專利名稱：一種抗菌化合物及其制備方法和用途的制作方法
一種抗菌化合物及其制備方法和用途所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新結(jié)構(gòu)的抗菌化合物及其發(fā)酵制備方 法和用途。
背景技術(shù)：
微生物的代謝產(chǎn)物是抗生素的主要來源，而放線菌是產(chǎn)生抗生素最主要的微生物 種類之一。自鏈霉素發(fā)現(xiàn)以來，已從放線菌中發(fā)現(xiàn)了大量的抗生素。近年來，人們從普通鏈 霉菌、極端環(huán)境放線菌、海洋放線菌和稀有放線菌中尋找新抗生素。如，慶大霉素、紅霉素、 萬古霉素、利福平等已成功應(yīng)用于臨床；應(yīng)用于農(nóng)作物病蟲害防治的抗生素有谷氏菌素、滅 瘟素、抗霉菌素120、武夷菌素等。滅瘟素是土壤放線菌產(chǎn)生的一種抗菌素，其分子結(jié)構(gòu)由一個胞啶嚀(cytosinine) 核苷和一個β-氨基酸稻瘟菌酸(blastidic acid)組成。日本人Takeuchi等首先于1955 年從一株鏈霉菌Sti^ptomyces griseochromogenes2A-327的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)滅瘟素A、B、C， 1968年最終確定其結(jié)構(gòu)，1958年從同一菌株發(fā)酵液中分離得到了滅瘟素S的純品，并很快 實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。我國于1959年由中國科學(xué)院微生物研究所從廣東花縣土壤中分離到其產(chǎn) 生菌-有色產(chǎn)色鏈霉菌(Str印tomyces griseochromogenes)。滅瘟素作為一種治療性殺菌 劑，對病源細(xì)菌和真菌的細(xì)胞生長呈現(xiàn)了廣泛的抑制效果。武夷霉素(miyiensis)是一種廣譜、高效、低毒的核苷類農(nóng)用抗生素，其產(chǎn)生菌 為1979年采自福建武夷山區(qū)的一株鏈霉菌——不吸水鏈霉菌武夷變種(Str印tomyces ahygroscopicus var. wuyiensis)。武夷霉素為水溶性兩性物質(zhì)，目前已分離出組分A、B， 其中經(jīng)鑒定確認(rèn)組分A為具有胞苷骨架的核苷類抗生素。是國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)的新型核苷類抗生素。多抗菌素(polyoxin)又稱多氧霉素、多效霉素、保利霉素，是一種多組分水溶性 廣譜抗菌素，屬內(nèi)吸性肽嘧啶核苷酸抗性素類殺菌劑。1965年由日本最早發(fā)現(xiàn)，我國于 1967年由中國科學(xué)院微生物研究所發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生菌為可可鏈霉菌阿索變種(Str印tomyces cacaoi var. asoensis)。中國的多抗霉素主要成分是多抗霉素A (polyoxin Α)和 B (polyoxin B)，由A至N共14種不同的同系物組成的混合物，商品中多抗霉素A和B的混 合物含量為84%。寧南霉素(ningnanmycin)是一種具有胞嘧啶核苷肽結(jié)構(gòu)的廣譜殺菌核苷類抗生 素，由諾爾其j 鏈霉菌西昌變禾中(Streptomyces noursei var. xichangensis)產(chǎn)生。其氨基 酸組分僅L型絲氨酸區(qū)別于谷氏菌素的D型絲氨酸?？捎糜诜乐味喾N作物細(xì)菌病害及病毒病害?？姑咕?20(TF-120)是由刺孢吸水鏈霉菌北京變種產(chǎn)生的另一種嘧啶核苷類 抗生素，廣譜抗真菌。其主要組分120-B經(jīng)提純鑒定是下里霉素(harimycin)，次要組分為 120-A 和 120-C 類似潮霉素 B(hygromycin B)和星霉素(asteromycin)。抑霉菌素(yimeimycin)為刺孢吸水鏈霉菌天目山亞種(Streptomyceshygrospinosis var. tianmushanensis η. var. Sang et al)產(chǎn)生白勺一禾中核^f 類抗生素，產(chǎn)生菌對白色假絲酵母、白粉病菌、紋枯病菌等真菌有抑制活性，對灰霉病菌、枯 萎病菌、稻瘟病菌的生長有較強的抑制活性。慶豐霉素(qingfengmeisu)是一種堿性水溶性胞嘧啶核苷類抗生素，由慶豐鏈霉 菌(Sti^ptomyces qingfengmyceticus)產(chǎn)生，其分子結(jié)構(gòu)中含有與滅瘟素相似的胞嘧啶組 分-胞啶嚀，是一種高效、無殘留、對人畜安全、用途廣泛的核苷類抗生素。