專利名稱：：低聚核酸的加帽法的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及低聚核酸的固相合成法中的加帽(capping)工序。
背景技術：
：作為制備低聚核酸的方法，一般已知的有固相合成法(非專利文獻1)。固相合成法是通過使被負載于固相載體的低聚核酸衍生物和亞磷酰胺化合物進行偶聯而制備所需鏈長的低聚核酸的方法，但并不一定亞磷酰胺化合物與所有的被負載于固相載體的低聚核酸衍生物完全反應。因此，為了用固相合成法制得高純度的低聚核酸，必須經過對被負載于固相載體的未反應的低聚核酸衍生物的5'位羥基進行保護而使其不參與上述偶聯反應的所謂的加帽工序。加帽工序中，作為用于保護低聚核酸衍生物的5'位羥基的?；噭话闶褂盟狒?例如，乙酸酐、苯氧基乙酸酐)，作為?；磻幕罨瘎?，一般使用例如4-二甲基氨基吡啶(以下稱為4-DMAP)或N-甲基咪唑(以下稱為NMI)。但是，有報道稱，作為?；磻幕罨瘎┦褂?-DMAP時，作為核酸堿基的鳥嘌呤與4-DMAP反應，鳥嘌呤轉變?yōu)?，6-二氨基嘌呤(以下稱為2，6-DAP)(非專利文獻2)。非專利文獻l:阿格羅沃(Agrawal)等，分子生物學方法低聚核苷酸及其類似物的策略(MethodsinMolecularBiology:ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs);HumanaPress:Totowa，Vol.20,63(1993)非專利文獻2:斯科特(Scott)等，核酸研究(NucleicAcidsResearch),Vol.17,NO.20,8333(1987)發(fā)明的揭示另一方面，NMI雖然是目前最常用的?；磻幕罨瘎景l(fā)明者12在對以下的通式(2)表示的低聚核酸衍生物用苯氧基乙酸酐和NMI實施了加帽工序后發(fā)現，如后述的實施例所示，無法以令人滿意的效率在5'位羥基導入苯氧基乙?；浣Y果是，出現為了獲得高純度的低聚核酸而進行的精制變得繁雜的問題。本發(fā)明的目的主要是提供在所謂的加帽工序中高效地將核糖的5'位羥基?；姆椒?。本發(fā)明者進行認真探討后發(fā)現，通過在用酰基保護以下的通式(2)表示的低聚核酸衍生物的核糖的5'位羥基的加帽工序中，作為?；噭┦褂靡韵碌耐ㄊ?lla)表示的苯氧基乙酸酐衍生物，作為?；磻幕罨瘎┦褂靡韵碌耐ㄊ?llb)或(llc)表示的吡啶衍生物，可高效地制備以下的通式(12)表示的低聚核糖衍生物，從而完成了本發(fā)明。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>式(2)、(lla)、(llb)、(11c)及(12)中，各Bx分別獨立，表示可具有保護基的核酸堿基或其修飾體。n表示1200的范圍內的整數，n較好為10100的范圍內的整數，更好為1550的范圍內的整數。各Q分別獨立，表示O或S。R51、R52、R53分別相同或不同，表示H、垸基或鹵素。R6a、R6b、R7a、R715、R7e、R^分別相同或不同，表示垸基。R6e、R^分別相同或不同，表示H或烷各WGZ表示吸電子基團，各W分別獨立，表示H、鹵素、烷氧基、垸硫基、垸基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基或以下的通式(3)表示的取代基。《3》<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>式(3)中，WGi表示吸電子基團。E表示?；蛞韵碌耐ㄊ?4)表示的取代基。(d)連接基-固相截體式(4)中，W表示單鍵或以下的通式(5)表示的取代基。6、(5)式(5)中，Q、WG"的含義如前所述。T表示H、酰氧基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二垸基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基、上述通式(3)表示的取代基或上述通式(4)表示的取代基，但E或T的任一方為取代基(4)。Bx中的核酸堿基只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，例如可例舉胞嘧啶、尿啼啶、胸腺嘧啶等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。Bx中的核酸堿基可被保護，其中具有氨基的核酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保護。作為該氨基的保護基，只要是作為核酸的保護基使用的基團即可，無特別限定，具體可例舉例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙?；⒈；?、丁酰基、異丁?；⒈交阴；?、苯氧基乙?；?、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-異丙基苯氧基乙?；?二甲基氨基)亞甲基等。作為鳥嘌呤的氨基的保護基，特好的是苯氧基乙?；?、4-叔丁基苯氧基乙?；?、4-異丙基苯氧基乙?；?。Bx中的修飾體是指核酸堿基被任意的取代基取代而得的基團，作為該取代基，可例舉例如齒素、?；⑼榛?、芳烷基、烷氧基、垸氧基烷基、羥基、氨基、一烷基氨基、二垸基氨基、羧基、氰基、硝基，它們在任意的位置取代有13個。作為Bx的修飾體中的鹵素，可例舉例如氟、氯、溴、碘。作為Bx的修飾體中的?；衫e例如直鏈狀或支鏈狀的碳數16的垸?；⑻紨?13的芳?；＞唧w可例舉例如甲?；?、乙?；?、正丙酰基、異丙?；⒄□；?、異丁酰基、叔丁酰基、戊?；⒓乎；?、苯甲?；?、萘甲?；?、乙酰丙?；?。作為Bx的修飾體中的烷基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數15的垸基。具體可例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基等。該烷基可被取代，作為該取代基，可例舉例如鹵素、垸基、垸氧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代有13個。作為Bx的修飾體中的芳烷基、烷氧基烷基、一烷基氨基及二烷基氨基的垸基部分，可例舉與上述垸基相同的基團。作為Bx的修飾體中的垸氧基，可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數14的垸氧基。具體可例舉例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。其中較好的是碳數13的烷氧基，特好的是甲氧基。Bx的修飾體中的烷氧基烷基的垸氧基部分可例舉與上述烷氧基相同的基團。Bx的修飾體中的芳垸基的芳基部分可例舉例如碳數612的芳基。具體可例舉例如苯基、1-萘基、2-萘基、聯苯基等。該芳基可被取代，作為該取代基，可例舉例如鹵素、烷基、垸氧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代有13個。作為Bx的修飾體中的烷基、芳基的取代基的鹵素、烷基及垸氧基可分別例舉與上述相同的基團。作為WG1、WG2的吸電子基團，可例舉例如氰基、硝基、烷基磺?；⒎蓟酋；Ⅺu素。其中優(yōu)選鹵素。作為WG1、WG2的吸電子基團中的鹵素，可例舉與上述Bx的修飾體中的鹵素相同的基團。WG1、WG2的烷基磺?；耐榛糠挚衫e與上述Bx的修飾體中的烷基相同的基團。WG1、WG2的芳基磺?；姆蓟糠挚衫e與上述Bx的修飾體中的芳烷基的芳基部分相同的基團。R4的鹵素、烷氧基、垸基氨基或二垸基氨基可例舉與上述Bx的修飾體中的對應的基團相同的基團。R4的垸氧基垸基氧基、垸硫基的垸基部分可例舉與上述Bx的修飾體中的垸基相同的基團。R4的垸氧基垸基氧基的烷氧基可例舉與上述Bx的修飾體中的烷氧基相同的基團。R4的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數26的鏈烯基。具體可例舉例如乙烯基、烯丙基、l-丙烯基、異丙烯基、l-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基等。R4的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分可例舉例如直鏈狀或支鏈狀的碳數24的炔基。具體可例舉例如乙炔基、2-丙炔基、l-丁炔基等。R51、R52、R53、R6a、R6b、R6c、R6d、R7a、R7b、R7c、R^中的烷基可例舉與上述Bx的修飾體中的垸基相同的基團。R51、R52、R"中的鹵素可例舉與上述Bx的修飾體中的鹵素相同的基團。作為E的?；?，可例舉與上述Bx的修飾體中的?；嗤幕鶊F。作為T的酰氧基中的?；糠郑衫e與上述Bx的修飾體中的?；嗤幕鶊F。作為T的鹵素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基，可例舉與上述Bx的修飾體中的對應的基團相同的基團。作為T的烷氧基烷基氧基及垸硫基的垸基部分，可例舉與上述Bx的修飾體中的烷基相同的部分。作為T的垸氧基烷基氧基的烷氧基部分，可例舉與上述Bx的修飾體中的烷氧基相同的部分。作為T的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分，可例舉與上述W的鏈烯基相同的基團。作為T的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例舉與上述W的炔基相同的基團。T的垸基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基可被保護，該保護基只要是作為氨基的保護基使用的基團即可，無特別限定，可例舉例如三氟乙?；⒈郊柞；?、4-甲氧基苯甲?；?、乙?；⒈；?、丁酰基、異丁?；?、苯基乙酰基、苯氧基乙?；?-叔丁基苯氧基乙?；?、4-異丙基苯氧基乙?；?二甲基氨基)亞甲基。特好的是三氟乙酰基。作為用于對核糖的5'位羥基加帽的酰基化試劑，可例舉例如上述式(lla)表示的苯氧基乙酸酐衍生物?？衫e例如苯氧基乙酸酐、4-異丙基苯氧基乙酸酐、4-叔丁基苯氧基乙酸酐、4-氯苯氧基乙酸酐。作為利用上述?；噭┻M行的?；磻幕罨瘎衫e例如吡啶衍生物(llb)及(llc)?？衫e例如2-二甲基氨基吡啶(2-DMAP)、2，6-二叔丁基-4-二甲基氨基吡啶、2，6-二甲基-4-二甲基氨基吡啶。此外，作為本發(fā)明，可例舉以下的通式(A)表示的低聚核酸(以下稱為低聚核酸(A))的制造方法。該方法包括在用?；Ｗo以下的通式(2)表示的低聚核酸衍生物的核糖的5'位羥基的加帽工序中，作為酰基化試劑使用以下的通式(lla)表示的苯氧基乙酸酐衍生物，作為酰基化反應的活化劑使用以下的通式(llb)或(llc)表示的吡啶衍生物，藉此制備以下的通式(12)表示的低聚核糖衍生物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>式(2)、(lla)、(llb)、(11c)及(12)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述。E、n、R6a、R6b、R6e、R6d、R7a、R7b、R7e、R7d、R51、R52、R53、T的含義如前所述。式(A)中，各Q、各R分別獨立，其含義如前所述。n、Z如前所述。各B分別獨立，表示核酸堿基或其修飾體。對B表示的核酸堿基無特別限定，可例舉例如胞嘧啶、尿啼啶、胸腺嘧啶等噴啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。B的修飾體由核酸堿基被任意的取代基取代而得，作為B的修飾體中的取代基，可例舉例如齒素、?；⑼榛?、芳烷基、烷氧基、垸氧基烷基、羥基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它們在任意的位置取代有13個。作為B的修飾體中的鹵素、?；?、烷基、芳烷基、垸氧基、烷氧基垸基、氨基、一垸基氨基、二烷基氨基，可例舉與上述Bx的修飾體中的各對應基團相同的基團。作為R的鹵素、垸氧基、垸基氨基及二烷基氨基，可例舉與上述Bx的修飾體中的各對應基團相同的基團。作為R的烷氧基垸基氧基及垸硫基的垸基部分，可例舉與上述Bx的修飾體中的烷基相同的基團。作為R的垸氧基烷基氧基的垸氧基部分，可例舉與上述Bx的修飾體中的垸氧基相同的基團。作為R的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分，可例舉與上述114的鏈烯基相同的基團。作為R的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例舉與上述W的炔基相同的基團。R的烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基可被保護，該保護基只要是作為氨基的保護基使用的基團即可，無特別限定，可例舉例如三氟乙?；?、苯甲?；?、4-甲氧基苯甲?；⒁阴；?、丙酰基、丁?；惗□；⒈交阴；?、苯氧基乙?；?、4-叔丁基苯氧基乙?；?、4-異丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亞甲基。特好的是三氟乙?；?。以下，對本發(fā)明進行詳細說明。實施發(fā)明的最佳方式以下所示的制法中，在原料具備對反應有影響的取代基(例如，羥基、氨基、羧基)時，預先按照公知的方法用合適的保護基對原料進行保護后再進行反應?？稍谧詈笸ㄟ^催化還原、堿處理、酸處理等公知方法將保護基脫離。I.低聚核酸(A)的制造方法低聚核酸(A)的制造方法如下所述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>式(A)中，各B、各Q、各R分別獨立，其含義如前所述。n、Z的含義如前所述。