專利名稱：新的檢測(cè)探針的制作方法
新的檢測(cè)探針本發(fā)明涉及通過(guò)新的核苷酸探針檢測(cè)核酸。本發(fā)明用于診斷領(lǐng)域中。目前，發(fā)現(xiàn)靶核苷酸序列是許多實(shí)驗(yàn)室的主要目標(biāo)，特別是在醫(yī)藥和食品加工領(lǐng) 域。在這些領(lǐng)域中，發(fā)現(xiàn)靶序列有助于例如檢測(cè)病原生物、發(fā)現(xiàn)在食品加工鏈中的污染細(xì)菌 或者診斷與遺傳性疾病或者癌癥相關(guān)的突變。這些方法中的主要難題涉及使用的檢驗(yàn)方法 的特異性、靈敏性、速度以及結(jié)果再現(xiàn)性。這對(duì)于提供精確結(jié)果、特別是在診斷領(lǐng)域是絕對(duì) 必要的。在文獻(xiàn)中描述了不同類型的方法。這些方法通常基于核酸核酸互補(bǔ)鏈的配對(duì)性 質(zhì)，通常稱作“核酸的雜交”，或者簡(jiǎn)單稱作“雜交”。通常地，在確定必須分析的生物體或者疾病的特定序列之后，需要從樣品中提取 核酸，并任選擴(kuò)增和檢測(cè)感興趣的序列。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多擴(kuò)增方法，如PCR、LCR、NASBA、TMA、 SDA。也有許多檢測(cè)技術(shù)。由 Tyagi 和 Kramer (Nature Biotech, 1996，14 :303-308)描述 的這些技術(shù)之一使用特殊探針，通常稱作“分子信標(biāo)”。這些探針具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，包含單鏈 的“環(huán)”部分和雙鏈的“莖”部分。所述“環(huán)”部分含有靶核酸序列的互補(bǔ)序列，“莖”部分由 彼此互補(bǔ)的兩個(gè)序列形成?！扒o”部分的互補(bǔ)序列之一的游離末端用熒光團(tuán)標(biāo)記，而“莖”部 分的另一鏈的另一游離末端與熒光猝滅劑結(jié)合。在不存在互補(bǔ)靶序列的條件下，檢測(cè)探針 是發(fā)夾形狀，且所述探針不產(chǎn)生熒光，熒光團(tuán)的能量被直接轉(zhuǎn)移至熒光猝滅劑。當(dāng)這個(gè)探針 與靶序列雜交時(shí)，其喪失其構(gòu)型，5'和3'末端遠(yuǎn)離，熒光猝滅劑與熒光團(tuán)互相分離。發(fā)射 的熒光反映出探針與靶的雜交，這在擴(kuò)增期間被檢測(cè)并任選量化。這被稱作實(shí)時(shí)同相檢測(cè)。 然而，這些分子信標(biāo)探針可展示出在存在某些污染物的條件下“莖”部分的不希望地提前打 開(kāi)。事實(shí)上已經(jīng)觀測(cè)到分子信標(biāo)探針通過(guò)未知機(jī)制與反應(yīng)混合物中存在的酶相互作用，如 NASBA擴(kuò)增中使用的酶。這些相互作用即使在不存在任何生物靶的條件下也發(fā)生，且使得非 特異性熒光信號(hào)增加。分子信標(biāo)探針的合成受到很大的制約，必需針對(duì)莖序列非常特別地設(shè)計(jì)。事實(shí)上， 它們可以非特異性雜交待檢測(cè)的靶，當(dāng)所述靶含有豐富的GC堿基時(shí)特別明顯，誘導(dǎo)假陽(yáng)性 或者相當(dāng)多的背景噪音，影響檢測(cè)的靈敏性。此外，需要導(dǎo)入兩個(gè)互補(bǔ)序列以形成莖；所 述發(fā)夾探針的完整序列包含至少30個(gè)核苷酸，而僅20個(gè)核苷酸通常為分子識(shí)別所需。因 此，這些發(fā)夾探針的合成產(chǎn)量特別受限。這些探針的另一缺點(diǎn)是難以設(shè)計(jì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因?yàn)?“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)促進(jìn)所述環(huán)自身折疊以及內(nèi)部的“環(huán)-環(huán)”相互作用。因此，在發(fā)現(xiàn)具有所需 熱動(dòng)力學(xué)特性的序列之前通常需要一些設(shè)計(jì)和合成。已經(jīng)提出許多解決方案嘗試克服莖的非特異性雜交的問(wèn)題。因此， Crey-Desbiolles 等(Nucleic Acids Res.，May 2005 ；33 :e77)提出用修飾的核苷酸置換 所述莖的天然核苷酸，所述修飾的核苷酸互相雜交形成所述莖，但是不能與靶的天然核苷 酸雜交。