一種高純度眼鏡蛇神經(jīng)毒素的提取方法及含有該毒素的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明申請(qǐng)鑒于眼鏡蛇蛇毒成分的復(fù)雜性和科博肽為堿性多肽、分子量大約7000道爾頓左右、相對(duì)耐熱耐酸堿等理化性質(zhì)，綜合考慮各種層析柱填料的分離機(jī)理、應(yīng)用特點(diǎn)、長期使用的穩(wěn)定性、成本的可控性以及提取目標(biāo)的達(dá)成，提供一種高純度眼鏡蛇神經(jīng)毒素的提取方法，該方法工藝穩(wěn)定、層析填料易得、綜合成本低、操作條件適應(yīng)性好、神經(jīng)毒素的收率高。本發(fā)明申請(qǐng)進(jìn)一步提供由上述方法制備得到的高純度科博肽，用它制成的注射用科博肽制劑中與治療作用無關(guān)的雜質(zhì)少、治療作用起效快、療效穩(wěn)定。本發(fā)明申請(qǐng)還提供幾種以高純度科博肽為有效成分，配方制成制劑所必要的制劑輔料的藥物組合物及不同的劑型，適合口服、口腔吸收、直腸給藥的科博肽制劑。
【專利說明】一種高純度眼鏡蛇神經(jīng)毒素的提取方法及含有該毒素的藥 物組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明申請(qǐng)涉及一種高純度眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的提取方法及以該毒素為單一有 效成分的藥物組合物，所述藥物組合物適合口服、口腔吸收和直腸給藥，特別涉及一種以高 純度科博肽為主藥的口服、口腔吸收、直腸給藥的制劑，屬于生物和生化制藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)毒素（neurotoxin，NT)是蛇毒中一類重要的活性組分，主要分布在眼鏡蛇科 和海蛇科及蝰科的響尾蛇蛇毒中。純化的微量眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素具有類似嗎啡的中樞鎮(zhèn)痛 作用，用于頑固性疼痛、惡性腫瘤疼痛和關(guān)節(jié)痛的鎮(zhèn)痛治療。NT的鎮(zhèn)痛作用有別于阿片類藥 物，表現(xiàn)為效價(jià)高、持續(xù)時(shí)間長、無耐受性和成癮性，是一種很有潛力的新型鎮(zhèn)痛藥。研究表 明，NT的含量以眼鏡蛇毒中含量較高，從眼鏡蛇毒中分離出的NT具有長短鏈兩種，其中以 短鏈NT鎮(zhèn)痛效果更好。
[0003] 科博肽系從湖南眼鏡蛇（NajaNajaAtra)蛇毒中分離純化的短鏈NT，是由68個(gè) 氨基酸組成的單鏈多肽，四個(gè)二硫鍵維系其空間結(jié)構(gòu)，分子量為7000道爾頓左右，適用于 晚期癌癥疼痛、慢性關(guān)節(jié)痛、坐骨神經(jīng)痛、神經(jīng)性頭痛、三叉神經(jīng)痛、麻風(fēng)反應(yīng)神經(jīng)痛等慢性 疼痛的治療，尤其用于慢性、頑固性、持續(xù)性疼痛的治療，現(xiàn)臨床使用為肌注給藥和口服復(fù) 方制劑（科博肽、曲馬多和布洛芬的組合物）給藥。
[0004] 蛇毒中成分復(fù)雜，其中蛋白質(zhì)占干重的90%，包括5-15種酶、3-12種非酶性蛋白 質(zhì)或多肽，另含5-20%小分子肽、氨基酸、糖類、脂類等等。眼鏡蛇毒中已經(jīng)研究確定的成分 有膜活性多肽、神經(jīng)毒素、神經(jīng)生長因子、溶血素（DLP)、CVA蛋白、眼鏡蛇毒因子等及其他 成分，如堿性磷酸單酯酶、磷酸二酯酶、乙酰膽堿酯酶、L-氨基酸氧化酶、核糖核酸酶、蛋白 水解酶等。目前，眼鏡蛇神經(jīng)毒素和科博肽的提取，主要使用鹽析（硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂 等中性鹽）、陽離子柱層析、親和層析等方法組合提取。其存在的缺陷主要有：鹽析沉淀經(jīng) 過蛋白變性、復(fù)性的過程，雜蛋白共沉淀比較多，活性蛋白損失大，在蛇毒處理過程中，價(jià)格 昂貴的蛇毒資源損失嚴(yán)重；親和層析填料制備困難，使用條件苛刻，大規(guī)模長期使用親和填 料容易被蛇毒雜蛋白質(zhì)毒化、重現(xiàn)性差；陽離子柱層析只對(duì)某些類型的堿性蛋白酶、多肽、 核酸類雜蛋白能夠按目標(biāo)蛋白分子所載電荷實(shí)施有效分離，但是對(duì)于蛇毒中復(fù)雜的其他成 分或電荷相差不大的蛋白酶、多肽的分離提取存在很大的局限性，部分研究得到的神經(jīng)毒 素和科博肽純度只達(dá)到SDS-PAGE電泳純。因此，從眼鏡蛇毒中有效、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的提取 高純度的神經(jīng)毒素和科博肽是一項(xiàng)復(fù)雜困難的工作。
[0005] 現(xiàn)有國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)單組份生物、生化藥品的純度要求通常為：SDS-PAGE 電泳一條帶或HPLC含量大于90 %，如科博肽國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS1-XG-009-2000)、或降纖酶 國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS1-XG-031-2000) ;HPLC含量大于95%或更高的的生物、生化單組份的高 純度的藥物意味著制劑中與治療作用無關(guān)的雜物質(zhì)含量更少，這對(duì)于保證藥品的質(zhì)量、療 效、改善藥物作用的時(shí)效、減少藥物的毒副反應(yīng)都具有重要意義。
[0006] 科博肽國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS1-XG-009-2000)規(guī)定要求：按干燥品計(jì)算，神經(jīng)毒蛋白 含量不得少于35.0% ;HPLC純度檢查主峰相對(duì)百分含量不得少于90.0%。而藥品原料的 含量和純度，在保證藥品質(zhì)量、療效、安全性、用藥劑型等方面具有決定作用?，F(xiàn)有市售科博 肽產(chǎn)品，存在原料批次間含量和純度相對(duì)低、臨床療效不穩(wěn)定、起效時(shí)間慢（陳汝筑，吳秀 榮.眼鏡蛇神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，1988,4(2) :113.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射眼 鏡蛇神經(jīng)毒素后2小時(shí)，大鼠痛閾顯著上升，3小時(shí)后達(dá)到較佳效果，NT鎮(zhèn)痛作用起效慢，但 維持時(shí)間長。陳燕，許云祿.舟山眼鏡蛇神經(jīng)毒素的分離純化及鎮(zhèn)痛作用研究[J].海峽藥 學(xué)，2007,19(12) :27.小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，給藥后2小時(shí)起效，4小時(shí)作用達(dá)峰值。朱天新， 袁彩君，任晚瓊.眼鏡蛇神經(jīng)毒素的規(guī)模化制備及其鎮(zhèn)痛作用的研究[J].華西藥學(xué)雜志， 2007, 22 (3) :247?249.小鼠熱板試驗(yàn)、大鼠電撕叫試驗(yàn)和小鼠扭體試驗(yàn)結(jié)果基本一致， 顯示CNT具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，且具有起效緩慢的特點(diǎn)）、科博肽單方制劑只可肌肉注射給 藥、病人用藥順應(yīng)性差等缺陷。