低聚核酸(A)的制法可按照公知方法進行，但也可以例如通過實施以下所示的步驟A步驟H的操作，分步驟地由3'至5'的方向縮合核酸單體化合物，藉此制備低聚核酸(A)。被用于下述步驟的化合物及試劑只要是常用于低聚核酸的合成的化合物及試劑即可，無特別限定。此外，與使用現有的核酸合成試劑的情況同樣，所有的步驟可采用人工方法或市售的DNA自動合成機來進行。用自動合成機進行反應時操作方法簡便，且合成的準確性高，因此優(yōu)選采用自動合成機的方法。(l)步驟A:使酸作用于以下的通式(l)表示的(低聚)核酸衍生物，藉此脫離5'位羥基的保護基，制備以下的通式(2)表示的(低聚)核酸衍生物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>式(6a)及(6b)中，Bx、Ri的含義如前所述。R2L、R^表示上述取代基(4)。W表示酰氧基。R"表示H、酰氧基、鹵素、垸氧基、垸硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、垸氧基烷基氧基或上述取代基(3)。作為R2、R"的酰氧基的?；糠?，可例舉例如乙酰基、丙?；⒍□；?、異丁?；?、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙?；?、4-異丙基苯氧基乙酰基。作為R"的鹵素、垸氧基、垸基氨基及二垸基氨基，可例舉與上述Bx的修飾體中的各對應基團相同的基團。作為R4a的垸氧基垸基氧基及烷硫基的院基部分，可例舉與上述Bx的修飾體中的烷基相同的基團。作為R"的烷氧基烷基氧基的垸氧基部分，可例舉與上述Bx的修飾體中的烷氧基相同的基團。作為R"的鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基的鏈烯基部分，可例舉與上述W的鏈烯基相同的基團。作為R"的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例舉與上述W的炔基相同的基團。R"的烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基可被保護，該保護基只要是作為氨基的保護基使用的基團即可，無特別限定，可例舉例如三氟乙?；?、苯甲?；?-甲氧基苯甲?；⒁阴；?、丙酰基、丁酰基、異丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙?；?-叔丁基苯氧基乙?；?、4-異丙基苯氧基乙?；?、(二甲基氨基)亞甲基。特好的是三氟乙?；Ｗ鳛楣滔噍d體，可例舉例如可控孔度玻璃(controlledporeglass;CPG)、草?；?可控孔度玻璃(例如參照Alul等，NucleicAcidsResearch,Vol.19，1527(1991))、TentaGel支承體-氨基聚乙二醇衍生物化支承體(例如參照Wright等，TetrahedronLetters,Vol.34，3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。作為連接基，可例舉例如3-氨基丙基、琥珀?；?，2，-二乙醇磺酰基、長鏈垸基氨基(LCAA)。核酸衍生物(6a)、核酸衍生物(6b)是按照公知方法制得的或可作為市售品獲得的被負載于固相載體的核酸衍生物，作為其優(yōu)選例子，可例舉以下的通式(7)、(8)表示的核酸化合物。式(7)及(8)中，Bx、Q、R1、R4、WG2如前所述。R4為取代基(3)的核酸化合物(7)、(8)可按照公知方法由后述的亞磷酰胺化合物(B)制得。作為可用于本步驟的酸，可例舉例如三氟乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。該可用于本步驟的酸也可用適當的溶劑將其濃度稀釋至15%后再使用。作為溶劑，只要不會對反應有影響即可，無特別限定，可例舉二氯甲烷、乙腈、水或它們的任意的混合溶劑。上述反應的反應溫度優(yōu)選2(TC5(TC。反應時間因(低聚)核酸衍生物(l)的種類、所用酸的種類和反應溫度等而異，通常以1分鐘1小時為宜。所用試劑的量相對于被負載于固相載體的(低聚)核酸衍生物以0.8100倍摩爾量為宜，更好為110倍摩爾量。(2)步驟B:采用活化劑使核酸單體化合物與步驟A制得的(低聚)核酸衍生物(2)縮合，制備以下的通式(9)表示的低聚核酸衍生物的步驟。式(2)及(9)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述。E、n、R1、T的含義如前所述。本步驟可通過使核酸單體化合物和活化劑作用于被負載于固相載體的低聚核酸衍生物而實施。作為核酸單體化合物，可例舉以下的通式(B)表示的亞磷酰胺化合物(以下稱為亞磷酰胺化合物(B))或以下的通式(C)表示的核酸化合物。式(B)及(C)中，BY、Bz分別表示可具有保護基的核酸堿基或其修飾體，R1、R4a的含義如前所述。R2a、R2b相同或不同，表示烷基或R23、R2b表示與鄰接的氮原子一起形成的56元的飽和氨基環(huán)基。該飽和氨基環(huán)基除了氮原子以外可具有1個作為成環(huán)原子的氧原子或硫原子。WG1、WG2分別表示吸電子基團。作為Bz中的核酸堿基，只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，可例舉例如胞啼啶、尿嘧啶等噴啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。作為BY中的核酸堿基，只要是被用于核酸的合成的堿基即可，無特別限定，可例舉例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤等嘌呤堿基。Bz、BY中的核酸堿基可被保護，其中具有氨基的核酸堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保護。作為該氨基的保護基，可例舉與上述Bx的修飾體中的氨基保護基相同的基團。Bz、BY的修飾體是指核酸堿基被任意的取代基取代而得的基團，作為該取代基，可例舉例如鹵素、?；?、垸基、芳烷基、烷氧基、垸氧基垸基、羥基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它們可在任意的位置取代13個基團。作為Bz、BY的修飾體中的鹵素、?；?、烷基、芳烷基、垸氧基、垸氧基烷基、一烷基氨基、二垸基氨基，可例舉與上述各Bx的修飾體中的對應的基團相同的基團。作為R23、R2b中的烷基，可例舉與上述Bx的修飾體中的烷基相同的基團。作為R"、R"中的56元飽和氨基環(huán)基，可例舉例如吡咯烷-l-基、哌啶-l-基、嗎啉-l-基、硫代嗎啉-l-基。作為活化劑，可例舉例如lH-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巰基-lH-四唑、4，5-二氯咪唑、4,5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑鹽、三氟甲磺酸咪唑鹽、三氟甲磺酸吡啶镥鹽、N，N-二異丙基乙胺、2，4，6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。作為反應溶劑，只要不會對反應有影響即可，無特別限定，例如可例舉乙腈、四氫呋喃(以下稱為THF)。上述反應的反應溫度以20。C5(TC為宜。反應時間因低聚核酸衍生物(2)的種類、所用活化劑的種類和反應溫度等而異，通常以1分鐘1小時為宜。所用試劑的量相對于被負載于固相載體的低聚核酸衍生物以1100倍摩爾量為宜，更好為110倍摩爾量。亞磷酰胺化合物(B)是在2'位羥基具有中性條件下可脫離的醚型保護基的亞磷酰胺化合物。此外，由于被導入2'位羥基的基團是直鏈狀的取代基，與3'位的羥基結合的磷原子的周圍的空間不擁擠，因此與以往使用的亞磷酰胺化合物相比，在合成低聚RNA時具有縮合反應在非常短的時間內進行、縮合收率良好的特點。(3)步驟C:用?；Ｗo在步驟B中未反應的(低聚)核酸衍生物(2)的核糖的5'位羥基的加帽工序中，作為?；噭┦褂靡韵碌耐ㄊ?lla)表示的苯氧基乙酸酐衍生物，作為酰基化反應的活化劑使用以下的通式(llb)或(llc)表示的吡啶衍生物，藉此制備以下的通式(12)表示的低聚核糖衍生物的步驟。(11fe》U1c》《")式(2)、(lla)、(llb)、(11c)及(12)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述。E、n、R6a、R6b、R6e、R6d、R7a、R7b、R7e、R7d、R51、R52、R53、T的含義如前所述。本步驟是對步驟B中未反應的(低聚)核酸衍生物(2)的5'位羥基進行保護的反應，可通過使苯氧基乙酸酐衍生物(lla)、?；磻幕罨瘎?llb)或(llc)和堿作用于被負載于固相載體的未反應的低聚核酸衍生物(2)而實施。?；噭┮部捎煤线m的溶劑將其濃度稀釋至0.051M后使用。?；噭┑挠昧恳虮回撦d于固相載體的低聚核酸衍生物(2)的種類等而異，相對于被負載于固相載體的低聚核酸衍生物(2)的摩爾量以0.8100倍摩爾量為宜，較好為1030倍摩爾量。作為?；磻幕罨瘎┑挠昧?，相對于苯氧基乙酸酐衍生物(lla)的摩爾量以0.850倍摩爾量為宜，更好為110倍摩爾量。此外，根據需要，為了捕集本步驟中的作為副產物的苯氧基乙酸衍生物，可添加作為苯氧基乙酸衍生物的捕集劑的例如吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶或它們的任意的混合物。特好的是2,6-二甲基吡啶。堿的用量因被負載于固相載體的低聚核酸衍生物(2)的種類、苯氧基乙酸酐衍生物(lla)等而異，相對于苯氧基乙酸酐衍生物(lla)的摩爾量以0.8100倍摩爾量為宜，較好為120倍摩爾量。作為用于反應的溶劑，只要不會對反應有影響即可，無特別限定，例如可例舉二氯甲烷、乙腈、THF或它們的任意的混合溶劑。上述步驟的反應溫度以2(TC5(TC為宜。反應時間因低聚核酸衍生物(2)的種類、所用酰基化試劑的種類、所用酰基化反應的活化劑、堿、反應溫度等而異，通常以1分鐘30分鐘為宜。(4)步驟D:通過使氧化劑作用于步驟B中制備的低聚核酸衍生物(9)而將亞磷酸基轉變?yōu)榱姿峄蛄虼姿峄牟襟E。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>式(9)及(13)中，各Bx、各Q、各R4、各WGZ分別獨立，其含義如前所述。E、n、R1、T的含義如前所述。本步驟是利用氧化劑將3價磷轉換為5價磷的反應，通過使氧化劑作用于被分子于固相載體的低聚核酸衍生物而實施。用氧來氧化磷時，作為氧化劑，例如可使用碘、過氧化氫叔丁基。該氧化劑也可用適當的溶劑將其濃度稀釋至O.052M后再使用。作為用于反應的溶劑，只要不會對反應有影響即可，可例舉吡啶、THF、水或它們的任意的混合溶齊U。例如可采用碘/水/吡啶-THF或碘/吡啶-乙酸和過氧化齊U(過氧化氫叔丁基/二氯甲垸等)。用硫來氧化磷時，作為氧化劑，例如可使用硫、Beaucage試劑(3H-苯并-1,2-二噻茂-3-酮-1,1-二氧化物)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)。該氧化劑可用適當的溶劑將其濃度稀釋至0.052M后再使用。作為用于反應的溶劑，只要不會對反應有影響即可，可例舉二氯甲烷、乙腈、吡啶或它們的任意的混合溶劑。反應溫度以2(TC5(TC為宜。反應時間因低聚核酸衍生物(9)的種類、所用氧化劑的種類、反應溫度等而異，通常為1分鐘30分鐘。所用試劑的量相對于被承載于固相載體的低聚核酸衍生物以1100倍摩爾量為宜，更好為1050倍摩爾量。(5)步驟E:將步驟D制備的低聚核酸衍生物(13)從固相載體切割(cleave)，脫離各核酸堿基部及各磷酸基的保護基的步驟。氧化劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>式(13)及(14)中，各B、各Bx、各Q、各R4、各WG分別獨立，其含義如前所述。E、n、R、R1、T、Z的含義如前所述。切割步驟是利用切割試劑將所需鏈長的低聚RNA從固相載體及連接基切割的反應，可通過向負載有所需鏈長的低聚核酸衍生物的固相載體添加切割試劑而實施。本步驟中可脫離核酸堿基部的保護基。作為切割試劑，可例舉例如濃氨水、甲胺。本步驟中可使用的切割試劑也可用例如水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、THF或它們的任意的混合溶劑稀釋后再使用。其中，優(yōu)選使用乙醇。反應溫度以15t:75'C為宜，優(yōu)選15"C3(TC,更好為18°C25°C。脫保護反應時間以10分鐘30小時為宜，優(yōu)選30分鐘24小時，更好為14小時。被用于脫保護的溶液中的氫氧化銨的濃度以2030重量％為宜，優(yōu)選2530重量％，更好為2830重量％。所用試劑的量相對于被負載于固相載體的低聚核酸衍生物(13)以1100倍摩爾量為宜，更好為1050倍摩爾量。(6)步驟F:使用于脫離各核糖的2'位羥基的保護基的試劑作用于步驟E制造的低聚核酸衍生物(14)，藉此制備以下的通式(15)表示的低聚核酸衍生物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>(14)(15》式(14)及(15)中，各B、各Q、各R、各W分別獨立，其含義如前所述。n、R1、Z的含義如前所述。本步驟可通過使用于脫離2'位羥基的保護基的試劑作用于低聚核酸衍生物(14)而實施。脫離2'位羥基的保護基的步驟可通過使作為脫離2'位羥基的保護基的試劑的例如氟化四丁基銨、三乙胺三氫氟酸鹽等作用而實施。所用的脫離2'位羥基的保護基的試劑的量相對于被脫離的保護基以1500倍摩爾量為宜，較好為510倍摩爾量。