這種方法的主要缺點(diǎn)是需要在識(shí)別序列的每個(gè)末端導(dǎo)入至少四個(gè)或者五個(gè)單位的 這種修飾的核苷酸，但是其不可商購(gòu)，使得發(fā)夾探針的合成更為復(fù)雜。此外，這種方法未解 決完整序列的大量核苷酸或者設(shè)計(jì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的難度的問(wèn)題。由 Browne (J. Am. Chem. Soc.，2005，127，1989-1994)提出的另一解決方案包括在莖的兩個(gè)序列中插入反向核苷酸。在這個(gè)實(shí)施方案中，莖的序列不能直接同與雜交于環(huán)的 序列相毗鄰的靶序列雜交，因?yàn)槠浞较蚺c靶是平行的。這種技術(shù)的缺點(diǎn)是莖的序列可以與 靶的其它更遠(yuǎn)距離的序列相互作用，所述序列可以折疊且變得易受這種相互作用的影響。 此外，通過(guò)這種方法未解決完整序列的大量核苷酸數(shù)目以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的問(wèn)題。由 Tsourkas 等(Nucleic Acids Res.，Oct 2002 ；30 :4208-4215)提出的另一解 決方案包括設(shè)計(jì)發(fā)夾探針，由此形成莖的序列之一也形成識(shí)別序列的一部分。這個(gè)解決方 案使得可以縮短探針的完整序列。然而，已經(jīng)觀測(cè)到與這種設(shè)計(jì)相關(guān)的特異性喪失。此外， 對(duì)于一些相同的識(shí)別序列，這種類型的設(shè)計(jì)具有較短的環(huán)，這限制其靈活性及增強(qiáng)環(huán)-環(huán) 相互作用，使得探針的熱動(dòng)力學(xué)特性不太可測(cè)。因此需要新的探針形式，使得可以克服現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中的缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明涉及檢測(cè)靶核酸的新的探針，其由包含三個(gè)片段的標(biāo)記的核苷酸鏈 組成-具有第一閉合序列的第一片段，-第二片段，其全部或者一部分具有用于對(duì)靶核酸進(jìn)行分子識(shí)別的識(shí)別序列，-具有第二閉合序列的第三片段，以及-至少兩個(gè)標(biāo)記，所述檢測(cè)探針的鏈的末端之一無(wú)任何標(biāo)記，其中，當(dāng)兩個(gè)閉合序列雜交在一起時(shí)，檢測(cè)探針具有完整的環(huán)狀形狀，所述閉合序 列因此將所述探針保持于在不存在所述靶核酸的條件下不能被檢測(cè)的構(gòu)象。“完整環(huán)狀”是 指所述探針的構(gòu)象，其中兩個(gè)閉合序列互相雜交形成雙鏈體，所述閉合序列之一的末端之 一與另一閉合序列的相對(duì)末端通過(guò)識(shí)別序列連接，一起形成如

圖1和2所示的圓。與發(fā)夾 結(jié)構(gòu)相反，這種構(gòu)象使得可以保持環(huán)序列線性排列，在所述莖的兩端之間拉伸，這樣防止環(huán) 序列中的內(nèi)部相互作用，也能夠促進(jìn)互補(bǔ)的靶與其接近。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)探針特征在于第一標(biāo)記由第一片段的一核 苷酸攜帶，第二標(biāo)記由第二片段或者第三片段的一核苷酸攜帶，當(dāng)這兩個(gè)閉合序列雜交時(shí) 所述兩個(gè)核苷酸相鄰。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述檢測(cè)探針特征在于兩個(gè)閉合序列的全部或 者一部分平行雜交。有利地，所述閉合序列之一是由α-異頭核苷酸組成的序列。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，所述檢測(cè)探針特征在于兩個(gè)閉合序列的全部 或者一部分反平行雜交。有利地，兩個(gè)閉合序列之一通過(guò)5' -5'或者3' -3'反向鍵 (inverted bond)結(jié)合于所述識(shí)別序列。有利地，至少一個(gè)標(biāo)記是熒光團(tuán)，至少另一標(biāo)記是熒光猝滅劑。因此，當(dāng)兩個(gè)閉合 序列雜交在一起時(shí)，攜帶標(biāo)記的核苷酸相鄰，由此發(fā)射后的熒光團(tuán)的能量的全部或者大部 分被轉(zhuǎn)移至熒光猝滅劑。優(yōu)選地，兩個(gè)標(biāo)記由彼此位置相對(duì)的核苷酸攜帶，這兩個(gè)核苷酸通 過(guò)氫鍵結(jié)合在一起，形成堿基對(duì)，或者間隔1-5個(gè)核苷酸。有利地，第一或者第二閉合序列的全部或者一部分可以與靶序列雜交。這種構(gòu)象 有助于更好地控制熒光團(tuán)與熒光猝滅劑之間的缺口 ；因?yàn)樗鲩]合序列之一固定在靶上， 如果這兩個(gè)閉合序列均是柔性單鏈構(gòu)象則不能彼此接近。這種構(gòu)象也具有減少可以非特異 性反應(yīng)的游離核苷酸數(shù)目以及減少完整序列的核苷酸數(shù)目的優(yōu)勢(shì)。有利地，所述探針的長(zhǎng) 度在25-40個(gè)核苷酸之間。