[0007] 市售口服含科博肽的鎮(zhèn)痛藥只有復(fù)方制劑--克洛曲片，該藥品由科博肽、鹽酸 曲馬多和布洛芬按1 : 150 : 300配比組成，其組分為：每片含科博肽按神經(jīng)毒蛋白計(jì)為 160μg，含鹽酸曲馬多（C16H25NO2 ·Ηα)25π^，含布洛芬（C13H18O2) 50mg;其中科博肽主要通過 抑制乙酰膽堿的釋放而起鎮(zhèn)痛作用；鹽酸曲馬多通過與中樞的阿片受體結(jié)合而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作 用；布洛芬通過抑制環(huán)氧化酶而起鎮(zhèn)痛作用；三者通過不同的作用機(jī)理發(fā)揮鎮(zhèn)痛的協(xié)同作 用；但是由于病人的個(gè)體差異和個(gè)體病人體內(nèi)生理生化指標(biāo)和病灶的復(fù)雜性，復(fù)方制劑中 藥物之間的相互作用也會(huì)引起一些與預(yù)期治療目標(biāo)相悖的副作用，存在一定的用藥風(fēng)險(xiǎn)和 用藥局限性。為了規(guī)避復(fù)方制劑的用藥風(fēng)險(xiǎn)，按照病人的個(gè)體狀況，醫(yī)生處方按照單方制劑 聯(lián)合用藥也是一種醫(yī)療方案的上佳選擇和需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明申請(qǐng)所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一種新的高純度神經(jīng)毒素（包括科 博肽）的提取方法，該方法工藝穩(wěn)定、層析填料易得、綜合成本低、操作條件適應(yīng)性好、神經(jīng) 毒素（包括科博肽）的收率高。
[0009] 本發(fā)明申請(qǐng)進(jìn)一步解決的技術(shù)問題是提供一種由上述方法制備得到的高純度科 博肽，用它制成的注射用科博肽制劑中與治療作用無關(guān)的雜質(zhì)少、治療作用起效快、療效穩(wěn) 定。
[0010] 本發(fā)明申請(qǐng)還進(jìn)一步解決的技術(shù)問題是提供幾種以高純度科博肽為有效成分，配 方制成制劑所必要的制劑輔料的藥物組合物及不同的劑型，適合口服、口腔吸收、直腸給藥 的科博肽制劑。
[0011] 本發(fā)明申請(qǐng)考慮到眼鏡蛇蛇毒成分的復(fù)雜性和科博肽為堿性多肽、分子量大約 7000道爾頓左右、相對(duì)耐熱耐酸堿等理化性質(zhì)，綜合考慮各種層析柱填料的分離機(jī)理、應(yīng)用 特點(diǎn)、長期使用的穩(wěn)定性、成本的可控性以及提取目標(biāo)的達(dá)成，提供一種高純度科博肽的提 取方法，所述提取方法概括如下：
[0012] 1.分離和純化科博肽：根據(jù)各種填料在寬PH范圍內(nèi)的穩(wěn)定性、離子化程度、載樣 量、與目標(biāo)蛋白科博肽的吸附力強(qiáng)弱以及分辨率，使用SP陽離子柱層析高通量捕獲目標(biāo)蛋 白-科博肽，使用CM陽離子柱層析精細(xì)純化科博肽；
[0013] 2.進(jìn)一步使用Sephadex凝膠過濾柱層析按分子量大小精細(xì)純化科博肽，使用 DEAE陰離子交換柱層析去除微量殘留的雜蛋白、酶類（例如酸性蛋白酶類、蛋白水解酶、絲 氨酸蛋白酶類等）得到高純度的科博肽和神經(jīng)毒素；
[0014] 3.按照上述純化方法得到的科博肽神經(jīng)毒蛋白含量達(dá)到50%以上，HPLC純度 達(dá)到96%以上、最高達(dá)到100% ;科博肽總收率達(dá)到3. 7%，而鹽析預(yù)處理方案總收率 2. 5-2. 6% ；
[0015] 4.得到的高純度科博肽經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)口服、注射給藥均具有顯著的鎮(zhèn)痛效果，藥效 起效時(shí)間短，鎮(zhèn)痛作用維持時(shí)間長。
[0016] 具體來說，所述高純度科博肽的提取方法，HPLC純度檢查主峰相對(duì)百分含量大于 96. 0 %，神經(jīng)毒蛋白含量大于50 %，所述方法包括下述步驟：
[0017] 1)取眼鏡蛇粗毒溶解于蒸餾水或含NaCl的緩沖液中，室溫或低溫離心，取上清 液，待上柱層析；
[0018] 2)取上清液，上SPSepharoseFF陽離子柱層析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷 酸鹽緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用磷酸鹽緩沖液或 Tris-HCl緩沖液在低溫透析后待上樣；
[0019] 3)將步驟2)收集的科博肽組分溶液，上樣CM52Cellulose陽離子柱層析，用含 NaCl的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分， 收集液用含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液低溫透析后待上樣；
[0020] 4)將步驟3)收集的科博肽組分溶液，上樣DEAES印haroseFF陰離子柱層析，用 磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集記錄譜圖的最大峰即科博肽組分，收集 液用含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液低溫透析后，把透析液裝入阻斷分子量為5000的 透析袋中，用聚乙二醇8000包埋濃縮待上樣；
[0021] 5)將步驟4)收集的科博肽組分濃縮溶液，上樣S印hadexG-50凝膠過濾柱層析， 用含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液洗脫，收集記錄譜圖最大峰即科博肽組分，收集液用 NaCl溶液低溫透析，所得的科博肽組分溶液過濾除菌，在冷凍干燥機(jī)中抽真空凍干，得到高 純度的科博肽；
[0022] 或
[0023] 所述的高純度科博肽的提取方法，包括下述步驟：
[0024] 1)取眼鏡蛇粗毒溶解于蒸餾水或含NaCl的緩沖液中，離心，取上清液，待上柱層 析；
[0025] 2)取上清液，上SPSepharoseFF陽離子柱層析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷 酸鹽緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用磷酸鹽緩沖液或 Tris-HCl緩沖液在低溫透析后待上樣；
[0026] 3)將步驟2)收集的科博肽組分溶液，上樣CM52Cellulose陽離子柱層析，用含 NaCl的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分， 收集液用含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液在低溫透析、濃縮后待上樣，
