega公司，美國(guó)威斯康辛州)的EcoRI位點(diǎn)以產(chǎn)生phRL_DS。將用SalI和PstI處理phRL-DS所得的片段插入至ρΕ1· 2 (0. D. 260 Boise公司，美國(guó)愛達(dá)荷州)穿梭載體的SalI和PstI位點(diǎn)，產(chǎn)生pEl. 2-DS。將用AlwNI消化pEl. 2-DS切割的I. 7kb大小DNA片段通過酶連接法使用大腸桿菌(E. coli) XLl-Blue電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞克隆至pAd328 (O.D. 260 Boise公司，美國(guó)愛達(dá)荷州)的SfiI位點(diǎn)。從生長(zhǎng)在添加有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上的菌落中提取的質(zhì)粒DNA，通過與EcoRI、SpeI, XbaI和PshAI的切割方式完全一致而確認(rèn)，并命名為pAd328-DS腺病毒載體(圖2C)。從HAd5的基因組DNA擴(kuò)增腺病毒El基因并克隆至pGEM-T Easy載體(Promega公司，美國(guó)威斯康辛州)，以產(chǎn)生重組質(zhì)粒pGEMT-Ad El。將pGEMT-Ad El用BssHI消化后再用EcoNI短暫處理，以從中去除ElB19k區(qū)。將去除 ElB19k 的 pGEMT-Ad El 命名為 pGEMT-Ad El Λ 19k。為了將 pAd328_DS 的 El基因替換為去除ElB Δ 19k的El基因，首先將IOOng的pAd328_DS和I μ g的SphI-線性化的pGEMT-Ad El Λ 19k混合，再通過電穿孔法轉(zhuǎn)導(dǎo)至大腸桿菌(E. coli)BJ5183。通過用HindIII, SphI和EcoRV消化以篩選同源重組。確認(rèn)與所有切割方式一致的克隆，并命名為pAd328-DSA 19k。根據(jù)以上描述的步驟制備pAd H5/S19 8DS質(zhì)粒，通過pHex_SAdl9六鄰體和pAd328_DS或pAd328-DSA 19k(圖2D)之間的同源重組產(chǎn)生pAd328H5/S19_DS和pAd328H5/S19_DSA 19k。<2-3>制備與SAdl9六鄰體重組的嵌合型腺病毒 質(zhì)粒pAd H5/S19_8DS經(jīng)PacI線性化后轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染14天后，觀察到所述細(xì)胞的細(xì)胞病變，將其與培養(yǎng)基一起收集。為了完全將病毒從其中分離出來，首先將細(xì)胞冷凍和解凍3次，然后進(jìn)行離心。將含有病毒的上清液進(jìn)行兩輪蝕斑純化以得到純病毒，并命名為Ad H5/S19_8DS病毒。通過對(duì)其基因組DNA測(cè)序分析，AdH5/S19_8DS病毒被確認(rèn)為具有SAdl9六鄰體基因的嵌合型腺病毒。按照上述步驟制備Ad328 H5/S19_DS和Ad328H5/S19_DSA 19k 病毒以產(chǎn)生 Ad H5/S19_8DS。<2-4>制備和純化具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒A549肺癌細(xì)胞在30個(gè)150mm大小的培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)到80%的融合度，然后在MOI為20時(shí)用Ad H5/S19_8DS病毒感染。于37° C孵育2天后，以12，000X g離心10分鐘收獲細(xì)胞，然后懸浮于IOmL裂解緩沖液(O. 5M Tris, pH8. O, ImM MgCl2)中。進(jìn)行3輪冷凍和解凍以裂解細(xì)胞，然后以12，OOOXg冷凍離心10分鐘去除細(xì)胞殘余物。為了制備不連續(xù)CsCl密度梯度，將8mL比重為I. 4的CsCl溶液放入超離心管(Beckman公司，美國(guó)加利福尼亞州)，并用6mL比重為I. 2的CsCl溶液覆蓋，以這種方式保持二者之間的明確邊界。將經(jīng)
0.22 μ m過濾器過濾的病毒樣品加載至CsCl I. 4/1. 2密度梯度而不弄亂該邊界，將該管用IOmMTris-HCl (pH7. 9)平衡重量。將該管放置到SW28離心機(jī)以23，OOOrpm在冷凍條件下超離心90分鐘以形成病毒帶。將所分離的病毒用連續(xù)CsCl密度梯度超離心步驟再次純化。為此，將8mL比重為