根據(jù)先前的實(shí)施方案，一旦與靶序列雜交，探針具有參與雜交的閉合序列，而另一 閉合序列由于其相反方向或者存在α核苷酸而不能雜交。這種構(gòu)象使得可以限制非特異 性雜交。此外，在探針的設(shè)計(jì)期間，給探針添加修飾的(α或者反向的)閉合序列不影響識(shí) 別序列的設(shè)計(jì)。因此，設(shè)計(jì)限于確定與檢測(cè)條件相關(guān)的靶序列的合適互補(bǔ)序列，以及隨后在 其末端之一加入與能與靶序列雜交的另一閉合序列互補(bǔ)的修飾的(α或者反向)閉合序 列，不需要證實(shí)與靶的可能的相互作用或者像發(fā)夾探針情況中那樣在每個(gè)末端加入序列。 這樣因此便于探針的設(shè)計(jì)。也有利的是所述閉合序列的長(zhǎng)度在6-30個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選6-15個(gè)核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，一核苷酸序列附著于所述檢測(cè)探針。優(yōu)選地，其附著 于天然閉合序列的末端，所述天然閉合序列是既非反向也非由α核苷酸組成的序列。因 此，本發(fā)明的檢測(cè)探針可以適合于專利申請(qǐng)W0-A-07/114986所謂的“觸手探針(tentacle probe) ”的探針設(shè)計(jì)。本發(fā)明的檢測(cè)探針可以用于其中核苷酸探針用于檢測(cè)靶核酸的任何檢測(cè)中。因 此，本發(fā)明的另一目的涉及檢測(cè)樣品中可能存在的靶序列的方法，所述方法包括如下步 驟-將樣品與本發(fā)明的檢測(cè)探針接觸，-檢測(cè)所述檢測(cè)探針與靶序列之間雜交體的形成，雜交體的形成表示所述樣品中 存在所述靶序列。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測(cè)是與靶序列的擴(kuò)增反應(yīng)一起進(jìn)行的；即所謂的 實(shí)時(shí)檢測(cè)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在靶序列的擴(kuò)增反應(yīng)之后進(jìn)行檢測(cè)；即所謂的“終點(diǎn)” 檢測(cè)。所述擴(kuò)增反應(yīng)可基于任何擴(kuò)增方法，線性或者指數(shù)擴(kuò)增，如PCR、LCR、NASBA、TMA、SDA、 RCA。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增方法是產(chǎn)生單鏈DNA或者RNA核酸的擴(kuò)增方法，如NASBA、TMA或者 不對(duì)稱PCR。本發(fā)明另一目的涉及檢測(cè)靶序列的包含本發(fā)明至少一種檢測(cè)探針的試劑盒。所述 試劑盒任選含有進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)必需的試劑和弓I物序列。例如，適于NASBA擴(kuò)增的本發(fā)明的 試劑盒可含有核苷酸和擴(kuò)增酶，如逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶。提供如下定義以更好地理解本發(fā)明。術(shù)語(yǔ)“核酸”或者“核苷酸序列”是指至少兩個(gè)脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸 的鏈，任選包含至少一個(gè)修飾的核苷酸，例如具有修飾的核酸堿基的至少一個(gè)核苷酸，如肌 苷、甲基-5-脫氧胞苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷、脫氧尿苷、二氨基_2，6-嘌呤、溴-5-脫 氧尿苷或者允許雜交的任何其它修飾的堿基。