專利名稱：一種酵母表達(dá)的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程制品的制備方法，具體地說(shuō)是一種牛乳鐵蛋白衍生來(lái)源的抗菌蛋白片段的真核表達(dá)及其產(chǎn)品制備方法。
背景技術(shù)：
乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)是一種天然非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，主要由乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌，廣泛分布于哺乳動(dòng)物乳汁和其他多種組織及其分泌液中，是哺乳動(dòng)物非特異性免疫和獲得性免疫反應(yīng)重要的介導(dǎo)分子。乳鐵蛋白是一個(gè)多效性的分子，除全長(zhǎng)蛋白的鐵離子結(jié)合能力外，乳鐵蛋白及其降解產(chǎn)物如N-lobe、C-lobe、N-端抗菌肽——乳鐵蛋白肽和乳鐵蛋白兩親肽等衍生片段在廣譜抗菌、抗炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫動(dòng)態(tài)平衡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白和核糖核酸酶作用等過(guò)程中起直接輔助作用，被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品、化妝品和飼料添加劑。根據(jù)蛋白藥物分子設(shè)計(jì)原理和方法，本發(fā)明以抗金黃色葡萄球菌為目標(biāo)，以牛乳鐵蛋白作為出發(fā)抗菌蛋白模板，創(chuàng)新性設(shè)計(jì)篩選和高效表達(dá)具有特異性抗金黃色葡萄球菌活性的抗菌多肽片段，具有重要的人與動(dòng)物臨床和預(yù)防醫(yī)學(xué)意義。金黃色葡萄球菌是人和動(dòng)物的重要病原菌之一，常引起鼻腔、口腔粘膜以及皮膚和上皮組織的感染，在獸醫(yī)臨床主要引起牛、羊的乳房炎，犬、貓的鼻炎、外耳炎，豬的敗血癥，雞的水腫癥等。金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性球菌病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)公共衛(wèi)生尤其是相關(guān)從業(yè)人員的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。此外，乳鐵蛋白完整分子的工業(yè)化和商業(yè)化應(yīng)用也已取得了很大進(jìn)展，已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。美國(guó)食品藥品管理局已于2001年批準(zhǔn)乳鐵蛋白作為食品添加劑用于運(yùn)動(dòng)和功能性食品中，其抗金黃色葡萄球菌的特異性和活性都不是很高，難以滿足臨床和預(yù)防醫(yī)學(xué)的實(shí)際需求。而小分子量抗菌肽的制備和純化存在分離成本很高，價(jià)格昂貴，一時(shí)難以推廣普及滿足生產(chǎn)需求。應(yīng)用基因工程技術(shù)在體外高效表達(dá)重組乳鐵蛋白衍生抗菌片段，提高表達(dá)量和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，有望為解決抗菌肽替代抗生素這一問(wèn)題提供了有效思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的牛乳鐵蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表達(dá)及其產(chǎn)品制備方法的目的在于開展牛乳鐵蛋白衍生抗菌分子BLfA的設(shè)計(jì)篩選、重組畢赤酵母構(gòu)建和轉(zhuǎn)抗菌蛋白酵母的高密度發(fā)酵研究，以突破乳鐵蛋白外源表達(dá)、翻譯后修飾及重組蛋白純化的技術(shù)瓶頸，獲得安全、環(huán)保、高產(chǎn)、高效的基因工程重組乳鐵蛋白及其衍生抗菌蛋白，推進(jìn)新型抗菌蛋白的工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)程。同時(shí)將為新型抗菌蛋白的分子設(shè)計(jì)、構(gòu)效關(guān)系研究和乳源抗菌蛋白產(chǎn)業(yè)化提供理論支持。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。