[0027] 4)將步驟3)收集的科博肽組分濃縮溶液，上樣S印hadexG-50凝膠過濾柱層析， 用含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液洗脫，收集記錄譜圖最大峰即科博肽組分，收集液用 含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液低溫透析后待上樣；
[0028] 5)將步驟4)收集的科博肽組分溶液，上樣DEAES印haroseFF陰離子柱層析，用 含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集記錄譜圖的最大峰即科博肽 組分，收集液用NaCl溶液低溫透析，所得的科博肽組分溶液過濾除菌，在冷凍干燥機(jī)中抽 真空凍干，得到高純度的科博肽。
[0029] 進(jìn)一步的，所述的高純度科博肽的提取方法，包括以下步驟：
[0030] 1)眼鏡蛇粗毒溶液濃度為0. 05-0. 2g/ml，溶解緩沖液為10-100mm〇l/L PH4. 0-8. 5 含 0· 45% -0· 9% (W/V% )濃度NaCl的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液；
[0031] 2) SP Sepharose FF陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 4. 0-8. 55_50mmol/L的 NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-1. Omol/L NaCl ;透析緩沖液為PH 5. 5-8. 5,濃度0. 0-0. 20mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，透析 參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8小時(shí)；
[0032] 3)CM52 Cellulose陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 5. 5-8. 55-50mmol/L的磷 酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-0. 80mol/L NaCl ;透析緩沖液為PH 5. 0-7. 5,鹽濃度0. 0-0. 15mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析參數(shù) 為4-KTC低溫透析4-8小時(shí)；
[0033] 4)DEAESepharoseFF陰離子柱層析，洗脫緩沖液為PH5. 0-7. 55_50mmol/L的憐 酸鹽或Tris-HCl緩沖液。洗脫鹽梯度為0. 00-0. 80mol/LNaCl，透析緩沖液為PH6. 0-8. 0， 鹽濃度為〇. 〇-〇. 50mol/LNaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析參數(shù)為4-10°C低溫透析 4-8小時(shí)；
[0034] 5) S印hadex G-50凝膠過濾柱層析，洗脫緩沖液為PH 6. 0-8. 0,鹽濃度為 0. 0-0. 50mol/L NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析液為0. 0-0. 25mol/L NaCl溶液，透 析參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8小時(shí)；
[0035]或
[0036] 所述的高純度科博肽的提取方法，包括下述步驟：
[0037] 1)眼鏡蛇粗毒溶液濃度為0. 05-0. 2g/ml，溶解緩沖液為10-100mm〇l/L PH4. 0-8. 5 含 0· 45% -0· 9% (W/V% )濃度NaCl的NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液；
[0038] 2)SPSepharoseFF陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH4. 0-8. 55_50mmol/L的 NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-1. 0m〇l/LNaCl;透析緩沖液為PH 5. 5-8. 5,濃度0. 0-0. 20mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，透析 參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8小時(shí)；
[0039] 3)CM52 Cellulose陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH5. 5-8. 55-50mmol/L的磷 酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-0. 80mol/L NaCl ;透析緩沖液為PH 6. 0-8. 0,鹽濃度為0. 0-0. 50mol/LNaCl的磷酸鹽或Tris-HCl，透析參數(shù)為4-KTC低溫透 析4-8小時(shí)；
[0040] 4)S印hadexG-50凝膠過濾柱層析，洗脫緩沖液為PH6. 0-8. 0,鹽濃度為 0. 0-0. 50mol/LNaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析緩沖液為PH5. 0-7. 5,鹽濃度 0.0-0. 15mol/LNaCl5-50mmol/L的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析參數(shù)為4-10°C低溫透 析4-8小時(shí)；
[0041] 5) DEAESepharose FF陰離子柱層析，洗脫緩沖液為PH5. 0-7. 55_50mmol/L的憐 酸鹽或Tris-HCl緩沖液。洗脫鹽梯度為0·00-0· 80mol/LNaCl，透析液為0·0-0· 25mol/LNaCl溶液，透析參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8小時(shí)。
[0042] 科博肽組分溶液的濃縮可以采用超濾濃縮、高鹽透析濃縮、或吸水材料（聚乙二 醇、聚乙烯吡咯烷酮）包埋濃縮等方法。
[0043] 由于科博肽屬于眼鏡蛇毒中神經(jīng)毒素的一種，眼鏡蛇毒中各種神經(jīng)毒素的理化性 質(zhì)具有一定的同源相似性，因此本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┑母呒兌壬窠?jīng)毒素和科博肽的提取方法， 對(duì)于各種眼鏡蛇神經(jīng)毒素的提取具有一定的通用性。