1.4的CsCl溶液放入超離心管(Beckman公司，美國(guó)加利福尼亞州)并用比重為I. 2的CsCl溶液覆蓋，以這種方式保持二者之間的明確邊界。使用密度梯度分離系統(tǒng)(Biocomp公司，加拿大)在該管中形成連續(xù)梯度。將通過所述不連續(xù)CsCl密度梯度超離心獲得的病毒樣品用一定體積的IOmM Tris-HCl (pH7. 9)稀釋并加載至CsCll. 4/1. 2梯度管而不弄亂二者之間的邊界。用IOmM Tris-HCl (pH7. 9)平衡其重量后，將該管以23，OOOrpm在冷凍條件下超離心90分鐘以形成病毒帶。用PBSG緩沖液(含10%甘油的PBS)透析3次，每6小時(shí)更換新緩沖液。實(shí)施例3 :具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒的體外研究
通過比較用該病毒在不同MOI下感染的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和正常細(xì)胞系MRC5中ElA和LK8的表達(dá)水平，對(duì)Ad H5/S19_8DS病毒進(jìn)行肺癌選擇性體外檢測(cè)。此外，測(cè)量AdH5/S19_8DS病毒與凝血因子的親和力，該凝血因子介導(dǎo)血液循環(huán)傳播病毒至肝臟?！?-DM0I-依賴性 ElA 表達(dá)在MOI為100、25、10和I時(shí)，用Ad H5/S19_8DS病毒感染在6_孔平板中生長(zhǎng)至80%融合度的A549肺癌細(xì)胞和MRC5正常細(xì)胞。于37° C孵育24小時(shí)后，以3，OOOrpm離心5分鐘收獲所述細(xì)胞，并懸浮于I X SDS-PAGE緩沖液(50mM Tris (pH6. 8)、2%SDS、IOOmM二硫蘇糖醇、O. 1%溴酚藍(lán)、10%甘油)，于100° C水浴中加熱5分鐘，并以10，OOOrpm離心2分鐘。所得上清液在4 12%的SDS-PAGE凝膠(Invitrogen公司，美國(guó)加利福尼亞州)上以20mA電泳2小時(shí)。用轉(zhuǎn)移單元(Invitrogen公司，美國(guó)加利福尼亞州)在施加300mA電場(chǎng)的Tris-甘氨酸緩沖液(39mM甘氨酸、48mM Tris,O. 037% SDS、20%甲醇)中，將從凝膠分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移約90分鐘至PVDF膜上。用TBS封閉溶液(Thermo Scientific公司，美 國(guó)伊利諾伊州)將所述膜于室溫下封閉I小時(shí)。小鼠抗-ElA單克隆抗體(BD Pharmingen公司，美國(guó)加利福尼亞州)作為一抗，用5%脫脂奶/IXTBST緩沖液以1:3，000稀釋，于室溫用探針探測(cè)I小時(shí)并用I X TBST緩沖液沖洗6次，每次5分鐘?？?小鼠HRP (KPL公司，美國(guó)馬薩諸塞州)作為二抗，用5%脫脂奶/I X TBST緩沖液以1: 5，000稀釋，用探針探測(cè)30分鐘并用I XTBST緩沖液沖洗6次，每次5分鐘，并與顯色劑(ECL，Amersham，英國(guó))反應(yīng)以顯示ElA蛋白條帶。ElA表達(dá)水平以MOI-依賴性方式增加，在A549癌癥細(xì)胞中比MRC-5正常細(xì)胞高100倍(圖3)。<3-2>對(duì)凝血因子X的親和力使用SPR(表面等離子體共振)法分析Ad H5/S19_8DS對(duì)凝血因子X的親和力。將純化的凝血因子X(HCX-0050，Haematological Technologies公司，美國(guó)佛蒙特州)應(yīng)用于CS5傳感器芯片(Biacore公司，瑞典)。在含有5mM CaCl2的HBSP緩沖液(IOmMHEPES ρΗ7· 4，150mM NaCl，O. 005% 吐溫 20)中分別以 3. OX 10nVP/mL、I. 5X10nVP/mL 和0. 75X10nVP/mL的濃度稀釋純化的Ad H5_8DS和AdH5/S19_8DS病毒。將HBSEP(IOmM HEPESpH 7. 4,150mM NaCl,3mM EDTA，0. 005%吐溫20)作為再生緩沖液用于將病毒從所述芯片上分離。當(dāng)病毒溶液以30 μ L/min的流速經(jīng)過凝血因子X-固定的CM5傳感器芯片時(shí)，記錄RU值。在所述3個(gè)不同濃度下，腺病毒血清型5AdH5_8DS分別顯示了 300、150和70RU的固定化因子SPR信號(hào)，而具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒Ad H5/S19_8DS顯示出很弱或很小的對(duì)于凝血因子X的親和力，因?yàn)樵谒?