以牛乳鐵蛋白分子序列為出發(fā)模板，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)手段，通過(guò)分子設(shè)計(jì)選定抗金黃色葡萄球菌導(dǎo)向的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA基因序列，全長(zhǎng)1032個(gè)堿基，編碼344個(gè)氨基酸殘基，利用畢赤巴斯德酵母進(jìn)行真核表達(dá)、包括可能發(fā)生的糖基化修飾在內(nèi)，推算表達(dá)產(chǎn)生的重組蛋白分子量約為43KD。牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列為
1ATGGCCCCGAGGAAAAACGTTCGATGGTGTACCATCTCCCAACCTGAGTGGTTCAAATGC
1MAPRKNVRWCTISQPEWFKC
61CGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTCCCTCTATCACCTGTGTGAGGAGG
21RRffQffRMKKLGAPSITCVRR
121GCCTTTGCCTTGGAATGTATCCGGGCCATCGCGGAGAAAAAGGCGGATGCTGTGACCCTG
41AFALECIRAIAEKKADAVTL
181GATGGTGGCATGGTGTTTGAGGCGGGCCGGGACCCCTACAAACTGCGGCCAGTAGCAGCA
61DGGMVFEAGRDPYKLRPVAA
241GAGATCTATGGGACGAAAGAGTCTCCCCAAACCCACTATTATGCTGTGGCCGTCGTGAAG
81EIYGTKESPQTHYYAVAVVK
301AAGGGCAGCAACTTTCAGCTGGACCAGCTGCAAGGCCGGAAGTCCTGCCATACGGGCCTT
101KGSNFQLDQLQGRKSCHTGL
361GGCAGGTCCGCTGGGTGGATCATCCCTATGGGAATCCTTCGCCCGTACTTGAGCTGGACA
121GRSAGffI IPMGILRPYLSffT
421GAGTCACTCGAGCCCCTCCAGGGAGCTGTGGCTAAATTCTTCTCTGCCAGCTGTGTTCCC
141ESLEPLQGAVAKFFSASCVP
481TGCATTGATAGACAAGCATACCCCAACCTGTGTCAACTGTGCAAGGGGGAGGGGGAGAAC
161CIDRQAYPNLCQLCKGEGEN
541CAGTGTGCCTGCTCCTCCCGGGAACCATACTTCGGTTATTCTGGTGCCTTCAAGTGTCTG
181QCACSSREPYFGYSGAFKCL
601CAGGACGGGGCTGGAGACGTGGCTTTTGTTAAAGAGACGACAGTGTTTGAGAACTTGCCA
201QDGAGDVAFVKETTVFENLP
661GAGAAGGCTGACAGGGACCAGTATGAGCTTCTCTGCCTGAACAACAGTCGGGCGCCAGTG
221EKADRDQYELLCLNNSRAPV
721GATGCGTTCAAGGAGTGCCACCTGGCCCAGGTCCCTTCTCATGCTGTCGTGGCCCGAAGT
241DAFKECHLAQVPSHAVVARS
781GTGGATGGCAAGGAAGACTTGATCTGGAAGCTTCTCAGCAAGGCGCAGGAGAAATTTGGA
261VDGKEDLIffKLLSKAQEKFG
841AAAAACAAGTCTCGGAGCTTCCAGCTCTTTGGCTCTCCACCCGGCCAGAGGGACCTGCTG
281KNKSRSFQLFGSPPGQRDLL
901TTCAAAGACTCTGCTCTTGGGTTTTTGAGGATCCCCTCGAAGGTAGATTCGGCGCTGTAC
301FKDSALGFLRIPSKVDSALY
961CTGGGCTCCCGCTACTTGACCACCTTGAAGAACCTCAGGGAAACTGCGGAGGAGGTGAAG
321LGSRYLTTLKNLRETAEEVK
1021GCGCGGTACACC
