專利名稱：一種自組裝短肽及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于自組裝短肽領(lǐng)域，特別涉及一種自組裝短肽及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自組裝短肽是一種新型的納米生物材料，自20世紀(jì)90年代問世以來，受到了人們 的廣泛重視，得到了快速的發(fā)展，己合成出多種不同結(jié)構(gòu)的自組裝短肽，并在細(xì)胞三維 培養(yǎng)及制備疏水藥物載體、止血藥物、燒傷治療藥物、抑菌藥物等方面應(yīng)用。但是，制 備出更多的自組裝短肽、擴(kuò)大自組裝短肽的應(yīng)用范圍仍然是科技工作者關(guān)注的問題。癌癥是影響人類健康的主要疾病之一，每年約有七百萬患者死于癌癥，約占全世界 死亡人口的12.5%。專家預(yù)測(cè)，至2020年，每年癌癥患者將增至一千六百萬(見World Health Organization: Cancer, www.who.int/cancer/en/ Accessed February, 2007)。 因it匕，吸 引了不同領(lǐng)域的科技人員加入到癌癥治療相關(guān)的研究中。然而過去50年以來，盡管人 們付出了巨大努力，癌癥治療所取得的進(jìn)展卻不盡人意。在癌癥治療的最早階段，人們普遍采用手術(shù)切除和放射性治療，但往往不能達(dá)到有 效根除腫瘤，同時(shí)在治療過程中所產(chǎn)生的副作用，使患者承受了巨大的生理和精神痛苦 (見Chabner BA & Roberts Jr. (2005) Nat Rev Cancer 5, 65-72.)。在此情況下，化療 逐步成為癌癥治療的主要手段。但是，絕大多數(shù)抗癌藥物在體內(nèi)是處于自由擴(kuò)散狀態(tài)， 這一方面導(dǎo)致藥物不能在病灶區(qū)達(dá)到治療所需濃度，致使療效減弱；另一方面，抗癌藥 物的自由擴(kuò)散也勢(shì)必對(duì)機(jī)體的其它正常組織器官造成一定的副作用(見Sinha R， Kim GJ， Nie S, & Shin DM (2006) Mol Cancer Ther 5, 1909-1917. LerouxJ -C, Allemann E, De Jaeghere F, Duelker E & Gurny K(1996;) J Control Release30,"9-50.)。2001年，Shin S.Y.等人公開了一種短肽S18 (見Shin S, Lee S, Yang S， Park E， Lee D， Lee M, Eom S, Song W, Kim Y， Hahm K, W a/. (2001) J尸五iTi 五S 58， 504-514.即為該文 獻(xiàn)中的P18肽段)，根據(jù)文獻(xiàn)記載，S18短肽具有殺傷腫瘤細(xì)胞K562、 Jurkat、 MDA-MB-3 61的特性，且對(duì)正常細(xì)胞NIH 3T3的殺傷作用很弱。但文獻(xiàn)中僅報(bào)道了該肽段在體外 細(xì)胞水平上的抗腫瘤作用，沒有進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤自組裝短肽，此種短肽通過自組裝作用聚集在腫瘤病灶區(qū)，而不在體內(nèi)自由擴(kuò)散，從而提高其在腫瘤病灶區(qū)的濃度，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的 殺傷力。本發(fā)明所述自組裝短肽，命名為R418，由抗腫瘤活性肽段S18、自組裝肽段 RADA16-I和連接肽段組成，抗腫瘤活性肽段S18位于自組裝肽段RADA16-I的羧基端， 二者之間通過連接肽段連接，其分子模型如圖3A所示，其氨基酸序列為序列表中SEQ IDNO.l所述，其分子量為4344.9 (見圖2)。所述自組裝肽段RADA16-I是一種離子互 補(bǔ)肽，有16個(gè)氨基酸，分子長(zhǎng)度大約為5nm，其組成出現(xiàn)極性和非極性氨基酸殘基交替； 側(cè)鏈分為兩部分， 一個(gè)為極性的，另一個(gè)為非極性的；內(nèi)部的非極性殘基通過疏水作用 形成分子間的相互作用，帶正、負(fù)電荷的殘基通過離子互補(bǔ)鍵在分子間也形成相互作用， 從而最終自組裝形成納米纖維(見Zhang S. Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly. Nature biotechnology. 2003, 21: 1171-1178.)。普遍而言，物質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定物質(zhì)的功能，首先采用原子力顯微鏡和透射電鏡觀察到 R418分子在溶液中通過自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，而單獨(dú)合成的S18分子沒有相應(yīng)的 納米結(jié)構(gòu)，從而證明R418分子具備自組裝和分子聚集的能力，而S18分子則缺乏相應(yīng) 的自組裝能力(見實(shí)施例4、實(shí)施例5)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述自組裝短肽R418很明顯地引起腫瘤細(xì)胞K562、 Jurkat、 MDA-MB-435S的死亡，而對(duì)NIH 3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低(見實(shí)施例6)。針 對(duì)K562細(xì)胞的進(jìn)一步研究，驗(yàn)證了自組裝短肽R418對(duì)K562具有很強(qiáng)的殺傷力(見實(shí) 施例7、實(shí)施例8)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述自組裝短肽R418與短肽S18相比，抑制K562腫瘤細(xì) 胞的效果更好，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷力(見實(shí)施例9)。小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述自組裝短肽R418與短肽S18相比，R418自 組裝后，在體內(nèi)腫瘤區(qū)域的局部濃度保持時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于S18局部濃度保持時(shí)間(見實(shí)施 例10)。本發(fā)明所述自組裝短肽R418可以通過添加藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床使用的抗腫瘤藥物。 本發(fā)明具有以下有益效果1、 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述自組裝短肽R418很明顯地引起腫瘤細(xì)胞的死亡，而對(duì) NIH 3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低。2、 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述短肽R418具備自組裝和分子聚集的能力，能長(zhǎng)時(shí)間在體 內(nèi)腫瘤區(qū)域保持較高濃度，而不自由擴(kuò)散。3、 本發(fā)明所述自組裝短肽R418不僅能在體內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而且與短肽S18相比，抑制腫瘤的效果更好。4、 本發(fā)明為癌癥的治療提供了一種有效的新藥品，具有明顯的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效顯。


