專利名稱：：使用klotho-fgf融合多肽的方法和組合物的制作方法使用KLOTHO-FGF融合多肽的方法和組合物1.
背景技術(shù)：
：α-Klotho基因編碼130kDa單次跨膜的I型跨膜蛋白質(zhì)，具有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。α-Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括稱為KL-Dl和KL-D2的2個亞結(jié)構(gòu)域。這2個亞結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌和植物的葡萄糖苷酶共享序列同源性。α-Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以通過跨膜結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞表面結(jié)合，或可以被斷裂且釋放到細(xì)胞外環(huán)境內(nèi)。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的斷裂看起來可以被局部低細(xì)胞外Ca2+濃度促進(jìn)。除α-Klotho外，α-Klotho的同系物——β-Klotho已得到鑒定(Ito等人，Mech.Dev.98115-9(2000))。β-Klotho也是具有細(xì)胞外KL-D1和KL-D2亞結(jié)構(gòu)域的單跨膜的I型跨膜蛋白質(zhì)。已證實(shí)對α-Klotho表達(dá)的調(diào)節(jié)在哺乳動物中可以引起衰老相關(guān)特征。α-Klotho基因的功能喪失性突變的純合小鼠發(fā)展出類似人衰老的特征，包括縮短的壽命、皮膚萎縮、肌肉消瘦、動脈硬化、肺氣腫和骨質(zhì)疏松癥(Kuro-o等人，Nature，390:45-51(1997))。相比之下，相對于野生型小鼠，α-Klotho基因在小鼠中的超表達(dá)延長壽命且增加對于氧化應(yīng)激的抗性(Kurosu等人，Science309:1829-1833(2005)；Yamamoto等人，J.Biol.Chem.28038029-38034(2005))。成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)構(gòu)成一個同源多肽生長因子家族，在許多生物體中表達(dá)(Ornitz和Itoh，GenomeBiol.2綜述，3005.1-3005.12(2001))。在脊椎動物物種中，F(xiàn)GFs在基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列方面都是高度保守的，彼此具有13-71%氨基酸同一性。在人中，存在22個已知的FGF家族成員(FGF15是人FGF19的小鼠直向同源物，因此不存在人FGF15)。在早期發(fā)育過程中，F(xiàn)GFs調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和分化，但在成年生物體中，F(xiàn)GFs維持穩(wěn)態(tài)、在組織修復(fù)中起功能并對損傷產(chǎn)生應(yīng)答。FGFs通過結(jié)合且從而激活細(xì)胞表面FGF受體而充當(dāng)生長因子。FGF受體(FGFRs)是酪氨酸激酶受體，其通過FGFR的自磷酸化、FRS2(FGF受體底物2)和ERKl/2(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)激酶1/2)的磷酸化和激活Egr-I(早期生長應(yīng)答蛋白-1)來激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。FGFs也對于硫酸肝素蛋白聚糖具有高親和力。當(dāng)與FGFs結(jié)合時，硫酸肝素增強(qiáng)對FGFRs的激活。近期研究已顯示FGF23缺陷小鼠和α-Klotho缺陷小鼠之間具有驚人相似的生物學(xué)特征(Shimada等人，J.Clin.Invest.113561-568(2004)；Yoshida等人Endocrinology143683-689(2002))，說明FGF23和α-Klotho之間的功能串?dāng)_。這些研究導(dǎo)致α-Klotho被鑒定為FGF23的專性配偶體(就通過其關(guān)連FGF受體的結(jié)合和信號傳導(dǎo)而言)(Urakawa等人，Nature221524-6(2007))。α-Klotho基因主要在腎、甲狀旁腺和脈絡(luò)叢中表達(dá)。推測α-Klotho的組織特異性表達(dá)使得FGF23信號傳導(dǎo)的活化被局限于這些組織。類似于FGF23/a-Kl0th0，就通過其相應(yīng)的關(guān)聯(lián)FGF受體的結(jié)合和信號傳導(dǎo)方面，β-Klotho是FGF19和FGF21的專性配偶體(Ogawa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1047432-7(2007)；Lin等人，J.BiolChem.28227227-84(2007)；和Wu等人，J.Biol.Chem.28229069-72(2007))。此類研究也已證實(shí)β-Klotho參與調(diào)節(jié)組織特異性代謝活性。β-Klotho最初顯示作為輔因子與FGF21—起發(fā)揮作用，用于調(diào)節(jié)脂肪組織中的碳水化合物和脂質(zhì)代謝。β-Klotho與FGF19結(jié)合調(diào)節(jié)肝中的膽汁酸代謝，因此解釋了β-Klotho缺陷小鼠中升高的膽汁合成(Ito等人，JClinInvest.2005Aug；115(8)2202-8)。美國專利號6,579,850描述了包括α-Klotho多肽的多肽和組合物。公開了人和小鼠α-Klotho多肽。該專利還公開了包括該多肽的組合物在治療類似于未老先衰的綜合征、治療成人病和抑制衰老中有用。美國專利號7,223,563描述了編碼FGF23多肽序列的經(jīng)分離的核酸或包括此分離的核酸的重組細(xì)胞。該專利進(jìn)一步涉及診斷和治療低血磷和高血磷病癥、骨質(zhì)疏松癥、皮肌炎和冠狀動脈病的方法。美國專利號7,259,248描述了編碼FGF21多肽序列的經(jīng)分離的核酸。該專利進(jìn)一步涉及診斷和治療肝病、胸腺功能相關(guān)病狀的方法，和治療睪丸病狀的方法。2.發(fā)明概述本發(fā)明涉及用Klotho融合多肽或可溶性Klotho多肽預(yù)防或治療年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥的方法、試劑盒和組合物。本發(fā)明的Klotho融合多肽由Klotho蛋白質(zhì)或其活性片段(例如，sKlotho)形成。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括Klotho蛋白質(zhì)或其活性片段和成纖維細(xì)胞生長因子或其活性片段的Klotho融合多肽。在第一個方面，本發(fā)明提供了具有Klotho蛋白質(zhì)的至少一個細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子或其活性片段的融合多肽。該Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以源自α或βKlotho同種型。此外，盡管Klotho融合多肽的FGF組分主要參考成纖維細(xì)胞生長因子-19、成纖維細(xì)胞生長因子-21和成纖維細(xì)胞生長因子-23進(jìn)行描述，但可以考慮到23種已知FGFs中的任何一種都可以用于實(shí)踐本發(fā)明。本申請的讀者可以想到，可以單獨(dú)地且具體地考慮α或β細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與每種人FGF蛋白質(zhì)或其活性片段的每一和任何組I=IO根據(jù)本發(fā)明，Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以包括Klotho蛋白質(zhì)的KL-Dl和KL-D2結(jié)構(gòu)域中的一個或兩個。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的Klotho融合多肽具有至少2個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域。例如，該2個細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域可以是串聯(lián)重復(fù)的2個KL-Dl結(jié)構(gòu)域、串聯(lián)重復(fù)的2個KL-D2結(jié)構(gòu)域、或1個KL-Dl結(jié)構(gòu)域和1個KL-D2結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合多肽包括全長αKlotho蛋白質(zhì)的氨基酸28-292。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合多肽包括全長βKlotho蛋白質(zhì)的氨基酸52-997。根據(jù)本發(fā)明，包括至少一個Klotho蛋白質(zhì)細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽和FGF或其活性片段可以共價連接在一起，例如化學(xué)連接或通過肽鍵在讀框內(nèi)融合。它們還可以經(jīng)由接頭進(jìn)行連接。多肽接頭的非限制性例子是SEQIDNOs11、12、13、14、15、16、17和18。此類接頭可以包括SEQIDNOs11、12、13、14、15、16、17和18的至少1個至高達(dá)約30個重復(fù)。根據(jù)本發(fā)明，Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子可以以各種方向和方式彼此可操作地連接。例如，Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域可以可操作地連接于成纖維細(xì)胞生長因子的N末端，或備選地成纖維細(xì)胞生長因子可以可操作地連接于Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的N末端。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括Klotho蛋白質(zhì)的sKlotho和接頭的融合多肽。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho和接頭的融合多肽。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括βKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho和接頭的融合多肽。在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人FGF蛋白質(zhì)或其活性片段(例如，不含信號肽)和接頭。本發(fā)明還考慮包括本發(fā)明的融合蛋白的藥物組合物及其用于治療或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥的用途。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與FGF-23融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與FGF-23融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的不含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與不含信號肽的FGF-23融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與不含信號肽的FGF-23融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的不含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與FGF_23(R179Q)變體融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與FGF_23(R179Q)變體融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的不含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與不含信號肽的FGF_23(R179Q)變體融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與不含信號肽的FGF_23(R179Q)變體融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的不含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括(1)含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho;⑵接頭；和(3)不含信號肽的FGF-23(R179Q)變體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括⑴不含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho;(2)接頭；和(3)不含信號肽的FGF_23(R179Q)變體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合多肽是糖基化的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括(1)含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho(SEQIDNO44或SEQIDNO45)；(2)包括SEQIDNO11的接頭；和(3)不含信號肽的FGF-23(R179Q)變體(SEQIDNO43)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括⑴不含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho(SEQIDNO7)；(2)包括SEQIDNO11的接頭；和(3)不含信號肽的FGF-23(R179Q)變體(SEQIDNO43)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括SEQIDNO19、20、40或41的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合多肽是糖基化的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho(SEQIDNO44或SEQIDNO45)；和包括SEQIDNO11的接頭。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括不含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho(SEQIDNO7)；和包括SEQIDNO11的接頭。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合多肽是糖基化的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括人FGF蛋白質(zhì)或其活性片段(例如，不含信號肽)；和包括SEQIDNO:11的接頭。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合多肽是糖基化的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括(例如，糖基化或非糖基化的)融合多肽(例如，作為唯一的藥學(xué)活性成分)的藥物組合物(例如，肌內(nèi)施用形式)，所述融合多肽包括⑴含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho(SEQIDNO44或SEQIDNO45)；(2)包括SEQIDNO11的接頭；和(3)不含信號肽的FGF-23(R179Q)變體(SEQIDNO43)；和所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀例如肌肉萎縮的用途。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括(例如，糖基化或非糖基化的)融合多肽(例如，作為唯一的藥學(xué)活性成分)的藥物組合物(例如，肌內(nèi)施用形式)，所述融合多肽包括⑴不含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho(SEQIDNO7)；(2)包括SEQIDNO11的接頭；和(3)不含信號肽的FGF_23(R179Q)變體(SEQIDNO43)；和所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀例如肌肉萎縮的用途。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括(例如，糖基化或非糖基化的)融合多肽(例如，作為唯一的藥學(xué)活性成分)的藥物組合物(例如，肌內(nèi)施用形式)，所述融合多肽包括SEQIDNO:19、20、40或41的氨基酸序列；和所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀例如肌肉萎縮的用途。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括(例如，糖基化或非糖基化的)融合多肽(例如，作為唯一的藥學(xué)活性成分)的藥物組合物(例如，肌內(nèi)施用形式)，所述融合多肽包括含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho(SEQIDNO44或SEQIDNO45)和包括SEQIDNO11的接頭；和所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀例如肌肉萎縮的用途。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括(例如，糖基化或非糖基化的)融合多肽(例如，作為唯一的藥學(xué)活性成分)的藥物組合物(例如，肌內(nèi)施用形式)，所述融合多肽包括不含信號肽的αKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho(SEQIDNO7)和包括SEQIDNO11的接頭；和所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀例如肌肉萎縮的用途。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括(例如，糖基化或非糖基化的)融合多肽(例如，作為唯一的藥學(xué)活性成分)的藥物組合物，所述融合多肽包括人FGF蛋白質(zhì)或其活性片段(例如，不含信號肽)和包括SEQIDNO:11的接頭。本發(fā)明還考慮包括本發(fā)明的融合蛋白的藥物組合物及其用于治療或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀(例如，肌肉萎縮)或代謝病癥(例如，糖尿病)的用途。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其與SEQIDNO:19至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少96%,至少97%、至少98%、至少99%相同。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其與SEQIDNO:20至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其與SEQIDNO:40至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少96%,至少97%、至少98%、至少99%相同。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其與SEQIDNO:41至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與FGF-19或其活性片段融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的含信號肽的0幻0&0蛋白質(zhì)的8幻0&0。