341 ARYT本發(fā)明提供的牛乳鐵蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表達(dá)及其產(chǎn)品制備方法，其步驟如下1、從荷斯坦奶牛乳腺組織中克隆了 BLf全長(zhǎng)cDNA ；2、以BLf全長(zhǎng)cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增了 BLfA編碼基因；3、構(gòu)建了 Pichia. pastoris重組表達(dá)載體pPICBLfA，BLfA在畢赤酵母搖瓶水平得到分泌表達(dá)，在甲醇誘導(dǎo)30h后達(dá)搖瓶水平最大表達(dá)量485mg/L;rBLfA經(jīng)Ni-NTA His-Bind 樹脂純化后純度為93. 8% ；重組蛋白的去糖基化反應(yīng)結(jié)果顯示，rBLfA被糖基化修飾，表觀分子量為43. OkDa ；4、進(jìn)行 rBLfA 的 Fe3+結(jié)合能力為 0. 330，rBLfA釋放!^e3+的 pH 范圍為 pH 7. 0-3. 5 ；5、rBLfA抑菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，rBLfA具有抑制金黃色葡萄球菌 Staphyloccocus. aureus 白勺功倉(cāng)泛，MIC 為 6· 5 μ mol/L ；6、表達(dá)rBLfA的重組菌株經(jīng)過(guò)5升發(fā)酵罐水平上的高密度發(fā)酵，分泌的目標(biāo)蛋白質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到499mg/L，利用透明顫菌血紅蛋白VHb在宿主菌胞內(nèi)與rBLfA共表達(dá)，使 rBLfA發(fā)酵罐水平的表達(dá)量提高了 23%，達(dá)6i;3mg/L，CO差光譜的結(jié)果表明，VHb在重組菌 X-33 (rBLfA-VHb)中得到了有效的表達(dá)。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品在醫(yī)藥、化妝品、食品、飼料等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景，提高機(jī)體免疫力，替代抗生素。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在UBLfA基本保持了其在天然牛乳鐵蛋白中的原有結(jié)構(gòu)，并具有4個(gè)牛乳鐵蛋白分子中最強(qiáng)的分子表面陽(yáng)離子特性。脫鐵(apo)的rBLfA和rBLf均可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌 S. aureus ATCC 25923的存活率下降，具有延緩S. aureus生長(zhǎng)的作用，其中rBLfA的抑生長(zhǎng)作用優(yōu)于對(duì)照產(chǎn)品牛乳鐵蛋白(純度為90%，Sigma, L9507)。2、甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母對(duì)甲醇的利用過(guò)程中，溶解氧的傳遞極為重要。Vgb的異源表達(dá)能改善重組畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)部氧的儲(chǔ)存與傳遞。VHb在重組菌X-33 (rBLfA-VHb)中的表達(dá)具有促進(jìn)搖瓶和發(fā)酵罐水平重組菌的生長(zhǎng)狀況及rBLfA合成能力的作用，使rBLfA發(fā)酵罐水平的表達(dá)量提高了 23%，達(dá)6i;3mg/L。3、由于抗菌肽分子量小，在構(gòu)建重組載體和重組蛋白分離純化時(shí)難度大，表達(dá)量不高，融合蛋白切割效率低，以及陽(yáng)離子性和溶血性較強(qiáng)，多聚體毒性高等抗菌肽本身的特殊性質(zhì)限制了其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。本研究的牛乳鐵蛋白衍生抗菌分子BLfA重組畢赤酵母細(xì)胞高密度發(fā)酵突破了乳鐵蛋白外源表達(dá)、翻譯后修飾及重組蛋白純化的技術(shù)瓶頸，能夠獲得安全、環(huán)保、高產(chǎn)、高效的基因工程重組乳鐵蛋白衍生抗菌蛋白，以期推進(jìn)新型抗菌蛋白的工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)程。


圖IrBLfA和對(duì)照牛乳鐵蛋白的抑菌效果圖2重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖3重組蛋白的純化圖4WeStern blot分析重組蛋白的去糖基化
