一種重組人乳鐵蛋白蠶蛹粉及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組人乳鐵蛋白蠶蛹粉及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳鐵蛋白（Lactoferrin，簡稱LF)，是轉(zhuǎn)鐵蛋白屬中的一員，主要存在于哺乳動物 乳清中，亦稱乳轉(zhuǎn)鐵蛋白。乳鐵蛋白分布廣泛，除乳汁中含有豐富的乳鐵蛋白外，在一些分 泌物，如：淚液、精液、膽汁中也檢測到乳鐵蛋白的存在。
[0003] 人乳鐵蛋白（Human Lactoferrin，hLF)，是一種分泌型鐵結(jié)合糖蛋白，由一條多 肽鏈折疊成兩個結(jié)構(gòu)相似的腦葉結(jié)構(gòu)，每個結(jié)構(gòu)含有一個鐵結(jié)合位點。hLF的cDNA為 2136bp，所編碼的前19個氨基酸為信號肽，后692個氨基酸構(gòu)成分子量約SOkD的成熟人乳 鐵蛋白。hLF具有鐵結(jié)合能力、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及消炎等多種生物學(xué)功能。
[0004] 潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC)，是一種慢性腸道疾病，其病因及發(fā)病機 制目前尚不清楚。病變主要位于結(jié)腸的黏膜層；以潰瘍?yōu)橹?；多累及直腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸。典型 的臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、粘液膿血便。由于其病因不明，病程漫長且易反復(fù)發(fā)作而治愈難 度大，已引起醫(yī)藥行業(yè)人士的廣泛重視。
[0005] 治療UC的常用給藥制劑有液體灌腸劑、泡沫劑和栓劑，但由于劑型應(yīng)用不便，制 約了藥效發(fā)揮。中藥口服制劑以湯藥居多，且大多為粗制劑，服用量大，生物利用度低，藥 效緩慢。柳氮磺胺嘧啶片（SASP)是目前西藥治療輕中度UC的首選口服藥物，口服后在腸 道被細(xì)菌分解成5-氨基水楊酸和磺胺嘧啶，前者被小腸大量吸收，導(dǎo)致無足量藥物抵達(dá)結(jié) 腸；而后者并無治療作用，吸收后產(chǎn)生大量不良反應(yīng)。因此，研究一種有效、安全的新型口服 藥顯得尤為必要和緊迫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種克服上述缺陷的重組人乳鐵蛋白蠶蛹粉及 其制備方法和應(yīng)用，通過構(gòu)建重組桿狀病毒Bm-hLF，以家蠶蛹作為生物反應(yīng)器大量表達(dá)重 組人乳鐵蛋白，并考察了 rhLF (重組人乳鐵蛋白）蠶蛹粉在用于制備由葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo) 的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種家蠶重組桿狀病毒Bm-hLF，該病毒含有hLF基 因。
[0008] 優(yōu)選地，其中所述hLF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述家蠶重組桿狀病毒Bm-hLF的制備方法，所述方法包括以 下步驟： 1) 通過設(shè)計引物，由PCR擴增的方法以攜帶有hLF基因的重組病毒DNA為模板獲得hLF 基因的目的片段； 2) hLF基因的5'和3'端分別引入通〇1和幻ml酶切位點后，連接到載體pFastBacl的 多角體啟動子下，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacl-hLF ; 3)取步驟2)所得的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacl-hLF轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞， 在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)板上進行藍(lán)白斑篩選，避光培 養(yǎng)4(T48h后挑取白斑，培養(yǎng)24?48h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，進行PCR鑒定； (4)取步驟3)鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，發(fā)病 后獲得一代病毒懸液(T4°C保存，提取病毒基因組再次進行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿 狀病毒Bm-hLF。