個(gè)濃度下發(fā)現(xiàn)的SPR信號(hào)都在5RU以內(nèi)(圖4A)。還通過下述〈3-3>中的描述的免疫沉淀法使用凝血因子X蛋白代替因子IX，檢測(cè)了 Ad328H5/S19_DS和Ad328H5/S19_DS Δ 19k對(duì)凝血因子X的親和力(圖4D)。<3-3>對(duì)凝血因子IX的親和力使用免疫沉淀法檢測(cè)Ad H5/S19_8DS對(duì)凝血因子IX的親和力。向含有ImLPBS的管中加入IXIOiiVP的Ad H5_8DS或Ad H5/S19_8DS，以及10 μ g純化的凝血因子IX(HCIX-0040, Haematological Technologies 公司，美國(guó)佛蒙特州)、5 μ g羊抗-凝血因子IX抗體和50 μ L瓊脂糖-蛋白G(50%漿液)，然后于回旋振蕩器中在4° C孵育2小時(shí)。以5，OOOrpm離心5分鐘后，將所獲得的瓊脂糖-蛋白G球團(tuán)用PBS洗滌3次，懸浮于100 μ L的I X SDS-PAGE 樣品緩沖液(50mM Tris (pH6. 8)，2%SDS, IOOmM 二硫蘇糖醇，O. 1% 溴酚藍(lán)，10%甘油)中，加熱5分鐘。將懸浮液離心，所得上清液在4 12% SDS-PAGE凝膠上以20mA電泳約2小時(shí)。將分離的蛋白在含有Tris-甘氨酸緩沖液(39mM甘氨酸，48mM Tris, O. 037% SDS,20%甲醇)的轉(zhuǎn)移單元中以300mA轉(zhuǎn)移約90分鐘至PVDF膜上。用TBS封閉溶液(ThermoScientific公司，美國(guó)伊利諾伊州)將所述膜于室溫封閉I小時(shí)。將小鼠抗_HAd5纖毛單克隆抗體(NeoMarkers公司，美國(guó)加利福尼亞州)作為一抗，用5%脫脂奶/I X TBST緩沖液以1:3，000稀釋，于室溫用探針探測(cè)I小時(shí)，并用IXTBST緩沖液洗滌6次，每次5分鐘。將抗-小鼠HRP(KPL公司，美國(guó)馬薩諸塞州)作為二抗，用5%脫脂奶/IXTBST緩沖液以1: 5，000稀釋，用探針探測(cè)30分鐘，用I X TBST緩沖液洗滌6次，每次5分鐘，并與顯色劑(ECL, Amersham,英國(guó))反應(yīng)以顯示纖毛條帶。將PVDF膜上的斑點(diǎn)浸沒于Restore 蛋白質(zhì)印跡膜再生液(Thermo Scientific公司，美國(guó)伊利諾伊州)并于回旋振蕩器中振蕩I小時(shí)，用I X TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，用TBS封閉溶液于室溫封閉I小時(shí)。將羊抗-凝血因子IX抗體(Affinity Biologicals公司，加拿大)作為一抗，用5%脫脂奶/I X TBST緩沖液以1:3，000稀釋，于室溫用探針探測(cè)I小時(shí)，并用I X TBST緩沖液洗滌6次，每次5分鐘。將抗-羊HRP (KPL公司，美國(guó)馬薩諸塞州)作為二抗，用5%脫脂奶/I X TBST緩沖液 以1:5,000稀釋，用探針探測(cè)30分鐘，用IXTBST緩沖液洗滌6次，每次5分鐘，并與顯色劑(ECL, Amersham,英國(guó))反應(yīng)以顯示凝血因子IX條帶(圖4B)。還使用上述免疫沉淀法檢測(cè)了 Ad328 H5/S19_DS 和 Ad328 H5/S19_DS Δ 19k 對(duì)凝血因子 IX 的親和力(圖 4C)。實(shí)施例4 :具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒的體內(nèi)研究〈4-1>生物分布將Ad H5/S19_8DS以3X IOiciVP的劑量靜脈注射至6周齡的Balb/c正常小鼠和裸鼠。注射2天后，用DNeasy血液和組織試劑盒(QIAGEN公司，德國(guó))分離腦、肝、肺、心、胸腺、脾、卵巢、子宮和血液的DNA。用OD分光光度計(jì)定量分析分離的DNA，以200ng用量作為 PCR 模板。用 SEQ ID NO: 14(5’ -ACT CGA GCA CGT TGT GCA TTGTCA-3’ )和 SEQ IDNO: 15 (5，-TGT CGA CTA GTT TTC TTA AAATGG-3，)引物組通過 PCR 擴(kuò)增腺病 E4 區(qū)毒。首先于94° C變性5分鐘，再按如下進(jìn)行30次PCR循環(huán)94° C變性30秒，55° C退火40秒，72° C延伸I分鐘，然后72° C再延伸3分鐘。