圖1是本發(fā)明所述自組裝短肽R418的高壓液相色譜(HPLC)圖譜。 圖2是本發(fā)明所述自組裝短肽R418的質(zhì)譜圖,。圖3是模型示意圖，圖中，A為本發(fā)明所述自組裝短肽R418的分子模型示意圖，B 為本發(fā)明所述自組裝短肽R418形成的自組裝納米纖維模型示意圖。圖4是原子力顯微鏡(AFM)圖譜，圖中，A、 C為本發(fā)明所述自組裝短肽R418 形成的納米纖維的AFM圖譜(其中，A為5X5um區(qū)域內(nèi)R418的納米纖維AFM圖， C為2X2um區(qū)域內(nèi)R418的納米纖維AFM圖)；E為C圖中黑色線段標(biāo)注處的R418 納米纖維截面圖；B、 D為自組裝肽段RADA16-I形成的納米纖維的AFM圖譜(其中， B為5X5um區(qū)域內(nèi)RADA16-I的納米纖維AFM圖，D為2X2"m區(qū)域內(nèi)RADA16-I 的納米纖維AFM圖。)；F為D圖中黑色線段標(biāo)注處的RADA16-I納米纖維截面圖； G、 H為抗腫瘤活性肽段S18的AFM圖譜(其中，G為5X5um區(qū)域內(nèi)S18的AFM 圖，H為2X2um區(qū)域內(nèi)S18的AFM圖)。圖5是本發(fā)明所述自組裝短肽R418的透射電鏡(TEM)圖像。圖6是R418、 S18及RADA16-I三種肽溶液對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)MTT測(cè)定圖，圖中， A是R418、 S18及RADA16-I三種肽溶液對(duì)K562的毒性實(shí)驗(yàn)MTT測(cè)定圖，B是R418、 S18及RADA16-I三種肽溶液對(duì)Jurkat的毒性實(shí)驗(yàn)MTT測(cè)定圖，C是R418、 S18及 RADA16-I三種肽溶液對(duì)MDA-MB-435S的毒性實(shí)驗(yàn)MTT測(cè)定圖，D是R418、 S18 及RADA16-I三種肽溶液對(duì)MDA-MB-231的毒性實(shí)驗(yàn)MTT測(cè)定圖，E是R418、 S18 及RADA16-I三種肽溶液對(duì)NIH 3T3的毒性實(shí)驗(yàn)MTT測(cè)定圖。圖7是對(duì)照溶液(Control) H20及肽溶液(R418、 S18、 RADA16)作用K562細(xì)胞的 熒光顯微圖。圖8是對(duì)照溶液(Control) H20及肽溶液(R418、 S18及RADA16)作用K562細(xì)胞 的流式細(xì)胞分析圖,圖中，A為對(duì)照溶液(Control)流式細(xì)胞分析圖，B為R418肽溶液流 式細(xì)胞分析圖，C為RADA16-I肽溶液流式細(xì)胞分析圖，D為S18肽溶液流式細(xì)胞分析圖。 圖9是對(duì)照溶液(Control) H20及肽溶液(R418、 S18)對(duì)K562細(xì)胞裸鼠移植瘤的作 用效果圖，圖中，A為動(dòng)物形貌對(duì)比圖，B為腫瘤大小對(duì)比圖，C為瘤重對(duì)比圖，D為腫瘤組織切片對(duì)比圖。圖10是短肽R418和S18分子的小動(dòng)物體內(nèi)活體成像圖，圖中，A為裸鼠成瘤圖， B為低濃度(0.4mM) R418和S18分子的體內(nèi)活體成像對(duì)比圖，C為高濃度(4mM) R418和S18分子的體內(nèi)活體成像對(duì)比圖。具體實(shí)施方^實(shí)施例l:自組裝短肽R418的制備1、 試劑PyBOP (六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基三吡咯烷基磷)、Boc-Phe-Merrifieldresin 樹脂、六氫吡啶、二甲基吡啶、TFA(三氟乙酸)、HPLC甲醇、保護(hù)氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-Ala-OH 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-His(Trt)-OH 、 Fmoc-Phe陽OH、 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc-Ile-OH 、 Fmoc-Trp-OH 、 Fmoc誦Gly-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Arg(Pmc)隱OH.IPE)、 thioanisole (茴香硫醚)、EDT (乙 二硫醇)、TIS (甲乙硫醚)、HOBT (l-羥基苯并三唑)為Merck公司產(chǎn)品；DMF (二 甲基甲酰胺)為韓國(guó)三星公司產(chǎn)品；NMM (甲基瑪菲林)購(gòu)自Sigma公司；DCM(二 氯甲烷)、苯酚、三乙胺為中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；甲醇為上海 振興化工一廠產(chǎn)品；四氫呋喃為上海化學(xué)試劑站中心化工廠產(chǎn)品。2、 儀器431A型多肽合成儀為Applied biosystems產(chǎn)品；高效液相色譜為安捷倫1100色譜 儀，制備色譜儀為WATERS600E;冷凍干燥機(jī)(FREEZE DRYER 18)為L(zhǎng)ABCONCO 產(chǎn)品；質(zhì)譜儀為FinniganLCQ。3、 制備方法 (1)肽鏈的合成接肽前樹脂處理① 稱取200毫克Boc-Phe-Merrifield resin到砂芯過濾反應(yīng)器中；② 加入二氯甲垸浸泡洗滌6次，每次5毫升，過濾除去洗滌的二氯甲烷；③ 加入10。/。的TFA (二氯甲烷作溶劑)5毫升，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以除去樹脂上氨 基酸N端的BOC保護(hù)基④ 加入二氯甲垸浸泡洗滌3次，每次5毫升，然后加入5%的三乙胺(二氯甲烷作 溶劑)5毫升，2次中和PH值后再用二氯甲垸洗滌6次，DMF洗滌5次即可放入儀器 反應(yīng)器中進(jìn)行接肽反應(yīng)。