這個(gè)多核苷酸也可以在核苷酸間鍵水平修 飾，例如硫代磷酸酯、H-磷酸酯、烷基磷酸酯；在主鏈水平修飾，如α-寡核苷酸(FR 2 607 507)或者 PNA (M.Egholm et al.，J. Am. Chem. Soc.，114，1895-1897，1992)或者 2' -0-烷 基核糖以及 LNA (BW，Sun et al.，Biochemistry，4160-4169，43，2004)。所述核酸可以是天 然或者合成的寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖體1 ^、信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA、通過(guò)酶擴(kuò)增 技術(shù)獲得的核酸，所述擴(kuò)增技術(shù)如.PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，在專利 US-A-4，683，195、US-A-4，683，202 和 US-A-4, 800, 159中描述，及其衍生的RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄PCR)，顯然是單一步驟 (single-stage)形式，如在專利 EP—B—O，569，272 中描述；
· LCR(連接酶鏈反應(yīng))，在專利申請(qǐng)ΕΡ-Α-0，201，184中揭示；· RCR (修復(fù)鏈反應(yīng))，在專利申請(qǐng)W0-A-90/01069中描述；· 3SR (自主序列復(fù)制)，見(jiàn)專利申請(qǐng)W0-A-90/06995所述；· NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增)，見(jiàn)專利申請(qǐng)W0-A-91/02818所述；· TMA (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)，見(jiàn)專利US-A-5，399，491所述；以及· RCA (滾環(huán)擴(kuò)增)，見(jiàn)專利US-6，576，448所述。在本發(fā)明中，“靶”或者“靶核酸”是指這樣的核苷酸序列，其中至少一部分核苷酸 單位鏈?zhǔn)翘禺愑谇一パa(bǔ)于所用檢測(cè)探針的核苷酸序列。所述靶可以是天然的，或者得自體 外酶擴(kuò)增反應(yīng)，如NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增)、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))或者本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的任何其它技術(shù)。當(dāng)靶序列得自體外擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，通過(guò)這種擴(kuò)增產(chǎn)生的序列被稱作 “擴(kuò)增子”?！皺z測(cè)探針”是指10-100個(gè)核苷酸單位的核酸序列，特別是10-50個(gè)核苷酸單位， 優(yōu)選25-40個(gè)核苷酸。這種探針包含稱作第二片段的核苷酸片段，至少一部分核苷酸單位 鏈特異于且互補(bǔ)于靶核苷酸序列。這種探針還包含稱作第一個(gè)和第三片段的兩個(gè)其它片 段，每個(gè)片段均具有其長(zhǎng)度在6-30個(gè)核苷酸之間的閉合序列，優(yōu)選在6-15個(gè)核苷酸之間?！暗谝黄巍笔侵高@樣的核苷酸序列，當(dāng)存在第三片段時(shí)，其可以與第三片段互補(bǔ) 以及極性適于所述第三片段?！暗诙巍笔侵笜O性適于靶序列的互補(bǔ)核苷酸序列?！暗谌巍笔侵笜O性適于第一片段的互補(bǔ)核苷酸序列?！皹?biāo)記”是指由核苷酸攜帶的分子。所述標(biāo)記與核苷酸之間的鍵合可以由本領(lǐng)域技 術(shù)人員通過(guò)各種方式實(shí)現(xiàn)。人工結(jié)合是通過(guò)使用攜帶活性基團(tuán)的標(biāo)記進(jìn)行，典型為羧基或 者巰基(thiol)基團(tuán)，其與攜帶相應(yīng)反應(yīng)基團(tuán)(例如胺或者巰基)的修飾的內(nèi)部核苷酸結(jié) 合，或者與用這些相同反應(yīng)基團(tuán)修飾的核苷酸鏈的一個(gè)末端結(jié)合。自動(dòng)結(jié)合是通過(guò)使用攜 帶標(biāo)記的亞磷酰胺(phosphoroamidites)，然后在核苷酸鏈的自動(dòng)合成期間與鏈的一個(gè)末 端或者在內(nèi)部位置發(fā)生結(jié)合而實(shí)現(xiàn)，根據(jù)所用亞磷酰胺的類型而定?！