[0044] 進(jìn)一步的，本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┑母呒兌瓤撇╇牡奶崛》椒ǖ母鞑襟E中，為了減少蛋 白水解酶和絲氨酸蛋白酶類對(duì)蛇毒溶液中科博肽成分的降解作用，DEAE陰離子柱層析作為 蛇毒原液的預(yù)處理和富集目標(biāo)蛋白的層析步驟可以調(diào)整為上述提取步驟的第2)步，層析 參數(shù)保持不變。
[0045] 上述步驟中，選擇的層析填料功能基團(tuán)SP、CM或DEAE和連接功能基團(tuán)的基質(zhì)可以 互換。
[0046] 上述步驟中，所述DEAE陰離子柱層析作為蛇毒原液的預(yù)處理和富集目標(biāo)蛋白的 層析步驟可以調(diào)整為上述提取步驟的第2)步，層析參數(shù)保持不變。
[0047] 本發(fā)明申請(qǐng)還提供所述方法提取得到的高純度的科博肽。
[0048] 本發(fā)明申請(qǐng)還提供含有科博肽的藥物組合物，其特征在于科博肽神經(jīng)毒蛋白含量 大于50 %，HPLC純度大于96 %。
[0049] 進(jìn)一步的，所述科博肽神經(jīng)毒蛋白含量介于70-100 %之間，HPLC純度為 98-100%。
[0050] 本發(fā)明申請(qǐng)還提供所述的藥物組合物的各種劑型。
[0051] 進(jìn)一步的，所述的劑型，包括口服劑、片劑、膠囊、直腸吸收栓劑、口腔吸收劑或腸 溶劑。
[0052] 本發(fā)明申請(qǐng)還提供所述高純度的科博肽的非注射給藥的各種組合物、劑型的控 釋、緩釋、速釋劑型及藥物組合物。
[0053] 具體地，所述適合口服給藥的科博肽片，其中主藥高純度科博肽含量140_560μg/ 片，其余輔料按片重計(jì)算：糊精1-15% ;羥丙基甲基纖維素（HPMC) 1-5% ;低取代羥丙基纖 維素（LHPC) 2-16% ;淀粉20-60% ;糖粉12-36% ;羧甲基淀粉鈉1-10 ;硬脂酸鎂1-5% ;微 粉硅膠0. 5-5%。
[0054] 可選擇的，所述適合口服給藥的科博肽腸溶片，其中主藥高純度科博肽含量 140-560μg/片，其余輔料按片重計(jì)算：糊精1-15 %;羥丙基甲基纖維素（HPMC) 1-5 %;低取 代羥丙基纖維素（LHPC) 2-16 % ;淀粉20-60 %糖粉12-36% ;羧甲基淀粉鈉1-10% ;硬脂酸 鎂1-5%;微粉硅膠0. 5-5%;腸溶包衣粉5-15%。
[0055] 可選擇的，所述適合直腸吸收的科博肽栓劑，其中主藥高純度科博肽含量 70-560μg/栓，其余輔料按栓重計(jì)算：可可豆脂90-99. 9%;聚山梨酯800. 1-10% (V/W)。
[0056] 可選擇的，所述適合口腔吸收的科博肽口腔吸收片，其中主藥高純度科博肽含量 70-560μg/片，其余輔料按片重計(jì)算：十二烷基硫酸鈉0. 1-4%微晶纖維素50-90%;阿斯 帕坦2-8% ;枸櫞酸1-10% ;羧甲基淀粉鈉1-20% ;聚維酮（PVP-K30)0. 1-3% ;微粉硅膠 0. 1-5%;硬脂酸鎂 0. 1-5%。
[0057] 本發(fā)明申請(qǐng)所述的技術(shù)方案具有以下的優(yōu)點(diǎn)：
[0058] 1、本發(fā)明申請(qǐng)所述的高純度科博肽的提取方法，用此方法從眼鏡蛇毒中提取的神 經(jīng)毒素和科博肽純度達(dá)96%以上，常規(guī)可控純度范圍達(dá)98% -100% ;神經(jīng)毒蛋白含量在 50%以上，進(jìn)一步優(yōu)選含量在70%-100%之間；
[0059] 2.用此方法提取的科博肽具有如下特征：SDS-PAGE電泳顯示一條帶，與科博肽 對(duì)照品一致；HP L C純度檢查峰面積積分達(dá)9 6%以上，進(jìn)一步優(yōu)選常規(guī)可控純度范圍達(dá) 98% -100%，保留時(shí)間與科博肽對(duì)照品一致；神經(jīng)毒蛋白含量在50%以上，進(jìn)一步優(yōu)選含 量在70%-100%之間；蛋白質(zhì)多肽質(zhì)譜測(cè)定分子量為6953±35 ;眼鏡蛇毒抗蛇毒血清鑒別 試驗(yàn)顯示沉淀線；
[0060] 3.提取方法中設(shè)計(jì)的適用PH范圍比較寬，工作的適用條件和方法的重現(xiàn)性比較 好；每一分離步驟根據(jù)蛇毒的復(fù)雜成分、科博肽的分子大小、科博肽分子電荷等特異性質(zhì)結(jié) 合柱填料的層析特點(diǎn)進(jìn)行的優(yōu)選設(shè)計(jì)，克服了選擇性差、雜蛋白共沉淀多、蛋白損失大的鹽 析、有機(jī)溶劑沉淀等方法對(duì)蛋白、多肽的變性缺點(diǎn)，最大程度的避免了在提取過程中蛋白、 多肽變性的可能性，在保證產(chǎn)品純度的前提下，提高了神經(jīng)毒蛋白的總收率，節(jié)約了寶貴的 生物資源，降低了生產(chǎn)總成本；
[0061] 4.方法技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)還在于各個(gè)不同機(jī)理層析步驟的有效組合，進(jìn)一步各個(gè)層析 步驟可以根據(jù)工作條件進(jìn)行次序調(diào)整，更進(jìn)一步每個(gè)步驟選擇的層析填料SP、CM、DEAE等 功能基團(tuán)和連接功能基團(tuán)的基質(zhì)（例如Sephadex、Sepharose、Cellulose等）可以互換；
[0062] 5.由此方法提取的高純度科博肽除了滿足注射用科博肽制劑的要求外，作為藥物 活性成分單獨(dú)組方制成口服制劑具有明顯的鎮(zhèn)痛效果。實(shí)現(xiàn)的途徑有：口服、直腸給藥、口 腔含服等，涉及的劑型有：片劑、腸溶片、直腸給藥栓劑、口服含片、口腔吸收膜劑、口腔吸收 速崩片等，以及上述給藥方式的膠囊。進(jìn)一步涉及上述給藥方式的速釋片、緩釋片、控釋片 及膠囊等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0063] 圖1步驟2)中眼鏡蛇毒粗毒SP s印harose FF柱層析圖，其中箭頭標(biāo)注的是緩 沖液鹽梯度達(dá)到〇·7mol/L NaCl的科博肽收集峰，紫外檢測(cè)參數(shù)：0· 2A 280nm;記錄儀參 數(shù)：200mv 2cm/h ;恒流泵流速：85ml/h ;柱洗脫條件：PH 5. 0鹽梯度為0· 0-1. Omol/L NaCl 50mmol/L的NaAC-HAC的緩沖液線性梯度洗脫；
[0064] 圖2步驟5)高純度科博肽的精制Sephadex G-50柱層析圖，其中箭頭標(biāo)注的是 當(dāng)洗脫液洗脫至二分之一柱體積時(shí)的科博肽收集峰，紫外檢測(cè)參數(shù)：〇. 2A 280nm記錄儀參 數(shù)：200mv 2cm/h恒流泵流速：50ml/h ;柱洗脫條件：PH 7. 0鹽濃度為0· 2mol/L NaCl的 lOmmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫；
[0065] 圖3科博膚對(duì)照品的HPLC圖，對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所，保留時(shí)間t =12.385min；
[0066] 圖4高純度科博肽樣品IHPLC圖，保留時(shí)間t = 12. 429min，科博肽峰面積積分 99. 89%；