接肽在431A自動(dòng)合成儀上進(jìn)行，稱取30mg Phe-MerrifieW resin放入反應(yīng)器中，然后按照多肽的序列順序從羧基端逐漸加入保護(hù)氨基酸(反應(yīng)過程中加入的保護(hù)氨基酸并 不是一次全部加入反應(yīng)容器，而是按照多肽的序列順序從羧基端逐漸加入，在加入氨基酸的同時(shí)要加入相同摩爾的PyBOP試劑和HOBT試劑)。具體而言，首先加入保護(hù)氨基 酸Fmoc-Lys(Boc)-OH、 PyBop、 HOBT、 NMM，反應(yīng)20分鐘后，經(jīng)DMF洗滌5遍， 然后加入配制好的六氫吡啶，此步用來脫除樹脂上的FMOC保護(hù)基團(tuán)，大約10分鐘， 在脫除FMOC后，用DMF洗滌樹脂5次，把六氫吡啶清洗干凈，以確保下一步反應(yīng)的 順利進(jìn)行(參見以下簡(jiǎn)要步驟)(a) Fmoc-Lys(Boc)-OH 29.52mg(b) PyBOP 123.63mg(c) HOBt+H20 475.20^1(d) NMM 365単(e) 30%六氫吡啶 900W x 2次(f) DMF 900^1 x 5次按照以上接肽實(shí)驗(yàn)步驟，重復(fù)循環(huán)反應(yīng)以加長(zhǎng)肽鏈，不同之處在于需變換(a)原料，(a)原料的變換順序與多肽羧基端至氨基端的序列相應(yīng)，具體而言(a)原料應(yīng)分別依 次變換為Fmoc-Lys(Boc)隱OH (29.52mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Leu-OH (22.27mg)、 Fmoc-His(Trt)-OH G9.05mg)、 Fmoc-Leu國(guó)OH (22.27mg)、 Fmoc-Phe-OH (24,41mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc隱Pro陽OH (21.26mg)、 Fmoc-Ile-OH (22.27mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc國(guó)Lys(Boc)隱OH (29.52mg)、 Emoc-Phe-OH (24.41mg)、 Fmoc-Leu-OH (22.27mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc-Trp-OH (26.87mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc-Pro-OH (21.26mg)、 Fmoc-Pro-OH (21.26mg)、 Fmoc-Pro-OH (21.26mg)、 Fmoc-Gly陽OH (18.74mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (25.93mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)-OH.IPE (48.20mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH(25.93mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)-OH.IPE (48.20mg)、 Fmoc陽Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (25.93mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)-OH.IPE (48.20mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)陽OH(25.93mg)、 Fmoc陽Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)陽OH.IPE (48.20mg)、乙?；?試劑(3ml)。接完多肽的樹脂經(jīng)過甲醇清洗后干燥。然后全部轉(zhuǎn)移至玻璃茄形瓶中，加入60毫升無水甲醇并冰浴到-20度時(shí)緩慢的通入氨氣，使其溫度保持在O度以下，通入氨氣時(shí) 間為90分鐘，然后密封振搖24小時(shí)取出，過濾收其濾液并濃縮抽干(這一步是將多肽 從樹脂上切下并酰胺化)，再加入事先配好并預(yù)冷的切肽試劑5ml (81.5%TFA、 5%thioanisole、 5%phenol、 5%water、 2.5%EDT、 1%TIS)。 25。C下攪拌反應(yīng)3小時(shí)。取 出過濾，收集濾液；樹脂用少量三氟乙酸洗3次，將洗滌液與濾液合并，濃縮后冷卻， 然后加入10ml冷乙醚使多肽沉淀，離心收集沉淀，真空干燥。得粗品約60mg。 (2)肽鏈的純化先采用安捷倫1100分析系統(tǒng)確定目標(biāo)肽，使用C18反相柱子，條件為A相為95% 的水(甲醇配比)，B相為95%的甲醇(甲醇配比)，然后各加O.l 。/。的TFA ，常規(guī)條件 在上樣品之前先用A相平衡柱子15分鐘，然后上樣，從A相到B相為25分鐘梯度洗 脫。檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，流速:lmL/min。收集目標(biāo)肽，然后做質(zhì)譜鑒定。再根據(jù)目標(biāo)多 肽的出峰時(shí)間來確定本條多肽的最佳洗脫梯度。確定目標(biāo)肽后，釆用Waters600E純化系統(tǒng)進(jìn)行多肽制備使用C18反相制備柱子， 條件為八相為95%的水(乙腈配比)，B相為95。/。的甲醇(乙腈配比)，然后各加0.1% 的TFA ，常規(guī)條件從A相到B相為70分鐘梯度。檢測(cè)波長(zhǎng)220nm,流速36mL/min， 先用A溶液平衡柱子，上樣后，從A到B溶液梯度洗脫，收集多肽洗脫峰，然后與分 析儀器配合確定樣品的目標(biāo)峰，所獲產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥即得本發(fā)明所述自組裝短肽R418, 其氨基酸序列為序列表中SEQ IDNO.l所述。實(shí)施例2:自組裝短肽R418的高效液相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)將實(shí)施例1制備的自組裝短肽R418采用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)(檢測(cè)條件A 相為5%的乙腈+O. 1%的三氟乙酸；8相為95%的乙腈+O. 1%的三氟乙酸；直線梯度為20 分鐘)，檢測(cè)結(jié)果見圖l，根據(jù)圖1中的譜峰面積確定其純度達(dá)到了95%。