將PCR產(chǎn)物在電場(chǎng)存在下跑1%瓊脂糖凝膠以按器官分析腺病毒的分布。注射后，HAd5即Ad H5_8DS在肝和肺中觀察到的最多，而在心和脾中部分地檢出。相反，具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒，Ad H5/S19_8DS病毒在心和脾中檢出最多，而僅部分地在肝和肺中檢出(圖5)。這種分布方式非常不同于腺病毒血清型5的生物分布，已知腺病毒血清型5經(jīng)靜脈注射傳導(dǎo)至肝中，大量注射則引起肝中毒。也即，Ad H5/S19_8DS病毒極少量傳導(dǎo)至肝，如同實(shí)施例〈3-2>中觀察到病毒顯示出對(duì)凝血因子X很小的親和力所推測(cè)的。實(shí)施例5 :具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒避免HAd5中和抗體免疫識(shí)別的能力的體外研究<5-1>通過ElA表達(dá)方式檢測(cè)抗-HAd5-陽(yáng)性血漿對(duì)AdH5/S19_8DS和Ad328H5/S19_DS轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響將野生型HAd5以IX IO11VP的劑量肌肉注射至小鼠后腿，2周后再注射同樣劑量的病毒以促進(jìn)免疫應(yīng)答。從所有注射病毒的小鼠血樣中分離血清，測(cè)量抗-腺病毒抗體水平。為此，將1/25、1/100和1/1,000稀釋的血清加入至涂布有腺病毒的ELISA平板，孵育I小時(shí)，用PBST (含O. 1%吐溫20的PBS)洗滌3次，然后用1/5，000稀釋的HRP-標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體孵育I小時(shí)。用PBST (含有O. 1%吐溫20的PBS)洗滌平板5次后，通過與TMB底物反應(yīng)30分鐘并用IM磷酸終止進(jìn)行顯色。測(cè)量平板的吸光度。與通過與以1/1000稀釋的抗-腺病毒抗體(AbD Serotec公司，美國(guó)北卡羅來納州)反應(yīng)制備的陽(yáng)性對(duì)照相比，當(dāng)其吸光度為50%或更高時(shí)被認(rèn)為是誘導(dǎo)陽(yáng)性免疫應(yīng)答。用Ad H5/S19_8DS或Ad328 H5/S19_DS在MOI為25時(shí)感染在6-孔平板上生長(zhǎng)至90%融合度的A549細(xì)胞I小時(shí)，然后于室溫與確定為陽(yáng)性免疫應(yīng)答的小鼠血漿一起孵育。于37° C孵育24小時(shí)后，以3，OOOrpm離心5分鐘收獲細(xì)胞，懸浮于I X SDS-PAGE樣品緩沖液(50mM Tris (pH6. 8)，2%SDS，IOOmM 二硫蘇糖醇，O. 1%溴酚藍(lán)，10%甘油)，于100° C水浴中加熱5分鐘，以10，OOOrpm離心2分鐘。用電泳試劑盒(Novex)在20mA下，將澄清的上清液在4 12%的SDS-PAGE凝膠上跑約2小時(shí)。在含有Tris-甘氨酸緩沖液(39mM甘氨酸、48mM Tris,O. 037% SDS、20%甲醇)轉(zhuǎn)移單元(Invitrogen公司，美國(guó)加利福尼亞州)中施加300mA的電場(chǎng),將分離的蛋白轉(zhuǎn)移約90分鐘至PVDF膜上。用TBS封閉溶液(Thermo Scientific公司，美國(guó)伊利諾伊州)將所述膜于室溫下封閉I小時(shí)。將小鼠抗-ElA單克隆抗體(BD Pharmingen公司，美國(guó)加利福尼亞州)作為一抗，用5%脫脂奶/IXTBST緩沖液以1:3，000稀釋，室溫下以其孵育所述膜I小時(shí)，然后用I X TBST緩沖液沖洗6次，每次5分鐘。將抗-小鼠HRP (KPL公司，美國(guó)馬薩諸塞州)作為二抗，用5%脫脂奶/I X TBST緩沖液以1: 5，000稀釋，用其孵育所述膜30分鐘，然后用I XTBST緩沖液沖洗6次，每次5分鐘。用顯色劑(ECL，Amersham，英國(guó))顯示ElA蛋白條帶。而Ad H5_8DS的轉(zhuǎn)導(dǎo)被抗_HAd5抗體-陽(yáng)性血漿抑制，抗_HAd5抗體-陽(yáng)性血漿對(duì)嵌合型腺病毒 Ad H5/S19_8DS (圖 6A)、Ad328H5/S19_DS 和 Ad328 H5/S19_DS Λ 19k (圖6B)的轉(zhuǎn)導(dǎo)沒有影響。