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與FGF-19或其活性片段融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的不含信號肽的βKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與FGF-21或其活性片段融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的含信號肽的3幻礎(chǔ)0蛋白質(zhì)的說10&0。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合多肽，其包括與FGF-21或其活性片段融合(直接地或經(jīng)由接頭間接地)的不含信號肽的βKlotho蛋白質(zhì)的sKlotho。本發(fā)明提供了編碼本文描述的任何Klotho融合多肽的核酸序列和包含該核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了具有本文考慮的任何Klotho融合多肽的組合物。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括肝素。本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防個體中的年齡相關(guān)性病狀的方法。個體(例如，人)被施用治療有效劑量的包含Klotho融合多肽的藥物組合物，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)(例如，αKlotho蛋白質(zhì))的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子或其活性片段，以便治療或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀。特別地，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防肌肉消瘦的方法，其包括給個體(例如，人)施用治療有效量的融合多肽，所述融合多肽具有至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子(或其活性片段)。此外，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防個體中的代謝病癥的方法。個體被施用治療有效劑量的包含本發(fā)明的融合多肽的藥物組合物，所述本發(fā)明的融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子(或其活性片段)，以便治療代謝病癥。特別地，具有至少一個β-Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子21的本發(fā)明融合多肽對于治療代謝病癥有用。本發(fā)明的Klotho-FGF23融合多肽可以用于治療或預(yù)防個體中的高血磷癥(hyperphosphatemia)或鈣質(zhì)沉著。施用藥理學(xué)有效劑量的包含本發(fā)明Klotho融合多肽的藥物組合物，所述本發(fā)明Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以治療或預(yù)防高血磷癥或鈣質(zhì)沉著。特別地，具有至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子23的本發(fā)明Klotho融合多肽對于治療高血磷癥或鈣質(zhì)沉著有用。本發(fā)明的Klotho-FGF23融合多肽可以用于治療或預(yù)防個體中的慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭。施用治療有效劑量的包含本發(fā)明Klotho融合多肽的藥物組合物，所述本發(fā)明Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)(例如，αKlotho蛋白質(zhì))的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以治療或預(yù)防慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭。本發(fā)明的Klotho-FGF23融合多肽可以用于治療或預(yù)防個體中的癌癥(例如，乳腺癌)。施用治療有效劑量的包含本發(fā)明的Klotho融合多肽的藥物組合物，所述本發(fā)明的Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)(例如，αKlotho蛋白質(zhì))的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以治療或預(yù)防癌癥或乳腺癌。本發(fā)明提供了包括至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和FGF或其活性片段的融合多肽，用于醫(yī)藥用途中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和FGF或其活性片段的融合多肽，用于在治療或預(yù)防肌肉萎縮中使用。本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀(例如，肌肉萎縮)的方法，其包括給有此需要的個體施用治療有效劑量的包括可溶性Klotho蛋白質(zhì)的藥物組合物。本發(fā)明還包括用于治療或預(yù)防個體中的年齡相關(guān)性病癥或代謝病癥的試劑盒。該試劑盒包括使用說明書和具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子的純化的Klotho融合多肽。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的Klotho融合多肽的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括使用說明書和編碼Klotho融合多肽的核酸，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子。3.附圖簡述圖1舉例說明了本發(fā)明Klotho融合多肽的幾個不同實(shí)施方案。所示的融合多肽包括與成纖維細(xì)胞生長因子可操作地連接的一個或多個Klotho細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域。包含一個或多個Klotho細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽包括例如Klotho的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(例如，人Klotho的a.a.1-982)或Klotho的活性片段。圖2舉例說明了本發(fā)明的幾種Klotho融合多肽及其組分(例如，Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、FGF)的氨基酸和核酸序列。圖3A-3C描述了sKlotho_FGF23融合蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)。圖3A顯示用抗FGF23抗體通過蛋白質(zhì)印跡在條件培養(yǎng)基中檢測出sKlotho-FGF23融合蛋白。圖3B顯示通過SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色在條件培養(yǎng)基中檢測出sKlotho_FGF23融合蛋白。圖3C顯示高度純化的sKlotho-FGF23-6xHis融合蛋白(通過SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色分析)。圖4舉例說明Egr-I螢光素酶測定法結(jié)果，比較了在肝素(20μg/ml)存在或不存在下用如下條件培養(yǎng)基處理的細(xì)胞中的Egr-I激活水平，所述條件培養(yǎng)基包含Klotho融合多肽、僅FGF23多肽、僅可溶性Klotho(sKlotho)多肽、或與FGF23多肽組合的可溶性Klotho多肽。圖5A-5B描述了Egr_l螢光素酶測定法結(jié)果，比較了在肝素不存在或存在下用純化的Klotho融合多肽、FGF23多肽或可溶性Klotho多肽處理的細(xì)胞中的Egr-I激活水平。圖5A顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較了在肝素(20μg/ml)不存在或存在下用單獨(dú)的FGF23、sKlotho-His(IOnM或20nM)和FGF23與sKlotho-His(IOnM或20nM)的組合處理的細(xì)胞中的Egr-I激活水平。圖5B顯示在用sKlotho-FGF23-His融合物(OnM、0.6nM、1.21nM、2.41nM、4.83nM、9.65nM和19.3nM)處理的細(xì)胞中的Egr-I螢光素酶報道分子活性。圖6A-6B舉例說明了用純化的sKlotho融合多肽處理對C2C12肌細(xì)胞的影響。圖6A顯示在地塞米松(100μΜ)不存在或存在下用IGF-I(IOnM)、FGF2(20ng/ml)或純化的Klotho融合多肽(20nM)處理的C2C12肌細(xì)胞中的肌管直徑測量結(jié)果。圖6B顯示在雷帕霉素(40nM)不存在或存在下由IGF-I(IOnM)、FGF2(20ng/ml)或純化的Klotho融合多肽(20nM)弓丨起的C2C12肌細(xì)胞中信號途徑蛋白質(zhì)的磷酸化。4.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療年齡相關(guān)性病狀和代謝病癥的方法、試劑盒和組合物。本發(fā)明的融合多肽包括Klotho蛋白質(zhì)或其活性片段。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合多肽包括與成纖維細(xì)胞生長因子多肽或其活性片段可操作地連接的Klotho蛋白質(zhì)或其活性片段。本發(fā)明的Klotho融合蛋白或sKlotho在治療和預(yù)防各種年齡相關(guān)性病狀和代謝病癥中有用，所述年齡相關(guān)性病狀包括少肌癥(sarcopenia)、皮膚萎縮、肌肉消瘦、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、免疫機(jī)能不全、高血壓、癡呆、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性、前列腺癌、中風(fēng)、預(yù)期壽命縮減、記憶喪失、皺紋、腎功能受損和年齡相關(guān)性聽力損失；所述代謝病癥包括II型糖尿病、代謝綜合征、高血糖癥和肥胖。本發(fā)明至少部分基于下述發(fā)現(xiàn)盡管物理約束(例如，Klotho和FGF多肽的大尺寸)，但Klotho-FGF融合多肽在激活FGF受體方面仍高度有效?？紤]到這2種蛋白質(zhì)的融合物可能干擾這些蛋白質(zhì)的異二聚化和因此它們的活性；例如，這些蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能被融合物干擾，或如果以“順式”形式放在一起時這些蛋白質(zhì)可能在空間上錯誤定向，這個發(fā)現(xiàn)是出乎意料的。本文描述的Klotho-FGF融合多肽是有利的，因?yàn)樗鼈冊试S施用單一治療性蛋白質(zhì)，與Klotho或FGF單獨(dú)施用時或作為分開的多肽一起施用時比較，該單一治療性蛋白質(zhì)具有增強(qiáng)的活性。Klotho和FGF以單個融合多肽的形式使用而非以2種分開的多肽的形式(即Klotho多肽和分開的FGF多肽)使用，可以更有效地激活FGF受體。^X如本文所使用的，“Klotho多肽，，、“Klotho蛋白質(zhì)”或“Klotho，，包括野生型“Klotho”的活性片段、衍生物、模擬物、變體和化學(xué)修飾的化合物或其雜合物。Klotho活性片段具有與FGF多肽結(jié)合的能力。一般地，Klotho活性多肽包含至少Klotho亞結(jié)構(gòu)域(例如，KL-Dl和KL-D2)。野生型Klotho具有與天然存在Klotho一樣的氨基酸序列。適用于本發(fā)明的示例性Klotho多肽包括α-Klotho(SEQIDNO2)禾Πβ-Klotho(SEQIDNO4)。α-Klotho和β-Klotho的核苷酸和氨基酸序列可以分別見于GenBank數(shù)據(jù)庫登記號NM_004795；NP_004786和NM_175737；NP_783864。Klotho多肽包括在美國專利號6,579,850中描述的那些，所述專利的內(nèi)容整體引入本文作為參考。Klotho多肽包括來自除人外的其他物種的那些，包括來自小鼠(NP_038851)、大鼠(NP_112626)、兔(ΝΡ_001075692)的α-Klotho，和來自小鼠(NP_112457)的β-Klotho。預(yù)測具有α-Klotho的物種包括黑猩猩(XP_522655)、獼猴(XPJ)Ol101127)、馬(XP_001495662)、母牛(XPJ)Ol2525OO)、鴨嘴獸(XPJ)Ol5IO98I)和雞(XP_417105)。預(yù)測具有β-Klotho的物種包括黑猩猩(XP_526550)、獼猴(ΧΡ_001091413)、馬(ΧΡ_001495248)、犬(XP_536257)、大鼠(XP_001078178)、鴨嘴獸(XP_001512722)和雞(XP_423224)。Klotho多肽可以具有這樣的氨基酸序列，其與SEQIDNO2或SEQIDNO4的氨基酸序列基本上相同，即與SEQIDNO2或SEQIDNO4的氨基酸序列或其活性片段至少70%、75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多相同。如本文所使用的，“融合多肽”或“融合蛋白”應(yīng)意指包括天然地不存在于同一多肽中的2個或更多個不同多肽或其活性片段的多肽。在某些實(shí)施方案中，該2個或更多個不同多肽共價可操作地連接在一起，例如化學(xué)連接或通過肽鍵在讀框內(nèi)融合。如本文所使用的，“Klotho融合多肽”是包括來自Klotho多肽或其活性片段的氨基酸序列的融合多肽?！俺衫w維細(xì)胞生長因子”和“FGF”在本文中可互換使用，并且應(yīng)指可以調(diào)節(jié)動物(包括人受試者)中的細(xì)胞增殖、遷移、分化、穩(wěn)態(tài)、組織修復(fù)和對損傷的應(yīng)答的多肽。FGFs能夠與成纖維細(xì)胞生長因子受體結(jié)合和調(diào)節(jié)其活性，包括FGFR的自磷酸化、FRS2(FGF受體底物2)和ERK1/2(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)激酶1/2)的磷酸化、和激活Egr-I(早期生長應(yīng)答蛋白-1)。術(shù)語“FGF”包括野生型“FGF”的活性片段、衍生物、模擬物、變體和化學(xué)修飾的化合物或其雜合物，例如，如本領(lǐng)域已知的且如美國專利號7,223,563和美國專利號7,259,248中描述的，所述專利的內(nèi)容整體引入作為參考。野生型FGF具有與天然存在的FGF—樣的氨基酸序列。適用于本發(fā)明的示例性成纖維細(xì)胞生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子-19(FGF19；SEQIDNO31)、成纖維細(xì)胞生長因子-21(FGF21；SEQIDNO33)、和成纖維細(xì)胞生長因子-23(FGF23；SEQIDNO35)。FGF多肽包括來自除人外的其他物種的那些，包括鼠類FGFs。一般地，F(xiàn)GF多肽具有與SEQIDNO31、SEQIDNO33或SEQIDNO35的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列；即具有與SEQIDNO:31、SEQIDNO33或SEQIDNO:35的氨基酸序列或其活性片段至少70%、75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多相同的氨基酸序列。術(shù)語“FGF”包括全長多肽的活性片段。能夠與其相應(yīng)FGF受體結(jié)合的活性FGF片段是本領(lǐng)域已知的，并且也考慮用于在本發(fā)明中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，基于本文公開的序列，使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)可以產(chǎn)生FGFs的重疊片段，例如Sambrook等人(1989,MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)禾口Ausubel等人(1997,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Green&Wiley,NewYork)中描述的技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，基于本文的公開內(nèi)容，通過本領(lǐng)域眾所周知和本文描述的方法可以測試FGF片段的生物活性，包括與FGF受體的結(jié)合。類似地，可以用FGF片段轉(zhuǎn)染具有必需FGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)器(即，F(xiàn)GF受體)的細(xì)胞培養(yǎng)物模型，并且隨后測試相對于野生型FGF而言FGF信號傳導(dǎo)的改變?；贔GF核心同源結(jié)構(gòu)域(長約120個氨基酸)的同源性，可以將FGFs分組為7個亞家族，F(xiàn)GF核心同源結(jié)構(gòu)域的側(cè)翼N和C末端序列在長度和一級序列上高度可變，特別是在不同的FGF亞家族中(Goetz等人，MolecularandCellularBiology，2007，第27卷，3417-3428)。FGF活性多肽一般包含至少FGF核心同源結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，除FGF核心同源結(jié)構(gòu)域外，F(xiàn)GF活性多肽還可以包含可賦予結(jié)合FGF受體的額外特異性的側(cè)翼序列。FGF19、FGF21和FGF23分組在FGF19亞家族中，因?yàn)橄鄬τ谄渌鸉GFs，這些配體的核心區(qū)共享高度序列同一性(FGF19與FGF21比較38%同一性；FGF19與FGF23比較36%同一性)。FGF19亞家族成員類似于內(nèi)分泌系統(tǒng)的信號分子起作用，并且調(diào)節(jié)對于經(jīng)典FGFs罕見的各種生理過程(例如，F(xiàn)GF19;能量和膽汁酸穩(wěn)態(tài)；FGF21葡萄糖和脂質(zhì)代謝；FGF23磷酸鹽和維生素D穩(wěn)態(tài))。如本文所使用的，“成纖維細(xì)胞生長因子受體”和“FGFR”是指本領(lǐng)域已知的FGFRs1-4中的任何一種、或其剪接變體(例如，F(xiàn)GFRlc)。適合于與本發(fā)明一起使用的示例性成纖維細(xì)胞生長因子受體包括成纖維細(xì)胞生長因子-19受體(例如，F(xiàn)GFR4-βKlotho)、成纖維細(xì)胞生長因子_21受體(例如，F(xiàn)GFRlc-αKlotho)、和成纖維細(xì)胞生長因子-23受體(例如，F(xiàn)GFRlc-αKlotho、FGFR3-αKlotho、FGFR4-αKlotho)。如本文所使用的，“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”指存在于細(xì)胞外的跨膜蛋白質(zhì)的片段(例如，不包括細(xì)胞內(nèi)或跨膜區(qū))?！癒lotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”、“可溶性Klotho”或“sKlotho，，(例如，SEQIDNO7；SEQIDNO39)，指Klotho多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其能夠結(jié)合成纖維細(xì)胞生長因子，和/或能夠通過與成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合而使得該成纖維細(xì)胞生長因子與成纖維細(xì)胞生長因子受體結(jié)合。Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以與全長αKlotho序列(SEQIDΝ0:2)的氨基酸殘基28-982相對應(yīng)，與全長βKlotho序列(SEQIDNO4)的氨基酸殘基52-997相對應(yīng)。“Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域”和“Klotho蛋白質(zhì)細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域”在本文中可互換使用，并且應(yīng)指Klotho多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域，該區(qū)域能夠結(jié)合成纖維細(xì)胞生長因子，和/或能夠通過與成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合而使得成纖維細(xì)胞生長因子與成纖維細(xì)胞生長因子受體結(jié)合。Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有重復(fù)的2個同源亞結(jié)構(gòu)域，即KL-Dl(SEQIDNO5)禾口KL-D2(SEQIDNO6)。KL-D1和KL-D2可以分別對應(yīng)于全長αKlotho多肽(SEQIDNO2)的氨基酸殘基58-506和517-953，和分別地對應(yīng)于全長βKlotho多肽(SEQIDNO4)的氨基酸殘基77-508和571-967，并且合適與本發(fā)明一起使用。一般地，包含至少一個Klotho亞結(jié)構(gòu)域的多肽是Klotho活性多肽。用于本發(fā)明多肽的Klotho細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域可以是αKlotho或βKlothoKL-Dl結(jié)構(gòu)域，具有分別與SEQIDNO5或SEQIDNO37的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。此夕卜，KlothoKL-Dl結(jié)構(gòu)域可以具有與SEQIDNO5或SEQIDNO37的氨基酸序列至少70%、75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多相同的氨基酸序列。Klotho細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域還可以是α或βKlotho多肽的KL-D2結(jié)構(gòu)域，分別與SEQIDNO6或SEQIDNO38的氨基酸序列基本上相同。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，KL-D2結(jié)構(gòu)域具有與SEQIDNO6或SEQIDNO38的氨基酸序列至少70%、75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多相同的氨基酸序列。如本文所使用的，“信號肽”應(yīng)意指可以指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并可以被切掉的肽鏈(長3-60個氨基酸)。適用于本發(fā)明的示例性信號肽包括Klotho信號肽(SEQIDNO19)和IgG信號肽(SEQIDNO20)。如本文所使用的，“接頭”應(yīng)意指這樣的官能團(tuán)(例如，化學(xué)制品或多肽)，其共價附著2個或更多個多肽或核酸從而使得它們彼此連接。如本文所使用的，“肽接頭”指用于使2個蛋白質(zhì)偶聯(lián)在一起(例如，使Klotho的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與成纖維細(xì)胞生長因子-23偶聯(lián))的一個或多個氨基酸。適用于本發(fā)明的肽接頭包括但不限于，具有由SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17禾口SEQIDNO18表示的氨基酸序列的多肽。如本文所使用的，“可操作地連接”應(yīng)意指2個或更多個生物分子的連接，該連接使得至少可以保留與生物分子相關(guān)的生物功能、活性和/或結(jié)構(gòu)。就多肽而言，該術(shù)語意指2個或更多個多肽的連接導(dǎo)致保留了每種多肽組分各自的至少某些相應(yīng)活性的融合多肽。該2個或更多個多肽可以直接或經(jīng)由接頭進(jìn)行連接。就核酸而言，該術(shù)語意指第一個多核苷酸被放置在第二個多核苷酸附近，由此當(dāng)合適分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活物蛋白質(zhì))與第二個多核苷酸結(jié)合時，所述第二個多核苷酸可以指導(dǎo)第一個多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。如本文所使用的，“特異性結(jié)合”應(yīng)指，由于第一個分子能夠采取有助于其自身和靶分子之間形成非共價相互作用的特定結(jié)構(gòu)，由此第一分子能夠自它可能暴露于的許多不同類型的分子中結(jié)合靶分子。第一分子與靶結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而第一分子與任何其他非特異性分子發(fā)生實(shí)質(zhì)上較少的識別、接觸或復(fù)合物形成。如本文所使用的，“多肽變體”或“蛋白質(zhì)變體”是指，其中一個或多個氨基酸已由來自參考序列的不同氨基酸置換的多肽。本領(lǐng)域理解，某些氨基酸可以由具有廣泛相似性質(zhì)的其他氨基酸置換，而不改變多肽活性的性質(zhì)(保守置換)，見下文中描述。這些術(shù)語還包括其中已添加或缺失、或由不同氨基酸替換了一個或多個氨基酸的多肽，例如蛋白質(zhì)同種型。適用于本發(fā)明的成纖維細(xì)胞生長因子-23的示例性變體是成纖維細(xì)胞生長因子-23變體(R179Q)。如本文所使用的，“藥物組合物”應(yīng)意指包含可以施用以治療或預(yù)防個體中的疾病或病癥的化合物(例如，本發(fā)明的融合多肽)的組合物。如本文所使用的，“個體”或“受試者”應(yīng)指哺乳動物，包括但不限于，人或非人哺乳動物，例如牛、馬、犬、綿羊或貓科動物。如本文所使用的，“治療”應(yīng)意指減少、抑制、減弱、縮小、阻止或穩(wěn)定住疾病的發(fā)展或進(jìn)展。在本發(fā)明中，本發(fā)明多肽的施用可以用于治療年齡相關(guān)性病狀和代謝病癥，所述年齡相關(guān)性病狀包括少肌癥、皮膚萎縮、肌肉消瘦、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、免疫機(jī)能不全、高血壓、癡呆、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性、前列腺癌、中風(fēng)、預(yù)期壽命減少、記憶喪失、皺紋、腎功能受損和年齡相關(guān)性聽力損失；所述代謝病癥包括II型糖尿病、代謝綜合征、高血糖癥和肥胖。如本文所使用的，“預(yù)防”應(yīng)指在受試者中減少病癥的發(fā)生或減少獲得病癥或其相關(guān)癥狀的危險。在本發(fā)明中，本發(fā)明的多肽的施用可以用于預(yù)防年齡相關(guān)性病狀和代謝病癥，所述年齡相關(guān)性病狀包括少肌癥、皮膚萎縮、肌肉消瘦、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、免疫機(jī)能不全、高血壓、癡呆、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性、前列腺癌、中風(fēng)、預(yù)期壽命減少、記憶喪失、皺紋、腎功能受損和年齡相關(guān)性聽力損失；所述代謝病癥包括II型糖尿病、代謝綜合征、高血糖癥和肥胖。預(yù)防可以是完全的，例如年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥的完全不存在。預(yù)防還可以是部分的，從而使得受試者中年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥發(fā)生的可能性比未接受本發(fā)明的受試者較不可能發(fā)生。如本文所使用的，“疾病”應(yīng)意指損害或干擾細(xì)胞、組織或器官的正常功能的任何病狀或病癥。如本文所使用的，“年齡相關(guān)性病狀”應(yīng)意指其在群體中的發(fā)病率或在個體中的嚴(yán)重度與年齡進(jìn)展相關(guān)的任何疾病或病癥。在一個實(shí)施方案中，年齡相關(guān)性病狀是指在超過100,000個個體的所選擇群體中相對于30-40歲的人類個體而言在60歲以上人類個體中發(fā)病率高至少1.5倍的疾病或病癥。與本發(fā)明有關(guān)的年齡相關(guān)性病狀包括但不限于，少肌癥、皮膚萎縮、肌肉消瘦、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、免疫機(jī)能不全、高血壓、癡呆、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性、前列腺癌、中風(fēng)、預(yù)期壽命減少、記憶喪失、皺紋、腎功能受損和年齡相關(guān)性聽力損失。如本文所使用的，“代謝病癥”應(yīng)意指通過影響細(xì)胞中的能量產(chǎn)生或毒素在細(xì)胞、組織、器官或個體中的累積而損害或干擾細(xì)胞、組織或器官的正常功能的任何疾病或病癥。與本發(fā)明有關(guān)的代謝病癥包括但不限于，II型糖尿病、代謝綜合征、高血糖癥和肥胖?！坝行┝俊被颉坝行Я俊笔亲阋詫?shí)現(xiàn)有利或所需臨床結(jié)果的量。在本發(fā)明中，這是有效產(chǎn)生預(yù)期藥理學(xué)、治療或預(yù)防結(jié)果的Klotho融合多肽或SKlotho的量。治療有效劑量導(dǎo)致病癥(例如，年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥)或病癥的一種或多種癥狀的預(yù)防或改善。治療有效劑量將依賴于待治療的受試者和疾病病狀、受試者的重量和年齡、疾病病狀的嚴(yán)重度、施用方式等而改變，并可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。如本文所使用的，“Klotho核酸分子”是編碼Klotho蛋白的基因。示例性人Klotho基因在GenBank登記號NM_004795(SEQIDNO1)提供。如本文所使用的，“片段”指多肽或核酸分子的部分。這個部分優(yōu)選包含參考核酸分子或多肽的完整長度的至少10%、20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或更多。片段可以包含10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000個或高達(dá)3000個核苷酸或氨基酸。術(shù)語“基本上相同”指與參考氨基酸序列(例如，本文描述的任何一個氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文描述的任何一個核酸序列)顯示出至少50%相同的多肽或核酸分子。優(yōu)選地，此類序列在氨基酸或核酸水平上與用于比較的序列至少60%、70%、75%、80%或85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%或更多相同。本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療年齡相關(guān)性病狀和代謝病癥的方法、試劑盒和組合物。本發(fā)明提供了具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的融合多肽。在某些實(shí)施方案中，融合多肽進(jìn)一步包括成纖維細(xì)胞生長因子或其活性片段。Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以源自α或βKlotho同種型。此外，盡管Klotho融合多肽的FGF組分主要參考成纖維細(xì)胞生長因子-19、成纖維細(xì)胞生長因子-21和成纖維細(xì)胞生長因子-23進(jìn)行描述，但可以想到，23種已知FGFs中的任何一種或其活性片段都可以用于實(shí)踐本發(fā)明。Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以包括Klotho蛋白質(zhì)的KL-Dl和KL-D2結(jié)構(gòu)域中的一個或兩個。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的Klotho融合多肽具有至少2個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域。例如，2個細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域可以是串聯(lián)重復(fù)的2個KL-Dl結(jié)構(gòu)域、串聯(lián)重復(fù)的2個KL-D2結(jié)構(gòu)域、或1個KL-Dl結(jié)構(gòu)域和1個KL-D2結(jié)構(gòu)域。Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子(或其活性片段)可以以各種方向和方式彼此可操作地連接。例如，Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域可以與成纖維細(xì)胞生長因子的N末端可操作地連接，或備選地成纖維細(xì)胞生長因子可以與該至少一個Klotho蛋白質(zhì)細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的N末端可操作地連接。本發(fā)明的融合多肽可以包括Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，即KL-Dl(SEQIDNO5)和KL-D2(SEQIDNO6),中的一個或兩個。KL-Dl和KL-D2分別對應(yīng)于全長αKlotho多肽(SEQIDNO2)的氨基酸殘基58-506和517-953，以及全長βKlotho多肽(SEQIDNO:4)的氨基酸殘基77-508和571-967，并且它們適用于本發(fā)明。Klotho融合多肽可以具有αKlotho多肽或βKlotho多肽的KL-Dl結(jié)構(gòu)域，其中所述αKlotho多肽的KL-Dl結(jié)構(gòu)域具有與SEQIDNO5的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，所述βKlotho多肽的KL-Dl結(jié)構(gòu)域具有與SEQIDNO37的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。特別地，Klotho融合多肽可以具有與SEQIDNO5或SEQIDNO37至少70%、75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多相同的氨基酸序列。Klotho融合多肽可以具有αKlotho多肽或βKlotho多肽的KL-D2結(jié)構(gòu)域，其中所述αKlotho多肽的KL-D2結(jié)構(gòu)域具有與SEQIDNO:6的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，所述βKlotho多肽的KL-D2結(jié)構(gòu)域具有與SEQIDNO38的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。特別地，Klotho融合多肽可以具有分別與SEQIDNO6或SEQIDNO38至少70%、75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多相同的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的Klotho融合多肽是可溶的，并且能夠與FGF受體纟口口。本發(fā)明的Klotho融合多肽可以包含多肽接頭，其使具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽和成纖維細(xì)胞生長因子連接。合適的接頭是本領(lǐng)域眾所周知的并且一般包含幾個Gly和幾個Ser殘基，例如(Gly4Ser)3(SEQIDNO11)、Gly4Ser多肽(SEQIDNO:12)、Gly(SEQIDNO13)、GlyGly(SEQIDNO14)、GlySer(SEQIDNO15)、Gly2Ser(SEQIDNO16)、Ala(SEQIDNO17)和AlaAla(SEQIDNO:18)。在某些實(shí)施方案中，接頭將具有SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17或SEQIDNO:18之任何一個所示的氨基酸序列的至少2個至高達(dá)約30個重復(fù)。當(dāng)多肽接頭存在于本發(fā)明的Klotho融合多肽中時，具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽可以通過肽鍵與接頭多肽的N末端連接，而FGF通過肽鍵與多肽接頭的C末端連接。備選地，F(xiàn)GF可以通過肽鍵與接頭多肽的N末端連接，而具有至少一個Klotho細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽通過肽鍵與多肽接頭的C末端連接?；瘜W(xué)接頭也可以用于使此2個多肽連接。本發(fā)明的Klotho融合多肽可以包括信號肽?？梢杂糜谂cKlotho融合多肽一起使用的示例性信號肽包括但不限于Klotho信號肽(SEQIDNO8)和IgG信號肽(SEQIDNO9)。4.1.Klotho和成纖維細(xì)胞生長因子多肽本發(fā)明的Klotho融合多肽預(yù)期顯示出與天然FGF相當(dāng)?shù)纳锘钚?，例如與FGF受體結(jié)合、和誘導(dǎo)FGF受體、FRS2(FGF受體底物2)和ERK1/2(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)激酶1/2)的磷酸化以及激活Egr-I(早期生長應(yīng)答蛋白-1)基因。FGF是結(jié)合FGF16受體的分泌型肽生長因子。FGF的氨基酸和核酸序列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是可容易獲得的。例如，示例性FGF19、FGF21和FGF23核苷酸序列可以分別見于GenBank數(shù)據(jù)庫登記號NM_005117、NM_019113和NM_020638，以及本文中的SEQIDNOs30、32和34。示例性FGF19、FGF21和FGF23氨基酸序列可以分別見于GenBank數(shù)據(jù)庫登記號NP_005108、NP_061986和NP_065689，以及在本文中SEQIDNOs31、33和35。此夕卜，F(xiàn)GF可以包括幫助該蛋白質(zhì)表達(dá)的一個或多個改變，例如FGF23(R179Q)變體(SEQIDNO36)。Klotho蛋白質(zhì)是具有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和短細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的130kDa單次跨膜的I型跨膜蛋白質(zhì)。Klotho的氨基酸和核酸序列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是可容易獲得的。例如，示例性的α-Klotho和β-Klotho核苷酸序列可以分別見于GenBank數(shù)據(jù)庫登記號ΝΜ_004795和ΝΜ_175737，以及本文中SEQIDNOs7和8。示例性的α-Klotho和β-Klotho氨基酸序列可以分別見于GenBank數(shù)據(jù)庫登記號ΝΡ_004786和ΝΡ_783864，以及本文中SEQIDNOs2禾口4。本發(fā)明的Klotho融合多肽可以與成纖維細(xì)胞生長因子受體結(jié)合，并且具有與成纖維細(xì)胞生長因子-19(SEQIDNO:31)、成纖維細(xì)胞生長因子-21(SEQIDNO33)、成纖維細(xì)胞生長因子-23(SEQIDNO35)或其變體(包括成纖維細(xì)胞生長因子_23變體(R179Q)(SEQIDNO36))可操作地連接的α-Klotho或β-Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。特別地，本發(fā)明的Klotho融合多肽可以包括與成纖維細(xì)胞生長因子-23(SEQIDNO35)或成纖維細(xì)胞生長因子-23變體(R179Q)(SEQIDNO36)可操作地偶聯(lián)的α-Klotho(SEQIDNO2)。此外，本發(fā)明的Klotho融合多肽可以具有與成纖維細(xì)胞生長因子-19(SEQIDNO31)可操作地偶聯(lián)的β-Klotho(SEQIDNO4)。本發(fā)明的Klotho融合多肽可以包括與成纖維細(xì)胞生長因子-21(SEQIDNO33)可操作地偶聯(lián)的β-Klotho(SEQIDNO4)。本發(fā)明包括各種Klotho和FGF基因的同源物以及由這些基因編碼的蛋白質(zhì)。就基因而言，“同源物”指與至少部分的基因基本上相同的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈或其部分，前提是該核苷酸序列編碼與作為其同源物的基因所編碼的蛋白質(zhì)具有基本上相同的活性/功能的蛋白質(zhì)。