滅粉霉素(mildiomycin)是1971年從新幾內(nèi)亞土壤中的 Streptomycesrimofaciens B-98891培養(yǎng)液中提取的一類堿性核苷類抗生素。其結(jié)構(gòu)中還 有5-羥甲基胞嘧啶。M9M (ezomycin)是北澤鏈霄菌(Streptomyces kitazawaensis)產(chǎn)生的一種啼 啶核苷類抗生素，由Al、A2、Bi、B2、Cl、C2、Dl、D2等8種組分組成，其主要成分為Al，是一 種具嘧啶苷結(jié)構(gòu)的抗生素。由放線菌Sti^ptomycesnitrazawaensis的近緣種產(chǎn)生，對灰霉 病有較好的防治作用。它的殺菌譜較窄，對人畜十分安全，對魚類毒性也很低。N9705是云南省工業(yè)微生物發(fā)酵工程重點實驗室從成都市郊區(qū)土壤中分離到一 株鏈霉菌，它能夠代謝產(chǎn)生一種胞嘧啶核苷衍生物-N物質(zhì)(命名為N9705)。譜圖分析顯 N9705是肽酰胞嘧啶核苷，而且活性試驗表明此核苷具有廣譜抗植物病原真菌、殺線蟲作用 及抗腫瘤、抗病毒活性。本實驗室在進(jìn)行微生物代謝產(chǎn)物的研究過程中，發(fā)現(xiàn)一株放線菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生一種 新的化合物，該化合物有很好的廣譜抗菌生物活性，尤其對革蘭氏陽性菌、植物病毒的抑制 活性很強，是一種新的抗生素，我們將其命名為新奧霉素。研究人員經(jīng)過長期大量的研究工 作，完成了該化合物的分離純化、理化性質(zhì)研究、結(jié)構(gòu)鑒定；對該放線菌進(jìn)行了菌種遺傳改 良，獲得了高產(chǎn)菌株，并研究獲得了高產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)該新抗生素的優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，從 而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的之一，是提供一種新結(jié)構(gòu)的抗菌化合物，命名為新奧霉素；本發(fā)明的目的之二，是提供一種用于生產(chǎn)新奧霉素的新菌株；本發(fā)明的目的之三，是提供一種“批次液體培養(yǎng)基流加補料發(fā)酵工藝”，發(fā)酵生產(chǎn)
新奧霉素；本發(fā)明的目的之四，是提供用于生產(chǎn)新奧霉素的培養(yǎng)基。更具體地說，本發(fā)明提供一種新結(jié)構(gòu)的抗菌化合物(新奧霉素)及其發(fā)酵制備方 法，包含以下步驟從一株采自貢嘎山土壤的放線菌“諾爾斯鏈霉菌”(Sti^ptomyces noursei)的發(fā) 酵液中，經(jīng)分離、鑒定獲得一種新結(jié)構(gòu)的抗菌化合物(新奧霉素)。將能夠產(chǎn)生新奧霉素的放線菌“諾爾斯鏈霉菌”(Sti^ptomyces noursei)及其遺 傳改良菌株，在一級液體培養(yǎng)基(例如，下文所述的培養(yǎng)基A)中培養(yǎng)，作為種子液；將培養(yǎng) 好的種子液接種到第二級液體培養(yǎng)基(例如，下文所述的培養(yǎng)基B)中培養(yǎng)；第二級液體培 養(yǎng)基接種第一級種子液后培養(yǎng)一段合適的時間，開始進(jìn)行流加補料液(例如，下文所述的補料液C)的補料發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，從上述發(fā)酵培養(yǎng)液中收集新奧霉素，并進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定。本發(fā)明的具體實施方案是，采用“諾爾斯鏈霉菌”(Str印tomyces noursei)及其遺 傳改良菌株“諾爾斯鏈霉菌XiAo-3” (Streptomyces noursei XiAo-3)，在液體培養(yǎng)基中進(jìn) 行二級發(fā)酵培養(yǎng)，在每級發(fā)酵階段選用不同的培養(yǎng)基，例如下文所述的培養(yǎng)基A、B。在第二 級發(fā)酵中，接種第一級種子液后，在適合的溫度下培養(yǎng)一段時間，例如，在26°C _32°C發(fā)酵 培養(yǎng)4-30小時后，選用合適的補料液，例如下文所述的補料液C，進(jìn)行流加補料發(fā)酵培養(yǎng)。