<5-2>通過免疫染色檢測(cè)抗-HAd5-陽(yáng)性血漿對(duì)H5/S19_8DS轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響用確定為陽(yáng)性免疫應(yīng)答的小鼠血漿孵育I小時(shí)后，用AdH5/S19_8DS或Ad H5/S19_DS在MOI為25時(shí)感染培養(yǎng)至90%融合度的A549細(xì)胞，然后于37° C孵育2天。用冷甲醇固定所述細(xì)胞，用無蛋白的T20 (TBS)封閉緩沖液(Thermo Scientific公司，美國(guó)伊利諾伊州)封閉I小時(shí)。在用PBST緩沖液稀釋(1/3,000)的小鼠抗-ElA單克隆抗體(BDPharmingen公司，美國(guó)加利福尼亞州)中孵育所述細(xì)胞I小時(shí)，用I X TBST緩沖液沖洗6次，每次5分鐘。然后，在用PBST緩沖液稀釋(1/5，000)的HRP-標(biāo)記的抗-小鼠二抗中再處理所述細(xì)胞I小時(shí)，用IXTBST緩沖液沖洗6次，每次5分鐘，并與DAB溶液反應(yīng)以顯色。發(fā)現(xiàn)抗_HAd5抗體-陽(yáng)性血漿抑制Ad H5_8DS的轉(zhuǎn)導(dǎo)，但對(duì)嵌合型腺病毒Ad H5/S19_8DS (圖7A)、Ad328H5/S19_DS 和 Ad H5/S19_DS Δ 19k (圖 7B)的轉(zhuǎn)導(dǎo)無影響。〈5-3>具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒避免HAd5中和抗體免疫識(shí)別的能力的體內(nèi)檢測(cè)將野生型HAd5以IXIOiiVP的劑量肌肉注射至倉(cāng)鼠后腿，2周后再以同樣劑量病毒注射以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。從所有注射病毒的倉(cāng)鼠血樣中分離血清，測(cè)量其抗-腺病毒抗體水平。為此，將1/25、1/100和1/1，000稀釋的血清加入至涂布有腺病毒的ELISA平板，孵育I小時(shí)，用PBST (含O. 1%吐溫20的PBS)洗滌3次，然后用1/5，000稀釋的HRP-標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體孵育I小時(shí)。用PBST (含有O. 1%吐溫20的PBS)洗滌平板5次后，通過與TMB底物反應(yīng)30分鐘并用IM磷酸終止進(jìn)行顯色。測(cè)量所述平板的吸光度。與通過與以1/1000稀釋的抗-腺病毒抗體反應(yīng)制備的陽(yáng)性對(duì)照相比，當(dāng)其吸光度為50%或更高時(shí)被認(rèn)為是誘導(dǎo)陽(yáng)性免疫應(yīng)答。發(fā)現(xiàn)以I X IO11VP劑量靜脈注射了 HAd5即Ad H5_8DS的免疫倉(cāng)鼠血液中LK8水平太低而無法檢出。反之，以IX IO11VP劑量靜脈注射了 Ad H5/S19_8DS的倉(cāng)鼠則確認(rèn)血液LK8水平為200ng/mL或更高，其表達(dá)量維持在200ng/mL或更高水平達(dá)28天，這表明抗-人腺病毒血清型5中和抗體沒有抑制具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖8)。實(shí)施例6 :具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒的毒性研究了 SAdl9六鄰體的毒性。為此，將病毒以I X IO11VP,5 X IO10VP, I X IO10VP,5 X IO9VP和I X IO9VP的劑量分別靜脈注射至5組各5只Balb/c小鼠，小鼠隔日稱重。注射后第3-6周，取小鼠血樣和血清分析紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白水平，紅細(xì)胞比容，MCV (平均紅細(xì)胞體積)，MCH(平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度)，MCHC (平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。進(jìn)行由白蛋白、總蛋白、SGPT (ALT)、SGOT (AST)和ALP水平的肝功能檢測(cè)，肌酸酐和BUN水平的腎功能檢測(cè)，肌酸酐激酶水平的肌肉檢測(cè)，以及總膽固醇和葡 萄糖水平的代謝檢測(cè)所組成的檢查。在5只以I X IO11VP的劑量注射了人腺病毒血清型5病毒Ad H5_8DS的小鼠組中，有4只小鼠在第5天死亡，而余下的I只為重病。