通過推定的同源物的氨基酸或核苷酸序列和本文所描述的基因或其編碼的蛋白質(zhì)的序列(例如，編碼Klotho和FGF的基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈)之間的同一性百分比，可以鑒定本文描述的基因的同源物。同一性百分比可以例如通過目視檢查或通過使用本領(lǐng)域已知或如本文所描述的各種計算機(jī)程序來確定。序列同一性一般使用序列分析軟件(例如，SequenceAnalysisSoftwarePackageoftheGeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,1710UniversityAvenue,Madison,Wis.53705,BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)進(jìn)行測量。此類軟件通過對各種置換、缺失和/或其他修飾分配同源性程度來匹配相同或相似序列。保守置換一般包括在下述組內(nèi)的置換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在確定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中在e_3和ε"100之間的概率得分指示緊密相關(guān)的序列。如本文所使用的，術(shù)語“同源”和“同源的”不限于命名具有理論共同遺傳祖先的蛋白質(zhì)，而是包括可以在遺傳上無關(guān)的但是已經(jīng)經(jīng)過進(jìn)化而執(zhí)行相似功能和/或具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。與本文描述的各種蛋白質(zhì)功能同源，也涵蓋這樣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有其所同源于的相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性。對于具有功能同源性的蛋白質(zhì)，不要求它們在其氨基酸序列上具有顯著同一性，而是通過具有相似或相同活性來如此定義具有功能同源性的蛋白質(zhì)。例如，就Klotho分子而言，該多肽應(yīng)具有與FGF多肽結(jié)合的功能特征并能夠使FGF與FGFR結(jié)合。就FGF分子而言，該多肽應(yīng)具有與FGFR結(jié)合和引起FGFR激活(例如，磷酸化)的功能特征。用于評估FGF與FGF受體的結(jié)合和/或FGF信號途徑的激活的測定法是本領(lǐng)域已知的且在本文中描述(參見實(shí)施例2)。用于評估Klotho活性的測定法也是本領(lǐng)域已知的且在本文中描述(例如，與FGF多肽結(jié)合)。具有結(jié)構(gòu)同源性的蛋白質(zhì)被定義為具有類似的三級(或四級)結(jié)構(gòu)，并且不必要求氨基酸同一性或編碼其的基因的核酸同一性。在某些情況下，結(jié)構(gòu)同源物可以包括這樣的蛋白質(zhì)，其僅在蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)或結(jié)合位點(diǎn)處維持結(jié)構(gòu)同源性。除結(jié)構(gòu)和功能同源性外，本發(fā)明還包括與本文描述的各種Klotho和FGF氨基酸序列具有氨基酸同一性的蛋白質(zhì)。為了確定2個氨基酸序列的同一性/同源性百分比，序列就最佳比較目的進(jìn)行比對(例如，可以在一個蛋白質(zhì)的氨基酸序列中引入空位以便與另一個蛋白質(zhì)的氨基酸序列最佳對齊)。隨后比較在相應(yīng)氨基酸位置處的氨基酸殘基。當(dāng)一個序列的一個位置與另一個序列中的相應(yīng)位置由相同的氨基酸殘基占據(jù)時，那么這兩個分子在那個位置處是相同的。2個序列之間的同一性百分比是由這些序列共享的相同位置數(shù)目的函數(shù)(即，同一性％=相同位置數(shù)/位置總數(shù)乘以100)。本文描述的本發(fā)明分子的氨基酸序列具有這樣的氨基酸序列，其與本文描述的氨基酸序列至少約60%、70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多相同或同源。本文描述的本發(fā)明分子的核酸序列具有這樣的核苷酸序列，其與本文描述的核苷酸序列雜交或至少約60%、70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多相同或同源。對于在本發(fā)明的融合多肽中使用合適的核酸分子，可以具有這樣的Klotho或FGF核苷酸序列，該核苷酸序列在嚴(yán)格條件下分別與編碼Klotho或FGF的核酸分子的互補(bǔ)物雜交。如本文所使用的，術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”意欲描述用于雜交和洗滌的條件，在該條件下彼此至少約70%、80%,85%,90%或更多同源的核苷酸序列一般保持彼此雜交。此類嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以在Ausubel等人CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyInterscienceNewYork(2001)，6.3.1-6.3.6中發(fā)現(xiàn)。嚴(yán)格雜交條件的一個具體的非限制性例子是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45°C雜交，隨后為在0.2XSSC、0.1%SDS中在55-65°C進(jìn)行一次或多次洗滌。4.2.本發(fā)明的Klotho-FGF融合多肽在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，Klotho融合多肽具有這樣的多肽鏈，所述多肽鏈具有第一多肽序列和第二多肽序列，第一多肽序列是Klotho多肽或其活性片段，第二多肽序列編碼FGF或其活性片段。本發(fā)明包括與SEQIDNO19_28所示氨基酸序列至少約95%或更多同源的融合多肽。SEQIDNO:19的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與FGF23(R179Q)變體(SEQIDNO36)N末端連接的Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO20的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與缺乏信號肽的Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域N末端連接的IgG信號肽，所述Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與FGF23(R179Q)變體N末端連接。SEQIDNO21的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與FGF23(R179Q)變體N末端連接的KL-Dl細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO22的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與FGF23(R179Q)變體N末端連接的KL-D2細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO23的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與FGF23(R179Q)變體N末端連接的2個KL-Dl細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO24的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與FGF23(R179Q)變體N末端連接的2個KL-D2細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO25的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域N末端連接的FGF23(R179Q)變體。SEQIDNO26的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與KL-Dl細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域N末端連接的FGF23(R179Q)變體。SEQIDNO27的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與KL-D2細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域N末端連接的FGF23(R179Q)變體。SEQIDNO:28的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與2個KL-Dl細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域N末端連接的FGF23(R179Q)變體。SEQIDNO29的氨基酸序列編碼Klotho融合多肽，其具有與2個KL-D2細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域N末端連接的FGF23(R179Q)變體。本發(fā)明的Klotho融合多肽可以包括與SEQIDNO7中所示的氨基酸序列至少約95%相同的氨基酸序列。SEQIDNO7的氨基酸序列編碼缺乏信號肽的Klotho細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。主題融合蛋白在本文中描述，并且可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備。例如，本發(fā)明的融合多肽可以如美國專利號6,194,177中所述進(jìn)行構(gòu)建。Klotho多肽的用途在美國專利號6,579,850中描述。FGF核酸分子的用途在美國專利號7,223,563中描述。在某些實(shí)施方案中，編碼Klotho的核酸分子通過PCR進(jìn)行克隆，并且與編碼FGF的核酸分子在讀框內(nèi)連接。編碼Klotho-FGF融合多肽的核酸與啟動子可操作地連接，以允許表達(dá)。隨后將編碼融合多肽的核酸分子轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)用于表達(dá)。最終構(gòu)建體的序列可以通過測序加以證實(shí)。當(dāng)制備本發(fā)明的融合蛋白時，可以將編碼Klotho的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的核酸分子在讀框內(nèi)與編碼FGF的核酸分子融合。所得到的核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致與FGF多肽N末端融合的Klotho細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域。其中Klotho的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域與FGF多肽C末端融合的融合物也是可以的。用于制備融合蛋白的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明的融合多肽具有共價連接的至少2個多肽，其中一個多肽來自一個蛋白質(zhì)序列或結(jié)構(gòu)域，例如Klotho，并且另一個多肽來自另一個蛋白質(zhì)序列或結(jié)構(gòu)域，例如FGF0本發(fā)明的融合多肽的Klotho和FGF可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法進(jìn)行連接。這些方法包括化學(xué)和重組方法。編碼待摻入本發(fā)明融合多肽內(nèi)的結(jié)構(gòu)域的核酸可以使用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)獲得。公開了可以在本發(fā)明中使用的一般方法的基本教科書包括Sambrook禾口Russell,MolecularCloning,ALaboratoryManual(第3版2001)；Kriegler,GeneTransferandExpressionALaboratoryManual(1990)；禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等人，編輯，1994-1999)。在編碼本發(fā)明的Klotho融合多肽的核酸中，19可以使用分別由SEQIDNO1和SEQIDNO3表示的編碼α-Klotho或β-Klotho的核酸序列。在編碼Klotho融合多肽的核酸中，可以使用分別由SEQIDNO30、SEQIDNO32和SEQIDNO34表示的編碼FGF19、FGF21或FGF23的核酸序列。本文描述的本發(fā)明分子的核酸序列可以包含這樣的核苷酸序列，其與SEQIDNO:1、SEQIDNO3、SEQIDNO30、SEQIDNO32或SEQIDNO34雜交或至少約60%、70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多相同或同源。編碼Klotho和FGF肽的核酸序列可以使用各種方法獲得。例如，編碼這些多肽的核酸序列可以通過用探針雜交從cDNA和基因組DNA文庫中克隆，或使用擴(kuò)增技術(shù)和寡核苷酸引物進(jìn)行分離。更通常地，使用DNA或RNA模板，通過擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增和分離Klotho和FGF序列(參見例如，Dieffenfach&Dveksler,PCRPrimersALaboratoryManual(1995))0備選地，可以合成產(chǎn)生重疊寡核苷酸且連接以產(chǎn)生一個或多個結(jié)構(gòu)域。編碼Klotho或FGF的核酸還可以使用抗體作為探針從表達(dá)文庫中分離。根據(jù)本發(fā)明，Klotho和FGF可以直接或經(jīng)由共價接頭進(jìn)行連接，所述共價接頭包括氨基酸接頭，例如多甘氨酸接頭，或另一類化學(xué)接頭，包括碳水化合物接頭、脂質(zhì)接頭、脂肪酸接頭、聚醚接頭例如PEG等(參見例如，Hermanson，Bioconjugatetechniques(1996))。形成融合物/融合多肽的多肽一般是C末端與N末端連接的，但它們也可以是C末端與C末端、N末端與N末端、或N末端與C末端連接的。可以在本發(fā)明融合多肽的內(nèi)部位置插入一個或多個多肽結(jié)構(gòu)域。融合蛋白的多肽可以具有任何次序?？梢酝ㄟ^制備連續(xù)編碼融合蛋白的重組多核苷酸，將來自一個蛋白質(zhì)序列的氨基酸鏈(例如Klotho的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域)與來自另一個蛋白質(zhì)序列的氨基酸鏈(例如FGF)共價連接，而產(chǎn)生融合多肽。融合蛋白中的不同氨基酸鏈可以直接拼接在一起，或可以經(jīng)由化學(xué)連接基團(tuán)或氨基酸連接基團(tuán)而間接拼接在一起。氨基酸連接基團(tuán)可以是長度約200個氨基酸或更多，或一般是1-100個氨基酸。在某些實(shí)施方案中，將脯氨酸殘基摻入接頭內(nèi)，以防止接頭形成顯著的二級結(jié)構(gòu)元件。接頭通?？梢允侨嵝园被嶙有蛄校渥鳛橹亟M融合蛋白的一部分合成。此類柔性接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。根據(jù)本發(fā)明，Klotho的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域或其片段的氨基酸序列可以經(jīng)由肽接頭與FGF連接。示例性肽接頭是本領(lǐng)域眾所周知的且在本文中描述。例如，肽接頭一般包括幾個Gly和幾個Ser殘基，例如(Gly4Ser)3(SEQIDNO11)、Gly4Ser多肽(SEQIDNO12)、Gly(SEQIDNO13)、GlyGly(SEQIDNO14)、GlySer(SEQIDNO15)、Gly2Ser(SEQIDNO16),Ala(SEQIDNO17)和AlaAla(SEQIDNO18)。特別地，用于在本發(fā)明的融合蛋白中使用的肽接頭可以充當(dāng)柔性鉸鏈。在將Klotho摻入本發(fā)明的融合蛋白內(nèi)之前，可以排除Klotho或FGF的信號序列。本發(fā)明融合蛋白的Klotho或FGF可以包括信號序列，例如由SEQIDNO:19表示的多肽。然而，這些序列也可以省略且由不同蛋白質(zhì)的信號序列，例如IgG信號序列(SEQIDNO9)替換。一般地，本發(fā)明的藥物組合物將包含成熟形式的Klotho和FGF。一般地，在摻入融合多肽內(nèi)之前，從Klotho或FGF結(jié)構(gòu)部分之一或兩者中排除內(nèi)含子。本發(fā)明的融合多肽可以包括與一個或多個反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈共價附著的一個或多個聚合物。作為非限制性例子，此類聚合物包括聚乙二醇(PEG)，其可以附著于一個20或多個游離半胱氨酸巰基殘基上，從而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)暴露于氧化條件時，阻斷二硫鍵的形成和聚集。此外，預(yù)期本發(fā)明的融合多肽的PEG化可以提供改善的性質(zhì)，如增加的半衰期、可溶性和蛋白酶抗性。本發(fā)明的融合多肽可以備選地通過在游離氨基基團(tuán)上共價添加聚合物而進(jìn)行修飾，所述游離氨基基團(tuán)例如賴氨酸ε氨基或N末端氨基。用于共價修飾的優(yōu)選半胱氨酸和賴氨酸將是不涉及受體結(jié)合、肝素結(jié)合或正確蛋白質(zhì)折疊的那些。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以采用測定融合多肽的生物化學(xué)和/或生物活性的方法，確定特定氨基酸殘基的修飾是否影響所需的蛋白質(zhì)活性。其他相似的合適修飾也可以考慮且是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明還涉及融合多肽的表達(dá)，所述融合多肽與SEQIDNO:19-28中所示氨基酸序列至少約95%或更多同源。4.3.本發(fā)明的融合多肽的表達(dá)為了表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白，可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，將利用本文描述或本領(lǐng)域已知的任何方法獲得的DNA分子插入合適的表達(dá)載體內(nèi)。例如，可以通過同聚物加尾或通過涉及使用合成DNA接頭的限制性酶連接或通過平端連接，將雙鏈CDNA克隆到合適的載體內(nèi)。DNA連接酶通常用于連接DNA分子，并且通過用堿性磷酸酶處理可以避免不希望有的連接。因此，本發(fā)明包括載體(例如，重組質(zhì)粒和噬菌體)，其包括如本文所描述的核酸分子(例如，基因或編碼基因的重組核酸分子)。術(shù)語“重組載體”包括載體(例如，質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、病毒、粘粒、F粘粒(fosmid)或其他純化的核酸載體)，其已經(jīng)經(jīng)過改變、修飾或改造以致于與重組載體所源自的原來的或天然的核酸分子相比包含較多、較少或不同的核酸序列。例如，重組載體可以包括編碼與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的編碼Klotho-FGF23融合物的核苷酸序列，所述調(diào)節(jié)序列是例如啟動子序列、終止序列和/或人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBSs)(如本文所定義)。允許包括于其中的基因或核酸表達(dá)的重組載體被稱為“表達(dá)載體”。對于真核宿主，基于宿主的性質(zhì)，可以采用不同的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列。它們可以衍生自病毒來源，例如腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、猿猴病毒等，在所述來源中這些調(diào)節(jié)信號與具有高表達(dá)水平的特定基因連接。例子包括但不限于，皰疹病毒的TK啟動子、SV40早期啟動子、酵母gal4基因啟動子等?？