將實(shí)施例1制備的自組裝短肽R418采用質(zhì)譜(質(zhì)譜儀為Finnigan LCQ)檢測(cè)，檢 測(cè)結(jié)果見圖2，根據(jù)圖2可確定其分子量為4344.9(理論分子量為4344.11)，表明所合成 短肽確為所設(shè)計(jì)肽。實(shí)施例3: R418抗腫瘤自組裝短肽的三維分子模型及自組裝模型繪制 對(duì)實(shí)施例1制備的自組裝短肽R418采用專業(yè)Molsoft. ICM畫圖軟件基于能量最小 化原理繪制三維分子模型示意圖，所繪制的三維分子模型示意圖見圖3A，通過該示意圖， 可清楚的知道其氨基酸的空間分布，該示意圖顯示，抗腫瘤活性肽段S18位于自組裝肽段RADA16-I的C端，二者之間通過連接區(qū)連接。實(shí)施例'l制備的自組裝短肽R418在水中可形成自組裝納米纖維，對(duì)所述自組裝短 肽R418形成的自組裝納米纖維采用專業(yè)Molsoft. ICM畫圖軟件基于能量最小化原理繪 制三維分子模型示意圖，所繪制的三維分子模型示意圖見圖3B。該示意圖顯示，眾多 R418分子自組裝形成一段納米纖維。 '實(shí)施例4:原子力顯微鏡檢測(cè)三種短肽分子的自組裝性能1、 實(shí)驗(yàn)材料短肽樣品R418 (實(shí)施例1制備，下同)、S18 (購(gòu)自上海波泰生物科技有限公司，下同)、 RADA16-I (購(gòu)自BD Bioscience, Bedford, MA.下同)。主要溶液無菌去離子水H20: 18 Millipore Milli-Q system,高壓滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?下同)。2、 主要實(shí)驗(yàn)儀器原子力顯微鏡AFM (SPA400, SIINanotechnology， Inc.)3、 實(shí)驗(yàn)方法(1) 用去離子水配置RADA16-I、 R418及S18的工作液，其終濃度為100pM。(2) 分別將配置的RADA16-I、 R418及S18工作液5微升均勻涂于新剝光的三片云母片表面。(3) 針對(duì)RADA16-I，當(dāng)涂片完成后約30s，以1000ul去離子水沖洗除去未附著 的短肽。(4) 將上述各短肽工作液涂片在室溫中空氣干燥。(5) 在氣相中對(duì)云母片進(jìn)行AFM掃描，用SPI4000的記錄模式收集AFM圖像。 使用20um掃描器(400)、 Olympus Si-DF20微懸臂，及彈簧常量為12.00N/m的針(Si，半徑10nm，矩形基底200.00um)。懸臂的自由共振頻率為127.00kHz。相位圖以 512X512像素的解析度記錄。為顯示自組裝短肽的細(xì)微納米結(jié)構(gòu)，對(duì)每個(gè)樣本均采用5 X5um、 2X2um的范圍進(jìn)行掃描。4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果短肽ADA16-I、 R418及S18工作液的原子力顯微(AFM)圖像見圖4，圖4顯示， 在短肽RADA16-I和R418溶液中可以觀察到納米纖維(見圖4A—D)，而且R418中的納米纖維比RADA16-I中的納米纖維寬(圖4E、 F);在短肽S18溶液中未觀察到納 米纖維(見圖4G、 H)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明短肽ADA16-I 、 R418分子具備自組裝和分子 聚集的能力，短肽S18分子則缺乏相應(yīng)的自組裝能力。實(shí)施例5:透射電子顯微鏡檢測(cè)短肽R418分子的自組裝性能 1、實(shí)驗(yàn)材料短肽樣品R418主要溶液去離子水H20PBS溶液(pH7.4): 8.0g/L NaCl + 0.2g/L KC1 + 1.56g/L Na2HP04 -H20 + 0.20g/L KH2P04,用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4。 ？BS高壓滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?、 主要實(shí)驗(yàn)儀器透射電子顯微鏡(TEM,H-600, Hitachi)3、 實(shí)驗(yàn)方法(1) 以去離子水或PBS (pH7.4)配制R418至終濃度為100pM的工作液，用于透 射電子顯微鏡的觀察。(2) 取少量工作液用1%磷鎢酸負(fù)染用潔凈的吸頭吸取一滴(約10-30pL)樣品 滴于潔凈的載玻片表面，用鑷子小心地夾取一塊由Formvar膜覆蓋的TEM銅網(wǎng)，在樣 品滴上輕輕蘸取少量樣品溶液，靜置數(shù)秒，待樣品與銅網(wǎng)充分結(jié)合后，再用銅網(wǎng)蘸取少 量1%的磷鴨酸，對(duì)已吸附的肽溶液進(jìn)行負(fù)染色。(3) 用濾紙吸干銅網(wǎng)上多余的溶液，在空氣中靜置數(shù)分鐘待銅網(wǎng)干燥。(4) 以TEM (H-600, Hitachi)掃描銅網(wǎng)，直接觀察銅網(wǎng)上的短肽自組裝結(jié)構(gòu)。4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果短肽R418溶液的透射電子顯微鏡(TEM)圖像見圖5，圖5顯示，在短肽R418 溶液中可以觀察到納米纖維。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明R418分子可以在水溶液中自組裝成納米纖維。實(shí)施例6: MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料(1)短肽樣品R418水溶液(無菌去離子水H20配置，下同)；S18水溶液(無菌去離子水H20配置，下同)；RADA16-I水溶液(無菌去離子水H20配置，下同)。(2) 細(xì)胞株白血病細(xì)胞株，K562 (ATCC序號(hào)CCL-243 ,下同)和Jurkat (ATCC序號(hào) TIB-152 ,下同)；乳腺癌細(xì)胞株，MDA-MB-435S (ATCC序號(hào)HTB-129 ,下同) 及MDA-MB-231 (ATCC序號(hào)HTB-26 ,下同)；對(duì)照細(xì)胞，NIH 3T3 (ATCC序號(hào) CRL-1658TM，下同)。(3) 主要溶液PBS(pH7.4): 8.0g/L NaCl + 0.2g/L KCl + 1.56g/L Na2HP04 .H20 + 0.20g/L KH2P04, 用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4。 PBS高壓滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩TT溶液稱取250mgMTT，放入小燒杯中，加50ml PBS在電磁力攪拌機(jī)上攪拌 30min，用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4'C保存?zhèn)溆茫瑑芍軆?nèi)有效。