第二級液體培養(yǎng)流加補料(例如補料液C)的方式可以采用連續(xù)(勻速或非勻速) 流加和/或間歇式流加方式，連續(xù)流加方式是優(yōu)選的。所述的連續(xù)(勻速或非勻速)流加方式，是以一定的流加速率，如0.01-4. OL/h， (勻速或非勻速)將適合的補料液(例如補料液C)連續(xù)流加入第二級發(fā)酵罐中，直至停止 發(fā)酵(下罐)前大約6-12小時。所述的間歇式流加方式，是以間隔一段時間加一次料的方式，間歇式將適合的補 料液(例如補料液C)流加入第二級發(fā)酵罐中。間歇時間優(yōu)選為每隔1-24小時補料2-10 次，優(yōu)選為間隔2-5小時補料1次。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)需要，采用其他的適合時間 間隔補料。發(fā)酵條件溫度26°C -32°C，PH :6_8發(fā)酵時間2-4天發(fā)酵結(jié)束后，采用薄膜濃縮技術(shù)方法濃縮發(fā)酵液。具體為，將發(fā)酵液經(jīng)微濾去除 菌體、不溶性蛋白、膠體及其它大分子物質(zhì)，微濾的操作壓力為0. 1-0. 8Mpa，操作溫度為 1-50°C，濾出液占進(jìn)料液體積20% -90%，透析水量占進(jìn)料液體積的30% -90%°C，合并濾 出液，備用。將微濾濾出液再經(jīng)納濾濃縮，所得濃縮液，減壓蒸干，獲得褐色膏狀粗提取物。粗提取物再經(jīng)正相硅膠層析，洗脫劑采用氯仿甲醇水=5 5 0.7，洗脫液 用管碟法進(jìn)行活性跟蹤檢測，收集活性部分；正相硅膠層析的活性部分再用反相硅膠層析 分離，洗脫劑用甲醇水=2 8，得到的活性樣品進(jìn)行高效液相色譜純化制備(制備條件 色譜柱為 SP-120-5-0DS-BI0 4. 6mIDmX150mm，流動相甲醇水=2 8，流速0. 8ml/min, 進(jìn)樣量10ul，檢測器SPD-10A)，獲得一種具有抑菌作用的白色粉末狀單一化合物(新奧霉 素)。通過對該單一化合物的紫外_可見光波段掃描分析、質(zhì)譜分析、分子量測定、一 維和二維核磁共振分析等，獲得該單一化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)為1-尿嘧啶-4-肌氨酰-絲氨 酰氨基-1，4- 二脫氧-β -D-吡喃葡萄糖醛酸，其結(jié)構(gòu)有三大構(gòu)件尿嘧啶、氨基己糖和二 肽，具有典型的核苷肽類化合物的特性，屬于尿嘧啶己糖二肽，其分子量為445，分子式為 C16H23N5Oltl，其特征在于紫外光下顯黃綠色熒光、茚三酮反應(yīng)陽性、雙縮脲反應(yīng)陽性；其化學(xué) 結(jié)構(gòu)為
權(quán)利要求
一種抗菌化合物，命名為新奧霉素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下F2009100601214C0000011.tif
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于該化合物的分子量為445，分子式為 C16H23N5Oltl，化學(xué)名稱為1-尿嘧啶-4-肌氨酰-絲氨酰氨基-1，4- 二脫氧-β -D-吡喃葡萄 糖醛酸，屬于尿嘧啶己糖二肽，紫外光下顯黃綠色熒光、茚三酮反應(yīng)陽性、雙縮脲反應(yīng)陽性。
3.權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，其特征是采用放線菌諾爾斯鏈霉菌 Streptomyces noursei及其遺傳改良菌株，在一級液體培養(yǎng)基A中培養(yǎng)，作為種子液；將培 養(yǎng)好的種子液接種到第二級液體培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，并進(jìn)行流加補料液C的補料發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā) 酵結(jié)束后，從發(fā)酵培養(yǎng)液中分離純化出該結(jié)構(gòu)化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物的制備方法，其特征是諾爾斯鏈霉菌Streptomyces noursei的遺傳改良菌株為諾爾斯鏈霉菌XiAo-3，Streptomyces noursei XiAo-3，已于 2009年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2898。