作為所用溶劑，只要是不會影響反應的溶劑即可，無特別限定，例如可例舉THF、N-甲基吡咯垸酮、吡啶、二甲亞砜或它們的任意的混合溶劑。反應溶劑的用量相對于脫離2'位羥基的保護基的試劑以0.8100倍摩爾量為宜，較好為110倍摩爾量。反應溫度以2(TC8(TC為宜。反應時間因低聚核酸衍生物(14)的種類、所用脫離2'位羥基的保護基的試劑的種類和反應溫度等而異，通常以1小時100小時為宜。此外，根據需要，還可添加用于捕集本步驟中作為副產物生成的丙烯腈的試劑，作為丙烯腈的捕集劑，例如有硝基垸、烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它們的任意的混合物。作為硝基垸，可例舉直鏈狀的碳數16的硝基垸。具體可例舉硝基甲垸等。作為垸基胺，可例舉直鏈狀的碳數16的烷基胺。具體可例舉例如甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺。作為脒，可例舉例如苯甲脒、甲脒。作為硫醇，可例舉例如直鏈狀的碳數16的硫醇。具體可例舉例如甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、l-丁硫醇、l-戊硫醇、1-己硫醇。作為硫醇衍生物，可例舉例如具有相同或不同的直鏈狀的碳數16的烷基巰基的醇或醚。具體可例舉例如2-巰基乙醇、4-o-p-oyl_4.lo巰基-l-丁醇、6-巰基-l-己醇、巰基甲醚、2-巰基乙醚、3-巰基丙醚、4-巰基丁醚、5-巰基戊醚、6-巰基己醚。丙烯腈的捕集劑的用量因低聚核酸衍生物(14)的種類等而異，相對于保護低聚核酸衍生物(14)的各核糖的2'位羥基的2-氰基乙氧基甲基以0.8500倍摩爾量為宜，較好為110倍摩爾量。(7)步驟G:將低聚核酸衍生物(15)的5'位羥基的保護基脫離的步驟。R,——O-H一、o式(15)及(A)中，各B、各Q、各R分別獨立，其含義如前所述。n、R1、Z的含義如前所述。本步驟是最終脫離低聚核酸衍生物(15)的5'位羥基的保護基的反應，可通過使酸作用于從固相載體切割得到的低聚RNA而實施。作為可用于本步驟的酸，可例舉例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸等。本步驟中可使用的酸也可用適當的溶劑稀釋后再使用。作為溶劑，只要是不會對反應有影響的溶劑即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲垸、乙腈、水、pH為25的緩沖液或它們的任意的混合溶劑。作為緩沖液，可例舉例如乙酸緩沖液。上述反應的反應溫度以2(TC5(TC為宜。反應時間因低聚核酸衍生物(15)的種類、所用酸的種類、反應溫度等而異，通常以l分鐘1小時為宜。所用試劑的量相對于被負載于固相載體的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩爾量為宜，更好為110倍摩爾量。(8)步驟H:分離精制步驟G制備的低聚核酸(A)的步驟。分離精制步驟是指通過單獨或組合使用例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、重結晶、C8-ds的反相柱色譜法、Cfd8的反相卡套柱(cartridgecolumn)色譜法、陽離子交換柱色譜法、陰離子交換柱色譜法、凝膠過濾柱色譜法、高效液相色譜法、透析、超濾等通常的分離精制方法，從上述反應混合物分離精制所需低聚RNA的步驟。作為洗脫溶劑，可例舉例如乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、水的單獨溶劑或任意比例的混合溶劑。這種情況下，也可以lmM2M的濃度添加作為添加劑的例如磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、乙酸銨、乙酸三乙基銨、乙酸鈉、乙酸鉀、Tris-HCl、乙二胺四乙酸，在19的范圍內調整溶液的pH。通過重復實施步驟A步驟D的操作，能夠制得所需鏈長的低聚核酸(A)。在上述低聚核酸的制造方法的步驟B中，作為核酸單體化合物至少1次使用亞磷酰胺化合物(B)，藉此可制得各R中的至少l個為羥基的低聚核酸(A)。此外，上述低聚核酸的制造方法的步驟B中，作為核酸單體化合物全部使用亞磷酰胺化合物(B)，藉此可制得各R都為0H的低聚核酸(A)。II.亞磷酰胺化合物(B)的制造方法亞磷酰胺化合物(B)可如下制備。以下所示的制法中，在原料具備對反應有影響的取代基(例如，羥基、氨基、羧基)時，一般預先按照公知的方法用合適的保護基對原料進行保護后再進行反應。可在反應后通過催化還原、堿處理、酸處理等公知方法將保護基脫離。亞磷酰胺化合物(B)可由公知化合物或易制備的中間體通過實施例如以下的步驟a步驟h的操作而制得。以下進行詳細說明。(l)步驟a:通過使烷基化試劑作用于以下的通式(16)表示的核糖核酸衍生物，制備在2，位羥基導入中性條件下脫離的醚型保護基的下述通式(17)、(17')表示的核糖核酸衍生物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>(16)烷基化試劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>(17)式(16)、(17)及(17，)中，Bz、R1、W&如前所述。烷基化試劑可例舉例如以下的通式(18)表示的醚化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>(18)式(18)中，L表示齒素、芳硫基、垸基亞砜基或烷硫基，WG'如前所述。L所表示的鹵素、芳硫基中的芳基、垸基亞砜基及垸硫基中的垸基可例舉與上述Bx的修飾體中的對應的基團相同的基團。作為醚化合物(18)的具體例，可例舉以下的1.2.的化合物。1.氯甲基2-氰基乙基醚2.2-氰基乙基甲硫基甲基醚醚化合物(18)是可在堿性條件下對2'位羥基導入中性條件下可脫離的醚型取代基的新的烷基化試劑，作為用于制備亞磷酰胺化合物(B)的試劑有用。醚化合物(18)可通過實施以下的步驟1步驟4來制備。步驟1:將以下的通式(19)表示的醇化合物垸硫基甲基化，制備以下的通式(20)表示的化合物的步驟。<20)式(19)及(20)中，WG'如前所述，R3表示垸基或芳基?；衔?20)是L為烷硫基的醚化合物(18)。R3所表示的烷基可例舉與上述Bx的修飾體中的垸基同樣的基團。R3為甲基時，作為烷硫基甲基化試劑，可例舉例如二甲亞砜、乙酸酐U9)及乙酸的混合溶液。二甲亞砜的用量相對于化合物(19)的摩爾量以10200倍摩爾量為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。乙酸的用量相對于化合物(19)的摩爾量以10150倍摩爾為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。乙酸酐的用量相對于化合物(19)的摩爾量以10150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。反應溫度優(yōu)選0'C10(TC。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以148小時為宜。步驟2:將化合物(20)鹵化，制備以下的通式(21)表示的化合物的步驟。(20)(21》式(20)及(21)中，WG1、R3如前所述，X2表示鹵素。化合物(21)是醚化合物(18)中的L為鹵素的化合物。X2所表示的鹵素可例舉與上述Bx的修飾體中的鹵素同樣的鹵素。本步驟可按照公知的方法(例如，T.Benneche等，Synthesis762(1983))實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等鹵代烴類。作為鹵化劑，可例舉例如硫酰氯、磷酰氯。鹵化劑的用量相對于化合物(20)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。反應溫度以0'C10(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以30分鐘24小時為宜。步驟3:將化合物(21)芳硫基化，制備以下通式(22)表示的化合物的步驟。《21)《22)式(21)及(22)中，WG1、X2如前所述，R3a表示芳基。化合物(22)是醚化合物(18)中的L為芳硫基的化合物。R3a所表示的芳基可例舉與上述Bx的修飾體中的芳基同樣的基團。本步驟可采用公知方法實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特32別限定，可例舉例如二氯甲烷、乙腈。作為芳硫基化試劑，可例舉例如苯硫酚、4-甲基苯硫醇。芳硫基化試劑的用量相對于化合物(21)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選15倍摩爾量。反應溫度以0"C10(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以148小時為宜。步驟4:將化合物(20)氧化，制備下述通式(23)表示的化合物的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>式(20)及(23)中，WG1、R3如前所述。化合物(23)是醚化合物(18)中的L為烷基亞砜基的化合物。R3所表示的垸基可例舉與亞磷酰胺化合物(B)中的垸基相同的基團。本步驟可采用公知方法實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、甲醇。作為氧化劑，可例舉例如間氯過苯甲酸、偏高碘酸鹽、過氧化氫。氧化劑的用量相對于化合物(20)的摩爾量以0.810倍摩爾量為宜，優(yōu)選i2倍摩爾量。反應溫度以orIO(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以148小時為宜。烷基化試劑采用化合物(21)時，可如下實施。本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(16)而實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等鹵代烴類。烷基化試劑的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。本步驟中，也可根據需要使金屬試劑和堿作用于化合物(16)，制得中間體后再使烷基化試劑與之作用。所述金屬試劑可例舉例如二氯化二丁基錫。金屬試劑的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。作為堿，可例舉吡啶、2,6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N,N-二異丙基乙胺、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一烯等有機堿。堿的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。反應溫度以0r12(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以30分鐘24小時為宜。烷基化試劑采用化合物(20)或(22)時，可如下實施。本步驟可按照公知方法(例如，M.Matteucci，TetrahedronLetters,31巻，2385(1990))，通過使烷基化試劑、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(16)而實施。垸基化試劑的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.85倍摩爾量為宜，優(yōu)選13倍摩爾量。作為酸，可例舉例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.0120倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.0210倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲垸、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙垸、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它們的任意的混合溶劑。作為本步驟中所用的針對于硫原子的鹵化劑，可例舉例如N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的鹵化劑的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.810倍摩爾量為宜，優(yōu)選15倍摩爾量。反應溫度以一78"C30"C為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以5分鐘5小時為宜。烷基化試劑采用化合物(23)時，可如下實施。本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑、酸酑和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(16)而實施。垸基化試劑的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.85倍摩爾量為宜，優(yōu)選13倍摩爾量。作為酸酐，可例舉例如三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.0120倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.0210倍摩爾量。