經(jīng)尸體解剖發(fā)現(xiàn)它們患有肝硬化，而其他組織無異常。經(jīng)尸體解剖檢查，觀察到其他組別的小鼠均為正常(圖9)。〈6-1>血液測(cè)試分別以I X 10nVP,5X IO10VP, I X IO10VP,5X IO9VP 和 I X IO9VP 的劑量靜脈注射HAd5即Ad H5_8DS。在第5天，以IX IO11VP的劑量注射所述病毒的所有小鼠均死亡。另一方面，其他組別的小鼠沒有觀察到異常的毒性。在血液學(xué)和血液生化測(cè)試方面，測(cè)試組和注射PBS的陰性對(duì)照組之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(圖10)。在以lX10nVP、5X10lclVP、
IX IO iciVP、5 X IO9VP和I X IO9VP劑量注射了具有SAd 19六鄰體的嵌合型腺病毒Ad H5/S19_8DS的所有組別小鼠均沒有觀察到異常的毒性。同樣在血液學(xué)和血液生化測(cè)試方面，測(cè)試組和注射PBS的陰性對(duì)照組之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(圖11)。在以最大劑量注射HAd5的組中檢測(cè)到的肝中毒沒有在注射具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒的相應(yīng)組中觀察到。〈6-2>活組織檢查將從注射小鼠中切除的腦、心、肝、肺、腎、脾、子宮和卵巢用3. 7%的中性福爾馬林固定，包埋于石蠟中，切片后用H&E染色。除了以I X IO11VP劑量注射人腺病毒血清型的組以外，所有測(cè)試組均沒有發(fā)現(xiàn)器官異常。肝活組織檢查結(jié)果表明以IX IO11VP劑量注射的組存在大量肝壞死，其被認(rèn)為是誘導(dǎo)了死亡小鼠的急性肝功能障礙。這就是通常觀察到的腺病毒肝中毒。對(duì)于具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒，即便以I X IO11VP的劑量注射也沒有導(dǎo)致肝中毒，這表明SAdl9六鄰體有希望成為解決使用HAd5所導(dǎo)致的肝中毒問題的方案。實(shí)施例7 :具有SAdl9六鄰體的嵌合型腺病毒在動(dòng)物腫瘤模型中的抗腫瘤活性<7-1>嵌合型腺病毒在人肺癌異種移植動(dòng)物模型中的腫瘤選擇性、抗腫瘤活性將非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系NCI-H460以5X IO6個(gè)細(xì)胞的劑量皮下注射至免疫缺陷型Balb/c裸鼠右側(cè)以形成5(Tl00mm3大小的腫瘤。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。將對(duì)照組小鼠以I X IO9Pfu劑量靜脈注射攜帶LK8基因的Ad-LK8復(fù)制缺陷型腺病毒或靜脈注射PBS，以常規(guī)兩天的間隔注射3次。對(duì)于測(cè)試組，以I X 109pfu和2 X IO8Pfu的劑量靜脈注射Ad H5/S19_8DS，以常規(guī)間隔注射3次。每隔2或3天測(cè)量腫瘤大小以繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。首次注射病毒后第24天，以IX IO9Pfu劑量注射Ad H5/S19_8DS的組，相比施用PBS的組表現(xiàn)出74%以上的腫瘤生長(zhǎng)抑制率，而相比施用Ad-LK8的組表現(xiàn)出64%以上的腫瘤生長(zhǎng)抑制率。另一方面，以2 X IO8Pfu劑量注射Ad H5/S19_8DS的組，相比施用PBS的組表現(xiàn)出61%以上的腫瘤生長(zhǎng)抑制率，而相比施用Ad-LKS的組表現(xiàn)出48%以上的腫瘤生長(zhǎng)抑制率。自注射后第17天，雙向重復(fù)測(cè)量方差分析(2-way RM ANOVA)檢測(cè)揭示了注射AdH5/S19_8DS的兩組相對(duì)于施用PBS組的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(注射后第17天，P〈0. 05 ;注射后第21天和第 24 天，P〈0. 01)(圖 12)。<7-2>嵌合型腺病毒在用HAd5免疫的人肺癌原位動(dòng)物模型中的腫瘤選擇性、抗腫瘤活性將Balb/c裸鼠以IXIOiqVP的劑量用HAd5肌肉注射至其后腿進(jìn)行兩輪免疫，每輪常規(guī)間隔2周。