圖5重組菌的CO差光譜分析下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。圖IrBLfA和對(duì)照牛乳鐵蛋白的抑菌效果，為rBLfA和對(duì)照牛乳鐵蛋白37°C分別作用Ih后金黃色葡萄球菌S. aureus ATCC 25923的存活率(CFU/mL)，其中樣品為Apo rBLfA 和Apo對(duì)照牛乳鐵蛋白，處理濃度分別為0,3. 13，6. 25，12. 5，25和50μ mol/L圖2重組蛋白的SDS-PAGE電泳，為重組菌X_33 (rBLfA-VHb)和X_33 (rBLfA)發(fā)酵罐水平表達(dá)rBLfA (A，B)，其中泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為66. 2，45. 0， 33. 0,26.0, 20. OkDa ；泳道2-9分別為誘導(dǎo)時(shí)間為12，24，36，48，60，72小時(shí)的發(fā)酵重組蛋白產(chǎn)物。圖3重組蛋白的純化，為畢赤酵母表達(dá)重組蛋白rBLfA的純化，其中泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為94. 0，66. 2，45. 0，33. 0,26. 0,20. 0,14. 4kDa ；泳道2-4分別為鎳柱純化后rBLfA蛋白。
圖4WeStern blot分析重組蛋白的去糖基化，為flfestern blot分析畢赤酵母表達(dá)重組蛋白rBLfA的去糖基化，兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗血清作為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔作為二抗，其中泳道1為預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為89. 0，45. 0，34. 0， 25. 0，19. OkDa ；泳道2為rBLfA ；泳道3為經(jīng)過(guò)Endo H處理的rBLfA。
圖5重組菌的CO差光譜分析，為重組菌X-33 (rBLfA-VHb)的CO差光譜分析，圖中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為吸光值。 具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的一種牛乳鐵蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表達(dá)及其制備方法的具體實(shí)施方式
如下1、從荷斯坦奶牛乳腺組織中克隆了 BLf全長(zhǎng)cDNA ；使用Trizol試劑提取牛乳腺組織總RNA，以荷斯坦奶牛乳腺組織總RNA為模板，兩步法RT-PCR擴(kuò)增BLf cDNA全長(zhǎng)分子，第一步為反轉(zhuǎn)錄，即合成第一鏈cDNA，RT-PCR第二步為PCR擴(kuò)增，以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，特異性引物序列為Pl :gTCCCATggCCCCgAggAAAAACgTTCgATggTgTA ；P2 ACgTCgACCCCTCgTCAggAAggCgCAg。2、以BLf全長(zhǎng)cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增了 BLfA編碼基因，引物為P1 ggAATTCgCCCCgAggAAAAACg ；P2 gCTCTAgAgCCCTggTgTACCgCgCCTTCA 3、構(gòu)建了 P. pastoris重組表達(dá)載體pPICBLfA，用限制性內(nèi)切酶Rne I線性化，將線形化的重組載體回收純化，分別電擊轉(zhuǎn)化P. pastoris X-33感受態(tài)細(xì)胞。4、BLfA在畢赤酵母搖瓶水平得到分泌表達(dá)，在甲醇誘導(dǎo)30h后達(dá)搖瓶水平最大表達(dá)量485mg/L ；rBLfA經(jīng)Ni-NTA His-Bind樹脂純化后純度為93. 8%;兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗血清作為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔作為二抗，進(jìn)行了 SDS-PAGE和Western Blot 分析重組蛋白的糖基化，結(jié)果顯示，rBLfA被糖基化修飾，表觀分子量為43. OkDa ；5、rBLfA的!^3+結(jié)合能力測(cè)定(1)將鐵飽和重組蛋白通過(guò)超濾置于pH值分別為7.0，6. 5，6.0，5. 5，5.0，4. 5， 4. 0,3. 