作為堿，可例舉例如四甲基脲、三甲基吡啶。堿的用量相對于化合物(16)的摩爾量以0.0120倍摩爾量為宜，優(yōu)選O.0210倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷或它們的任意的混合溶劑。反應溫度以一78"C3(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以5分鐘24小時為宜。(2)步驟b:分離精制步驟a制得的核糖核酸衍生物(17)的步驟。本步驟可通過例如薄層色譜法、硅膠色譜法等常規(guī)的分離精制方法從步驟a制得的混合物進行分離精制。(3)步驟c:與步驟b分別進行，通過使烷基化試劑作用于以下的通式(24)表示的核糖核酸衍生物，制得在2，位羥基導入了中性條件下脫離的醚型保護基的以下的通式(25)表示的核糖核酸衍生物的步驟。國劑.、0OHOOvON^鵬，(24)(25)式(24)及(25)中，Bz、WGi如前所述，A表示以下的通式(26a)或(26b)所示的硅取代基。R瞎R6_S(-0—SI—6sRsU6a)R6《26b)式(26a)及(26b)中，R6表示垸基。R6所表示的垸基可例舉與亞磷酰胺化合物(B)中的烷基相同的基團。垸基化試劑可例舉與前述相同的試劑。垸基化試劑采用化合物(21)時，可如下實施。本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(24)而實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷等鹵代烴類。垸基化試劑的用量相對于化合物(24)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。本步驟中，也可根據需要使金屬試劑和堿作用于化合物(24)，制得中間體后再使烷基化試劑作用。所述金屬試劑可例舉例如二氯化二丁基錫、氯化叔丁基鎂。金屬試劑的用35量相對于化合物(24)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。作為堿，可例舉吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一烯等有機堿。堿的用量相對于化合物(24)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。反應溫度以0。C12(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以30分鐘24小時為宜。烷基化試劑采用化合物(20)或(22)時，可如下實施。本步驟可按照公知方法(例如，M.Matteucci，TetrahedronLetters,31巻，2385(1990))，通過使烷基化試劑、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(24)而實施。烷基化試劑的用量相對于化合物(24)的摩爾量以0.85倍摩爾量為宜，優(yōu)選13倍摩爾量。作為酸，可例舉例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相對于化合物(24)的摩爾量以0.0120倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.0210倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲浣、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它們的任意的混合溶劑。作為本步驟中所用的針對于硫原子的鹵化劑，可例舉例如N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的卣化劑的用量相對于化合物(24)的摩爾量以0.810倍摩爾量為宜，優(yōu)選15倍摩爾量。反應溫度以一78'C3(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以5分鐘5小時為宜。烷基化試劑采用化合物(23)時，可如下實施。本步驟可按照公知方法，通過使烷基化試劑、酸酐和堿作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的化合物(24)而實施。烷基化試劑的用量相對于化合物(24)的摩爾量以0.85倍摩爾量為宜，優(yōu)選13倍摩爾量。作為酸酐，可例舉例如三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相對于化合物(24)的摩爾量以0.0120倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.0210倍摩爾量。作為堿，可例舉例如四甲基脲、三甲基吡啶。堿的用量相對于化合物(24)的摩爾量以0.0120倍摩爾量為宜，優(yōu)選O.0210倍摩爾量。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷或它們的任意的混合溶劑。反應溫度以一78。C3(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以5分鐘24小時為宜。(4)步驟d:與步驟a步驟c分別進行，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸衍生物(24)而制得下述通式(27)表示的核糖核酸衍生物的步驟。99、BzW'S、CH3、0OH(24)、oo、一s、〖27)式(24)及(27)中，A、Bz如前所述。本步驟可按照公知方法，通過使二甲亞砜、乙酸和乙酸酐作用于可作為市售品獲得或可按照文獻記載的方法合成的核糖核酸衍生物(24)而實施。二甲亞砜的用量相對于化合物(24)的摩爾量以10200倍摩爾量為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。乙酸的用量相對于化合物(24)的摩爾量以10150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。乙酸酐的用量相對于化合物(24)的摩爾量以10150倍摩爾量為宜，優(yōu)選20100倍摩爾量。反應溫度以1(TC5(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以30分鐘24小時為宜。(5)步驟e:通過使下述通式(28)表示的醇化合物、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于步驟d制得的核糖核酸衍生物(27)，制備在2'位羥基導入了中性條件下脫離的醚型保護基的下述通式(25)表示的核糖核酸衍生物的步驟。O、R，HO鵬，o、^"1BzwY、弊A》^ili^丄^Ef(27》《2S)式(25)、(27)及(28)中，A、Bz、WG'如前所述。本步驟可按照公知方法，通過使醇化合物(28)、酸和針對于硫原子的鹵化劑作用于核糖核酸衍生物(27)而實施。所用溶劑只要不會影響反應即可，無特別限定，可例舉例如二氯甲垸、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它們的任意的混合溶劑。醇化合物(28)的用量相對于化合物(27)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。作為酸，可例舉例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸銀、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。作為針對于硫原子的鹵化劑，可例舉例如N-溴琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘琥珀酰亞胺(NIS)。針對于硫原子的鹵化劑的用量相對于化合物(27)的摩爾量以0.120倍摩爾量為宜，優(yōu)選O.210倍摩爾量。反應溫度以一10(TC2(rC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以5分鐘12小時為宜。(6)步驟f:通過實施脫離步驟c或步驟e制得的核糖核酸衍生物(25)的3'位和5'位羥基的保護基的反應，制得下述通式(29)表示的核糖核酸衍生物的步驟。一(29)式(25)及(29)中，A、Bz、WGi如前所述。本步驟可通過將化合物(25)溶于有機溶劑，使單獨的氟化劑或氟化劑和酸(例如，乙酸、鹽酸、硫酸)的任意混合比的混合試劑與之反應而實施。作為可用于本步驟的氟化劑，可例舉例如氟化銨、氟化四丁基銨(以下稱為TBAF)、三乙胺三氫氟酸鹽、氫氟酸吡啶。氟化劑的用量相對于化合物(25)的摩爾量以0.120倍摩爾量為宜，優(yōu)選0.210倍摩爾量。反應溫度以0"C12(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以30分鐘24小時為宜?；旌先軇┲械姆瘎┖退岬幕旌媳纫?:0.11:2為宜，優(yōu)選1:1《25)381:1.2。(7)步驟g:在步驟f制得的核糖核酸衍生物(29)的5'位羥基導入酸性條件下脫離的保護基(R1)的核糖核酸衍生物(17)的制造步驟。HO、BzRlX3R、歐(29)(l"式(17)、(29)及(30)中，Bz、R1、WG'如前所述，X3表示鹵素。X3所表示的鹵素可例舉與上述Bx的修飾體中的鹵素相同的鹵素。本步驟可按照公知的方法，通過使RY(30)作用于化合物(29)而實施。RY的用量相對于化合物(29)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選l10倍摩爾量。所用溶劑只要對反應沒有影響即可，無特別限定，可例舉例如乙腈、THF。作為堿，可例舉吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二異丙基乙胺、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一烯等有機堿。堿的用量相對于化合物(29)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。反應溫度以0"C12(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以30分鐘24小時為宜。(8)步驟h:通過使亞磷酰胺化試劑和根據需要使用的活化劑作用于步驟b或步驟f制得的核糖核酸衍生物(17)，制備3，位羥基被亞磷酰胺化的亞磷酰胺化合物(B)的步驟。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>物c<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>式(31a)及(31b)中，R2a、R2b、WG2如前所述，X'表示卣素。X'所表示的鹵素可例舉與上述Bx的修飾體中的鹵素相同的鹵素。本步驟是使亞磷酰胺化試劑作用于化合物(17)而將3，位羥基亞磷酰胺化的反應，可按照公知的方法實施。根據需要還可釆用活化劑。所用溶劑只要對反應沒有影響即可，無特別限定，可例舉例如乙腈、THF。亞磷酰胺化試劑的用量相對于化合物(17)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。作為活化劑，可例舉例如lH-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巰基-1H-四唑、4，5-二氯咪唑、4，5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑鹽、三氟甲磺酸咪唑鹽、三氟甲磺酸吡啶鈸鹽、N，N-二異丙基乙胺、2，4，6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑?；罨瘎┑挠昧肯鄬τ诨衔?17)的摩爾量以0.820倍摩爾量為宜，優(yōu)選110倍摩爾量。反應溫度以O。C12(TC為宜。反應時間因所用原料的種類、反應溫度等而異，通常以30分鐘24小時為宜。如上所制備的亞磷酰胺化合物(B)本身可通過例如濃縮、液相轉換、轉溶、溶劑萃取、結晶化、重結晶、分餾、層析等公知的方法進行分離精制。實施例以下，例舉參考例和試驗例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明并不僅限定于此。參考例1氯甲基2-氰基乙基醚步驟1甲硫基甲基2-氰基乙基醚的制備將32g(450mmo1)3-羥基丙腈溶于450ml二甲亞砜，加入324mL乙酸酐和231mL乙酸，室溫下攪拌24小時。將990g碳酸氫鈉溶于4.5L水調制成溶液，用1小時的時間將反應液滴入該溶液中，隨即攪拌l小時，用乙酸N"一乙酯萃取反應液，用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得油狀物進行精制，獲得41g呈無色油狀物的甲硫基甲基2-氰基乙基醚(收率70%)。'H—NMR(CDC13):2.18(s,3H);2.66(t，2H,J=6.3Hz);3.77(t，2H，J=6.3Hz);4.69(s，2H)步驟2氯甲基2-氰基乙基醚的制備使3.3g(25mmol)步驟1獲得的甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于70mL二氯甲烷，冰冷下滴加2mL(25mmol)硫酰氯，再于室溫反應1小時。反應后蒸除溶劑，在真空中進行蒸餾，獲得2.5g呈無色油狀物的目標化合物(收率85%)。