梢赃x擇允許阻遏或激活的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)信號，從而使得可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在本文描述的某些本發(fā)明分子中，具有編碼融合多肽的一條或多條多肽鏈的核苷酸序列的一個或多個DNA分子與一個或多個調(diào)節(jié)序列可操作地連接，所述調(diào)節(jié)序列能夠使該所需DNA分子整合到宿主細(xì)胞內(nèi)。可以例如通過引入允許選擇包含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的一種或多種標(biāo)記，選擇已被引入的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞?？蛇x標(biāo)記基因可以與待表達(dá)的核酸序列直接連接，或可以通過共轉(zhuǎn)染引入相同細(xì)胞內(nèi)。為了最佳地合成本文所述的蛋白質(zhì)，也可能需要另外的元件。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明了使用哪些另外的元件。在特定質(zhì)?；虿《据d體的選擇中，重要的因素包括但不限于，從不包含載體的那些受體細(xì)胞中識別且選擇出包含載體的受體細(xì)胞的容易性；在特定宿主中所需的載體的拷貝數(shù)；和是否希望能夠使載體在不同物種的宿主細(xì)胞之間“穿梭”。一旦構(gòu)建了(一種或多種)載體以包括用于表達(dá)的DNA序列后，可以通過本領(lǐng)域已知的各種合適方法中的一種或多種將載體引入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)，所述方法包括但不限于，例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等。宿主細(xì)胞可以是原核或真核的。真核宿主細(xì)胞的例子包括例如，哺乳動物細(xì)胞，例如人、猴、小鼠和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。此類細(xì)胞利于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，包括例如正確折疊或糖基化。此外，酵母細(xì)胞也可以用于表達(dá)本發(fā)明的融合多肽。如同大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞，酵母細(xì)胞也能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，包括例如糖基化。存在利用強(qiáng)啟動子序列和高拷貝數(shù)質(zhì)粒的許多重組DNA策略，其可以用于在酵母中生產(chǎn)蛋白質(zhì)。酵母轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器可以識別在克隆的哺乳動物基因產(chǎn)物上的引導(dǎo)序列，從而使得具有引導(dǎo)序列的肽(即，前肽)可以分泌。高產(chǎn)量生產(chǎn)本發(fā)明融合多肽的一個特別優(yōu)選方法是利用在DHFR缺陷CHO細(xì)胞中通過相繼增加水平的氨甲蝶呤實(shí)現(xiàn)的二氫葉酸還原酶(DHFR)擴(kuò)增(如美國專利號4,889,803中的描述)。所獲得的多肽可以為糖基化形式。在引入一種或多種載體后，宿主細(xì)胞通常在選擇培養(yǎng)基中生長，所述選擇培養(yǎng)基選擇性導(dǎo)致包含載體的細(xì)胞的生長。重組蛋白質(zhì)的純化可以通過本領(lǐng)域已知或本文描述的任何方法進(jìn)行，例如涉及提取、沉淀、色譜和電泳的任何常規(guī)操作。可以用于純化蛋白質(zhì)的其它純化操作是使用結(jié)合靶蛋白質(zhì)的單克隆抗體的親和色譜法。一般地，使包含重組蛋白質(zhì)的粗制品流過在其上固定了合適單克隆抗體的柱。蛋白質(zhì)通常通過該特異性抗體與柱結(jié)合，而雜質(zhì)則流過。在洗滌柱后，可以例如通過改變pH或離子強(qiáng)度從凝膠中洗脫蛋白質(zhì)。4.4.用于評估融合多肽活性的測定法本文描述的測定法(參見實(shí)施例2)和本領(lǐng)域已知的那些測定法可以用于檢測本發(fā)明的融合多肽的Klotho或FGF活性。合適的活性測定法包括受體結(jié)合測定法、細(xì)胞增殖測定法和細(xì)胞信號測定法。例如，可以用于測定融合多肽是否具有Klotho或FGF活性的結(jié)合測定法包括測定融合多肽與FGF受體的結(jié)合。FGF受體結(jié)合測定法包括但不限于競爭和非競爭測定法。例如，F(xiàn)GF受體結(jié)合可以這樣進(jìn)行檢測使表達(dá)FGF受體的細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的FGF(例如，放射性標(biāo)記)接觸，和增加未經(jīng)標(biāo)記的Klotho-FGF融合多肽的濃度。將競爭與相同受體結(jié)合的該2種配體加入包含細(xì)胞的反應(yīng)混合物中。隨后洗滌細(xì)胞且測量經(jīng)標(biāo)記的FGF。在未經(jīng)標(biāo)記的融合多肽的存在下，經(jīng)標(biāo)記的FGF與其受體的結(jié)合量的減少指示Klotho-FGF融合多肽與該受體結(jié)合。備選地，可以標(biāo)記Klotho-FGF融合多肽，并且檢測融合多肽與細(xì)胞的直接結(jié)合。Klotho或FGF活性也可以通過測定融合多肽是否誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行測量。例如，在某些實(shí)施方案中，用于檢測Klotho-FGF融合多肽的生物活性的測定法涉及使表達(dá)FGF受體的細(xì)胞與融合多肽接觸，測定細(xì)胞應(yīng)答，例如細(xì)胞增殖或Egr-I激活、C2C12細(xì)胞中的肌管直徑，和比較在融合多肽的存在和不存在下的細(xì)胞應(yīng)答。相對于不存在時，融合多肽復(fù)合物存在下細(xì)胞應(yīng)答的增加指示融合多肽具有生物活性。此外，還可以測量受體下游的信號事件的增加，用于指示生物活性(例如，F(xiàn)GFR、FRS2、ERK1/2、p70S6K等的磷酸化)。4.5藥物組合物和治療方法本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的一種或多種融合多肽和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體的藥物組合物。藥物組合物可以進(jìn)一步包括藥學(xué)有效劑量的肝素。此類藥物組合物可以包括在試劑盒或容器中。此類試劑盒或容器可以與關(guān)于融合多肽延長的體內(nèi)半衰期或體外保存期的說明書包裝在一起。任選地與此類試劑盒或容器(一個或多個)組合在一起的可以是具有管理藥物或生物制品的制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的格式的通知，所述通知反映已經(jīng)從該機(jī)構(gòu)獲得了制造、使用或銷售用于人施用的批準(zhǔn)。通過給患者施用藥物組合物，此類組合物可以用于治療、預(yù)防或改善患者(優(yōu)選哺乳動物且最優(yōu)選人)中的疾病或疾病癥狀(例如，年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥)的方法中。一般而言，本發(fā)明的藥物組合物的治療有效量是約0.0001mg/kg-0.001mg/kg;0.001mg/kg-約10mg/kg體重或約0.02mg/kg-約5mg/kg體重。通常，融合多肽的治療有效量是例如約O.OOlmg-約O.Olmg、約O.Olmg-約100mg、或約IOOmg-約lOOOrng。優(yōu)選地，融合多肽的治療有效量是約0.001mg/kg-2mg/kg。關(guān)于融合多肽的最佳藥物制劑可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員依賴于施用途徑和所需劑量來決定。(參見例如Remington”sPharmaceuticalSciences，第I8版(1"0)，MackPublishingCo.,Easton,Pa.,其完整內(nèi)容在此引入作為參考)。本發(fā)明的融合多肽可以作為藥物組合物施用，所述藥物組合物可以為固體、液體或氣體(氣溶膠)的形式。一般的施用途徑可以包括但不限于，經(jīng)口、局部、腸胃外、舌下、直腸、陰道、皮內(nèi)和鼻內(nèi)。腸胃外施用包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。優(yōu)選地，腸胃外施用組合物。更優(yōu)選地，靜脈內(nèi)施用組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)行配制，以便允許在給受試者施用組合物后本發(fā)明的多肽是生物可利用的。組合物可以采取一個或多個劑量單位的形式，其中例如，片劑可以是單個劑量單位，而氣溶膠形式的本發(fā)明多肽的容器可以容納多個劑量單位。在制備藥物組合物時使用的材料在所使用的量上可以是無毒的。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，藥物組合物中活性成分(一種或多種)的最佳劑量將依賴于各種因素。相關(guān)因素包括但不限于，受試者類型(例如，人)、受試者的總體健康、需要治療的受試者的年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥的類型、組合物作為多藥物方案的一部分使用、本發(fā)明多肽的具體形式、施用方式和所采用的組合物。藥學(xué)上可接受的載體或媒介物可以是顆粒，從而組合物可以是例如片劑或粉劑形式。載體(一種或多種)可以是液體，其中組合物可以是例如經(jīng)口糖漿劑或可注射液體。此外，載體(一種或多種)可以是氣態(tài)的，以便提供在例如吸入施用中有用的氣溶膠組合物。術(shù)語“載體”指與本發(fā)明的多肽一起施用的稀釋劑、助劑或賦形劑。此類藥學(xué)載體可以是液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成起源的那些油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。載體可以是鹽水、阿拉伯樹膠、明膠、淀粉糊、滑石、角蛋白、膠態(tài)二氧化硅、尿素等。此外，可以使用輔助、穩(wěn)定、增稠、潤滑和著色劑。在一個實(shí)施方案中，當(dāng)施用于受試者時，本發(fā)明的多肽和藥學(xué)上可接受的載體是無菌的。當(dāng)靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的多肽時，水是優(yōu)選載體。鹽水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液體載體，特別對于可注射溶液。合適的藥學(xué)載體還包括賦形劑，例如淀23粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇等。需要時，本發(fā)明組合物還可以包含少量濕潤或乳化劑、或pH緩沖劑。組合物可以旨在用于經(jīng)口施用，并且如果這樣的話，那么組合物優(yōu)選為固體或液體形式，其中半固體、半液體、懸浮液和凝膠形式包括在此處考慮為固體或液體的形式內(nèi)。作為口服施用的固體組合物，組合物可以配制成粉劑、粒劑、壓縮片、丸劑、膠囊、咀嚼片、糯米紙囊劑等形式。此類固體組合物一般包含一種或多種惰性稀釋劑。此外，可以存在下述中的一種或多種粘合劑例如乙基纖維素、羧甲基纖維素、微晶纖維素或明膠；賦形劑例如淀粉、乳糖或糊精，崩解劑例如海藻酸、海藻酸鈉、PrimogeL玉米淀粉等；潤滑劑例如硬脂酸鎂或Sterotex；助流劑例如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑例如蔗糖或糖精，調(diào)味劑例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味料，和著色劑。當(dāng)藥物組合物為膠囊例如明膠膠囊的形式時，除上述類型的材料外，它還可以包含液體載體例如聚乙二醇、環(huán)糊精或脂肪油。藥物組合物可以為液體的形式，例如酏劑、糖漿劑、溶液、乳狀液或懸浮液。液體可以用于經(jīng)口施用或用于通過注射遞送。當(dāng)預(yù)期用于經(jīng)口施用時，組合物可以包含甜味劑、防腐劑、染料/色素和增味劑中的一種或多種。在用于通過注射施用的組合物中，還可以包括表面活性劑、防腐劑、濕潤劑、分散劑、懸浮劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑和等滲劑中的一種或多種。本發(fā)明的液體組合物，無論它們是溶液、懸浮液還是其他類似形式，還可以包括下述中的一種或多種無菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液，優(yōu)選生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉、可以充當(dāng)溶劑或懸浮介質(zhì)的不揮發(fā)性油例如合成的甘油單或二酯、聚乙二醇、丙三醇、環(huán)糊精、丙二醇或其他溶劑；抗細(xì)菌劑例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用于調(diào)節(jié)張力的試劑例如氯化鈉或右旋糖。腸胃外組合物可以封裝在由玻璃、塑料或其他材料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水是優(yōu)選助劑。可注射組合物優(yōu)選是無菌的。藥物組合物包含本發(fā)明的化合物(例如，融合多肽)的有效量，從而使得可以獲得合適劑量。藥物組合物可以包含目前針對相應(yīng)病癥所處方的化合物的已知有效量。在有效預(yù)防、治療和/或控制年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥的預(yù)防和/或治療方案中使用時，本發(fā)明多肽的施用途徑可以基于本領(lǐng)域已知的其他治療劑的目前處方施用途徑。本發(fā)明的多肽可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或推注(bolusinjection)、通過經(jīng)由上皮或皮膚與粘膜襯里(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收。施用可以是全身或局部的。各種遞送系統(tǒng)是已知的，例如微粒、微膠囊、膠囊等，并且可以用于施用本發(fā)明的多肽?？梢越o受試者施用一種以上的本發(fā)明多肽。施用方法可以包括但不限于，經(jīng)口施用和腸胃外施用；腸胃外施用包括但不限于，皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、舌下、鼻內(nèi)、大腦內(nèi)、心室內(nèi)、鞘內(nèi)、陰道內(nèi)、透皮、經(jīng)直腸、吸入、或局部地施用于耳、鼻、眼或皮膚。可以腸胃外施用本發(fā)明的多肽。特別地，可以靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的多肽。還可以采用肺施用，例如使用吸入器或霧化器，以及用霧化試劑的制劑，或在碳氟化合物或合成的肺表面活性劑中灌注。本發(fā)明的多肽還可以用常規(guī)粘合劑和載體例如甘油三酯配制為栓劑。本發(fā)明的多肽可以在控制釋放系統(tǒng)中遞送。例如，可以使用泵(參見Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.1987，14，201；Buchwald等人，Surgery1980，88507；Saudek等人，N.Engl.J.Med.1989，321574)。聚合材料也可以用于本發(fā)明的多肽的控制釋放(參見MedicalApplicationsofControlledRelease，Langer和Wise(編輯)，CRCPres.,BocaRaton,FL,1974；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen禾口Ball(編輯)，Wiley,NewYork,1984；Ranger禾口Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.1983,23，61;還參見Levy等人，Science1985，228，190；During等人，Ann.Neurol.，1989，25，351；Howard等人，J.Neurosurg.，1989，71，105)。特別地，控制釋放系統(tǒng)可以置于本發(fā)明多肽的靶例如腦附近，因此僅需要全身劑量的部分(參見例如，Goodson，inMedicalApplicationsofControlledRelease,同上，第2卷，1984，第115-138頁)?？梢允褂迷谟蒐anger的綜述(Science1990，249，1527-1533)中討論的其他控制釋放系統(tǒng)。用于達(dá)到本發(fā)明多肽的控制或持續(xù)釋放的聚合材料公開于例如美國專利號5,679,377；美國專利號5,916,597；美國專利號5,912,015；美國專利號5,989,463；美國專利號5,128,326；PCT公開號WO99/15154；和PCT公開號WO99/20253中。在持續(xù)釋放制劑中使用的聚合物的例子包括但不限于，聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯共乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。優(yōu)選地，在持續(xù)釋放制劑中使用的聚合物是惰性的、不含可浙濾的雜質(zhì)、在貯存時穩(wěn)定、無菌和生物可降解的。一般而言，本發(fā)明的藥物組合物的治療有效量是約0.0001mg/kg-0.001mg/kg;0.001mg/kg-約10mg/kg體重或約0.02mg/kg-約5mg/kg體重。在其他實(shí)施方案中，預(yù)防和/或治療方案涉及給患者施用一個或多個劑量的本發(fā)明多肽的有效量，其中該劑量的有效量實(shí)現(xiàn)至少0.01μg/mL-至少400μg/mL本發(fā)明多肽的血漿水平。預(yù)防和/或治療方案可以涉及給患者施用多個劑量的本發(fā)明多肽的有效量，其中該多個劑量維持至少0.01μg/mL-400μg/mL本發(fā)明多肽的血漿水平。預(yù)防和/或治療方案可以施用至少1天、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月或9個月。預(yù)防和/或治療方案可以涉及施用與一種或多種另外治療劑組合的本發(fā)明的多肽。目前用于預(yù)防、治療和/或控制年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥的該一種或多種治療劑的推薦劑量可以得自本領(lǐng)域的任何參考文獻(xiàn)，包括但不限于，Hardman等人，編輯，Goodman&Gilman‘sThePharmacologicalBasisOfBasisOfTherapeutics，IOthed.，Mc-Graw-Hill,NewYork,2001；Physician，sDeskReference(第60版，2006)，其整體引入本文作為參考。本發(fā)明包括治療病癥的方法，其中需要Klotho蛋白質(zhì)和FGF的激動劑活性。本25發(fā)明的此類方法的例子包括但不限于年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥。本發(fā)明包括用于治療或預(yù)防個體中的年齡相關(guān)性病狀的方法。給需要治療的個體施用藥理學(xué)有效劑量的包含Klotho融合多肽的藥物組合物，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以便治療或預(yù)防年齡相關(guān)性病狀。在某些實(shí)施方案中，Klotho融合多肽與藥理學(xué)有效劑量的肝素一起共施用。年齡相關(guān)性病狀包括少肌癥、皮膚萎縮、肌肉消瘦、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、免疫機(jī)能不全、高血壓、癡呆、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性、前列腺癌、中風(fēng)、預(yù)期壽命減少、記憶喪失、皺紋、腎功能受損和年齡相關(guān)性聽力損失。在某些實(shí)施方案中，Klotho融合多肽包含至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在一個特定實(shí)施方案中，包含至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子23的Klotho融合蛋白施用于需要治療肌肉消瘦的個體。本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防個體中的代謝病癥的方法。