從取自所述小鼠的血樣中發(fā)現(xiàn)其含有抗_HAd5抗體。將NSCLC細(xì)胞系NCI-H2172以I X IO6細(xì)胞的劑量接種至尾部血管。在以I X 109pfu注射劑量接種腫瘤后的 第7、9和11天，空白對(duì)照和免疫的小鼠接受三次靜脈注射Ad-LK8、Ad H5/S19_8DS或AdH5_8DS。在第6周，從所述小鼠切離肺(圖13)。對(duì)肺中產(chǎn)生的腫瘤計(jì)數(shù)，并按照大小分組X彡O. 5cm, O. 5cm〈x ( O. 7cm和O. 7cm〈x ( lcm,并將其分別記為5、7和10分。對(duì)肺產(chǎn)生的腫瘤進(jìn)行計(jì)數(shù)，在施用PBS的陰性對(duì)照組中平均為18. 6，而在施用Ad-LK8的組中平均為
11.2。對(duì)于施用Ad H5/S19_8DS的組，發(fā)現(xiàn)分別在用和未用HAd5進(jìn)行免疫的肺中平均腫瘤數(shù)為5. 6和5. 4。另一方面，對(duì)于施用Ad H5_8DS的組，發(fā)現(xiàn)分別在免疫或空白對(duì)照的小鼠肺中平均腫瘤數(shù)為10. 8和6. 2。因此，Ad H5/S19_8DS顯示出與免疫無關(guān)的幾乎相同的滴度，但是，由于抗-HAd5抗體Ad H5_8DS顯示出明顯下降的效價(jià)。測(cè)量平均肺體積，正常小鼠為274mm3，施用PBS的組為570mm3，施用Ad_LK8的組為480mm3。然而，發(fā)現(xiàn)注射Ad H5/S19_8DS的免疫或未免疫小鼠組的肺體積分別為370mm3和360mm3。它們之間的肺體積沒有顯著性差異。在施用Ad H5_8DS的組中，免疫或未免疫小鼠平均肺體積分別為410mm3和350mm3。測(cè)量平均肺重量，正常小鼠為170mg，施用PBS的組為376mg，施用Ad_LK8的組為278mg。當(dāng)注射AdH5/S19_8DS時(shí)，免疫或未免疫小鼠組所測(cè)量的平均肺重量均為218mg，而對(duì)于施用Ad H5_8DS的組的平均肺重量，免疫小鼠為240mg，未免疫小鼠為230。對(duì)于根據(jù)腫瘤大小所得的分?jǐn)?shù)，測(cè)量的平均數(shù)為施用PBS的組為107. 8，而施用Ad-LK8的組為60. 8。當(dāng)注射AdH5/S19_8DS時(shí)，所述免疫組和未免疫組得到的分?jǐn)?shù)分別為28和27。另一方面，當(dāng)注射Ad H5_8DS時(shí)，所述免疫組和未免疫組分別得到的分?jǐn)?shù)為57. 2和32. 6 (圖14)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，不考慮HAd5的免疫，Ad H5/S19_8DS甚至進(jìn)行靜脈注射也能具有抗腫瘤活性。盡管已經(jīng)針對(duì)上述具體實(shí)施方式
描述了本發(fā)明，應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明做出各種修改和變化，其同樣落入所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.分離自具有如SEQID NO: 16所示氨基酸序列的猿腺病毒血清型19的六鄰體。
2.編碼如權(quán)利要求I所述六鄰體的DNA。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA，其具有如SEQID NO:3所示的核苷酸序列。
4.具有如SEQID N0:21所示氨基酸序列的高變區(qū)(HVR)，其分離自猿腺病毒血清型19。
5.編碼如權(quán)利要求4所述HVR的DNA。
6.如權(quán)利要求5所述的DNA，其具有如SEQID NO:20所示核苷酸序列。
7.嵌合型腺病毒，其通過在六鄰體中用具有如SEQID NO: 16所示氨基酸序列的六鄰體蛋白或七(7)個(gè)或以上其中的連續(xù)的殘基進(jìn)行替換而具有非天然氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的嵌合型腺病毒，其中所述非天然氨基酸序列為具有如SEQIDNO:21所示氨基酸序列的HVR。
9.如權(quán)利要求7所述的嵌合型腺病毒，其中所述非天然氨基酸序列為選自下組的HVR片段SEQ ID NO:21的氨基酸殘基11-41 ;SEQ ID NO:21的氨基酸殘基46-52 ;SEQ IDNO:21的氨基酸殘基69-78 ;SEQ ID NO:21的氨基酸殘基106-119 ;SEQ ID NO:21的氨基酸殘基126-138 ；SEQ ID NO:21的氨基酸殘基160-173 ;以及SEQ ID NO:21的氨基酸殘基275-303。