5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，4°C靜置Mh ；(2)超濾去除多余的鹽及鐵離子；(3)酶標(biāo)儀測(cè)定465nm處光吸收值，以對(duì)照牛乳鐵蛋白鐵飽和狀態(tài)(pH8. 0)下0D465nm值為100%，估算出不同pH條件下rBLFA的鐵飽和度。rBLfA 的 Fe3+ 結(jié)合能力為 0. 330，rBLfA 釋放 Fe3+ 的 pH 范圍為 pH 7. 0-3. 5。6、rBLfA的抑菌活性檢測(cè)(1)甘油管保存的金黃色葡萄球菌(S. aureus ATCC 25923)在MHB平板劃線，于 37 °C活化培養(yǎng)；(2)挑取單菌落，37 °C，240rpm振蕩過(guò)夜培養(yǎng)至0D600nm為 0. 2-0. 4(7. 2 X 108-1. 44 X 109CFUs/mL)；(3)收集1. 5mL菌液，等體積生理鹽水洗滌兩次，重懸于等體積生理鹽水中；(4)將倍比稀釋后不同濃度的待測(cè)抗菌樣品溶液100 μ L分別加到滅菌的96孔板中，濃度分別為50，25，12. 5,6. 25 ( μ mol/μ L)，陽(yáng)性對(duì)照為50 μ mo 1/LAmp,陰性對(duì)照為生理鹽水；(5)向每孔中加ΙΟΟμΙ菌液，密封后置37°C中孵育lh。樣品的終濃度為6，3，1.5， 0. 75 ( μ g/ μ L)；(6)將溫育后的樣品梯度稀釋為10-4、10_5、10-6，各取50 μ L，涂平板；(7)待菌液吸收后，封口，倒置，370C，靜置培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算CFU。rBLfA的抑菌活性檢測(cè)結(jié)果顯示rBLfA具有抑制金黃色葡萄球菌S. aureus生長(zhǎng)的功能，MIC 為 6. 5ymol/L;7、表達(dá)rBLfA的重組菌株進(jìn)行了細(xì)胞高密度發(fā)酵，產(chǎn)量為499mg/L，利用透明顫菌血紅蛋白VHb在宿主菌胞內(nèi)與rBLfA共表達(dá)，使rBLfA發(fā)酵罐水平的表達(dá)量提高了 23 %，達(dá) 613mg/L。8、重組菌X-33 (rBLfA-VHb)的CO差光譜測(cè)定(1)使VHb在過(guò)量的Naj2O4的還原作用下由原始狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)；(2)向預(yù)處理后的X-33 (rBLfA-VHb)的無(wú)細(xì)胞提取液中通入CO氣體，溶液逐漸由無(wú)色變?yōu)闇\紅色；(3)分光光度計(jì)掃描、計(jì)算、分析400-500nm之間的差光譜。CO差光譜的結(jié)果表明，整合有vgb基因的X-33 (rBLfA-VHb)的無(wú)細(xì)胞提取液樣品在419nm處有一明顯的波峰出現(xiàn)，而對(duì)照組X_33 (rBLfA)則無(wú)特征性波峰出現(xiàn)，證明VHb在重組菌X-33 (rBLfA-VHb)中得到了有效的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種酵母表達(dá)的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA，其特征是具有4個(gè)牛乳鐵蛋白分子中最強(qiáng)的分子表面陽(yáng)離子特性，其中牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA基因的核苷酸序列為1 ATGGCCCCGAGGAAAAACGTTCGATGGTGTACCATCTCCCAACCTGAGTGGTTCAAATGC 61 CGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTCCCTCTATCACCTGTGTGAGGAGG 121 GCCTTTGCCTTGGAATGTATCCGGGCCATCGCGGAGAAAAAGGCGGATGCTGTGACCCTG 181 GATGGTGGCATGGTGTTTGAGGCGGGCCGGGACCCCTACAAACTGCGGCCAGTAGCAGCA 241 GAGATCTATGGGACGAAAGAGTCTCCCCAAACCCACTATTATGCTGTGGCCGTCGTGAAG 301 AAGGGCAGCAACTTTCAGCTGGACCAGCTGCAAGGCCGGAAGTCCTGCCATACGGGCCTT 361 GGCAGGTCCGCTGGGTGGATCATCCCTATGGGAATCCTTCGCCCGTACTTGAGCTGGACA 421 GAGTCACTCGAGCCCCTCCAGGGAGCTGTGGCTAAATTCTTCTCTGCCAGCTGTGTTCCC 