盁晒鈭F(tuán)”是指當(dāng)由合適波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)射熒光信號(hào)的分子。所述熒光團(tuán)可以 是若丹明或者衍生物如德克薩斯紅，熒光素或者衍生物，Alexa家族熒光團(tuán)如Alexa532和 Alexa647、Alexa 405、Alexa 700、Alexa 680，或者任何其它合適的熒光團(tuán)，根據(jù)使用的測(cè) 量?jī)x器而定。適于檢測(cè)探針的熒光團(tuán)各不相同，這些為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。在本發(fā)明中，“熒光素”是指芳香族化學(xué)分子，當(dāng)由波長(zhǎng)為大約495nm的光激發(fā)時(shí)， 其發(fā)射熒光信號(hào)，在大約530nm處的發(fā)射最大。“熒光猝滅劑”或者“猝滅劑，，是指干擾由熒光團(tuán)發(fā)射的熒光的分子。這種猝滅劑 可以選自非熒光芳香族分子，以避免寄生發(fā)射。優(yōu)選地，所述猝滅劑是Dabsyl或者Dabcyl 或者Black hole quencherTM"，其是非熒光芳香族分子，當(dāng)其與熒光團(tuán)物理上相鄰近時(shí) 防止熒光團(tuán)發(fā)射熒光。也可以使用熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)，如在Fluorescent Energy Transfer NucleicAcid Probes, p. 4, Ed. V. V. Didenko, Humana Press 2006, ISSN 1064-3745中描述。所述猝滅劑也可以選自熒光分子，例如TAMRA(羧基四甲基若丹明)?！皹O性”是指核苷酸序列相對(duì)于其互補(bǔ)序列的方向，5' -3'或者3' -5'。因此， 節(jié)段可以是如此方向
·反平行在這種情況中，寡核苷酸以相反方向與互補(bǔ)序列雜交。在本發(fā)明中，一 個(gè)實(shí)施方案是具有這樣的一個(gè)閉合序列，其由反向核苷酸組成，由此當(dāng)所述閉合序列與另 一閉合序列雜交時(shí)，檢測(cè)探針是環(huán)狀的?！て叫性谶@種情況中，寡核苷酸以相同方向與互補(bǔ)序列雜交。在本發(fā)明中，一個(gè) 實(shí)施方案是具有這樣的一個(gè)閉合序列，其由α核苷酸組成，由此當(dāng)所述閉合序列與另一閉 合序列雜交時(shí)，檢測(cè)探針是環(huán)狀的。“雜交”是指這樣的過(guò)程，即在合適條件下，具有完全或者部分互補(bǔ)序列的兩個(gè)單 鏈核苷酸片段可以形成由核酸堿基之間的氫鍵穩(wěn)定的雙鏈或者“雙鏈體”。所述雜交條件由 操作條件的嚴(yán)格性和低鹽度決定。當(dāng)在更嚴(yán)格條件下進(jìn)行時(shí)，雜交是更特異性的。嚴(yán)格性 是根據(jù)探針/靶雙鏈體的堿基成分以及兩個(gè)核酸之間的錯(cuò)配程度而定義。嚴(yán)格性也與反應(yīng) 變量相關(guān)，如雜交溶液中存在的離子濃度和類型、變性劑的性質(zhì)和濃度和/或雜交溫度。其 中雜交反應(yīng)必須進(jìn)行的條件的嚴(yán)格性主要依賴于使用的雜交探針。所有這些數(shù)據(jù)均為本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知，且技術(shù)人員可以確定適當(dāng)?shù)臈l件?！?α核苷酸”或者“ α異頭核苷酸”是指具有非天然α _異頭構(gòu)型的脫氧核糖核苷 酸或者核糖核苷酸，其中由脫氧核糖的異頭碳攜帶的含氮堿基位于平面下方，而不是在β 核苷酸情況中的位于平面上方。α核苷酸的含氮堿基可以是修飾的核酸堿基，如肌苷、甲 基-5-脫氧胞苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷、脫氧尿苷、二氨基_2，6-嘌呤、溴-5-脫氧尿苷 或者允許雜交的任何其它修飾的堿基。α核苷酸也可以在核苷酸間鍵水平修飾，例如硫代 磷酸酯、H-磷酸酯、烷基磷酸酯；或者在主鏈水平修飾，如2' -0-烷基核糖、PNA和LNA。優(yōu) 選地，所述α核苷酸是在專利申請(qǐng)W0-A-88/04301中描述的那些核苷酸?！胺聪蚝塑账帷笔侵概c含有其的序列相反方向的脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸。 