沸點8485°C(0.3托)H-麗R(CDC13):2.72(t，2H，J=6.3Hz);3.92(t，2H，J=6.3Hz);5.52(s，2H)參考例25，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)步驟15，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備將546mg(lmmol)5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)尿苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷后加入452mg(3.5mmol)二異丙基乙胺，再加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，然后于室溫反應1小時。升溫至8(TC后滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌30分鐘。反應結束后在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得5'-0-(4，4'-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(197mg，收率34X)。'H—NMR(CDC13):2.47(d，1H，J=7.8Hz);2.69(t'2H,J=6.3Hz);3.55(dd，1H，11.3，2.2Hz);3.62(dd，1H，11.3，2.2Hz);3.83(s,6H);3.87(t，2H，J=6.3Hz);4.07—4.08(m，1H);4.32(dd，1H，J=5.3，1.9Hz);4.54(q，1H，J=5.3Hz);4.94，5.11(2d，2H，J=6.9Hz);5.32(d,1H,J=8.2Hz);6.00(d，1H，J=1.9Hz);6.85-6.88(m，4H);7.29-7.41(m，9H);8.02(d，1H，J=8,2Hz);8.53(br.s,1H)ESI-質譜652[M+Na]+41步驟25，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將209mg(0.332mmol)步驟1獲得的5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，_0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷和23mg(0.332mmo1)四唾溶于2mL乙腈，再滴加150mg(0.498mmol)的2-氰基乙基N，N，N，，N，-四異丙基亞磷酰胺，于45"C反應1.5小時。反應后加入飽和碳酸氫鈉水溶液，用乙酸乙酯萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(200rag，收率73%)。ESI-質譜852[M+Na]+參考例32'-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷步驟13，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備氬氣氛下，將150mg(0.3mmol)3'，5，-0-(四異丙基二硅氧垸-1，3-二基)尿苷溶于7mL的THF，加入54mg(0.4mmo1)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和100mg分子篩4A，攪拌10分鐘。將溫度調整為0。C，加入10mg(0.06mmo1)三氟甲磺酸的THF溶液2mL，攪拌后加入92mg(0.4mmol)N-碘琥珀酰亞胺，攪拌1小時。用硅藻土過濾反應液，用二氯甲垸洗滌后，有機相用1M硫代硫酸氫鈉水溶液洗滌，再用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑。用薄層色譜法對所得殘渣進行精制，獲得3'，5'-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(150mg，收率85%)。'H-匿(CDC13):0.97-1.12(m，28H);2.68-2.73(m，2H);3.78-3.86(m,1H);3.96-4.05(m,2H);4.12-4.30(m，4H);5.0-5.04(m，2H);5.70(d，1H，J二8.2Hz);5.75(s，1H);7.90(d，1H，J=8.2Hz);9.62(br.s,1H)ESI-質譜570[M+H]+步驟22，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備將200mg(0.35mmol)步驟1獲得的3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-l,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷溶于2mL甲醇，再加入65mg(1.76腿o1)氟化銨，于5(TC加熱攪拌5小時。放冷后加入乙腈攪拌，過濾濃縮。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進行精制，獲得目標化合物(108mg，收率94%)。丄H—NMR(CD3OD):2.72—2.76(t，2H，J=6.2Hz);3.68—3.92(m，4H);4.00-4.03(m，1H);4.26-4.32(m，2H);4.81—4.95(m，2H);5.71(d，1H,J=8.1Hz);6.00(d,1H，J=3.3Hz);8.10(d，1H,J=8.1Hz)ESI-質譜350[M+Na]+參考例45，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制備將14g(43mmo1)2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于300mL的THF，在氬氣氛下加入68g(856腿o1)吡啶和20g分子篩4A，攪拌10分鐘。將19.6g(57.8mmo1)4,4，-二甲氧基三苯甲基氯以l小時的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時。接著，加入IOmL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。濃縮濾液后將殘渣溶于乙酸乙酯，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進行精制，獲得目標化合物(26.5g，收率98%)。參考例5NL乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3'-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1NL乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，_0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備將588mg(lmmol)N4-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)胞苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmo1)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應l小時。然后，將溫度升至8(TC，滴加155.4mg(1.3醒ol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌60分鐘。反應結束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得W-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(219mg，收率35X)。'H-NMR(CDC13):2.19(s，3H);2.56(d，1H'J=8.8Hz);2.65(t，2H,J=6.2Hz);3.55(dd，1H，10.5，2.5Hz);3.63(dd，1H，10.5，2.5Hz);3.82(s，6H);3.86(t，2H，J=6.2Hz);4.09—4.14(m，1H);4.28(d，1H，J二5.1Hz);4.44—4.49(m，1H);4.97，5.24(2d，2H，J=6.9Hz);5.96(s,1H);6.86-6.88(m，4H);7.09(d，1H，J=6.9Hz);7.26-7.42(m,9H);8.48(d，1H，J=6.9Hz);8.59(br.s，1H)ESI-質譜:693[M+Na]+步驟2N4-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將205mg(0,306mmol)步驟l獲得的N4-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2mL二氯甲垸，加入105mg(0.812mmol)二異丙基乙胺，再滴加116mg(0.49mmol)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應l小時。反應后蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(242mg，收率91%)。ESI-質譜:871[M+H]+參考例6NL乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷步驟1Nt乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備混合1.OOg(l.89mmol)N4-乙?；?3'，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)胞苷和500mg(3.79mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚，將混合物溶于10raL甲苯和10raLTHF的混合溶劑。然后，加入975mg(3.79mmol)三氟甲磺酸銀，再加入分子篩4A，干燥。冰冷下加入370mg(2.08mmol)N-溴琥珀酰亞胺，將反應容器遮光，攪拌10分鐘。再追加70mg(0.39mmol)N-溴琥珀酰亞胺，攪拌25分鐘。反應結束后加入二氯甲烷稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液進行洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得Nt乙酰基-3，，5'-0-(四異丙基二硅氧垸-l，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(936mg，收率81%)。力一NMR(CDC13):0.90—1.11(m，28H);2.28(s,3H);2.62—2.79(ra，2H);3.78—3.89(m,1H);3.96—4.04(m，2H);4.19-4.23(m，3H);4.30(d，1H，J=13.6Hz);5.00(d，1H，J=6.8Hz);5.09(d，1H，J=6.8Hz);5.77(s，1H);7.44(d，1H，J=7.5Hz);8.30(d，1H，J=7.5Hz);10.13(s，1H)ESI-質譜611[M+H]+步驟2N4-乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備將500mg(0.819mmol)步驟l獲得的N4-乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2.5mLTHF和2.5mL甲醇的混合溶劑，加入150mg(4.10mmol)氟化銨，于5(TC反應4小時。反應結束后，用乙腈稀釋，過濾，蒸除溶劑，再用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(210mg,收率70%)。'H—NMR(D20):2.13(s，3H);2.66—2.71(m，2H);3.72—3.78(m，3H);3.90(dd，1H，J-13.0,2.6Hz);4.06—4.11(m，1H);4.20(dd，1H，J=7.1，5.2Hz);4.29(dd，1H，J=5.1，2.9Hz);4.83(d，1H，J=7.2Hz);4.94(d,1H，J=7.2Hz);5.95(d，1H，J=2.9Hz);7.25(d，1H，J=7.6Hz);8.25(d，1H，J=7.6Hz)ESI-質譜391[M+Na]+參考例7N4-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制備將9.9g(26.8mmo1)2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于190mLTHF，在氬氣氛下加入43g(538mmo1)吡啶和20g分子篩4A，攪拌10分鐘。將11.8g(34.9mmo1)4，4，-二甲氧基三苯甲基氯以l小時的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時。接著，加入2mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。用蒸發(fā)器濃縮濾液后將殘渣溶于乙酸乙酯，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進行精制，獲得目標化合物(15g，收率83%)。