給需要治療的個體施用藥理學(xué)有效劑量的包含Klotho融合多肽的藥物組合物，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以便治療代謝病癥。在某些實(shí)施方案中，Klotho融合多肽與藥理學(xué)有效劑量的肝素一起共施用。該方法可以用于治療或預(yù)防II型糖尿病、代謝綜合征、高血糖癥和肥胖。在一個特定實(shí)施方案中，包含至少一個β-Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子21的Klotho融合蛋白施用于需要治療代謝病癥的個體。本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防個體中的高血磷癥或鈣質(zhì)沉著的方法。給需要治療的個體施用藥理學(xué)有效劑量的包含Klotho融合多肽的藥物組合物，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以便治療高血磷癥或鈣質(zhì)沉著。在某些實(shí)施方案中，Klotho融合多肽與藥理學(xué)有效劑量的肝素一起共施用。在一個特定實(shí)施方案中，包含至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子23的Klotho融合蛋白施用于需要治療高血磷癥或鈣質(zhì)沉著的個體。本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防個體中的慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭的方法。給需要治療的個體施用藥理學(xué)有效劑量的包含Klotho融合多肽的藥物組合物，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以便治療慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭。在某些實(shí)施方案中，Klotho融合多肽與藥理學(xué)有效劑量的肝素一起共施用。在某些實(shí)施方案中，包含至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的Klotho融合蛋白施用于需要治療慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭的個體。本發(fā)明還包括用于治療或預(yù)防個體中的癌癥的方法。給需要治療的個體施用藥理學(xué)有效劑量的包含Klotho融合多肽的藥物組合物，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以便治療癌癥。該方法可以用于治療或預(yù)防乳腺癌。在某些實(shí)施方案中，Klotho融合多肽與藥理學(xué)有效劑量的肝素一起共施用。在某些實(shí)施方案中，包含至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的Klotho融合蛋白施用于需要治療癌癥的個體。在通過施用包含Klotho融合多肽的藥物組合物治療病癥的方法中，Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子。在一個特定實(shí)施方案中，Klotho融合蛋白包含至少一個βKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子21。Klotho融合多肽組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文描述的任何施用方法進(jìn)行施用。優(yōu)選的施用方法包括皮下或靜脈內(nèi)。其他有效施用方式在本文中描述。4.6.治療方法和用于評估功效的測定法提供給個體施用Klotho融合多肽的本發(fā)明方法可以用于治療各種病癥，包括年齡相關(guān)性病癥或代謝病癥。不受任何具體理論限制，Klotho/FGF融合多肽可以用于治療其中存在Klotho或FGF的失調(diào)的病癥。示例性病癥包括代謝病癥和年齡相關(guān)性病癥。例如，F(xiàn)GF23或Klotho敲除小鼠顯示出各種相似表型，包括低身體活動、生長遲緩、肌肉消瘦、皮膚萎縮、動脈粥樣硬化、短壽命等(參見Razzaque和Lanske，J.ofEndrocrinology,1941-10(2007)，其引入本文作為參考)。特別地，本發(fā)明的Klotho/FGF23融合多肽特別可以用于治療年齡相關(guān)性病癥，包括肌肉消瘦。不受理論束縛，Klotho和FGF23控制礦物質(zhì)(例如，磷酸鹽和鈣)和維生素D穩(wěn)態(tài)的能力可能是這些蛋白質(zhì)用于調(diào)節(jié)衰老和肌肉萎縮的方法。另一方面，本發(fā)明的Klotho/FGF19融合多肽和Klotho/FGF21融合多肽可以用于治療代謝病癥。例如，β-Klotho和FGF19已被證實(shí)可以通過調(diào)節(jié)膽固醇7-α-羥化酶(CYP7A1)控制膽汁酸穩(wěn)態(tài)。膽汁穩(wěn)態(tài)病癥的非限制性例子是膽汁淤積。β-Klotho和FGF21已顯示誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞中的脂解，并由此誘導(dǎo)減少的脂肪貯存和增加的葡萄糖攝取。脂解/脂肪貯存病癥的非限制性例子是肥胖以及相關(guān)的代謝和心血管疾病。至少部分地基于FGF23能夠刺激尿中的磷酸鹽排泄以及由此減少血清中的磷酸鹽水平的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的Klotho-FGF23融合多肽可以用于治療或預(yù)防個體中的高血磷癥或鈣質(zhì)沉著。例如，已證實(shí)在患者中導(dǎo)致Klotho缺陷的Klotho純合錯義突變可以引起嚴(yán)重的瘤樣鈣質(zhì)沉著和動脈鈣化(Ichikawa等人，J.Clin.Invest.1172684-2691(2007)，其引入本文作為參考)。給個體施用藥理學(xué)有效劑量的包含Klotho融合多肽的藥物組合物，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以便治療或預(yù)防高血磷癥或鈣質(zhì)沉著。特別地，包含至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子的Klotho融合多肽用于治療高血磷癥或鈣質(zhì)沉著。本發(fā)明的Klotho融合多肽還可以用于治療或預(yù)防個體中的慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭。例如，已顯示與未受影響的腎比較，Klotho表達(dá)在具有慢性腎衰竭的患者的腎中是減少的(Koh等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.2801015-1020(2001),其引入本文作為參考)。給個體施用藥理學(xué)有效劑量的包含Klotho融合多肽的藥物組合物，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以便治療或預(yù)防慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭。特別地，包含至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的Klotho融合多肽用于治療慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭。本發(fā)明的Klotho融合多肽還可以用于治療或預(yù)防個體中的癌癥。例如，已顯示與正常乳腺組織比較，Klotho表達(dá)在乳腺癌組織中是減少的(Wolf等人，Oncogene(2008)提前網(wǎng)上公開，其引入本文作為參考)。給個體施用藥理學(xué)有效劑量的包含Klotho融合多肽的藥物組合物，所述Klotho融合多肽具有至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域和成纖維細(xì)胞生長因子，以便治療或預(yù)防癌癥或乳腺癌。特別地，包含至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的Klotho融合蛋白用于治療癌癥或乳腺癌。用于評估本發(fā)明的Klotho融合多肽對年齡相關(guān)性病癥或代謝病癥的功效和/或確定有效劑量的方法包括，基于生物體的測定法，例如，使用哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、靈長類動物或一些其他非人動物)或其他動物(例如，非洲爪蟾(Xenopus)、斑馬魚或無脊椎動物例如蠅或線蟲)。Klotho融合多肽可以一次或以方案(規(guī)律或不規(guī)律的)的形式施用于生物體。隨后評估生物體的參數(shù)，例如年齡相關(guān)的參數(shù)。有意義的Klotho融合多肽導(dǎo)致參數(shù)相對于參考例如對照生物體的參數(shù)發(fā)生改變。還可以評估其他參數(shù)(例如，與毒性、清除率和藥代動力學(xué)相關(guān)的)。本發(fā)明的Klotho融合多肽可以使用動物進(jìn)行評估，所述動物具有特定病癥，例如本文描述的病癥，例如年齡相關(guān)性病癥、代謝病癥。這些病癥還可以提供一個敏化的系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中可以觀察所測試多肽對生理學(xué)的影響。示例性病癥包括失神經(jīng)性、廢用性萎縮；代謝病癥(例如，肥胖病癥和/或糖尿病動物例如db/db小鼠和ob/ob小鼠)；大腦、肝缺血；順鉬/泰素/長春新堿模型；各種組織(異種移植)移植物；轉(zhuǎn)基因骨模型；疼痛綜合征(包括炎癥和神經(jīng)病病癥)；百草枯、遺傳毒性和氧化應(yīng)激模型；和腫瘤I模型。為了測量年齡相關(guān)性病癥，動物模型可以是當(dāng)卡路里受限時具有改變的表型的動物。例如，F(xiàn)344大鼠提供用于評估Klotho融合多肽的有用測定系統(tǒng)。當(dāng)卡路里受限時，F(xiàn)344大鼠具有0-10%的腎病變發(fā)病率。然而，當(dāng)隨意進(jìn)食時，它們具有60-100%的腎病變發(fā)病率。為了評估本發(fā)明的Klotho融合多肽，將多肽施用于動物(例如，F(xiàn)344大鼠或其他合適動物)，并且例如在一段時間后評估動物的參數(shù)。動物可以隨意或正常進(jìn)食(例如，不在卡路里限制下，但某些參數(shù)可以在此類條件下進(jìn)行評估)。一般地，動物隊(duì)列用于該測定法。一般地，如果受試多肽以接受卡路里限制的相似動物的表型方向影響參數(shù)，則指示該受試多肽可能對動物的壽命調(diào)節(jié)具有有利的改變作用。此類受試多肽可以引起卡路里限制的至少某些壽命調(diào)節(jié)效應(yīng)，例如此類效應(yīng)的子集，而無需剝奪生物體的卡路里攝取。待測的參數(shù)可以是年齡相關(guān)或疾病相關(guān)的參數(shù)，例如與動物模型相關(guān)的病癥的癥狀。例如，受試多肽可以施用于SH大鼠，并且監(jiān)控血壓。相對于未用多肽處理的相似參考動物，指示有利的受試多肽可以引起癥狀的改善。與病癥或衰老有關(guān)的其他參數(shù)可以包括抗氧化水平(例如，抗氧化酶水平或活性)、脅迫抗性(例如，百草枯抗性)、核心體溫、葡萄糖水平、胰島素水平、促甲狀腺素水平、催乳激素水平和促黃體生成激素水平。為了測量本發(fā)明的多肽用于治療年齡相關(guān)性病癥的有效性，可以使用具有減少的Klotho表達(dá)的動物，例如具有突變型Klotho的小鼠；參見Kuroo，等人Nature，390；45(1997)和美國公開號2003/0119910，這2個參考文獻(xiàn)都整體引入本文作為參考。例如，將受試多肽施用于突變型小鼠并且監(jiān)控年齡相關(guān)的參數(shù)。相對于未用多肽處理的相似參考動物，指示有利的受試多肽可以引起癥狀的改善。通過測量體重、檢查繁殖能力的獲得、測量血糖水平、觀察壽命、觀察皮膚、觀察運(yùn)動功能例如步行等，可以評估與代謝病癥或衰老有關(guān)的參數(shù)。評估還可以通過測量胸腺重量、觀察在胸腔內(nèi)表面上形成28的鈣化性結(jié)節(jié)的大小等進(jìn)行。此外，Klotho基因的mRNA或Klotho蛋白質(zhì)的定量測定對于評估也是有用的。再其他的體內(nèi)模型和生物體測定法包括就代謝參數(shù)評估動物，例如與胰島素病癥、II型糖尿病相關(guān)的參數(shù)。示例性代謝參數(shù)包括葡萄糖濃度、胰島素濃度和胰島素敏感度。另一個示例性系統(tǒng)涉及例如在動物模型中的腫瘤。腫瘤可以是自發(fā)的或誘導(dǎo)的。例如，腫瘤可以由具有各種遺傳組成的細(xì)胞發(fā)展，例如它們可以是p53+或p53-。還可以使用具有自身免疫病癥的生物體，例如易患SLE的NZB小鼠。為了評估骨疾病的特征，可以例如使用具有卵巢切除的動物作為例如骨質(zhì)疏松癥的模型。類似地，對于關(guān)節(jié)疾病，模型可以基于佐劑誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎(例如，小鼠可以用軟骨蛋白聚糖、高遷移率族蛋白質(zhì)、鏈球菌細(xì)胞壁材料或膠原進(jìn)行免疫接種)；對于腎疾病，可以使用kd/kd小鼠。認(rèn)知(特別是學(xué)習(xí)與記憶)的動物模型也是可得的。糖尿病及其并發(fā)癥的動物模型也是可得的，例如鏈脲佐菌素模型。犬模型可以用于例如評估中風(fēng)和缺血。在評估受試多肽是否能夠改變壽命調(diào)節(jié)時，可以監(jiān)控或評估數(shù)個年齡相關(guān)的參數(shù)或生物標(biāo)記。示例性年齡相關(guān)的參數(shù)包括ω細(xì)胞或生物體的壽命；Gi)具有生物學(xué)年齡依賴性表達(dá)模式的細(xì)胞或生物體中的基因轉(zhuǎn)錄物或基因產(chǎn)物的存在或豐度；Gii)細(xì)胞或生物體對脅迫的抗性；Gv)細(xì)胞或生物體的一種或多種代謝參數(shù)(示例性參數(shù)包括循環(huán)胰島素水平、血糖水平；脂肪含量；核心體溫等等)；(V)生物體中存在的細(xì)胞或一組細(xì)胞的增殖能力；和(Vi)細(xì)胞或生物體的物理外觀或行為。術(shù)語“平均壽命”指一隊(duì)列的生物體的平均死亡年齡。在某些情況下，在控制的環(huán)境條件下使用一隊(duì)列的遺傳上相同的生物體評估“平均壽命”。棄去由于災(zāi)難引起的死亡。當(dāng)無法在控制的環(huán)境條件下確定平均壽命(例如，對于人)時，可以使用對足夠大群體的可靠統(tǒng)計學(xué)信息(例如，來自人壽保險的生命統(tǒng)計表(actuarialtable))作為平均壽命。對2個此類生物體例如1個參考生物體和1個用Klotho融合多肽處理的生物體之間的分子差異的表征，可以揭示生物體的生理學(xué)狀態(tài)的差異。參考生物體和經(jīng)處理的生物體一般是相同實(shí)足年齡。如本文所使用的，術(shù)語“實(shí)足年齡”指自預(yù)選事件起所過去的時間，所述預(yù)選事件例如受孕、限定的胚胎或胎兒期、或更優(yōu)選地出生。各種標(biāo)準(zhǔn)可以用于確定生物體對于該比較性分析是否是“相同”實(shí)足年齡。一般地，所需的精確度是野生型生物體的平均壽命的函數(shù)。例如，對于線蟲秀麗隱桿線蟲(C.elegans)——實(shí)驗(yàn)室野生型株N2在某些控制的條件下存活平均約16天，相同年齡的生物體可能已存活了相同天數(shù)。對于小鼠，相同年齡的生物體可能已存活了相同周或月數(shù)；對于靈長類動物或人，相同年齡的生物體可能已存活了相同年數(shù)(例如在2、3或5年內(nèi))；等等。一般地，相同實(shí)足年齡的生物體可以已存活了該物種的野生型生物體的平均壽命的15、10、5、3、2或內(nèi)的時間量。優(yōu)選地，生物體是成年生物體，例如生物體已存活了至少如下時間量，在該時間量中平均野生型生物體已成熟至其能夠繁殖的年齡。生物體篩選測定法可以在生物體顯示出明顯的衰老身體特征之前進(jìn)行。例如，生物體可以是已經(jīng)活了相同物種的野生型生物體的僅10、30、40、50、60或70%平均壽命的成體。代謝、免疫能力和染色體結(jié)構(gòu)中的年齡相關(guān)性改變已得到報告。在測試的受試者中(例如，對于基于生物體的測定法)或?qū)τ诨颊?例如，在用本文描述的治療劑治療之前、期間或之后)，可以評估這些改變中的任何改變。與卡路里限制相關(guān)的標(biāo)記也可以在篩選測定法的受試者生物體(或經(jīng)處理的受試者)中進(jìn)行評估。盡管這些標(biāo)記可能不是年齡相關(guān)的，但它們可以指示當(dāng)Klotho途徑受到調(diào)節(jié)時改變的生理學(xué)狀態(tài)。標(biāo)記可以是其豐度在卡路里限制動物中發(fā)生改變的mRNA或蛋白質(zhì)。W001/12851和美國專利號6,406,853描述了示例性標(biāo)記。源自本文所述動物的細(xì)胞或類似于本文所述動物模型的動物的細(xì)胞的細(xì)胞模型可以用于基于細(xì)胞的測定法。用于評估受試多肽對肌肉萎縮的作用的模型包括1)由去神經(jīng)導(dǎo)致的大鼠內(nèi)側(cè)腓腸肌肌量丟失，例如通過在大腿中段切斷右側(cè)坐骨神經(jīng)；2)由固定引起的大鼠內(nèi)側(cè)腓腸肌肌量丟失，例如通過以90度彎曲固定右踝關(guān)節(jié)；3)由后肢懸掛引起的大鼠內(nèi)側(cè)腓腸肌肌量丟失；(參見例如U.S.2003-0129686)；4)由惡病質(zhì)性細(xì)胞因子——白介素-I(IL-I)處理引起的骨骼肌萎縮(R.N.Cooney，S.R.Kimball,T.C.Vary,Shock7，1-16(1997))；和5)由糖皮質(zhì)激素——地塞米松處理引起的骨骼肌萎縮(A.L.Goldberg，JBiolChem244，3223-9(1969)。)AMD的示例性動物模型包括模擬滲出性(濕性)黃斑變性的激光誘導(dǎo)的小鼠模型Bora等人，Proc.NatLAcad.Sci.USΑ.,1002679-84(2003)；表達(dá)突變型組織蛋白酶D而導(dǎo)致與“地圖狀萎縮”形式的AMD相關(guān)的特征的轉(zhuǎn)基因小鼠(Rakoczy等人，Am.J.Pathol.,1611515-24(2002))；和在視網(wǎng)膜色素上皮中超表達(dá)VEGF而導(dǎo)致CNV的轉(zhuǎn)基因小鼠。Schwesinger等人，Am.J.Pathol.1581161-72(2001)。帕金森氏病的示例性動物模型包括通過用多巴胺能神經(jīng)毒素1-甲基_4苯基1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)處理致使帕金森病的靈長類動物(參見例如，美國專利公開號20030055231和Wichmann等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，991199-213(2003)；6-羥基多巴胺損傷的大鼠(例如，Lab.Anim.Sci.，49:363-71(1999))；和轉(zhuǎn)基因無脊椎動物模型(例如，Lakso等人，J.Neurochem.86165-72(2003)禾ΠLink，Mech.AgeingDev.，1221639-49(2001))。II型糖尿病的示例性分子模型包括具有缺陷性Nkx-2.2或Nkx-6.1的轉(zhuǎn)基因小鼠；(美國專利號6,127,598)；ZuckerDiabeticFattyfa/fa(ZDF)大鼠(美國專利號6,569,832)；和自發(fā)地發(fā)展肥胖且隨后頻繁進(jìn)展至顯性2型糖尿病的恒河猴(Hotta等人，Diabetes,50:1126-33(2001)；和具有2型糖尿病樣胰島素抗性的、帶顯性失活的IGF-I受體(KR-IGF-IR)的轉(zhuǎn)基因小鼠。神經(jīng)病的示例性動物和細(xì)胞模型包括在小鼠(美國專利號5,420,112)或兔(Ogawa等人，Neurotoxicology，21501-11(2000))中長春新堿誘導(dǎo)的感覺-運(yùn)動神經(jīng)??；用于研究自主神經(jīng)病的鏈脲佐菌素(STZ)-糖尿病大鼠(Schmidt等人，Am.J.Pathol.,16321-8(2003))；和進(jìn)行性運(yùn)動神經(jīng)病(pmn)小鼠(Martin等人，Genomics,75:9-16(2001))。高血磷癥或瘤樣鈣質(zhì)沉著的示例性動物模型包括Klotho敲除小鼠和FGF23敲除小鼠(Yoshida等人，Endocrinology143683-689(2002))。慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭的示例性動物模型包括COL4A3+/-小鼠(Beirowski30等人，J.Am.Soc.Nephrol.171986-1994(2006))。