[0067] 圖5高純度科博肽SDS-PAGE電泳，從左至右電泳條帶依次為：科博肽對(duì)照品、高 純度科博肽樣品1、樣品2、樣品3 ;
[0068]圖6高純度科博肽抗原抗體鑒別實(shí)驗(yàn)，箭頭所指位置可見白色沉淀線依次相連成 六角形白色沉淀圈；
[0069]圖7高純度科博肽分子量質(zhì)譜圖，科博肽分子量為6953,從圖可見科博肽分子量 為6953, 7051位置有一個(gè)小峰，豐度占比不超過2. 0 %，可能是科博肽分子與碎片的耦合 體；
[0070] 圖8市售樣品1:市售注射用科博肽（140yg/支）HPLC圖，保留時(shí)間t= 12. 930min，科博肽峰面積積分91. 90% ;
[0071] 圖9市售樣品2 :市售注射用科博肽（140μg/支）HPLC圖；保留時(shí)間t= 12. 973min，科博肽峰面積積分94. 10%。

【具體實(shí)施方式】
[0072] 以下結(jié)合具體的實(shí)施方案，對(duì)所述技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行非限制性的描述，目的為了公眾 更好理解所述技術(shù)。
[0073] 高純度科博肽的提取
[0074] 實(shí)施例1
[0075] 1)取眼鏡蛇毒粗毒（購自江西余江眼鏡蛇養(yǎng)殖場(chǎng)）8克溶于80毫升PH 5. 050mmol/LNaAC-HAC溶液中。充分溶解后低溫離心（溫度：0°C-10°C、轉(zhuǎn)速：3600轉(zhuǎn)/ 分、時(shí)間：30分鐘），取上清液，待上柱；
[0076] 2)蛇毒上清液上Sp sepharose FF，用PH 5. 050mmol/L NaAC-HAC鹽梯度為 0. 0-1. Omol/L NaCl的緩沖液共計(jì)3000毫升進(jìn)行線性鹽梯度洗脫，待洗脫緩沖液鹽梯度達(dá) 到0. 7mol/L NaCl時(shí)，按記錄譜圖收集科博肽組分，科博肽神經(jīng)毒蛋白峰共320ml，層析結(jié) 果見圖1 ;設(shè)備設(shè)定參數(shù)：紫外檢測(cè)參數(shù)：〇. 2A280nm ;記錄儀參數(shù)：200mv 2cm/h ;恒流泵流 速：85ml/h ;將收集的科博肽液體用PH7. 425mmol/L Tris-HCl緩沖液在4-10°C低溫透析6 小時(shí)，待上樣；
[0077] 3)將步驟2收集處理好的科博肽溶液上CM-52 Cellulose柱層析，用 PH7. 425mmol/L Tris-HCl鹽梯度為0. 0-0. 5mol/L NaCl的緩沖液共計(jì)2000ml進(jìn)行線性鹽 梯度洗脫，待洗脫緩沖液鹽梯度達(dá)到〇.25mol/L NaCl時(shí)，按記錄譜圖收集科博肽組分，收 集科博肽神經(jīng)毒蛋白峰共280ml ;設(shè)備設(shè)定參數(shù)：紫外檢測(cè)參數(shù)：0. 2A 280nm ;記錄儀參數(shù)： 200mv 2cm/h ;恒流泵流速：50ml/h ;收集液用PH 6. 0鹽濃度0. 05mol/L NaCl 10mmol/L的 磷酸鹽緩沖液在4-10°C低溫透析6小時(shí)后待上樣；
[0078] 4)將步驟3)收集的科博肽液體280毫升上樣DEAE S印harose FF陰離子柱層析， 用PH 6. 0 lOmmol/L鹽梯度0. 0-0. 5mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液共計(jì)2000ml進(jìn)行線性鹽 梯度洗脫，待洗脫緩沖液鹽梯度達(dá)到〇.20mol/L NaCl時(shí)收集記錄譜圖的最大峰即科博肽 組分，收集蛋白吸收值最大的峰共計(jì)220毫升；設(shè)備設(shè)定參數(shù)：紫外檢測(cè)參數(shù)：0. 2A 280nm ; 記錄儀參數(shù)：200mv 2cm/h ;恒流泵流速：50ml/h ;收集液用PH7. 0,鹽濃度為0· 2mol/L NaCl 的lOmmol/L磷酸鹽緩沖液在4-10°C低溫透析6小時(shí)后，把透析好的收集液裝入阻斷分子量 為5000的透析袋中，用聚乙二醇8000包埋濃縮至科博肽液體體積至30ml后待上樣； [0079] 5)將步驟4)處理好的科博肽濃縮液上樣S印hadex G-50柱層析，用PH7. OlOmmol/ L含0. 2mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫，當(dāng)洗脫液洗脫至二分之一柱體積時(shí)，收集記錄譜 圖最大峰即科博肽組分，收集主峰可得神經(jīng)毒蛋白溶液180ml，層析結(jié)果見圖2 ;設(shè)備設(shè)定 參數(shù)：紫外檢測(cè)參數(shù)：〇· 2A280nm;記錄儀參數(shù)：200mv2cm/h;恒流泵流速：50ml/h;
[0080] 6)將步驟5)收集的180ml神經(jīng)毒蛋白溶液依次用注射用水、0. 15mol/LNaCl溶液 在4-10°C低溫透析6小時(shí)，透析完成后所得的科博肽組分溶液用0. 22μm的濾膜過濾除菌， 再轉(zhuǎn)移至凍干托盤中，在冷凍干燥機(jī)中在_40°C預(yù)凍3小時(shí)后開始抽真空凍干，凍干24小時(shí) 后當(dāng)制品溫度達(dá)到25°C時(shí)繼續(xù)保溫4小時(shí)后凍干結(jié)束，凍干可得高純度科博肽成品353mg; 性狀：白色粉末，樣品經(jīng)檢測(cè)：福林酚法神經(jīng)毒蛋白含量85. 62% ;SDS-PAGE電泳一條帶，與 科博肽對(duì)照品一致；HPLC純度為99. 89%，色譜峰保留時(shí)間與科博肽對(duì)照品相同；神經(jīng)毒蛋 白總收率3. 78%。
[0081] 實(shí)施例2
[0082] 1)取眼鏡蛇毒粗毒8克溶于80毫升PH7. 4 50mmol/LTris-HCl溶液中。充分溶 解后低溫離心（溫度：0°c-KTC、轉(zhuǎn)速：3600轉(zhuǎn)/分、時(shí)間：30分鐘），取上清液，待上柱；
[0083] 2)蛇毒上清液上SpsepharoseFF，用PH7.450mmol/LTris-HCl鹽梯度為 0. 0-1.Omol/LNaCl的緩沖液共計(jì)3000毫升進(jìn)行線性鹽梯度洗脫，收集科博肽神經(jīng)毒蛋白 峰共305ml;設(shè)備設(shè)定參數(shù)：紫外檢測(cè)參數(shù)：0. 2A280nm;記錄儀參數(shù)：200mv2cm/h;恒流 泵流速：85ml/h;
[0084] 后續(xù)步驟同實(shí)施例1，凍干可得高純度科博肽成品378mg，神經(jīng)毒蛋白含量 78. 20%;SDS-PAGE電泳一條的，與科博肽對(duì)照品一致；HPLC純度為99. 32%，色譜峰保留時(shí) 間與對(duì)照品相冋；神經(jīng)毒蛋白總收率3. 69%。
[0085] 實(shí)施例3
[0086] 1)取眼鏡蛇毒粗毒8克溶于80毫升PH6. 850mmol/LTris-HCl溶液中。充分溶解 后低溫離心（溫度：〇°C-10°C、轉(zhuǎn)速：3600轉(zhuǎn)/分、時(shí)間：30分鐘），取上清液，待上柱；