參考例8W-乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1N2-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將627mg(l腿ol)N2-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)鳥苷溶于4mL的1,2-二氯乙垸，加入452mg(3.5mmo1)二異丙基乙胺后加入365mg(L2ramol)二氯化二丁基錫，室溫下反應l小時。然后，將溫度升至8(TC，滴加155.4mga.3imnol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌60分鐘。反應結束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫45酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得W-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(450mg，收率63%)。'H—NMR(CDC13):1.92(s'3H);2.47—2.51(m，2H);2.68(br.s，1H);3.30(dd，1H,10.7，3.8Hz);3.47(dd，1H，10.7，3.8Hz);3.55—3.60(m，1H);3.65—3.70(m，1H);3.74，3.75(2s，6H);4.22—4.23(m，1H);4.55—4.58(m,1H);4.78,4.83(2d，2H，J=7.0Hz);5.01(t，1H，J=5.1Hz);5.99(d，1H,J=5.1Hz);6.76-6.79(m，4H);7.17—7.44(m，9H);7.88(s，1H);8.36(br.s，1H);12.06(br.s，1H)步驟2W-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3'-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將400mg(0.563mmo1)步驟1獲得的N2-乙?；?5，-0-(4，4'-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于2mL二氯甲烷，加入181mg(1.4mmol)二異丙基乙胺，再滴加161mg(0.68mmo1)2-氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應l小時。反應后蒸除溶劑，利用20g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(471mg，收率92%)。參考例9NL乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1NL乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將22.0g(36.0mmol)N6-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)腺苷溶于170mL的1，2-二氯乙烷，加入16.3mg(126mmol)二異丙基乙胺后加入12.lg(39.7mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應1小時。然后，將溫度升至80。C攪拌15分鐘，再滴加4.30g(36.0mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌30分鐘。反應結束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得N6-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(7.47g，收率33%)。'H—NMR(CDC1》:2.51(t,2H，J=6.2Hz);2.58(d,1H，J=5.5Hz);2.61(s，3H);3.45(dd,1H，J=10.7,4.0Hz);3.54(dd，1H,J=10.7，3.2Hz);3.62—3.79(m，2H);3.79(s，6H);4.25(br.q，1H'J=4.6Hz);4.59(q，1H，J=5.2Hz);4.87—4.94(m，3H);6.23(d，1H，J二4.4Hz);6.80-6.83(m，4H);7.22-7.32(m，7H);7.40-7.43(m，2H);8.20(s，1H);8.61(br.s,1H);8.62(s，1H)ESI-質譜695[M+H]+步驟2N6-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2_氰基乙氧基甲基)腺苷3'-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將10.0g(14.4mmol)步驟1獲得的N6-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于75mL二氯甲垸，加入4.7g(36mmol)二異丙基乙胺，再滴加4.82g(20.3mmo1)2-氰基乙基N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應l小時。反應后剩余30mL左右的溶劑，進行蒸除，再用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(12.0g，收率93%)。ESI-質譜895[M+H]+參考例10N^乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷步驟1N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備使245mg(1.09mmol)N-碘琥珀酰亞胺和280mg(1.09mmo1)三氟甲磺酸銀懸浮于8mL二氯甲烷，加入分子篩4A，干燥。冰冷下，在其中加入將40Omg(O.73隱0)^-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-l,3-二基)腺苷和145mg(1.llmraol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于4mL二氯甲垸而形成的溶液，隨即攪拌3小時。反應結束后加入二氯甲垸稀釋，再用硫代硫酸鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉水溶液進行洗滌，用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，所得混合物用硅膠柱色譜法精制，獲得lf-乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(201mg,收率45%)。'H-NMR(CDCU:0.98—1.11(m，28H);2,62(s，3H);2.69(td,2H,6.5，J=1.5Hz);3.81—3.89(m,1H);4.02—4.09(m，2H);4.17(d，1H，J二9.4Hz);4.28(d，1H，J=13.4Hz);4.50(d，1H，J=4.5Hz);4.67(dd,1H,J=8.8，4.5Hz);5.02(d，1H,J=7.0Hz);5.08(d，1H,J=7.0Hz);6.10(s，1H);8.34(s，1H);8.66(s，1H);8.67(s，1H)ESI-質譜:636[M+H]+步驟2N6-乙?；?2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將300mg(0.47誦ol)步驟1獲得的N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧垸-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于0.lmL乙酸和2mL的0.5MTBAF的THF溶液的混合溶液，室溫下攪拌2小時。反應結束后用硅膠柱色譜法對所得反應混合物進行精制，獲得目標化合物(160mg，收率86%)。lH-臓(DMSO-d6):2.25(s，3H);2.53-2.68(m，2H);3.41-3.46(m,1H);3.56-3.64(m，2H);3.69-3.73(m，1H);4.00-4.01(m，1H);4.36—4.37(m，1H);4.72—4.78(m，3H);5.20(bt，2H);5.41(d，1H，J=5.2Hz);6.17(d，1H，J=5.7Hz);8.66(s，1H);8.72(s，1H);10,72(s，1H)ESI-質譜415[M+Na]+參考例11Ne-乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將9.50g(24.2mmo1)N6-乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于100mL脫水吡啶，濃縮干燥后，氬氣氛下溶于100mL脫水吡啶。冰冷下，加入10.7g(31.2mmo1)4，4，-二甲氧基三苯甲基氯，室溫下反應1小時20分鐘。反應結束后，用二氯甲垸稀釋，再用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(13.8g,收率82%)。參考例12N^苯氧基乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)步驟1N2-苯氧基乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將720mg(lmmol)N2-苯氧基乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)鳥苷溶于4mL的1,2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmo1)二異丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基錫，室溫下反應1小時。然后，將溫度升至80°C，再滴加155.4mg(1.3ramol)氯甲基2-氰基乙基醚，隨即攪拌60分鐘。反應結束后，在飽和碳酸氫鈉水溶液中加入反應液，用二氯甲烷萃取，再用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行48精制，獲得W-苯氧基乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(384mg，收率48%)。'H-NMR(CDC13):2.47-2.51(m，2H);2.58(br.s，1H);3.42(dd，1H，10.1,3.8Hz);3.46(dd,1H，10.1，3.8Hz);3.53—3.57(m，1H);3.69—3.73(m，1H);3.77(s,6H);4.24-4.26(m,1H);4.48—4,50(m,1H);4.61—4.65(m，2H);4.83，4.87(2d,2H，J=7.0Hz);4.88(t,1H，J=5.7Hz);6.05(d,1H，J=5.7Hz);6.80—6.82(m，4H);6.92—6.96(m，3H);7.07—7.11(m，2H);7.20—7.42(m，9H);7.84(s,1H);8.99(s，1H);11.81(br.s，1H)ESI-質譜825[M+Na]+步驟2N^苯氧基乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3'-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)的制備將320rag(0.399mmo1)步驟1獲得的W-苯氧基乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于4mL二氯甲烷，加入128.8mg(0.996mmol)二異丙基乙胺，再滴力口141.5mg(0.598mmo1)2_氰基乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺，室溫下反應l小時。反應后蒸除溶劑，再利用30g的硅膠柱色譜對所得混合物進行精制，獲得目標化合物(316mg，收率79%)。ESI-質譜1003[M+H]+參考例13NL苯氧基乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷步驟1Ni苯氧基乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將2.0g(3.Ommol)N2-苯氧基乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)鳥苷溶于16mL的THF，加入0.99g(7.6mmo1)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和1.0g分子篩4A，氬氣氛下于—45。C攪拌10分鐘。然后，加入0.68g(4.5mmol)三氟甲磺酸的5mLTHF溶液，攪拌后加入1.02g(4.5mmol)N-碘琥珀酰亞胺，攪拌15分鐘。在反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，過濾后用乙酸乙酯萃取，有機相用1M硫代硫酸氫鈉水溶液洗滌，再依次用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌，接著用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑。所得殘渣用硅膠柱色譜法精制，獲得N2-苯氧基乙酰基-3'，5，-0-(四異丙基二硅氧垸—1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷(2.0g,收率89%)。工H—醒R(CDC13):0.99—1.11(m，28H);2.59—2.77(m，2H);3.82—4.05(m，3H);4.15(d，1H，J=9.3Hz);4.25—4.35(m,2H);4.52—4.56(dd，1H，J二9.3,4.3Hz);5.00，5.07(2d，2H，J=7.2Hz);5.95(s,1H);6.99—7.12(m,3H);7.35—7.40(m，2H);8.09(s，1H);9.38(br.s,1H);11.85(br.s,1H)ESI-質譜766[M+Na]+步驟2N2-苯氧基乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備在2.83mL(2.83mmo1)的1MTBAF/THF溶液中加入0.14mL(0.14mmo1)乙酸，調制出溶液。將1.0g(1.35mmol)步驟l獲得的N2-苯氧基乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷溶于2.83mLTHF，在其中加入先前調制的溶液，氬氣氛下于室溫攪拌1小時。減壓下濃縮反應液后將其溶于二氯甲烷，用硅膠柱色譜法精制，獲得目標化合物(0.67g，收率99%)。'H—NMR(DMS0—d6):2.59—2.66(m，2H);3.41—3.63(m，4H);3.98(m，1H);4.32(m，1H);4.58—4.62(t，1H，J=5,3Hz);4.71—4.78(dd，2H，J=13.1,6.8Hz);4.87(s,2H);5.12(s，1H);5.37(s，1H);5.97(d，1H，J二6.1Hz);6.96-6.99(m,3H);7.28-7.34(m，2H);8.30(s，1H);11.78(br.s，2H)ESI-質譜500[M-H]—參考例14W-苯氧基乙?；?5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷的制備將660mg(1.32mmol)N2-苯氧基乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分鐘。然后，溶于9mLTHF，在氬氣氛下加入2.lg(26.4mmol)吡啶和600mg分子篩4A，攪拌10分鐘。將540mg(1.58誦o1)4,4，-二甲氧基三苯甲基氯以1小時的間隔分3次加入其中，再攪拌1小時。接著，加入2mL甲醇攪拌2分鐘，再用硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。用蒸發(fā)器濃縮濾液后將殘渣溶于乙酸乙酯，再與飽和碳酸氫鈉水溶液分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑。用硅膠柱色譜法對所得殘渣進行精制，獲得目標化合物(800mg，收率75%)。參考例15N6-乙?；?3，，5，-O-(四異丙基二硅氧烷-l,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷步驟1N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-O-甲硫基甲基腺苷的制備將2.00g(3.62mmol)N6-乙酰基-3，，5，-0-(四異丙基二硅氧垸-1,3-二基)腺苷溶于25mL二甲亞砜，加入17.5mL乙酸酐和12.5mL乙酸，室溫下攪拌14小時。反應結束后在200mL水中加入反應液，用乙酸乙酯萃取，用飽和碳酸氫鈉水溶液進行洗滌，再用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，用硅膠柱色譜法對所得混合物進行精制，獲得N6-乙酰基-3',5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2'-0-甲硫基甲基腺苷(1.36g，收率61%)。'H-NMR(CDC13):0.96—1.11(m，28H);2.20(s,3H);2.61(s,3H);4.03(dd，1H，J=13.4，2.4Hz);4.18(d，1H，J=9.1Hz);4.27(d，1H，J=13.4Hz);4.63—4.71(m，2H);5.00(d，1H，J=11.5Hz);5.07(d，1H，J=11.5Hz);6.09(s，1H);8.31(s，1H);8.65(s，1H);8.69(s，1H)ESI-質譜635[M+Na]+步驟2N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制備將1.OOg(l.63隨ol)步驟1獲得的N6-乙?；?3，，5，-0-(四異丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-甲硫基甲基腺苷溶于25mLTHF。加入5.88g(82.7mmol)3-羥基丙腈，再加入分子篩4A，干燥，冷卻至一45。C。接著，加入440mg(1.96mmol)N-碘琥珀酰亞胺，再加入490mg(3.26mmo1)三氟甲磺酸，于一45。C攪拌15分鐘。反應結束后，在冷卻的狀態(tài)下加入三乙胺進行中和，用二氯甲烷稀釋，再用硫代硫酸鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，所得混合物用硅膠柱色譜法精制，獲得目標化合物(722mg，收率71X)。試驗例1在加帽工序中使用的?；磻幕罨瘎┘氨窖趸宜嵫苌锏牟都瘎┑男Ч?將負載有市售的5，-0-(4，4'-二甲氧基三苯甲基)胸苷的CPG固相載體(333mg，15umol)裝入帶玻璃濾器的柱子中，使用核酸自動合成機(Expedite:美國應用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems))進行低聚核酸(腺苷酰-[3，一5，]-胞苷酰-[3，一5，]-尿苷酰-[3，一5，]-鳥苷酰-[3，一5，]-腺苷酰-[3，一5，]-胞苷酰-[3，一5，]-尿苷酰-[3，一5，]-鳥苷酰-[3，一5，]-腺苷酰-[3'—5，]-胞苷酰-[3，一5']-尿苷酰-[3，一5']-鳥苷酰-[3，一5']-腺苷酰-[3，一5，]-胞苷酰-[3'—5，]-尿苷酰-[3，一5，]-鳥苷酰-[3，一5，]-腺苷酰-[3，一5，]-胞苷酰-[3，一5，]-尿苷酰-[3，一5，]-鳥苷酰-[3，一5，]-胸苷)的合成。作為核酸單體化合物使用N4-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、W-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)_2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N4-苯氧基乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)，作為縮合催化劑使用苯甲基巰基四唑，作為氧化劑使用碘溶液，作為在加帽工序中使用的試劑使用以下的表1中記載的4種試劑，使核酸單體化合物縮合20次。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage52</formula>試劑的構成0.1M苯氧基乙酸酐的THF溶液和2-DMAP/2，6-二甲基吡啶/THF溶液(2-DMAP(6.5g)，2，6-二甲基吡啶(lOmL)，THF溶液(90mL))對于在以上的條件下制得的各低聚核酸，作為切割試劑使用氨水-乙醇(3:1)，于4(TC用4小時實施從CPG固相載體的切割和各磷酸部位、堿基部位的保護基的脫離反應。過濾各反應化合物后減壓下濃縮濾液，用含l%硝基甲烷的1MTBAF的THF溶液于室溫反應3小時，進行2'位羥基的保護基的脫離反應。直接取出一部分未精制的在上述條件下制得的低聚核酸，進行HPLC分析。圖1為使用上述1的試劑而制得的未精制的低聚核酸在以下測定條件下進行HPLC的結果。圖2為使用上述2的試劑而制得的未精制的低聚核酸在以下測定條件下進行HPLC的結果。圖3為使用上述3的試劑而制得的未精制的低聚核酸在以下測定條件下進行HPLC的結果。圖4為使用上述4的試劑而制得的未精制的低聚核酸在以下測定條件下進行HPLC的結果。測定條件HPLC裝置送液單元LC-IOAT(株式會社島津制作所制)檢測器SPD-IOAVP(株式會社島津制作所制)陰離子交換HPLC柱DNAPacPA-100<4mm4>X250mm〉(戴安(DI0NEX)公司制)柱溫50°C流動相梯度線性梯度20分鐘(B液5—25%)A液含10%乙腈的25mMTris-HC1緩沖液B液含10%乙腈、700mM高氯酸鈉的25mMTris-HCl緩沖液流動相的流量lml/分鐘紫外可視分光光度計檢測波長260nm接著，在乙醇中滴入各反應溶液，生成沉淀后離心分離母液和沉淀。通過傾析除去母液，用陰離子交換柱(DEAE)處理沉淀來除去不需要的峰后，用洗脫溶劑(含l.OM氯化鈉水溶液的lOmM磷酸緩沖液)精制。對溶液進行透析處理后，獲得目標化合物。在用滅菌水稀釋至約200D/ml左右的試樣200yl中添加核酸酶Pl(O.5單位)，于37。C反應48小時后，于37'C使堿性磷酸酶(5單位)和緩沖液(lmMMgCl2、0.ImMZnCl2、lmM精脒的50mMTris-HCl緩沖液，pH9.3)反應24小時，進行酶分解。在以下測定條件下對各酶分解產物進行HPLC分析(參照圖5、6、7)。圖5是對使用上述2的試劑制得的低聚核酸的酶分解產物在下述測定條件下進行HPLC分析的結果。圖6是對使用上述3的試劑制得的低聚核酸的酶分解產物在下述測定條件下進行HPLC分析的結果。圖7是對使用上述4的試劑制得的低聚核酸的酶分解產物在下述測定條件下進行HPLC分析的結果。測定條件HPLC裝置送液單元LC-IOAS(株式會社島津制作所制)檢測器SPD-6AV(株式會社島津制作所制)反相HPLC柱Develosil0DS-UG-5反相柱<4.6mm4>X250mm〉(野村化學株式會社制)柱溫40°C流動相梯度等度(isocratic)20分鐘50mM磷酸二氫鉀水溶液(pH3.0):甲醇二20:1流動相的流量lml/分鐘紫外可視分光光度計檢測波長260nm從圖14的結果可確認，作為用于促進?；磻幕罨瘎┦褂?-DMAP時的加帽效率比使用NMI或4-DMAP時更好。作為苯氧基乙酸酐的捕集劑使用2，6-二甲基吡啶時的加帽效率比使用吡啶時更好。從圖57的結果可確認，作為?；磻幕罨瘎┦褂眯袸或4-DMAP時，在保持時間約8.5分鐘時可見少量的來自鳥苷的2,6-二氨基嘌呤體的生成。另一方面，作為?；磻幕罨瘎┦褂?-DMAP時，2,6-二氨基嘌呤體的生成明顯下降，進一步地將堿由吡啶改為2,6-二甲基吡啶時，無法確認到2，6-二氨基嘌呤體的生成。試驗例2在加帽工序中使用的?；磻幕罨瘎┘氨窖趸宜嵫苌锏牟都瘎┑男Ч?將負載有市售的5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)胸苷的CPG固相載體(333mg，15umol)裝入帶玻璃濾器的柱子中，使用核酸自動合成機(Expedite:美國應用生物系統(tǒng)公司)進行低聚核酸(胞苷酰-[3，一5，]-尿苷酰-[3，一5']-尿苷酰-[3，一5，]-腺苷酰-[3'—5，]-胞苷酰-[3，一5']-鳥苷酰-[3，一5，]-胞苷酰-[3，一5，]-尿苷酰-[3，一5，]-鳥苷酰-[3，一5，]-腺苷酰-[3，一5']-鳥苷酰-[3'—5']-尿苷酰-[3"5']-腺苷酰-[3'—5']-胞苷酰-[3，一5，]-尿苷酰-[3'—5，]-尿苷酰-[3，一5，]-胞苷酰-[3，一5，]-鳥苷酰-[3'—5，]-腺苷酰-[3，一5']-胸苷酰-[3，一5，]-胸苷)的合成。作為核酸單體化合物使用W-乙?；?5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、NL乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺)、N4-苯氧基乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鳥苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二異丙基亞磷酰胺)，作為縮合催化劑使用苯甲基巰基四唑，作為氧化劑使用碘溶液，作為在加帽工序中使用的試劑使用以下的表2中記載的3種試劑，使核酸單體化合物縮合20次。對于在以上的條件下制得的各低聚RNA，作為切割試劑使用氨水-乙醇(3:1)，于4(TC用4小時實施從CPG固相載體的切割和各磷酸部位、堿基部位的保護基的脫離反應。過濾各反應化合物后減壓下濃縮濾液，用含1%硝基甲烷的1MTBAF的THF溶液于室溫反應3小時，進行2'位羥基的保護基的脫離反應。然后，在乙醇中滴入各反應溶液，生成沉淀后離心分離母液和沉淀。通過傾析除去母液，用陰離子交換柱(DEAE)處理沉淀來除去不需要的峰后，用洗脫溶劑(含l.OM氯化鈉水溶液的lOmM磷酸緩沖液)精制。對溶液進行透析處理后，獲得目標化合物。使用上述各試劑時的低聚核酸的收量和收率如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>通過MALDI-TOF-MS確認所得化合物為目標化合物。對應于計算值6607.06[M+H]+，各實測值分別為6607.69[M+H]+、6609.97[M+H]+、6607.91[M+H]+。