癌癥的示例性動物模型包括將癌細(xì)胞或組織移植或植入裸鼠內(nèi)，如本領(lǐng)域已知的(Giovanella等人，Adv.CancerRes.4469-120(1985))。例如，乳腺癌的動物模型包括移植或植入了乳腺癌細(xì)胞或組織的裸鼠(例如，Yue等人，CancerRes.54:5092-5095(1994)；Glinsky等人，CancerRes.565319-5324(1996)；VisonneauAm.J.Path.l521299-1311(1998))。組合物可以施用于受試者，例如成年受試者，特別是健康成年受試者或具有年齡相關(guān)性疾病的受試者。在后面一種情況下，該方法可以包括評估受試者，例如以表征年齡相關(guān)性疾病的癥狀或其他疾病標(biāo)記，并且由此鑒定受試者為具有神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏、或年齡相關(guān)性疾病或易患此類疾病。骨骼肌萎縮提供給個體施用Klotho融合多肽的本發(fā)明的方法可以用于治療骨骼肌萎縮。肌肉萎縮包括眾多神經(jīng)肌肉的、代謝的、免疫學(xué)的和神經(jīng)學(xué)的病癥和疾病以及饑餓、營養(yǎng)缺乏、代謝應(yīng)激、糖尿病、衰老、肌營養(yǎng)不良或肌病。肌肉萎縮在衰老過程期間發(fā)生。肌肉萎縮還可以起因于肌肉的使用減少或不用。癥狀包括骨骼肌組織量的下降。在人類男性中，肌肉量在50-80歲之間下降三分之一。肌肉萎縮的某些分子特征包括遍在蛋白連接酶的上調(diào)和肌纖維蛋白質(zhì)的喪失(Furuno等人，J.Biol.Chem.，2658550-8557,1990)。例如通過測量3-甲基-組氨酸產(chǎn)生可以跟蹤這些蛋白質(zhì)的分解，所述3-甲基-組氨酸是肌動蛋白和在某些肌肉中肌球蛋白的特別組分(Goodman，Biochem.J.241121-12，1987和Lowell，等人，Metabolism，35:1121-112，1986；Stein和Schluter，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.272E688-E696,1997)肌酸激酶(細(xì)胞損傷標(biāo)記)的釋放(Jackson,等人，Neurology,41101104，1991)也可以具有指示性。非胰島素依賴性糖尿病提供給個體施用Klotho融合多肽的本發(fā)明方法可以用于治療非胰島素依賴性糖尿病。非胰島素依賴性糖尿病也稱為“成年發(fā)病型”糖尿病和2型糖尿病。2型糖尿病還包括“非肥胖2型”和“肥胖2型”。II型糖尿病的特征可以在于(1)胰腺β胰島細(xì)胞的胰島素分泌減少，從而使得產(chǎn)生小于維持血糖水平平衡所需量的胰島素，和/或(2)“胰島素抗性”，其中機(jī)體無法對胰島素正常應(yīng)答。(美國專利號5,266,561和美國專利號6,518,069)。例如，葡萄糖刺激的胰島素水平一般無法升高超過4.0nmOl/L。(美國專利號5,266,561)。II型糖尿病的示例性癥狀包括禁食時的高血糖癥(美國專利號5,266,561)；疲勞；過度口渴；尿頻；視力模糊；和增加的感染率。II型糖尿病的分子指示包括在胰腺中胰島淀粉樣沉積。神經(jīng)病神經(jīng)病可以包括由影響運(yùn)動、感覺、感覺運(yùn)動或自主神經(jīng)的全身性疾病、遺傳病狀或毒性劑引起的中樞和/或外周神經(jīng)功能障礙。(參見例如，美國專利申請?zhí)?0030013771)。癥狀可以因神經(jīng)損害的原因和受累神經(jīng)的具體類型而改變。例如，運(yùn)動神經(jīng)病的癥狀包括在執(zhí)行身體任務(wù)時的笨拙或如肌肉虛弱、在少量運(yùn)動用后的虛脫、在直立或步行中的困難和神經(jīng)肌肉反射的減弱或不存在。(美國專利申請?zhí)?0030013771)自主神經(jīng)病的癥狀包括便秘、心律異常和體位性低血壓反射的減弱。(美國專利申請?zhí)?0030013771)，感覺神經(jīng)病的癥狀包括疼痛和麻木；手、腿或足中的麻刺感；和對觸摸的極度敏感性，并且視網(wǎng)膜病變的癥狀包括視力模糊、突然失明、黑斑和閃光。阿爾茨海默氏病提供給個體施用Klotho融合多肽的本發(fā)明方法可以用于治療阿爾茨海默氏病(AD)。阿爾茨海默氏病是導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元喪失的復(fù)雜神經(jīng)變性疾病。其提供了僅一例也是年齡相關(guān)性病狀的神經(jīng)變性疾病例子。阿爾茨海默氏病的臨床標(biāo)志包括記憶、判斷、對物理環(huán)境的定向和語言的進(jìn)行性損害。AD的神經(jīng)病學(xué)標(biāo)志包括區(qū)域特異性的神經(jīng)元喪失、淀粉樣蛋白斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。淀粉樣蛋白斑塊是包含淀粉樣蛋白肽(也稱為Ap或Ap42)的細(xì)胞外斑塊，淀粉樣蛋白肽是8-淀粉樣蛋白前體蛋白(也稱為APP)的切割產(chǎn)物。神經(jīng)原纖維纏結(jié)是由異常過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau的細(xì)絲組成的不溶性細(xì)胞內(nèi)聚集物。淀粉樣蛋白斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)可以促成導(dǎo)致由凋亡引起的神經(jīng)元喪失的繼發(fā)事件(Clark和Karlawish，Ann.Intern.Med.138(5)400-410(2003)。例如，ρ-淀粉樣蛋白在培養(yǎng)的神經(jīng)元中誘導(dǎo)胱天蛋白酶-2-依賴性凋亡(Troy等人JNeurosci.20(4)1386-1392)。斑塊在體內(nèi)的沉積可能以相似方式觸發(fā)近端神經(jīng)元的凋亡。各種標(biāo)準(zhǔn)，包括遺傳、生物化學(xué)、生理學(xué)和認(rèn)知標(biāo)準(zhǔn)，可以用于評估受試者中WAD。AD的癥狀和診斷對于醫(yī)學(xué)從業(yè)者是已知的。AD的某些示例性癥狀和標(biāo)記在下文呈現(xiàn)。有關(guān)已知與AD相關(guān)的這些指標(biāo)和其他指標(biāo)的信息可以用作“AD相關(guān)參數(shù)”。AD相關(guān)參數(shù)可以包括定性或定量信息。定量信息的例子是一維或多維的數(shù)字值，例如蛋白質(zhì)的濃度或X線斷層攝影圖。定性信息可以包括評估，例如醫(yī)生的意見或二元評估(“是”/“否”)等等。AD相關(guān)參數(shù)包括指示受試者經(jīng)診斷未有AD或沒有AD的特定指標(biāo)的信息，例如非AD典型的認(rèn)知測試結(jié)果或與AD無關(guān)的遺傳APOE多態(tài)性。進(jìn)行性認(rèn)知損害是AD的標(biāo)志。這個損害可以呈現(xiàn)為記憶、判斷、決策、對物理環(huán)境的定向和語言的下降(Nussbaum和Ellis，NewEngJ.Med.348(14)1356351364(2003))。其他形式的癡呆的排除可以幫助做出AD的診斷。神經(jīng)元死亡導(dǎo)致AD患者中的進(jìn)行性腦萎縮。成像技術(shù)(例如，磁共振成像或計算機(jī)輔助斷層攝影術(shù))可以用于檢測腦和/或腦萎縮中的AD相關(guān)損傷。AD患者可以顯示出起因于該疾病的病理狀態(tài)的生物化學(xué)異常。例如，在腦脊髓液中的tan蛋白質(zhì)水平在AD患者中是升高的(Andreasen，N.等人ArchNeurol.58349-350(2001))。淀粉樣蛋白β42(A,B42)肽的水平在AD患者的CSF中可能減少。Ap42的水平在AD患者的血漿中可能增加(Ertekein-Taner，N.，等人Science29023032304(2000))0在來自受試者的樣品中檢測生物化學(xué)異常的技術(shù)包括本領(lǐng)域已知的細(xì)胞、免疫學(xué)和其他生物學(xué)方法。關(guān)于一般指導(dǎo)，參見例如，Sambrook&Russell，MolecularCloningALaboratoryManual，第3版，ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(2001),Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.(1989),(Harrow,E.禾口Lane,D.(1988)AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)及其更新版本中描述的技術(shù)。例如，抗體、其他免疫球蛋白和其他特異性結(jié)合配體可以用于檢測與AD相關(guān)的生物分子，例如蛋白質(zhì)或其他抗原。例如，一種或多種特異性抗體可以用于探測樣品。各種格式是可以的，例如ELISAs、基于熒光的測定法、蛋白質(zhì)印跡和蛋白質(zhì)陣列。產(chǎn)生多肽陣列的方法在本領(lǐng)域中得到描述，例如在DeWildt等人(2000).NatureBiotech.18,989-994；Lucking等人(1999).Anal.Biochem.270，103-111；Ge，H.(2000).NucleicAcidsRes.28，e3,I-VII；MacBeath,G.，禾口Schreiber，S.L.(2000).Science289，1760-1763；和W099/51773A1中。在一種測定法中，使用AD的非人動物模型(例如，小鼠模型)，例如以評估多肽或治療方案。例如，美國專利號6,509,515描述了一種此類模型動物，其天然地能夠用于學(xué)習(xí)和記憶測試。該動物在腦組織中表達(dá)的淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)序列的水平使得該動物可以在從出生后的短時間段內(nèi)，一般在出生后1年內(nèi)，優(yōu)選在出生后2-6個月內(nèi)，出現(xiàn)進(jìn)行性神經(jīng)學(xué)病癥。在胚胎期，優(yōu)選在單細(xì)胞或受精的卵母細(xì)胞期，并且一般不遲于約8細(xì)胞期，將APP蛋白質(zhì)序列引入動物或動物的祖先內(nèi)。受精卵或胚胎隨后在作為養(yǎng)育者的假孕雌性中發(fā)育至足月。淀粉樣蛋白前體蛋白基因被引入動物胚胎內(nèi)，以如下狀態(tài)整合在染色體上，所述狀態(tài)導(dǎo)致淀粉樣蛋白前體蛋白的超內(nèi)源表達(dá)，和在腦的皮質(zhì)-邊緣區(qū)域中的進(jìn)行性神經(jīng)病學(xué)疾病的發(fā)展，所述腦的皮質(zhì)_邊緣區(qū)域是在進(jìn)行性神經(jīng)病學(xué)疾病狀態(tài)例如AD中顯著受累的腦區(qū)域。受累轉(zhuǎn)基因動物中的神經(jīng)膠質(zhì)增生和臨床表現(xiàn)模擬了神經(jīng)病學(xué)疾病。該神經(jīng)病學(xué)疾病的進(jìn)行性方面的特征在于減少的探索和/或行動行為和減少的脫氧葡萄糖攝取/利用和在腦的皮質(zhì)_邊緣區(qū)域中的過度神經(jīng)膠質(zhì)增生。此外，可見的改變類似于在某些衰老動物中見到的那些。其他動物模型也在US5,387,742；5,877,399；6,358,752；和6,187,992中描述。帕金森氏病提供給個體施用Klotho融合多肽的本發(fā)明方法可以用于治療帕金森氏病。帕金森氏病包括黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)變性，導(dǎo)致調(diào)節(jié)運(yùn)動功能的黑質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)的退化。這種病理狀態(tài)接著導(dǎo)致運(yùn)動功能障礙。(參見例如Lotharius等人，Nat.Rev.Neurosci.,3932-42(2002))。示例性運(yùn)動癥狀包括運(yùn)動不能、屈曲姿勢、起步困難、姿勢不穩(wěn)、僵住、肌強(qiáng)直和震顫。示例性非運(yùn)動癥狀包括抑郁、缺乏動力、消極、癡呆和胃腸功能紊亂(參見例如，F(xiàn)ahn，Ann.N.Y.Acad.Sci.，9911-14(2003)和Pfeiffer，LancetNeurol.,2107-16(2003))。帕金森氏病已在0.5-1%的65-69歲和1-3%的80歲和以上的人中觀察到。(參見例如，Nussbaum等人，N.Engl.J.Med.，3481356-64(2003))。帕金森氏病的分子標(biāo)記包括芳香族L氨基酸脫羧酶(AADC)的減少(參見例如美國申請?zhí)?0020172664)；和黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元中多巴胺含量的喪失(參見例如，F(xiàn)ahn，Ann.N.Y.Acad.Sci.,9911-14(2003)和Lotharius等人，Nat.Rev.Neurosci.，3932-42(2002))。在某些家族性病例中，PD與編碼α-突觸核蛋白和parkin(Ε3遍在蛋白連接酶)蛋白質(zhì)的單基因中的突變相關(guān)。(例如，Riess等人，J.Neurol.250Suppl11310(2003)和Nussbaum等人，N.Engl.J.Med.,3481356-64(2003))。神經(jīng)元特異性C末端遍在蛋白水解酶基因中的錯義突變也與帕金森氏病相關(guān)(例如，Nussbaum等人，N.Engl.J.Med.,3481356-64(2003))。亨廷頓氏病提供給個體施用Klotho融合多肽的本發(fā)明方法可以用于治療亨廷頓氏病。用于評估Klotho融合多肽對亨廷頓氏病的功效和/或確定有效劑量的方法包括基于生物體的測定法，例如，使用哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、靈長類、或某些其他非人動物)或其他動物(例如，非洲爪蟾、斑馬魚或無脊椎動物例如蠅或線蟲)。用于亨廷頓氏病的許多動物模型系統(tǒng)是可獲得的。參見例如，Brouillet，F(xiàn)unctionalNeurology15(4)239-251(2000)；Ona等人Nature399263-267(1999)，Bates等人HumMolGenet.6(10)1633-7(1997)；Hansson等人J.ofNeurochemistry78694-703;和Rubinsztein,D.C.，TrendsinGenetics,第IS卷，No.4,第202-209頁(有關(guān)HD的各種動物和非人模型的綜述)。此類動物模型的例子是轉(zhuǎn)基因小鼠品系R6/2系(Mangiarini等人Cell87493-506(1996))。R6/2小鼠是轉(zhuǎn)基因亨廷頓氏病小鼠，其超表達(dá)人HD基因的外顯子1(在內(nèi)源啟動子的控制下)。R6/2人HD基因的外顯子1具有擴(kuò)展的CAG/聚谷氨酰胺重復(fù)長度(平均150個CAG重復(fù))。這些小鼠發(fā)展進(jìn)行性、最終致命的神經(jīng)學(xué)疾病，具有人亨廷頓氏病的許多特征。在R6/2小鼠中在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均觀察到部分地由Huntingtin(由HD外顯子1編碼)的N末端部分構(gòu)成的異常聚集物(Davies等人Cell90537-548(1997))。例如，轉(zhuǎn)基因動物中的人Huntingtin蛋白由包括至少55個CAG重復(fù)且更優(yōu)選約150個CAG重復(fù)的基因編碼。這些轉(zhuǎn)基因動物可以發(fā)展亨廷頓氏病樣表型。這些轉(zhuǎn)基因小鼠的特征在于減少的體重增加、壽命減少以及特征在于異常步態(tài)、靜止性震顫、后肢緊握和出生后8-10周活動過度的運(yùn)動損害(例如R6/2品系；參見Mangiarini等人Cell87493-506(1996))。該表型朝向運(yùn)動減少進(jìn)行性惡化。這些轉(zhuǎn)基因小鼠的腦也顯示出神經(jīng)化學(xué)和組織學(xué)異常，例如神經(jīng)遞質(zhì)受體(谷氨酸、多巴胺能)的改變、N-乙酰天冬氨酸(神經(jīng)元完整性的標(biāo)記)的濃度減少以及紋狀體和腦大小的減少。因此，評價可以包括評估與神經(jīng)遞質(zhì)水平、神經(jīng)遞質(zhì)受體水平、腦大小和紋狀體大小相關(guān)的參數(shù)。此外，包含轉(zhuǎn)基因部分或全長人Huntingtin蛋白質(zhì)的異常聚集物存在于這些動物(例如，R6/2轉(zhuǎn)基因小鼠品系)的腦組織中。參見例如，Mangiarini等人Cell87:493-506(1996)，Davies等人Cell90537-548(1997)，Brouillet,FunctionalNeurology15(4)239-251(2000)和Cha等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA956480-6485(1998)。為了測試本申請中描述的受試多肽或已知多肽在動物模型中的效應(yīng)，可以例如通過將受試多肽注射到動物的循環(huán)內(nèi)，給轉(zhuǎn)基因動物施用不同濃度的受試多肽?？梢栽趧游镏性u估亨廷頓氏病樣癥狀。隨后監(jiān)控亨廷頓氏病樣癥狀的進(jìn)展，例如如上文對于小鼠模型描述的癥狀，以確定用受試多肽處理是否導(dǎo)致癥狀的減少或延遲。在另一種測定法中，監(jiān)控Huntingtin蛋白質(zhì)聚集物在這些動物中的解體。隨后可以處死動物并且獲得腦切片。隨后就包含轉(zhuǎn)基因人Huntingtin蛋白質(zhì)、其部分、或人Huntingtin蛋白或其部分的融合蛋白的聚集物的存在，分析腦切片。這個分析可以包括例如用抗Huntingtin抗體染色腦組織的切片，并且加入識別該抗Huntingtin抗體的與FITC綴合的二級抗體(例如，抗Huntingtin抗體是小鼠抗人抗體，二級抗體是特異于人抗體的抗體)，并且通過熒光顯微鏡檢查蛋白質(zhì)聚集物?？色@得各種方法用于評估和/或監(jiān)控亨廷頓氏病。疾病的各種臨床癥狀和指標(biāo)是已知的。亨廷頓氏病引起運(yùn)動障礙、精神病學(xué)障礙和認(rèn)知改變。這些癥狀的程度、發(fā)作年齡和表現(xiàn)可以變化。運(yùn)動障礙可以包括稱為舞蹈病的快速、隨機(jī)、舞蹈樣動作。示例性運(yùn)動評估包括眼追蹤、眼球掃視開始、掃視速度、構(gòu)音障礙、舌前突(tongueprotrasion),指叩能力、俯/仰、拳-手-掌序列、臂僵直、運(yùn)動遲緩、最大肌張力障礙(軀干、上和下肢)、最大舞蹈(例如，軀干、面部、上和下肢)、步態(tài)、足尖足跟銜接行走(tandemwalking)，和后退。示例性治療可以，例如經(jīng)過一年時期，引起UHDRS的子量表TotalMotorScore4(TMS-4)的改變。癌癥提供給個體施用Klotho融合多肽的本發(fā)明方法可以用于治療癌癥。癌癥包括由不適當(dāng)?shù)馗咚降募?xì)胞分裂、不適當(dāng)?shù)氐退降牡蛲龌騼烧咭鸬?、或?qū)е虏贿m當(dāng)?shù)馗咚降募?xì)胞分裂、不適當(dāng)?shù)氐退降牡蛲龌騼烧叩娜魏渭膊?。癌癥的例子包括但不限于，白血病(例如，急性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、急性成髓細(xì)胞白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性骨髓單核細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏病)、沃爾登斯特倫氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血癥、重鏈病和實(shí)體瘤例如肉瘤和癌(例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細(xì)胞癌、肝瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、成腎細(xì)胞瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜細(xì)胞瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、施旺細(xì)胞瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)。淋巴增生性病癥也視為增生性疾病。本文引用的所有專利、專利申請和出版的參考文獻(xiàn)在此整體引入作為參考。盡管本發(fā)明已參考其實(shí)施方案而言進(jìn)行了具體地顯示且描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在其中進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)的各種改變，而不背離后附權(quán)利要求所涵蓋的本發(fā)明的范圍。5.