[0087] 2)蛇毒上清液上SpsepharoseFF，用PH6. 8 50mmol/LTris-HCl鹽梯度為 0. 0-1.Omol/LNaCl的緩沖液共計(jì)3000毫升進(jìn)行線性鹽梯度洗脫，收集科博肽神經(jīng)毒蛋白 峰共337ml;設(shè)備設(shè)定參數(shù)：紫外檢測(cè)參數(shù)：0. 2A280nm;記錄儀參數(shù)：200mv2cm/h;恒流 泵流速：85ml/h;
[0088] 后續(xù)步驟同實(shí)施例1，凍干可得高純度科博肽成品362mg，神經(jīng)毒蛋白含量 80. 35% ;SDS-PAGE電泳一條的，與科博肽對(duì)照品一致；HPLC純度為98. 96%，色譜峰保留時(shí) 間與對(duì)照品相同；神經(jīng)毒蛋白總收率3. 64%。
[0089] 實(shí)施例4
[0090]步驟1)、2)、3)同實(shí)施例1;
[0091] 4)將收集到的科博肽溶液280ml裝入透析袋中用聚乙二醇8000包埋濃縮至 30ml，待上樣；處理好的科博肽濃縮液上樣S印hadexG-50柱層析，用PH7.OlOmmol/L含 0. 2mol/LNaCl磷酸鹽緩沖液洗脫，當(dāng)洗脫液洗脫至二分之一柱體積時(shí)，收集記錄譜圖最大 峰即科博肽組分，可得神經(jīng)毒蛋白溶液230ml;設(shè)備設(shè)定參數(shù)：紫外檢測(cè)參數(shù)：0. 2A280nm; 記錄儀參數(shù)：200mv2cm/h;恒流泵流速：50ml/h;收集液用PH6. 0鹽濃度0· 05mol/LNaCl lOmmol/L的磷酸鹽緩沖液在4-10°C低溫透析6小時(shí)后待上樣；
[0092] 5)將步驟4)收集的科博肽液體230毫升上樣DEAES印haroseFF陰離子柱層析， 用PH6. 0 10mmol/L/L含0. 0-0. 5mol/LNaCl的磷酸鹽緩沖液共計(jì)2000ml進(jìn)行線性鹽梯 度洗脫，待洗脫緩沖液鹽梯度達(dá)到〇.20mol/LNaCl時(shí)收集記錄譜圖的最大峰即科博肽組 分，收集蛋白吸收值最大的峰共計(jì)190毫升；設(shè)備設(shè)定參數(shù)：紫外檢測(cè)參數(shù)：0. 2A280nm; 記錄儀參數(shù)：200mv2cm/h;恒流泵流速：50ml/h;收集的190ml神經(jīng)毒蛋白溶液依次用注 射用水、0. 15mol/LNaCl溶液在4-KTC低溫透析6小時(shí)，透析完成后所得的科博肽組分溶 液用0. 22μm的濾膜過濾除菌，再轉(zhuǎn)移至凍干托盤中，在冷凍干燥機(jī)中在-40°C預(yù)凍3小時(shí) 后開始抽真空凍干，凍干24小時(shí)后當(dāng)制品溫度達(dá)到25°C時(shí)繼續(xù)保溫4小時(shí)后凍干結(jié)束，凍 干可得高純度科博肽成品356mg，神經(jīng)毒蛋白含量83.92% ;SDS-PAGE電泳一條帶，與科博 肽對(duì)照品一致；HPLC純度為99. 56%，色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品相同；神經(jīng)毒蛋白總收率 3. 73%。
[0093] 以科博肽為主要成分的不同劑型的藥物組合物
[0094] 實(shí)施例5
[0095]科博肽注射液（規(guī)格2ml:70μg/支）
[0096] 科博肽 140mg 藥用氯化鈉（0.9%) 36g Na2HPO4 · 12H20 8.32g NaH2PO4 · 2H20 5.54g 藥用活性炭（0.3%) 12g 加注射用水至 4000ml
[0097] 取處方量的磷酸鹽各加注射用水至500ml攪拌溶解后，兩種磷酸鹽溶液混合備 用；取處方量的藥用氯化鈉加適量注射用水溶解，加入上述備用的磷酸鹽混勻，加注射用水 至4000ml，加入處方量的藥用活性炭，攪拌吸附30分鐘，用0. 22μm濾膜過濾，將此溶液分 裝于磨口瓶封口，進(jìn)行IKTC滅菌30分鐘，取出后降溫至室溫加入處方量的科博肽，充分溶 解后定容至4000ml，藥液進(jìn)行除菌過濾，取樣送檢含量，合格后按2ml/支灌裝到2R西林瓶 中，壓塞、乳蓋、貼簽備用。
[0098] 實(shí)施例6
[0099] 科博肽片（規(guī)格280μg/0. 25g片）
[0100] 科博肽 0.28g 0.112% 糊精 27.5g 11% 羥丙基曱基纖維素（HPMC) 5g 2%
[0101] 低取代羥丙基纖維素（LHPC) 20g 8% 淀粉 117.5g 47% 糖粉 60g 24% 羧甲基淀粉納 IOg 4% 酸鎂 5g 2% 微粉珪膠 4.72g 1.9% 制成1000片
[0102] 所有輔料均過80目篩，把糊精、糖粉、淀粉、LHPC等充分混勻待用；將羥丙基甲基 纖維素（HPMC)制成4% (W/V)溶液125毫升，把科博肽溶于HPMC液中，以這個(gè)溶液為粘合 劑和預(yù)混的輔料混合作軟材，制濕顆粒，45°C干燥整粒后過16目篩，加入處方量的硬脂酸 鎂、微粉硅膠及羧甲基淀粉鈉進(jìn)行壓片。
[0103] 實(shí)施例7
[0104] 科博肽腸溶片（規(guī)格280μg/0. 25g/素片）
[0105] 科博肽 0.28g 0.112% 糊精 27.5g 11% 羥丙基曱基纖維素（HPMC) 5g 2% 低取代羥丙基纖維素（LHPC) 20g 8% 淀粉 117.5g 47% 糖粉 60g 24%
[0106] 羧曱基淀粉鈉 IOg 4% 酸鎂 5g 2% 微粉娃肢 4.72g 1.9% 制成1000片
[0107] 所有輔料均過80目篩，把糊精、糖粉、淀粉、LHPC等充分混勻待用；將羥丙基甲基 纖維素（HPMC)制成4% (W/V)溶液125毫升，把科博肽溶于HPMC液中，以這個(gè)溶液為粘合 劑和預(yù)混的輔料混合作軟材，制濕顆粒，45°C干燥后整粒過16目篩，加入處方量的硬脂酸 鎂、微粉硅膠及羧甲基淀粉鈉進(jìn)行壓片。
[0108]包衣：
[0109] 腸溶包衣粉20克增重8%溶劑80%乙醇固物含量10%(W/V)
[0110] 壓片后素片用有孔包衣機(jī)，使用20克腸溶包衣粉包薄膜衣，片增重8%，溶劑用 80%乙醇，包衣液200毫升固物含量10% (W/V)。
[0111] 實(shí)施例8
[0112] 科博肽直腸吸收栓劑（規(guī)格140μg/2g栓）
[0113] 科博肽 0.07g 0.0007% 可可豆脂 980g 98% 聚山梨酯 80 20ml2%(V/W) 制成500個(gè)栓（魚雷形）
[0114] 取配方量的可可豆脂在45°C水浴上熔化，把配方量的科博肽溶于20ml注射用水 中與聚山梨酯80混合均勻，加入上述熔化的可可豆脂基質(zhì)中，保溫緩慢攪拌均勻后，保溫 灌模，冷凝后取出即得。
[0115] 注：由于科博肽含量很小，科博肽的置換價(jià)f=1
[0116] f=ff/[G-(M-W)]
[0117] G-空白純基質(zhì)栓平均重量
[0118]M-含藥栓的平均栓重
[0119]W-含藥栓的平均含藥量
[0120] 需要的基質(zhì)量X= (G_W/f)nη-栓劑枚數(shù)
[0121] 為促進(jìn)科博肽的釋放和吸收，根據(jù)科博肽的水溶性性質(zhì)，選擇油脂性基質(zhì)可可豆 脂；選擇表面活性劑聚山梨酯80。
[0122] 實(shí)施例9
[0123] 科博肽口腔吸收片劑（規(guī)格140μg/0.Ig/片）