傳統(tǒng)上以3' -5'方向合成，反向核苷酸以5' -3'方向被導(dǎo)入核苷酸鏈其他部分之后或 者之前。反向核苷酸和鏈的其他部分通過(guò)5' -5'或者3' -3'鍵連接在一起。參見(jiàn)Koga Μ. et al.，J. Org. Chem.，1991，56，3757。反向核苷酸可任選包含至少一個(gè)修飾的核苷酸，例 如具有修飾的核酸堿基的至少一個(gè)核苷酸，如肌苷、甲基-5-脫氧胞苷、二甲基氨基-5-脫 氧尿苷、脫氧尿苷、二氨基_2，6-嘌呤、溴-5-脫氧尿苷或者允許雜交的任何其它修飾的堿 基。反向的核苷酸也可以在主鏈水平修飾，例如PNA、2' -0-烷基核糖和LNA?！澳┒恕笔侵腹押塑账岷铣傻钠鹗键c(diǎn)和終點(diǎn)，通常由第一個(gè)或者最后一個(gè)核苷即 3'或者5'攜帶的游離羥基數(shù)目限定。應(yīng)理解適當(dāng)選擇延長(zhǎng)單位(α或者β核苷的亞磷酰 胺，反向或者非反向)，可以合成3' -5'方向或者相反方向的寡核苷酸，或者在合成期間 甚至可以交替延長(zhǎng)方向。這樣導(dǎo)致寡核苷酸攜帶3' -5'、5' -3'、3' -3'或者5' -5' 末端。在本發(fā)明中，“生物樣品”是指可含有核酸的任何樣品。所述核酸可以從組織、血 液、血清、唾液、患者循環(huán)細(xì)胞中提取，或者可以從食品、加工食品中提取，或者可以來(lái)自環(huán) 境。提取是通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方案進(jìn)行，例如根據(jù)專利ΕΡ-Β-0，369，063所述 分離方法進(jìn)行。提供附圖是為了舉例說(shuō)明實(shí)施例，而無(wú)限制之意。通過(guò)附圖可以更易于理解本發(fā) 明。圖1 本發(fā)明的探針的完整環(huán)狀構(gòu)象的實(shí)例。
T:dT_FAM，熒光團(tuán)小寫(xiě)字母核苷酸α核苷酸Q 熒光猝滅劑。圖2 本發(fā)明的探針的完整環(huán)狀構(gòu)象實(shí)例。T:dT_FAM，熒光團(tuán)Q 熒光猝滅劑小寫(xiě)字母核苷酸反向核苷酸。圖3 α型B型流感病毒模型的本發(fā)明的探針的熱變性實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例1所述(任 意單位(RFU，相對(duì)熒光單位)的熒光發(fā)射與測(cè)量的溫度(攝氏度CC ))相關(guān))。圖3a 存在其合成的靶的條件下的探針。圖北沒(méi)有靶的單獨(dú)的探針。圖4:α型HIV模型的本發(fā)明的探針的熱變性實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例1所述(任意單位 (RFU)的熒光發(fā)射與溫度(°C )相關(guān))。圖如存在其合成的靶的條件下的探針。圖4b 沒(méi)有靶的單獨(dú)的探針。圖5 反向型B型流感病毒模型的本發(fā)明的探針的熱變性實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例2所述 (任意單位(RFU)的熒光發(fā)射與溫度(°C )相關(guān))。圖fe 存在其合成的靶的條件下的探針。圖恥沒(méi)有靶的單獨(dú)的探針。圖6 反向型HIV模型的本發(fā)明的探針的熱變性實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例2所述(任意單位 (RFU)的熒光發(fā)射與溫度(°C )相關(guān))。圖6a 存在其合成的靶的條件下的探針。圖6b 沒(méi)有靶的單獨(dú)的探針。圖7 研究本發(fā)明的α型探針對(duì)B型流感病毒靶模型的雜交特異性的實(shí)驗(yàn)?？v坐 標(biāo)示出測(cè)量的以攝氏度表示的解鏈點(diǎn)數(shù)值(Tm表示解鏈溫度)，其與分子信標(biāo)CpinfB(方形 符號(hào))的“莖”部分的一條鏈或者本發(fā)明的探針0pa6d(圓形符號(hào))的閉合序列之一的互補(bǔ) 核苷酸的數(shù)目(橫坐標(biāo))相關(guān)。圖8:研究本發(fā)明的α型探針對(duì)HIV-IA靶模型的雜交特異性的實(shí)驗(yàn)?？v坐標(biāo)示 出測(cè)量的以攝氏度表示的解鏈點(diǎn)數(shù)值(Tm)，其與分子信標(biāo)HIV-IA (方形符號(hào))的“莖”部分 的一條鏈或者本發(fā)明的探針Hoa8(圓形符號(hào))的閉合序列之一的互補(bǔ)核苷酸的數(shù)目(橫坐 標(biāo))相關(guān)。