如上所述，在加帽工序中，通過使用2-DMAP作為酰基化反應的活化劑，使用2，6-二甲基吡啶作為苯氧基乙酸衍生物的捕集劑，低聚核酸的分離收率顯著提高。產業(yè)上利用的可能性通過本發(fā)明的加帽工序，對于低聚核酸衍生物(2)，可以令人滿意的效率制得核糖5，位羥基被?；Ｗo了的低聚核酸衍生物(12)。此外，通過本發(fā)明的加帽工序，如使用4-DMAP作為酰基化反應的活化劑時，不生成作為副產物的2，6-DAP。如上所述，通過本發(fā)明的加帽工序，可以高純度且方便地進行低聚核酸的制造。附圖的簡單說明圖1表示由HPLC分析獲得的色譜圖吸收強度。圖2表示由HPLC分析獲得的色譜圖吸收強度。圖3表示由HPLC分析獲得的色譜圖吸收強度。圖4表示由HPLC分析獲得的色譜圖吸收強度。圖5表示由HPLC分析獲得的色譜圖吸收強度。圖6表示由HPLC分析獲得的色譜圖吸收強度。圖7表示由HPLC分析獲得的色譜圖。圖中，縱軸為時間(分鐘)，橫軸為。圖中，縱軸為時間(分鐘)，橫軸為。圖中，縱軸為時間(分鐘)，橫軸為。圖中，縱軸為時間(分鐘)，橫軸為。圖中，縱軸為時間(分鐘)，橫軸為。圖中，縱軸為時間(分鐘)，橫軸為。圖中，縱軸為時間(分鐘)，橫軸為吸收強度。權利要求1.以下的通式(12)表示的低聚核酸衍生物的制造方法，其特征在于，在用?；Ｗo以下的通式(2)表示的低聚核酸衍生物的核糖的5’位羥基的加帽工序中，作為?；噭┦褂靡韵碌耐ㄊ?11a)表示的苯氧基乙酸酐衍生物，作為?；磻幕罨瘎┦褂靡韵碌耐ㄊ?11b)或(11c)表示的吡啶衍生物，式(2)、(11a)、(11b)、(11c)及(12)中，各Bx分別獨立，表示可具有保護基的核酸堿基或其修飾體，n表示1～200的范圍內的整數，各Q分別獨立，表示O或S，各WG2表示吸電子基團，R51、R52、R53分別相同或不同，表示H、烷基或鹵素，R6a、R6b、R7a、R7b、R7c、R7d分別相同或不同，表示烷基，R6c、R6d分別相同或不同，表示H或烷基，各R4分別獨立，表示H、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基或以下的通式(3)表示的取代基，式(3)中，WG1表示吸電子基團，E表示酰基或以下的通式(4)表示的取代基，式(4)中，E1表示單鍵或以下的通式(5)表示的取代基，式(5)中，Q、WG2的含義如前所述，T表示H、酰氧基、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基、上述通式(3)表示的取代基或上述通式(4)表示的取代基，但E或T的任一方為取代基(4)。2.如權利要求1所述的低聚核酸衍生物的制造方法，其特征在于，吡啶衍生物(llb)為2-二甲基氨基吡啶。3.如權利要求1所述的低聚核酸衍生物的制造方法，其特征在于，苯氧基乙酸酐衍生物(lla)為苯氧基乙酸酐。4.如權利要求1所述的低聚核酸衍生物的制造方法，其特征在于，WG1為氰基。5.如權利要求14中任一項所述的低聚核酸衍生物的制造方法，其特征在于，還使用吡啶或2,6-二甲基吡啶。6.以下的通式(A)表示的低聚核酸的制造方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式(A)中，各B分別獨立，表示核酸堿基或其修飾體，n表示l200的范圍內的整數，各Q分別獨立，表示O或S，各R分別獨立，表示H、羥基、鹵素、烷氧基、垸硫基、烷基氨基、二烷棊氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或垸氧基垸基氧基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，其特征在于，包括下述步驟在用?；Ｗo以下的通式(2)表示的低聚核酸衍生物的核糖的5'位羥基的加帽工序中，作為?；噭┦褂靡韵碌耐ㄊ?lla)表示的苯氧基乙酸酐衍生物，作為?；磻幕罨瘎┦褂靡韵碌耐ㄊ?llb)或(llc)表示的吡啶衍生物，藉此制備以下的通式(12)表示的低聚核糖衍生物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(2)、(lla)、(llb)、(11c)及(12)中，各Q分別獨立，其含義如前所述，n如前所述，各Bx分別獨立，表示可具有保護基的核酸堿基或其修飾體，各WGS表示吸電子基團，R51、R52、R"分別相同或不同，表示H、烷基或鹵素，R6a、R6b、R7a、R7b、R7e、R7d分別相同或不同，表示烷基，R6e、116(1分別相同或不同，表示H或烷基，各W分別獨立，表示H、鹵素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二垸基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基或以下的通式(3)表示的取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>，(3》式(3)中，1\\^31表示吸電子基團，E表示?；蛞韵碌耐ㄊ?4)表示的取代基，(4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>HE'-連接基固相載體式(4)中，E'表示單鍵或以下的通式(5)表示的取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(5)中，Q、WG"的含義如前所述，T表示H、酰氧基、鹵素、烷氧基、垸硫基、垸基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基、上述通式(3)表示的取代基或上述通式(4)表示的取代基，但E或T的任一方為取代基(4)。7.如權利要求6所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，吡啶衍生物(llb)為2-二甲基氨基吡啶。8.如權利要求6所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，苯氧基乙酸酐衍生物(11a)為苯氧基乙酸酐。9.如權利要求6所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，WG'為氰基。10.如權利要求69中任一項所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，還使用吡啶或2,6-二甲基吡啶。11.以下的通式(A)表示的低聚核酸的制造方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(A)中，各B分別獨立，表示核酸堿基或其修飾體，n表示l200的范圍內的整數，各Q分別獨立，表示O或S，各R分別獨立，表示H、羥基、鹵素、垸氧基、垸硫基、垸基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷基氧基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，其特征在于，包括下述步驟AH:步驟A:使酸作用于以下的通式(l)表示的(低聚)核酸衍生物，藉此脫離5'位羥基的保護基，制備以下的通式(2)表示的(低聚)核酸衍生物的步驟，式(1)及(2)中，各Q分別獨立，其含義如前所述，n如前所述，各Bx分別獨立，表示可具有取代基的核酸堿基或其修飾體，Rt表示以下的通式(10)表示的取代基，(10)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(10)中，R11、R12、R。相同或不同，表示氫或烷氧基，各\\^2表示吸電子基團，各W分別獨立，表示H、鹵素、烷氧基、垸硫基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基垸基氧基或以下的通式(3)表示的取代基，《3》式(3)中，WGt表示吸電子基團，E表示?；蛞韵碌耐ㄊ?4)表示的取代基，(4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>——E1—連接基固相裁體式(4)中，Ei表示單鍵或以下的通式(5)表示的取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(5)式(5)中，Q、WGZ的含義如前所述，T表示H、酰氧基、鹵素、垸氧基、垸硫基、烷基氨基、二院基氨基、鏈烯氧基、鏈烯硫基、鏈烯基氨基、二鏈烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、垸氧基烷基氧基、上述通式(3)表示的取代基或上述通式(4)表示的取代基，但E或T的任一方為取代基(4)，步驟B:采用活化劑使核酸單體化合物與步驟A制得的(低聚)核酸衍生物(2)縮合，制備以下的通式(9)表示的低聚核酸衍生物的步驟，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>《2》式(2)及(9)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述，E、n、R1、T的含義如前所述，步驟C:用酰基保護在步驟B中未反應的(低聚)核酸衍生物(2)的核糖的5'位羥基的加帽工序中，作為?；噭┦褂靡韵碌耐ㄊ?lla)表示的苯氧基乙酸酐衍生物，作為?；磻幕罨瘎┦褂靡韵碌耐ㄊ?llb)或(llc)表示的吡啶衍生物，藉此制備以下的通式(12)表示的低聚核糖衍生物的步驟，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式(2)、(lla)、(llb)、(11c)及(12)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分別獨立，其含義如前所述，E、n、T如前所述，R51、R52、R"分別相同或不同，表示H、垸基或鹵素，R6a、R6b、R7a、R7b、R7e、R^分別相同或不同，表示烷基，R6e、R^分別相同或不同，表示H或烷基，步驟D:通過使氧化劑作用于步驟B中制備的低聚核酸衍生物(9)而將亞磷酸基轉變?yōu)榱姿峄蛄虼姿峄牟襟E，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式(9)及(13)中，各Bx、各Q、各R4、各WGS分別獨立，其含義如前所述，E、n、R1、T的含義如前所述，步驟E:將步驟D制備的低聚核酸衍生物(13)從固相載體切割，脫離各核酸堿基部及各磷酸基的保護基的步驟，式(14)及(15)中，各B、各Q、各R、各W分別獨立，其含義如前所述，n、R1、Z的含義如前所述，步驟G:將步驟F制造的低聚核酸衍生物(15)的5'位羥基脫離的步驟，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>式(13)及(14)中，各B、各Bx、各Q、各R4、各WG2、Z分別獨立，其含義如前所述，E、n、R、R1、T、Z的含義如前所述，步驟F:使用于脫離各核糖的2'位羥基的保護基的試劑作用于步驟E制造的低聚核酸衍生物(14)，藉此制備以下的通式(15)表示的低聚核酸衍生物的步驟，式(15)及(A)中，各B、各Q、各R分別獨立，其含義如前所述，n、R1、Z的含義如前所述，步驟H:分離精制步驟G制備的低聚核酸(A)的步驟。12.如權利要求ll所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，步驟B中，作為核酸單體化合物的至少1種使用以下的通式(B)表示的化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(B)式(B)中，Bz表示可具有保護基的核酸堿基或其修飾體，W表示以下的通式(10)表示的取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>《10)式(10)中，R11、R12、1113相同或不同，表示氫或烷氧基，R2a、R2b相同或不同，表示垸基或R23、R2b表示與鄰接的氮原子一起形成的56元的飽和氨基環(huán)基，該飽和氨基環(huán)基除了氮原子以外可具有1個作為成環(huán)原子的氧原子或硫原子，WG1、WG2相同或不同，表示吸電子基團。13.如權利要求11或12所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，通過重復步驟AD，制造所需鏈長的低聚核酸。14.如權利要求1113中任一項所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，吡啶衍生物(llb)為2-二甲基氨基吡啶。15.如權利要求1113中任一項所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，苯氧基乙酸酐衍生物(lla)為苯氧基乙酸酐。16.如權利要求1113中任一項所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，WGi為氰基。17.如權利要求1116中任一項所述的低聚核酸的制造方法，其特征在于，還使用吡啶或2,6-二甲基吡啶。全文摘要本發(fā)明的目的是提供在所謂的加帽工序中高效地將5’位羥基?；姆椒āＭㄊ?12)表示的低聚核酸衍生物的制造方法，其特征在于，在用酰基保護以通式(2)表示的低聚核酸衍生物的各核糖的5’位羥基的加帽工序中，作為酰基化試劑使用以通式(11a)表示的苯氧基乙酸酐衍生物，作為?；磻幕罨瘎┦褂靡酝ㄊ?11b)或(11c)表示的吡啶衍生物。文檔編號C07H21/00GK101426804SQ20078001395公開日2009年5月6日申請日期2007年2月26日優(yōu)先權日2006年2月27日發(fā)明者塩谷由輝子申請人:日本新藥株式會社