10.如權(quán)利要求7所述的嵌合型腺病毒，其為人腺病毒。
11.如權(quán)利要求10所述的嵌合型腺病毒，其中所述人腺病毒選自下組人腺病毒血清型 2、3、5、11、24、26、30、34、35、36、41、48、49 和 50。
12.如權(quán)利要求7所述的嵌合型腺病毒，其中所述嵌合型腺病毒還包括治療性轉(zhuǎn)基因。
13.如權(quán)利要求12所述的嵌合型腺病毒，其中所述治療性轉(zhuǎn)基因選自下組腫瘤抑制基因、抗原基因、細(xì)胞毒素基因、細(xì)胞抑制基因、自殺基因、抗血管生成基因和免疫調(diào)節(jié)基因。
14.如權(quán)利要求13所述的嵌合型腺病毒，其中所述腫瘤抑制基因選自下組p53基因、APC基因、DPC-4/Smad-4基因、BRCA-I基因、BRCA-2基因、WT-I基因、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因、MMAC-I基因、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白、DCC (在結(jié)腸直腸癌中去除的)基因、麗SC-2基因、NF-I基因、NF-2基因、MTSl基因、⑶K4基因和VHL基因； 所述抗原基因?yàn)榘┡呖乖?CEA)、⑶3、⑶133、⑶44或p53 ； 所述細(xì)胞毒素基因選自編碼綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒素和白喉毒素的基因； 所述細(xì)胞抑制基因選自下組P21、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的基因和生長(zhǎng)終止特異性同源盒(GAX)基因； 所述自殺基因選自編碼單純皰疹病毒胸苷激酶、水痘胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、β -內(nèi)酰胺酶、羧肽酶G2、細(xì)胞色素Ρ450-2Β1、硝基還原酶、β -葡糖醛酸酶和TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體)的基因； 所述抗血管生成基因選自編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、血管生成抑制素、內(nèi)皮抑制素和載脂蛋白(a)三環(huán)結(jié)構(gòu)域(LK8)的基因；以及 所述免疫調(diào)節(jié)基因選自編碼⑶16、CTLA-4、IL24和GM-CSF的基因。
15.包括如權(quán)利要求7所述嵌合型腺病毒的組合物。
16.將治療性轉(zhuǎn)基因遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其包括將權(quán)利要求12所述的嵌合型腺病毒引入所述細(xì)胞。
17.一種治療癌癥的方法，其包括將權(quán)利要求12所述的嵌合型腺病毒施用于個(gè)體中。
18.一種制備用于基因治療的腺病毒載體的方法，其包括將人腺病毒六鄰體的七(7)個(gè)或以上氨基酸殘基替換為具有如SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的六鄰體蛋白的七(7)個(gè)或以上氨基酸殘基。
19.包括如權(quán)利要求7所述嵌合型腺病毒的分離的宿主細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求19所述的分離的宿主細(xì)胞，其中所述分離的宿主細(xì)胞為人細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離自由SEQ ID NO:3所示多核苷酸編碼的猿腺病毒血清型19的新六鄰體、其高變區(qū)、含有其的嵌合型腺病毒，及其治療上的用途，提供了解決使用腺病毒開發(fā)基因治療劑進(jìn)行安全和有效地系統(tǒng)治療的問題的方案。
文檔編號(hào)C12N15/861GK102844329SQ201080066219
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者李圭鉉, 尹成泰, 高垡經(jīng), 李洪圭, 趙義哲 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所