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物的制備方法，其特征是所述培養(yǎng)基A的組成質(zhì)量 百分比為葡萄糖0.5% -5.0%，蛋白胨0.3% -5.0%，玉米粉0.5% -5. O %，大豆餅粉 0. 5% -5. 0%，酵母粉 0. 1% -2. 0%，硫酸鎂 0. 05% _1.0%，磷酸二氫鉀 0. 1% -1.0%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物的制備方法，其特征是所述的培養(yǎng)基B的組成質(zhì)量百分比為成分—-般范圍優(yōu)選范圍淀粉0.1% -5.(3%0.3% -3 0%甘油0.1% -3.(3%0.3% -3 0%蔗糖/糖蜜0. 1% -4.0%0. 3% -3. 0%硫酸銨0.01% -2.0%0.1% -2, 0%葡萄糖0.1% -10.0%0.5% -6, 0%蛋白胨0.3% -10.0%0.5% -8, 0%黃豆粉或黃豆粉水解液0.1% -10.0%0.5% -5 0%花生粉或花生粉水解液0.1% -10.0%0.5% -5 0%生物氮素0.1% -10.0%0.5% -5 0%玉米粉0.1% -10.0%0.5% -5 0%酵母粉0.01% -4.0%0.1% -2. 0%磷酸氫二鉀0.01% -5.0%0.05% -1. 0%硫酸鎂0.01% -5.0%0.05% -1. 0%氯化鈉0.01% -5.0%0.05% -1. 0%氯化鈣0.01%-5.0%0.05% -1.0%
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物的制備方法，其特征是所述的補料液C的的組成質(zhì) 量百分比為成分一般范圍優(yōu)選范圍蔗糖/糖蜜0. 1%-4. 0%0. 3%-3. 0%葡萄糖0. 1% --10. 0%0. 5% --6. 0%淀粉0. 1% --5. 0%0. 3% --3. 0%黃豆粉或黃豆粉水解液0. 1% --10. 0%0. 5% --5. 0%花生粉或花生粉水解液0. 1% --10. 0%0. 5% --5. 0%過氧化氫0. 01%-5. 0%0. 05%-2. 0%酵母粉0. 01%-4. 0%0. 1% --2. 0%
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物的制備方法，其特征是所述的流加補料的方式為連 續(xù)流加或/和間歇流加方式，連續(xù)流加方式是優(yōu)選的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物的制備方法，其特征是采用連續(xù)流加方式是以 0.01-4. OL/h的速度連續(xù)流加補料液C，直至停止發(fā)酵前6-12小時；采用間歇式流加補料液 方式是每隔1-24小時補料2-10次，優(yōu)選為每隔2-5小時補料1次，每次補料量為發(fā)酵液總 體積^O. 01% -1.5%,優(yōu)選為 0. 05% -0. 3%0
10.權(quán)利要求1所述的抗菌化合物在農(nóng)藥或醫(yī)藥產(chǎn)品制造中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌化合物及其發(fā)酵制備方法和用途。本發(fā)明抗菌化合物，分子量為445，分子式為C16H23N5O10，化學(xué)名稱為1-尿嘧啶-4-肌氨酰-絲氨酰氨基-1，4-二脫氧-β-D-吡喃葡萄糖醛酸，屬于尿嘧啶己糖二肽，命名為新奧霉素。采用放線菌諾爾斯鏈霉菌Streptomyces noursei及其遺傳改良菌株，在一級液體培養(yǎng)基A中培養(yǎng)，作為種子液；將培養(yǎng)好的種子液接種到第二級液體培養(yǎng)基B中培養(yǎng)，并進(jìn)行流加補料液C的補料發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵結(jié)束后，從發(fā)酵培養(yǎng)液中分離純化出該結(jié)構(gòu)化合物。該抗菌化合物用于農(nóng)藥或醫(yī)藥產(chǎn)品的制造。本發(fā)明具有產(chǎn)率高、工藝簡單、易于工業(yè)化的特點。
文檔編號C07K5/062GK101967182SQ20091006012
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者劉 東, 周金燕, 李志東, 楊杰, 肖亮, 譚紅, 鐘娟 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所