溶解液含有0.01M HC1的10%的SDS溶液。2、 主要實(shí)驗(yàn)儀器(1) 細(xì)胞操作用生物安全柜(NUAIRE， CLASS II )(2) 離心機(jī)(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R Centriflige)(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, 1X71)(4) C02培養(yǎng)箱(Thermo，HEPACLASS 100)(5) 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Gene Company limited, P Quant)3、 實(shí)驗(yàn)方法(1) K562細(xì)胞培養(yǎng)條件(下同)完全培養(yǎng)基的配制RPMI 1640培養(yǎng)基+抗生素(100 units/mL penicillin G ，100 u g/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購(gòu)自Invitrogen公司) 培養(yǎng)溫度37°C?？諝庖?%C02。(2) Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)條件(下同)完全培養(yǎng)基的配制RPMI 1640培養(yǎng)基+抗生素(100 units/mL penicillin G ,100" g/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購(gòu)自Invitrogen公司) 培養(yǎng)溫度37°C?？諝庖?%C02。(3) MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)條件(下同)完全培養(yǎng)基的配制Leibovitz's L-15培養(yǎng)基+抗生素(100 units/mLpenicillin G ，100 y g/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購(gòu)自Invitrogen公司) 培養(yǎng)溫度37°C?？諝庖鬅o<302。(4) MDA-MB-435S細(xì)胞培養(yǎng)條件(下同)完全培養(yǎng)基的配制Leibovitz's L-15培養(yǎng)基+抗生素(100 units/mL penicillin G ,100 yg/mLstreptomycin)十胰島素(0.01 mg/ml)， 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購(gòu)自 Invitrogen公司)培養(yǎng)溫度37°C?？諝庖鬅oC02。(5) NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)條件(下同)完全培養(yǎng)基的配制RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen)十抗生素(100 units/mL penicillin G, 100 ug/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購(gòu)自Invitrogen公司) 培養(yǎng)溫度37'C?？諝庖?%C02。(6) MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)步驟a. 接種細(xì)胞向96孔板的微孔中加入含有新鮮完全培養(yǎng)基(見上述各細(xì)胞培養(yǎng)條 件)的細(xì)胞懸濁液lOOpl，其中K562細(xì)胞接種量為5xl0S個(gè)/ L, Jurkat細(xì)胞接種量為2 X 104個(gè)/孔，NIH 3T3、 MDA-MB-435S及MDA-MB-231細(xì)胞接種量均為1X 104個(gè)/孔。b. 在相應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下孵育24小時(shí)。c. 加藥(短肽溶液)分別添加10pl不同濃度的R418, S18,RADA16-I溶液至不同 的已接種細(xì)胞的微孔中(最終體系的肽濃度梯度為20^M、 10pM、5nM、2.5pM、 1.25pM)， 實(shí)驗(yàn)在相同條件下進(jìn)行三個(gè)復(fù)孔的測(cè)量。在相應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下孵育48小時(shí)。d. 加MTT溶液向每孔添加20pMTT反應(yīng)液(5mg/mlMTT溶于PBS)， 37'C孵育 4小時(shí)。e. 加溶解液向每孔加入100^1包含0.01M HC1的10%的SDS溶液過夜，以溶解蘭紫色沉淀。f. 光吸收值(OD值)的測(cè)定用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定吸收光譜。g. 細(xì)胞存活率=(給藥組光吸收值一空白組光吸收值)/(對(duì)照組光吸收值一空白組光fl及收值)xiooy。。備注空白組指不含細(xì)胞和肽溶液，只含有相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)基的平行實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組 指以無菌去離子水H20代替肽溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的平行實(shí)驗(yàn)組。 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT分析顯示，48小時(shí)作用后，不同濃度的RADA16-I對(duì)腫瘤細(xì)胞和NIH 3T3細(xì) 胞的細(xì)胞毒性很低(見圖6 A-E)。與RADA16-I相對(duì)照，R418和S18很明顯地引起腫 瘤細(xì)胞K562、 Jurkat、 MDA-MB-435S的死亡(圖6 A-C)，而R418及S18對(duì)NIH 3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低(圖6E)。實(shí)施例7:熒光顯微鏡觀察1、 實(shí)驗(yàn)材料(1) 短肽樣品R418 (無菌去離子水H20配置，下同)； S18 (無菌去離子水H20配置，下同)； RADA16-I (無菌去離子水H20配置，下同)。(2) 細(xì)胞株白血病細(xì)胞株K562 (ATCC序號(hào)CCL-243 ,下同)。