[0124] 科博肽 0.14g 0.14% 十二烷基硫酸鈉 2.0g 2% 微晶纖維素 71.86g 71.86% 阿斯帕坦 4.5g 4.5% 枸櫞酸 5g 5% 羧曱基淀粉鈉 14.0g 14% 聚維酮（PVP-K30) 1.5g 1.5% 微粉硅膠 0.5g 0.5% 賴酸鎂 0.5g 0.5% 制成1000片
[0125]所有輔料均過80目篩，把十二烷基硫酸鈉、微晶纖維素、阿斯帕坦、枸櫞酸及50% 配方量的羧甲基淀粉鈉充分混勻待用；將PVP制成6 % (W/V)溶液25毫升，把科博肽溶于 PVP液中，以這個(gè)溶液為粘合劑和預(yù)混的輔料混合作軟材，制濕顆粒，45°C干燥后整粒過24 目篩，加入處方量的硬脂酸鎂、微粉硅膠及剩余50%羧甲基淀粉鈉進(jìn)行壓片。
[0126] 實(shí)驗(yàn)例
[0127]本發(fā)明申請(qǐng)所述方法得到的高純度科博肽神經(jīng)毒蛋白含量和純度，如下方法測(cè) 定：
[0128] 一、神經(jīng)毒蛋白含量測(cè)定：
[0129] 按科博肽國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS1-XG-009-2000)規(guī)定的方法，取科博肽適量，加水制 成每Iml中含約0. 6mg蛋白的溶液，精密量取I. 0ml，照藥典附件"福林酚測(cè)定法"測(cè)定，從 回歸曲線中求得供試品中的蛋白含量，結(jié)果見表一。
[0130]表一科博肽神經(jīng)毒蛋白含量和純度
[0131]

【權(quán)利要求】
1. 一種高純度科博肽的提取方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟： 1) 取眼鏡蛇粗毒溶解于蒸餾水或含NaCl的緩沖液中，。室溫或低溫離心，取上清液，待 上柱層析； 2) 取上清液，上SP S印harose FF陽離子柱層析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖 液進(jìn)行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩 沖液在低溫透析后待上樣； 3) 將步驟2)收集的科博肽組分溶液，上樣CM52Cellul〇Se陽離子柱層析，用含NaCl的 磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液 用含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液低溫透析后待上樣； 4) 將步驟3)收集的科博肽組分溶液，上樣DEAE S印harose FF陰離子柱層析，用磷酸 鹽或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集記錄譜圖的最大峰即科博肽組分，收集液用 含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液低溫透析后，把透析液裝入阻斷分子量為5000的透析 袋中，用聚乙二醇8000包埋濃縮待上樣； 5) 將步驟4)收集的科博肽組分濃縮溶液，上樣S印hadex G-50凝膠過濾柱層析，用含 NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液洗脫，收集記錄譜圖最大峰即科博肽組分，收集液用NaCl 溶液低溫透析，所得的科博肽組分溶液過濾除菌，在冷凍干燥機(jī)中抽真空凍干，得到高純度 的科博肽； 或 所述的高純度科博肽的提取方法，包括下述步驟： 1) 取眼鏡蛇粗毒溶解于蒸餾水或含NaCl的緩沖液中，離心，取上清液，待上柱層析； 2) 取上清液，上SP S印harose FF陽離子柱層析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖 液進(jìn)行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩 沖液在低溫透析后待上樣； 3) 將步驟2)收集的科博肽組分溶液，上樣CM52Cellul〇Se陽離子柱層析，用含NaCl的 磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液 用含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液在低溫透析、濃縮后待上樣， 4) 將步驟3)收集的科博肽組分濃縮溶液，上樣S印hadex G-50凝膠過濾柱層析，用含 NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液洗脫，收集記錄譜圖最大峰即科博肽組分，收集液用含 NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液低溫透析后待上樣； 5) 將步驟4)收集的科博肽組分溶液，上樣DEAE S印harose FF陰離子柱層析，用含 NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集記錄譜圖的最大峰即科博肽組 分，收集液用NaCl溶液低溫透析，所得的科博肽組分溶液過濾除菌，在冷凍干燥機(jī)中抽真 空凍干，得到高純度的科博肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度科博肽的提取方法，其進(jìn)一步特征在于： 1) 眼鏡蛇粗毒溶液濃度為0. 05-0. 2g/ml，溶解緩沖液為10-100mm〇l/L PH 4. 0-8. 5含 0? 45% -0? 9% (W/V% )濃度 NaCl 的 NaAC-HAC、Tris-HCl 或磷酸鹽緩沖液； 2. SP Sepharose FF陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 4. 0-8. 55_50mmol/L的 NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-1. 0m〇l/L NaCl ;透析緩沖液為PH 5. 5-8. 5,濃度0. 0-0. 20mol/L NaC15-50mmol/L的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，透析 參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8小時(shí)； 3. CM52Cellul〇Se陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 5. 5-8. 55-50mmol/L的磷酸鹽緩沖 液或Tris-HCl緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-0. 80mol/L NaCl ;透析緩沖液為PH 5. 0-7. 5,鹽 濃度0. 0-0. 15mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析參數(shù)為4-10°C低 溫透析4-8小時(shí)； 4. DEAE S印harose FF陰離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 5. 0-7. 55-50mmol/L的磷酸鹽 或Tris-HCl緩沖液。