實(shí)施例實(shí)施例l.Klotho融合多肽的表達(dá)和純化Klotho融合多肽的表達(dá)通過用表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞制備本發(fā)明的多肽，所述表達(dá)載體編碼具有αKlotho的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和FGF23(R179Q)變體的Klotho融合多肽。通過瞬時轉(zhuǎn)染Klotho、FGF23和Klotho_FGF23(R179Q)融合蛋白的相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒，產(chǎn)生了包含所表達(dá)多肽的條件培養(yǎng)基。使用Lipofectamine2000(Invitrogen,目錄#11668-019)在6孔平板中執(zhí)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后5小時，用3mlDMEM加上FBS替換轉(zhuǎn)染混合物。在添加3mlDMEM加上1%FBS后72小時收集條件培養(yǎng)基。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離來自各種瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的條件培養(yǎng)基樣品，并且通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析(圖3A)或用考馬斯藍(lán)進(jìn)行染色(圖3B)。35對各種樣品執(zhí)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(泳道1，對照；泳道2，F(xiàn)GF23；泳道3，sKlotho；泳道4-6，sKlotho-FGF23)?？捡R斯藍(lán)染色揭示一條高>180kDa條帶的表達(dá)(圖3B，由右側(cè)箭頭指示)，該條帶在泳道1-3中不存在，泳道1-3包含未用編碼Klotho融合多肽的載體轉(zhuǎn)染的樣品。通過蛋白質(zhì)印跡分析了分泌到培養(yǎng)基內(nèi)的Klotho融合多肽的性質(zhì)(圖3A)?？笷GF23大鼠單克隆IgG2A(R&DSystems,Cat#MAB26291)用作一抗，以通過蛋白質(zhì)印跡檢測Klotho融合多肽。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)在考馬斯染色的凝膠中觀察到的該額外條帶是Klotho融合多肽。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)Klotho融合多肽具有針對該Klotho融合多肽預(yù)期的分子量。這個分析證實(shí)Klotho-FGF23(R179Q)融合蛋白的表達(dá)。Klotho融合多肽的純化從來自瞬時轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體的HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中純化了本發(fā)明的多肽，所述表達(dá)載體編碼具有αKlotho的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和FGF23R179Q變體的Klotho融合多肽。為了產(chǎn)生條件培養(yǎng)基，用編碼sKlotho-FGF23-6xHis的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染(在與18ml2μg/ml聚乙烯亞胺(PEI)混合的18mlOptiMEM1(GIBC0，目錄#11058)中的500μgDNA)在表達(dá)培養(yǎng)基中懸浮生長的HEK293細(xì)胞(在Freestype293表達(dá)培養(yǎng)基(GIBC0，目錄#12338)中IO6細(xì)胞/ml的464mlHEK293T細(xì)胞)。在轉(zhuǎn)染后，允許培養(yǎng)物生長(120小時；37°C在5%C02溫箱中；125rpm振蕩)。在溫育結(jié)束時，通過離心(IOOOrpm共5分鐘)收獲條件培養(yǎng)基。隨后將條件培養(yǎng)基應(yīng)用于鎳-瓊脂糖柱。sKlotho-FGF23-6xHis與柱緊密結(jié)合，用50mM咪唑洗脫。所得到的純化的材料隨后在PBS中透析以去除咪唑。通過SDS-PAGE分離純化的sKlotho-FGF23-6xHis樣品(泳道1，純化的SKl0th0-FGF23-6xHiS；泳道2，分子量標(biāo)記)，并且通過用考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析(圖3C)。染色的SDS-PAGE凝膠證實(shí)純化的sKlotho-FGF23-6xHis具有預(yù)期分子量。在加載純化的材料的泳道中未能檢測出對應(yīng)于全長sKl0th0-FGF23-6XHis外的蛋白質(zhì)的條帶，也證實(shí)了該sKlotho-FGF23-6xHis是純化的。實(shí)施例2.評估Klotho融合多肽的活性的體外測定法Egr-I-螢光素酶在Egr-I-螢光素酶報道分子測定法中測試所表達(dá)的αKlotho融合多肽的生物活性。Klotho融合多肽與FGF23受體的結(jié)合導(dǎo)致了Egr-I的下游激活和由Egr-I啟動子調(diào)節(jié)的螢光素酶報道分子的表達(dá)?；赨rakawa等人(Nature，2006，第444卷，770-774)的報告，構(gòu)建Egr-I-螢光素酶報道基因。用Egr-I-螢光素酶報道基因連同轉(zhuǎn)染標(biāo)化報道基因(海腎螢光素酶)一起轉(zhuǎn)染種植在48孔聚-D-賴氨酸平板中的HEK293T細(xì)胞。在Egr-I螢光素酶報道基因轉(zhuǎn)染后5小時，用3mlDMEM加上1%FBS替換轉(zhuǎn)染混合物。在添加3mlDMEM加上FBS后72小時收集條件培養(yǎng)基。5小時后，用待測試活性的樣品替換轉(zhuǎn)染混合物。在起始實(shí)驗(yàn)中，在Egr-I-螢光素酶報道分子測定法中，在20μg/ml肝素(Sigma，Cat#H8537；溶解于DMEM中為2mg/ml原液)的存在或不存在下，測試了50%條件培養(yǎng)基(單獨(dú)或包含Klotho、FGF23、Klotho和FGF23、以及Klotho-FGF23(R179Q)融合蛋白)和含1%FBS的50%DMEM(圖4)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用規(guī)定量的純化的多肽(圖5A和5B)。20小時后細(xì)胞在被動裂解緩沖液(Promega，目錄#E194A)中裂解細(xì)胞，并且使用Dua卜GloLuciferaseAssaySystem(Promega，目錄36#E2940)測定螢光素酶活性。在起始實(shí)驗(yàn)中，在未經(jīng)分級分離的條件培養(yǎng)基中證實(shí)了Klotho融合多肽活性。使用Egr-I-螢光素酶報道基因(圖4)，這些實(shí)驗(yàn)定量了螢光素酶報道分子表達(dá)的改變倍數(shù)。包含F(xiàn)GF23和Klotho多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的組合的條件培養(yǎng)基激活Egr-I-螢光素酶，但僅包含F(xiàn)GF23的條件培養(yǎng)基或僅包含Klotho的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的條件培養(yǎng)基不激活Egr-I-螢光素酶。與包含單獨(dú)的FGF23或Klotho的條件培養(yǎng)基形成對比，包含融合蛋白sKlotho-FGF23(R179Q)的條件培養(yǎng)基激活Egr-I-螢光素酶報道基因。在這些實(shí)驗(yàn)中，與包含F(xiàn)GF23和Klotho的組合的條件培養(yǎng)基比較，包含融合蛋白sKlotho_FGF23(R179Q)的條件培養(yǎng)基明顯更好地激活Egr-I-螢光素酶報道基因。在肝素的存在下，包含融合蛋白sKlotho-FGF23(R179Q)的條件培養(yǎng)基和包含F(xiàn)GF23和Klotho的組合的條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)作用明顯得到增強(qiáng)。表1列出了條件培養(yǎng)基中各種FGF-Klotho融合多肽的相對表達(dá)、和與各種FGF-Klotho融合多肽相對應(yīng)的未經(jīng)分級分離的條件培養(yǎng)基在Egr-I螢光素酶報道分子測定法中的相對活性。表l.SKlotho-FGF23融合物變體的表達(dá)和活性權(quán)利要求1.融合多肽，其包括(a)包括至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽；和(b)包括成纖維細(xì)胞生長因子的多肽。2.權(quán)利要求1的融合多肽，其中(a)的多肽與(b)的多肽的N末端可操作地連接。3.權(quán)利要求1的融合多肽，其中(b)的多肽與(a)的多肽的N末端可操作地連接。4.權(quán)利要求1、2或3的融合多肽，其中(a)的多肽與(b)的多肽通過多肽接頭連接。5.權(quán)利要求4的融合多肽，其中所述多肽接頭包括選自下述的氨基酸序列SEQIDNO:11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO:18。6.權(quán)利要求4的融合多肽，其中所述多肽接頭包括選自下述的氨基酸序列的至少1個至高達(dá)約30個重復(fù)SEQIDNO:12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18。7.權(quán)利要求4的融合多肽，其中(a)的多肽通過肽鍵與所述多肽接頭的N末端連接，并且(b)的多肽通過肽鍵與所述多肽接頭的C末端連接。8.權(quán)利要求4的融合多肽，其中(a)的多肽通過肽鍵與所述多肽接頭的C末端連接，并且(b)的多肽通過肽鍵與所述多肽接頭的N末端連接。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的融合多肽，其中所述Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域是KL-Dl結(jié)構(gòu)域或KL-D2結(jié)構(gòu)域。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的融合多肽，其中(a)的多肽包括至少2個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域。11.權(quán)利要求10的融合多肽，其中2個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域是串聯(lián)重復(fù)的2個KL-Dl結(jié)構(gòu)域。12.權(quán)利要求10的融合多肽，其中2個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域是串聯(lián)重復(fù)的2個KL-D2結(jié)構(gòu)域。13.權(quán)利要求10的融合多肽，其中2個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域是KL-Dl結(jié)構(gòu)域和KL-D2結(jié)構(gòu)域。14.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的融合多肽，其中(a)的多肽是Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的融合多肽，其進(jìn)一步包括信號肽。16.權(quán)利要求15的融合多肽，其中信號肽是Klotho信號肽。17.權(quán)利要求15的融合多肽，其中信號肽是IgG信號肽。18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的融合多肽，其與成纖維細(xì)胞生長因子受體特異性結(jié)合。19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的融合多肽，其中Klotho蛋白質(zhì)是α-Klotho020.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的融合多肽，其中Klotho蛋白質(zhì)是β-Klothoο21.權(quán)利要求19的融合多肽，其中成纖維細(xì)胞生長因子是成纖維細(xì)胞生長因子-23。22.權(quán)利要求19的融合多肽，其中成纖維細(xì)胞生長因子是成纖維細(xì)胞生長因子-23變體(R179Q)。23.權(quán)利要求20的融合多肽，其中成纖維細(xì)胞生長因子是成纖維細(xì)胞生長因子-19。24.權(quán)利要求20的融合多肽，其中成纖維細(xì)胞生長因子是成纖維細(xì)胞生長因子-21。25.權(quán)利要求1的融合多肽，其包括與SEQIDNO19的氨基酸序列95%或更多相同的氨基酸序列。26.權(quán)利要求1的融合多肽，其包括與SEQIDNO20的氨基酸序列95%或更多相同的氨基酸序列。27.權(quán)利要求1的融合多肽，其包括與SEQIDNO40的氨基酸序列95%或更多相同的氨基酸序列。28.權(quán)利要求1的融合多肽，其包括與SEQIDNO41的氨基酸序列95%或更多相同的氨基酸序列。29.權(quán)利要求1的融合多肽，其具有SEQIDNO19的氨基酸序列。30.權(quán)利要求1的融合多肽，其具有SEQIDNO20的氨基酸序列。31.權(quán)利要求1的融合多肽，其具有SEQIDNO40的氨基酸序列。32.權(quán)利要求1的融合多肽，其具有SEQIDNO41的氨基酸序列。33.權(quán)利要求1的融合多肽，其包括與SEQIDNO5中所示的氨基酸序列95%或更多相同的氨基酸序列。34.權(quán)利要求1的融合多肽，其包括與SEQIDNO6中所示的氨基酸序列95%或更多相同的氨基酸序列。35.權(quán)利要求1的融合多肽，其包括與SEQIDNO7中所示的氨基酸序列95%或更多相同的氨基酸序列。36.權(quán)利要求1的融合多肽，其包括與SEQIDNO35中所示的氨基酸序列95%或更多相同的氨基酸序列。37.藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)的融合多肽和藥學(xué)上可接受的載體。38.核酸，其包括編碼權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)的融合多肽的序列。39.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求38的核酸。40.載體，其包括權(quán)利要求38的核酸。41.用于治療或預(yù)防個體中的年齡相關(guān)性病狀的方法，其包括給有此需要的個體施用治療有效劑量的包括融合多肽的藥物組合物，所述融合多肽包括(a)包括至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽；和(b)包括成纖維細(xì)胞生長因子的多肽。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述年齡相關(guān)性病狀選自少肌癥、皮膚萎縮、肌肉消瘦、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、免疫機(jī)能不全、高血壓、癡呆、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性、前列腺癌、中風(fēng)、預(yù)期壽命減少、記憶喪失、皺紋、腎功能受損和年齡相關(guān)性聽力損失。43.權(quán)利要求41的方法，其中Klotho蛋白質(zhì)是αKlotho蛋白質(zhì)。44.權(quán)利要求42的方法，其中年齡相關(guān)性病狀是肌肉消瘦，Klotho蛋白質(zhì)是CiKlotho蛋白質(zhì)，并且成纖維細(xì)胞生長因子是成纖維細(xì)胞生長因子23。45.用于治療或預(yù)防個體中的代謝病癥的方法，其包括給有此需要的個體施用治療有效劑量的包括融合多肽的藥物組合物，所述融合多肽包括(a)包括至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽；和(b)包括成纖維細(xì)胞生長因子的多肽。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述代謝病癥選自II型糖尿病、代謝綜合征、高血糖癥和肥胖。47.權(quán)利要求45的方法，其中所述融合多肽包括(a)包括至少一個β-Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽；和(b)包括成纖維細(xì)胞生長因子21的多肽。48.用于治療或預(yù)防個體中的高血磷癥或鈣質(zhì)沉著的方法，其包括給有此需要的個體施用治療有效劑量的包括融合多肽的藥物組合物，所述融合多肽包括(a)包括至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽；和(b)包括成纖維細(xì)胞生長因子的多肽。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述融合多肽包括(a)包括至少一個αKlotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽；和(b)包括成纖維細(xì)胞生長因子23的多肽。50.用于治療或預(yù)防個體中的慢性腎臟疾病或慢性腎衰竭的方法，其包括給有此需要的個體施用治療有效劑量的包括融合多肽的藥物組合物，所述融合多肽包括(a)包括至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽；和(b)包括成纖維細(xì)胞生長因子的多肽。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述Klotho蛋白質(zhì)是αKlotho蛋白質(zhì)。52.用于治療或預(yù)防個體中的癌癥的方法，其包括給有此需要的個體施用治療有效劑量的包括融合多肽的藥物組合物，所述融合多肽包括(a)包括至少一個Klotho蛋白質(zhì)的細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu)域的多肽；和(b)包括成纖維細(xì)胞生長因子的多肽。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。54.權(quán)利要求52的方法，其中所述Klotho蛋白質(zhì)是αKlotho蛋白質(zhì)。55.權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)的融合多肽，其中所述Klotho蛋白質(zhì)是人Klotho蛋白質(zhì)。56.權(quán)利要求37的藥物組合物，其進(jìn)一步包括肝素。57.權(quán)利要求41-54中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括施用治療有效劑量的肝素。58.權(quán)利要求41-54中任一項(xiàng)的方法，其中所述個體是人。59.權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)的融合多肽，用于在醫(yī)學(xué)中使用。60.權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)的融合多肽，用于治療或預(yù)防肌肉萎縮。61.治療或預(yù)防肌肉萎縮的方法，其包括(基本上組成是、或組成是)給有此需要的個體施用治療有效劑量的藥物組合物，所述藥物組合物包括SEQIDNO7、SEQIDNO44或SEQIDNO45的可溶性Klotho蛋白質(zhì)。62.治療或預(yù)防肌肉萎縮的方法，其包括(基本上組成是或組成是)給有此需要的個體施用治療有效劑量的藥物組合物，所述藥物組合物包括(l)SEQIDNO:7、SEQIDNO44或SEQIDNO45的可溶性Klotho蛋白質(zhì)，禾Π(2)接頭。全文摘要本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療年齡相關(guān)性病狀或代謝病癥的方法、試劑盒和組合物。本發(fā)明的Klotho融合多肽包括至少Klotho蛋白質(zhì)或其活性片段。該Klotho融合蛋白在治療和預(yù)防各種年齡相關(guān)性病狀和代謝病癥中有用。文檔編號C07K14/50GK102015760SQ200980111072公開日2011年4月13日申請日期2009年1月26日優(yōu)先權(quán)日2008年1月28日發(fā)明者D·格拉斯,S-I·胡申請人:諾瓦提斯公司