(3) 主要溶液PBS溶液(pH7.4):配制同實(shí)施例6，高壓滅菌后4'C保存?zhèn)溆?。Calcein AM : 4 mM in anhydrous DMSO (購(gòu)自Molecular Probes )Ethidium homodimer-12 mM in DMSO/H20 1:4 (v/v)(購(gòu)自Molecular Probes )2、 主要實(shí)驗(yàn)儀器(1) 細(xì)胞操作用生物安全柜(NUAIRE, CLASS II)(2) 離心機(jī)(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R Centrifoge)(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, 1X71)(4) C02培養(yǎng)箱(Thermo, HEPACLASS 100)3、 實(shí)驗(yàn)方法(1) 接種細(xì)胞向6孔板中加入含有新鮮完全培養(yǎng)基的K562細(xì)胞懸濁液4mL/孔， K562細(xì)胞接種量為5xl()4個(gè)/mL。(2) 在37'C、 5% C02的培養(yǎng)條件下孵育24小時(shí)。(3) 分別加入R418、 RADA16-I和S18短肽溶液400pL至不同的，已接種細(xì)胞的 微孔中，使肽溶液終濃度達(dá)到2(HiM，將6孔板在37'C、 5% C02的培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育12小時(shí)。
(4) 離心收獲K562細(xì)胞，用PBS溶液沖洗，去除培養(yǎng)基，最終將細(xì)胞混懸于2mL 的PBS溶液中。
(5) 加入calceinAM禾tl EthD-l熒光染料，.使calcein AM的終濃度為2|iM,使 EthD-l的終濃度為4nM，在室溫下將反應(yīng)體系避光作用40分鐘。
(6) 將6孔板置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
備注對(duì)照組(Control)指以無菌去離子水H20代替肽溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的平行實(shí)驗(yàn)組。 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
對(duì)照組(Control)和各實(shí)驗(yàn)組的熒光顯微圖像見圖7，圖7顯示，對(duì)照組(Control) 和用RADA16-I處理過的K562細(xì)胞死亡率很低，用R418和S18處理過的K562細(xì)胞死 亡率非常高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明R418和S18對(duì)腫瘤細(xì)胞K562具有很強(qiáng)的殺傷力。
實(shí)施例8:流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定
1、 實(shí)驗(yàn)材料
(1) 短肽樣品
R418 (無菌去離子水H20配置，下同)；
S18 (無菌去離子水H20配置，下同)；
RADA16-I (無菌去離子水H20配置，下同)。
(2) 細(xì)胞株
白血病細(xì)胞株K562 (ATCC序號(hào)CCL-243 ,下同)。
(3) 主要溶液
PBS(pH7.4):配制同實(shí)施例6，高壓滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?br> Vybrant Apoptosis Assay試劑盒# 7 (購(gòu)自Molecular Probes) <>
2、 主要實(shí)驗(yàn)儀器
(1) 細(xì)胞操作用生物安全柜(NUAIRE, CLASSII)
(2) 離心機(jī)(BEC薩N COULTER, Allegra X-22R Centrifuge)
(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, 1X71)
(4) C02培養(yǎng)箱(Thermo, HEPA CLASS 100)
(5) 流式細(xì)胞儀(FACSAria, BD)
3、 實(shí)驗(yàn)方法
(1)在6孔板上每孔接種5X 1(^個(gè)/mLM密度的K562細(xì)胞懸液4mL。(2) 6孔板在37'C的C02培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
(3) 分別添加10pl不同濃度的R418, S18, RADA16-I溶液至不同的，己接種細(xì)胞 的微孔中，使其終濃度達(dá)到20uM。
(4) 繼續(xù)孵育，使短肽作用時(shí)間達(dá)到12小時(shí)。
(5) 收獲，沖洗細(xì)胞，將細(xì)胞混懸于pH7.4的冷PBS溶液中。
(6) 細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞的濃度大約為1Xl(T個(gè)/mL。
(7) YO-PRO-1和PI避光染色30分鐘。
(8) 以流式細(xì)胞儀(FACSAria， BD)來分析正常、凋亡或壞死的細(xì)胞。
備注對(duì)照組(Control)指以無菌去離子水H20代替肽溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的平行實(shí)驗(yàn)組。 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
流式細(xì)胞分析結(jié)果見圖8，圖8顯示，R418、 S18、 RADA16-I作用的K562細(xì)胞以 及對(duì)照組(Control) K562細(xì)胞都有極小比例(< 2 %)的凋亡細(xì)胞。但是，相對(duì)于對(duì)照組(圖 1A， 5.2 %)和RADA16-I組(圖8C， 3.2%)， R418作用的K562細(xì)胞的壞死比例(圖8B， 87.8%)以及S18作用的K562細(xì)胞壞死比例(圖8D, 80.5%)顯著增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明R418和S18對(duì)腫瘤細(xì)胞K562具有很強(qiáng)的殺傷力，并且主要是通過促使細(xì)胞壞死的 方式致死K562細(xì)胞死亡。
實(shí)施例9: R418對(duì)裸鼠體內(nèi)K562腫瘤生長(zhǎng)的影響
1、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