481 TGCATTGATAGACAAGCATACCCCAACCTGTGTCAACTGTGCAAGGGGGAGGGGGAGAAC 541 CAGTGTGCCTGCTCCTCCCGGGAACCATACTTCGGTTATTCTGGTGCCTTCAAGTGTCTG 601 CAGGACGGGGCTGGAGACGTGGCTTTTGTTAAAGAGACGACAGTGTTTGAGAACTTGCCA 661 GAGAAGGCTGACAGGGACCAGTATGAGCTTCTCTGCCTGAACAACAGTCGGGCGCCAGTG 721 GATGCGTTCAAGGAGTGCCACCTGGCCCAGGTCCCTTCTCATGCTGTCGTGGCCCGAAGT 781 GTGGATGGCAAGGAAGACTTGATCTGGAAGCTTCTCAGCAAGGCGCAGGAGAAATTTGGA 841 AAAAACAAGTCTCGGAGCTTCCAGCTCTTTGGCTCTCCACCCGGCCAGAGGGACCTGCTG 901 TTCAAAGACTCTGCTCTTGGGTTTTTGAGGATCCCCTCGAAGGTAGATTCGGCGCTGTAC 961 CTGGGCTCCCGCTACTTGACCACCTTGAAGAACCTCAGGGAAACTGCGGAGGAGGTGAAG 1021 GCGCGGTACACC
2.一種制備權(quán)利要求1所述的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA的制備方法，其特征是(1)從荷斯坦奶牛乳腺組織中克隆了BLf全長(zhǎng)cDNA ；以BLf全長(zhǎng)cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增了 BLfA編碼基因；(2)構(gòu)建了Pichia. pastoris重組表達(dá)載體pPICBLfA，BLfA在畢赤酵母搖瓶水平得到分泌表達(dá)，在甲醇誘導(dǎo)30h后達(dá)搖瓶水平最大表達(dá)量485mg/L ；rBLfA經(jīng)Ni-NTA His-Bind 樹脂純化后純度為93. 8% ；重組蛋白的去糖基化反應(yīng)結(jié)果顯示，rBLfA被糖基化修飾，表觀分子量為43. OkDa ；(3)表達(dá)的rBLfA的重組菌株進(jìn)行了細(xì)胞高密度發(fā)酵，產(chǎn)量分別為499mg/L，利用透明顫菌血紅蛋白VHb在宿主菌胞內(nèi)與rBLfA共表達(dá)，使rBLfA發(fā)酵罐水平的表達(dá)量提高了 23%，達(dá)6i;3mg/L，CO差光譜的結(jié)果表明，VHb在重組菌X_33 (rBLfA_VHb)中得到了有效的表達(dá)。結(jié)果，rBLfA的Fe3+結(jié)合能力為0. 330，rBLfA釋放Fe3+的pH范圍為pH 7. 0-3. 5 ；rBLfA 具有抑制金黃色葡萄球菌Maphyloccocus. aureus生長(zhǎng)的功能，MIC為6. 5 μ mol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種基因工程抗菌蛋白的制備方法，具體地說(shuō)是一種牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA的真核表達(dá)蛋白及其制備方法。從荷斯坦奶牛乳腺組織中克隆了BLfA編碼基因并構(gòu)建重組表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母中表達(dá)，搖瓶和5升發(fā)酵罐最大表達(dá)量分別為485和499mg/L；利用透明顫菌血紅蛋白VHb在宿主菌胞內(nèi)與rBLfA共表達(dá)，表達(dá)量提高了23％，達(dá)613mg/L；rBLfA經(jīng)親和純化，純度為93.8％；鐵結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，rBLfA的Fe3+結(jié)合能力為0.330，釋放Fe3+的pH范圍為7.0-3.5；rBLfA具有抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的功能，MIC為6.5μmol/L。
文檔編號(hào)C07K14/79GK102408480SQ20101028687
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者楊雅麟, 滕達(dá), 王建華, 白雪晶 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所