洗脫鹽梯度為0. 00-0. 80mol/L NaCl，透析緩沖液為PH 6. 0-8. 0,鹽濃 度為0. 0-0. 50mol/L NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8 小時(shí)； 5. S印hadex G-50凝膠過濾柱層析，洗脫緩沖液為PH 6. 0-8. 0,鹽濃度為 0. 0-0. 50mol/L NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析液為0. 0-0. 25mol/L NaCl溶液，透 析參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8小時(shí)； 或 所述的高純度科博肽的提取方法，包括下述步驟： 1) 眼鏡蛇粗毒溶液濃度為0. 05-0. 2g/ml，溶解緩沖液為10-100mm〇l/L PH 4. 0-8. 5含 0? 45% -0? 9% (W/V% )濃度 NaCl 的 NaAC-HAC、Tris-HCl 或磷酸鹽緩沖液； 2. SP Sepharose FF陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 4. 0-8. 55_50mmol/L的 NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-1. 0m〇l/L NaCl ;透析緩沖液為PH 5. 5-8. 5,濃度0. 0-0. 20mol/L NaC15-50mmol/L的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，透析 參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8小時(shí)； 3. CM52Cellul〇Se陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 5. 5-8. 55-50mmol/L的磷酸鹽緩沖 液或Tris-HCl緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-0. 80mol/L NaCl ;透析緩沖液為PH 6. 0-8. 0,鹽 濃度為〇. 〇_〇. 50mol/LNaCl的磷酸鹽或Tris-HCl，透析參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8小時(shí)； 4. S印hadex G-50凝膠過濾柱層析，洗脫緩沖液為PH 6. 0-8. 0,鹽濃度為 0. 0-0. 50mol/L NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液；透析緩沖液為PH 5. 0-7. 5,鹽濃度 0.0-0. 15mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析參數(shù)為4-10°C低溫透 析4-8小時(shí)； 5. DEAE S印harose FF陰離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 5. 0-7. 55-50mmol/L的磷酸鹽 或 Tris-HCl 緩沖液，洗脫鹽梯度為 0. 00-0. 80mol/L NaCl ;透析液為 0. 0-0. 25mol/L NaCl 溶液，透析參數(shù)為4-10°C低溫透析4-8小時(shí)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高純度科博肽的提取方法，其特征在于：上述步驟中，選 擇的層析填料功能基團(tuán)SP、CM或DEAE和連接功能基團(tuán)的基質(zhì)可以互換。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高純度科博肽的提取方法，其特征在于：所述DEAE陰離 子柱層析作為蛇毒原液的預(yù)處理和富集目標(biāo)蛋白的層析步驟可以調(diào)整為上述提取步驟的 第2)步，層析參數(shù)保持不變。
5. 由權(quán)利要求1-4所述的方法提取得到的高純度的科博肽。
6. -種含有科博肽的藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求5所述的高純度的科博 肽。
7. -種含有科博肽的藥物組合物，其特征在于科博肽神經(jīng)毒蛋白含量大于50%，HPLC 純度大于96%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于科博肽神經(jīng)毒蛋白含量介于 70-100%之間，純度為 98-100%。
9. 含有如權(quán)利要求6-8所述的藥物組合物的各種劑型。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的劑型，其特征在于：包括片劑、膠囊、直腸吸收栓劑、口腔吸 收劑或腸溶劑。
11. 含有權(quán)利要求5所述高純度的科博肽的以非注射形式給藥的藥物組合物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的劑型，其特征在于：所述適合口服吸收的片劑，其中主藥高 純度科博肽含量140-5601! g/片，其余輔料按片重計(jì)算：糊精1-15% ;羥丙基甲基纖維素 (HPMC) 1-5% ;低取代羥丙基纖維素（LHPC) 2-16% ;淀粉20-60% ;糖粉12-36% ;羧甲基淀 粉鈉1-10 ;硬脂酸鎂1-5% ;微粉硅膠0. 5-5%。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的劑型，其特征在于：所述適合腸溶吸收的片劑，其中主藥高 純度科博肽含量140-5601! g/片，其余輔料按片重計(jì)算：糊精1-15% ;羥丙基甲基纖維素 (HPMC) 1-5% ;低取代羥丙基纖維素（LHPC) 2-16% ;淀粉20-60 %糖粉12-36% ;羧甲基淀粉 鈉1-10% ;硬脂酸鎂1-5% ;微粉硅膠0. 5-5% ;腸溶包衣粉5-15%。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的劑型，其特征在于：所述適合直腸吸收的科博肽栓劑，其中 主藥高純度科博肽含量70-560 y g/栓，其余輔料按栓重計(jì)算：可可豆脂90-99. 9%;聚山梨 酯 800. 1-10% (V/W)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的劑型，其特征在于：所述口腔吸收劑為片劑，其中主藥高純 度科博肽含量70-5601! g/片，其余輔料按片重計(jì)算：十二烷基硫酸鈉0. 1-4%微晶纖維素 50-90%;阿斯帕坦2-8%;枸櫞酸1-10%;羧甲基淀粉鈉1-20%;聚維酮（PVP-K30)0. 1-3%; 微粉硅膠0. 1-5% ;硬脂酸鎂0. 1-5%。
【文檔編號(hào)】A61P25/04GK104327176SQ201410572487
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】張慶宇 申請(qǐng)人:張慶宇