4-6周齡的BALB/c裸鼠，平均體重約為20g，雌雄各半，由四川大學(xué)由四川大學(xué)實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中心獲得。詞養(yǎng)于無特定病原體(簡(jiǎn)稱SPF)條件下，飲水、標(biāo)準(zhǔn)詞料及其他與 動(dòng)物接觸的物品均經(jīng)高壓滅菌處理。
2、 實(shí)驗(yàn)材料
(1) 細(xì)胞株
白血病細(xì)胞株，K562 (ATCC序號(hào)CCL-243 ,下同)。
(2) 短肽樣品
R418 (無菌去離子水H20配置，下同)； S18 (無菌去離子水H20配置，下同)。
(3) 主要試劑
Matrigel: 購(gòu)自BD Bioscience, Bedford, MA. RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司。3、 主要實(shí)驗(yàn)儀器
(1) 細(xì)胞操作用生物安全柜(NUAIRE， CLASS II)
(2) 離心機(jī)(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R CentrifUge)
(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, 1X71)
(4) C02培養(yǎng)箱(Thermo, HEPA CLASS 100)
4、 實(shí)驗(yàn)方法
(1) 大量培養(yǎng)K562細(xì)胞。
(2) 細(xì)胞清洗及收集
A、 將K562細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15mL離心管內(nèi)；
B、 離心1000rpm， 5min;
C、 棄去上清，加入較大體積新的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基(15mL/離心管)到離 心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液；
D、 再次離心細(xì)胞懸液；
E、 棄去上清，加入較小體積新的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基(0.2mL/離心管)到離 心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液；
(3) 細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度約為lxl()8個(gè)/mL。
(4) 細(xì)胞接種取lxl()8個(gè)/mL的K562細(xì)胞懸液與Matrigel 1:1混合成混懸液， 每次取200pl，皮下注射入裸鼠的背部右側(cè)。
(5) 每天觀察裸鼠的成瘤情況。
(6) 在觀察到實(shí)體瘤形成后，將裸鼠隨機(jī)分成3組(每組七只裸鼠)對(duì)照組、R418 組和S18組。
(7) 每隔三天向R418組的各只裸鼠的腫瘤邊緣分別注射一次短肽R418溶液(4mM, O.lmL)、向S18組的各只裸鼠的腫瘤邊緣分別注射短肽S18溶液(4mM， O.lmL)。對(duì)于對(duì) 照組，則每次注射0.1mL無菌去離子水。
(8) 自第一次給藥12天后處死裸鼠，剝離腫瘤，進(jìn)行腫瘤質(zhì)量測(cè)量及腫瘤組織切 片HE染色分析。
5、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9，圖9顯示，用藥12天后，R418組裸鼠的腫瘤遠(yuǎn)小于S18組和對(duì) 照組(見圖9A、 B)，比較實(shí)體瘤重量(見圖9C)， R418組瘤重為133.23 ± 27.58mg， S18組瘤重為549.06 ± 93.76mg克，對(duì)照組瘤重為576.63 ± 54.20mg;在腫瘤組織切片分 析中(見圖9D)，與對(duì)照組和S18組相比，R418組腫瘤的壞死水平顯著提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，R418不僅能在體內(nèi)抑制K562腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且與S18相比，對(duì)K562腫
瘤細(xì)胞的抑制效果更好。
實(shí)施例10: R418和S18分子的體內(nèi)活體成像
活體動(dòng)物體內(nèi)成像技術(shù)是在活體動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)、記錄和分析特定細(xì)胞和分子的直觀 圖像，進(jìn)而為研究者提供傳統(tǒng)影像學(xué)無法檢測(cè)到的體內(nèi)細(xì)胞和分子水平的信息，為疾病 發(fā)病機(jī)理和藥物作用機(jī)制等研究提供新的技術(shù)手段。
1、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，平均體重約為20g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)別。
2、 實(shí)驗(yàn)材料
(1) 細(xì)胞株
白血病細(xì)胞株K562 ( ATCC序號(hào)CCL-243 )。
(2) 短肽樣品
熒光染料FITC標(biāo)記的R418、 S18短肽(分別為FITC-R418和FITC-S18)。
(3) 主要試劑
Matrigel: 購(gòu)自BD Bioscience, Bedford, MA。
培養(yǎng)基RPMI 1640。
麻醉劑15mg/mL戊巴比妥納。
3、 主要實(shí)驗(yàn)儀器
(1) 細(xì)胞操作用生物安全柜(NUAIRE, CLASS II)
(2) 離心機(jī)(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R Centrifoge)
(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, IX")
(4) C02培養(yǎng)箱(Thermo，HEPACLASSlOO)
(5) 活體熒光成像系統(tǒng)(lightools, LT-99D2 Illumatool Dual Light System)
4、 實(shí)驗(yàn)方法
(1) 大量培養(yǎng)K562細(xì)胞。
(2) 細(xì)胞清洗及收集.-
A、 將K562細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15mL離心管內(nèi)；
B、 離心1000rpm， 5min;
C、 棄去上清，加入較大體積新的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基(15mL/離心管)到離心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液；
D、 再次離心細(xì)胞懸液；