圖9:研究本發(fā)明的反向型探針對(duì)B型流感病毒靶模型的雜交特異性的實(shí)驗(yàn)?？v坐 標(biāo)示出測(cè)量的以攝氏度表示的解鏈點(diǎn)數(shù)值(Tm)，其與分子信標(biāo)CpinfB (方形符號(hào))的“莖” 部分的一條鏈或者本發(fā)明的探針0pi6d(圓形符號(hào))的閉合序列之一的互補(bǔ)核苷酸的數(shù)目 (橫坐標(biāo))相關(guān)。圖10 研究本發(fā)明的反向探針對(duì)HIV-IA模型的雜交特異性的實(shí)驗(yàn)?？v坐標(biāo)示出測(cè) 量的以攝氏度表示的解鏈點(diǎn)數(shù)值(Tm)，其與分子信標(biāo)HIV-IA (方形符號(hào))的“莖”部分的一 條鏈或者本發(fā)明的探針Hoi8(圓形符號(hào))的閉合序列之一的互補(bǔ)核苷酸的數(shù)目(橫坐標(biāo))相關(guān)。
圖11 在反應(yīng)混合物中存在污染物的條件下對(duì)分子信標(biāo)探針和本發(fā)明的探針的 不希望的提前開(kāi)放的研究。圖Ila:在存在T7 RNA聚合酶的條件下測(cè)量探針的熒光信號(hào)(任意單位，通過(guò)將 每個(gè)數(shù)值除以與時(shí)間(以分鐘表示)相關(guān)的最小初始數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化熒光)。圖lib 在不存在T7 RNA聚合酶的條件下測(cè)量探針的熒光信號(hào)(任意單位，通過(guò) 將每個(gè)數(shù)值除以與時(shí)間(以分鐘表示)相關(guān)的最小初始數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化熒光)。圖12 在本發(fā)明的探針中使用的各種結(jié)構(gòu)的示意圖。圖12a:使用的不同核苷酸的結(jié)構(gòu)核苷酸1= β -異頭核苷酸，核苷酸2 = α-異 頭核苷酸，核苷酸3 =反向核苷酸。圖12b 本發(fā)明的探針的閉合序列的雜交實(shí)例，當(dāng)其中一條鏈由α核苷酸組成時(shí)， 其中Τ是dT-FAM，即這個(gè)分子的熒光團(tuán)；Q相應(yīng)于熒光猝滅劑；小寫(xiě)字母的核苷酸是這個(gè) 圖右手側(cè)的α核苷酸，而用虛線畫(huà)出的圓示出在這個(gè)圖左手側(cè)的這些相同的α-異頭核苷 酸；最后，在這個(gè)圖右手側(cè)的大寫(xiě)字母的核苷酸是β核苷酸，其在左手側(cè)含有非環(huán)形的堿基B。圖12c:本發(fā)明的探針的閉合序列的雜交實(shí)例，當(dāng)其中一條鏈由反向核苷酸組成 時(shí)，其中T是dT-FAM熒光團(tuán)；Q是熒光猝滅劑；小寫(xiě)字母核苷酸是反向核苷酸；用虛線畫(huà)出 的圓示出5' -5'鍵。在下文提供的所有實(shí)施例中使用的本發(fā)明的探針、分子信標(biāo)探針和靶核酸是通過(guò) 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的亞磷酰胺(phosphoroamidites)合成方法合成的。亞磷酰胺合成方 法由Beaucage和Lyer (Tetrahedron, 48, 223-2311,1992)描述。試劑和亞磷酰胺可商購(gòu)， 主要購(gòu)自 Eurogentec S. A. (Seraing, Belgium)禾口 Glen Research (Sterling, Virginia, USA)。用于導(dǎo)入修飾的α核苷酸的α亞磷酰胺購(gòu)自Chemgenes (Wilmington，MA, USA, catalog No. ANP-1651, ANP-1652, ANP-1653, ANP-1654)。用于導(dǎo)入反向核苷酸的反向亞 磷酰胺購(gòu)自 Glen Research (Sterling, Virginia, USA, catalog No. 10-0001，10-0101， 10-0201，10-0301)。寡核苷酸通過(guò)HPLC純化。其純度也通過(guò)HPLC分析監(jiān)測(cè)，其相同性通 過(guò)Maldi-TOF質(zhì)譜分析監(jiān)測(cè)。本發(fā)明的探針和分子信標(biāo)中使用的標(biāo)記是-Dabsyl 熒光猝滅劑(Glen Research, Cat. No. 20-5912)，稱作 Da,-FAM(熒光素-胺)熒光團(tuán)，Molecular Probes, Cat. No. C-2210，-FAM(熒光素-胺)熒光團(tuán)，附著于脫氧胸腺嘧啶核苷酸(Glen Research, Cat. No. 10-1056)，稱作 dT-FAM。