[0010] 本發(fā)明還提供一種上述家蠶重組桿狀病毒Bm-hLF表達(dá)的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 2 所示。
[0011] 本發(fā)明還提供含有上述蛋白的rhLF蠶蛹粉。
[0012] 本發(fā)明還提供上述rhLF蠶蛹粉的制備方法，所述方法包括以下步驟： 1) 家蠶重組桿狀病毒Bm-hLF病毒液以穿刺法接種于家蠶蛹； 2) 通風(fēng)透光，持續(xù)培養(yǎng)5~7天，培養(yǎng)環(huán)境為25~28°C，濕度80% ; 3) 收集發(fā)病蠶蛹，4~8°C勻漿，凍干，獲得所述rhLF蠶蛹粉。
[0013] 本發(fā)明還提供上述rhLF蠶蛹粉的體外抑菌活性檢測方法，所述方法包括以下步 驟： 1) 取-80°C保存的凡co/i TGl甘油菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm，搖床培 養(yǎng)12?14h，以活化菌種； 2) 將步驟1)活化得到的凡cWiTGl菌液轉(zhuǎn)接到新的LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)2 h， 使菌液變渾濁； 3) 將上述rhLF蠶蛹粉溶于提前在4°C中預(yù)冷的PBS中，冰上攪拌使其充分溶解，4°C， 15000rpm，離心30min，上清重復(fù)離心，所得上清在超凈工作臺過0. 22 μ m濾膜除菌，獲得所 述rhLF蠶蛹粉的上清液； 4) 在超凈工作臺上，取滅菌EP管加入新的LB液體培養(yǎng)基200 μ L，再加入2 μ L步驟2) 獲得的菌液和20 μ L步驟3)獲得的所述rhLF蠶蛹粉的上清液，37°C，220rpm搖床培養(yǎng)，分 別在2h、4h、6h、8h、10h后取出相應(yīng)的菌液，IOOOrpm離心lOmin，沉淀用PBS洗2次以消除 蠶蛹粉的顏色干擾，最后用220 μ L的PBS重懸，測0D_值，每組3個重復(fù)； 5) 以接種野生病毒蠶蛹粉和正常蠶蛹粉為陰性對照，處理方法同步驟3)所述，PBS為 空白對照，繪制生長曲線。
[0014] 本發(fā)明還提供上述rhLF蠶蛹粉在用于制備由葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié) 腸炎的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)效果如下： 本發(fā)明構(gòu)建的含有人乳鐵蛋白的重組桿狀病毒，可以利用家蠶蛹作為生物反應(yīng)器高 效表達(dá)重組人乳鐵蛋白，且表達(dá)產(chǎn)物具有很好的生物學(xué)活性，將表達(dá)重組人乳鐵蛋白的蠶 蛹凍干制成蠶蛹粉，可以直接用于潰瘍性結(jié)腸炎的口服治療，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，可降低成 本，提高產(chǎn)量，所生產(chǎn)的rhLF蠶蛹粉應(yīng)用價值大。
[0016] 目前，尚無利用rhLF蠶蛹粉口服治療潰瘍性結(jié)腸炎的應(yīng)用，蠶蛹粉本身含有多種 天然蛋白質(zhì)保護劑和脂類物質(zhì)可以對表達(dá)的重組人乳鐵蛋白起到一定的保護作用，提高其 穩(wěn)定性，具有較好的藥用價值。
【附圖說明】
[0017] 圖1為hLF基因的PCR擴增圖：M. IOkb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；I. PCR產(chǎn)物（箭頭所示 為hLF條帶）； 圖2為重組質(zhì)粒pFastBacl-hLF鑒定圖：M. IOkb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；I. ZAo I /??? I 酶切重組質(zhì)粒；2. PCR產(chǎn)物； 圖3為重組Bacmid-hLF的PCR鑒定圖：M. IOkb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；I. M13 F和hLF R 為上下游引物的PCR結(jié)果；2. hLF F和M13 R為上下游引物的PCR結(jié)果； 圖4為重組桿狀病毒基因組PCR鑒定圖；M. IOkb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；I. M13 F和hLF R 為上下游引物的PCR結(jié)果；2. hLF F和M13 R為上下游引物的PCR結(jié)果；