E、 棄去上清，加入較小體積新的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基(0.2mL/離心管)到離 心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液； '
(3) 細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整K562細(xì)胞密度約為1x108個(gè)/mL。
(4) 細(xì)胞接種取lxl()8個(gè)/mL的K562細(xì)胞懸液與Matrigel 1:1混合成混懸液， 每次取100pl，分別皮下注射入裸鼠的背部左、右兩側(cè)。
(5) 每天觀察裸鼠的成瘤情況。
(6) 在觀察到實(shí)體瘤形成后，在裸鼠腹部注射麻醉劑戊巴比妥納0.1—0.2mL進(jìn)行
動(dòng)物麻醉。
(7) 待裸鼠麻醉后，將FITC-R418分子溶液(0.05mL, 0.4mM)皮下注射至裸鼠 右側(cè)背部腫瘤的瘤邊，同時(shí)將FITC-S18分子溶液(0.05mL， 0.4mM)皮下注射至同一 只裸鼠左側(cè)背部腫瘤的瘤邊。
(8) 將裸鼠放置于lightools活體熒光成像系統(tǒng)中(激發(fā)波長(zhǎng)為470nm，發(fā)散波長(zhǎng) 為515mn)，通過CCD照相采集R418和S18在不同時(shí)間段的體內(nèi)熒光圖像，通過對(duì)比 兩種分子的體內(nèi)熒光圖像，分析R418和S18在體內(nèi)腫瘤區(qū)域的局部濃度保持情況的差 異°
(9) 平行將高濃度的FITC-R418分子溶液(0.05mL， 4mM)皮下注射至另外一 只裸鼠的右側(cè)背部腫瘤的瘤邊，同時(shí)將高濃度的FITC-S18分子溶液(0.05mL， 4mM) 皮下注射至該裸鼠左側(cè)背部腫瘤的瘤邊。同上步驟8的實(shí)驗(yàn)操作，采集高濃度R418和 S18在不同時(shí)間段的體內(nèi)熒光圖像，通過對(duì)比兩種分子的體內(nèi)熒光圖像，分析高濃度 R418和S18在體內(nèi)腫瘤區(qū)域的局部濃度保持情況的差異。
5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10 ，圖10顯示，在0.4mM FITC—R418溶液和0.4mM FITC — S18
溶液的活體熒光成像對(duì)比中，腫瘤區(qū)域的S18在60分鐘的時(shí)間點(diǎn)上幾乎已完全消失， 但R418則一直在腫瘤區(qū)域保持了較高濃度，在250分鐘的時(shí)間點(diǎn)上，仍然可以很清楚
地在腫瘤區(qū)域觀察到較高濃度的R418溶液；在4mM FITC—R418溶液和4mM FITC —
S18溶液的活體熒光成像對(duì)比中，發(fā)現(xiàn)在注射藥物后的l一3天內(nèi)，F(xiàn)ITC-S18的熒光減
弱速度快于FITC-R418，在第四天，F(xiàn)ITC-S18在腫瘤區(qū)域完全消失，而FITC-R418仍
然保持了一定的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，R418在體內(nèi)腫瘤區(qū)域的局部濃度保持時(shí)間
遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于S18局部濃度保持時(shí)間，進(jìn)一步闡明了為什么在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，R418比S18具有更強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。
SEQUENCE LISTING
<iio>四川大學(xué)
<120> —種自組裝短肽及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用 <160> 1
<170> Patentln Version 3.2
<210>1
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<222> (1)(38) <223>端基保護(hù)
<400> 1
CH3CO-ArgAla Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala
5 10 Arg Ala Asp Ala Gly Pro Pro Pro Lys Trp Lys Leu Phe Lys
15 20 25
Lys lie Pro Lys Phe Leu His Leu Ala Lys Lys Phe- NH2 30 3權(quán)利要求
1、一種自組裝短肽，其特征在于它的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO.1所述。
2、 權(quán)利要求1所述自組裝短肽在制備治療或預(yù)防白血病的藥物中的應(yīng)用。
3、 權(quán)利要求1所述自組裝短肽在制備治療或預(yù)防乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種自組裝短肽R418，由抗腫瘤活性肽段S18、自組裝肽段RADA16-I和連接肽段組成，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO.1所述。通過原子力顯微鏡和透射電鏡的表征，證明R418分子具有在溶液狀態(tài)下自組裝形成納米纖維的特性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，自組裝短肽R418顯著地引起腫瘤細(xì)胞K562、Jurkat、MDA-MB-435S的死亡，而對(duì)NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低。小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)表明，R418自組裝后，在體內(nèi)腫瘤區(qū)域的局部濃度保持時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于S18局部濃度保持時(shí)間。與小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)相一致，動(dòng)物腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)表明，自組裝短肽R418與短肽S18相比，抑制腫瘤的效果更好。
文檔編號(hào)C07K14/00GK101302249SQ20081004477
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者唐成康, 趙曉軍 申請(qǐng)人:四川大學(xué)