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)靶核酸的探針，其由包含三個(gè)片段的標(biāo)記的核苷酸鏈組成 -具有第一閉合序列的第一片段，-第二片段，其全部或者一部分具有用于對(duì)靶核酸進(jìn)行分子識(shí)別的識(shí)別序列， -具有第二閉合序列的第三片段，以及 -至少兩個(gè)標(biāo)記，所述檢測(cè)探針的鏈的末端之一無(wú)任何標(biāo)記，其中，當(dāng)所述兩個(gè)閉合序列雜交在一起時(shí)，所述檢測(cè)探針具有完整的環(huán)狀形狀，所述閉 合序列因此將所述探針保持于在不存在所述靶核酸的條件下不能被檢測(cè)的構(gòu)象。
2.權(quán)利要求1的檢測(cè)探針，特征在于第一標(biāo)記由第一片段的一核苷酸攜帶，第二標(biāo)記 由第二或者第三片段的一核苷酸攜帶，當(dāng)所述兩個(gè)閉合序列雜交時(shí)這兩個(gè)核苷酸相鄰。
3.權(quán)利要求1或2的檢測(cè)探針，特征在于所述兩個(gè)閉合序列的全部或者一部分是平行 雜交的。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的檢測(cè)探針，特征在于所述閉合序列之一的全部或者一部分是 由α核苷酸組成的序列。
5.權(quán)利要求1或2的檢測(cè)探針，特征在于所述兩個(gè)閉合序列的全部或者一部分經(jīng)歷反 平行雜交。
6.權(quán)利要求1、2或5任一項(xiàng)的檢測(cè)探針，特征在于所述兩個(gè)閉合序列之一通過(guò) 5' -5'或者3' -3'反向鍵結(jié)合于所述識(shí)別序列。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的檢測(cè)探針，特征在于至少一個(gè)標(biāo)記是熒光團(tuán)，及至少一個(gè)其 它標(biāo)記是熒光猝滅劑。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的探針，特征在于第一或者第二閉合序列的全部或者一部分可 以與靶序列雜交。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的探針，特征在于一核苷酸序列附著于所述閉合序列之一的末端。
10.檢測(cè)樣品中可能存在的靶序列的方法，包括如下步驟 -將所述樣品與前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的檢測(cè)探針接觸，-檢測(cè)所述檢測(cè)探針與靶序列之間雜交體的形成，所述雜交體的形成表示所述樣品中 存在所述靶序列。
11.權(quán)利要求10的方法，特征在于所述檢測(cè)是與靶序列的擴(kuò)增反應(yīng)聯(lián)合進(jìn)行的。
12.權(quán)利要求10的方法，特征在于所述檢測(cè)是在靶序列的擴(kuò)增反應(yīng)之后進(jìn)行的。
13.檢測(cè)靶序列的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的至少一種檢測(cè)探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及可以檢測(cè)核酸的新的核苷酸探針，其由包含三個(gè)片段的標(biāo)記的核苷酸鏈組成具有第一閉合序列的第一片段，第二片段，其全部或者一部分具有用于對(duì)靶核酸進(jìn)行分子識(shí)別的識(shí)別序列，具有第二閉合序列的第三片段，以及至少兩個(gè)標(biāo)記，所述檢測(cè)探針的鏈的末端之一無(wú)任何標(biāo)記，其中，當(dāng)兩個(gè)閉合序列雜交在一起時(shí)，檢測(cè)探針具有完整的環(huán)狀形狀，所述閉合序列因此將所述探針保持于在不存在所述靶核酸的條件下不能被檢測(cè)的構(gòu)象。本發(fā)明還涉及應(yīng)用所述探針進(jìn)行檢測(cè)的方法和試劑盒。本發(fā)明優(yōu)選用于診斷領(lǐng)域中。
文檔編號(hào)C07H21/00GK102083848SQ200980125989
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者A·拉尤, E·貝爾納爾門(mén)德斯 申請(qǐng)人:生物梅里埃公司