專利名稱：單糖和二糖衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖衍生物，其中單糖分子的至少一個(gè)游離羥基(單糖分子上有3、4或5個(gè)游離羥基)或者二糖分子的至少一個(gè)游離羥基(二糖分子上優(yōu)選有8個(gè)游離羥基)已被修飾。這些修飾是用各種取代基團(tuán)對或者是羥基上的氫原子或者是整個(gè)羥基基團(tuán)本身進(jìn)行的取代。以此方式，根據(jù)進(jìn)行取代的數(shù)量和類型的不同，可以獲得具有所需性質(zhì)的單糖或二糖衍生物。
具體來說，本發(fā)明涉及一種新的、具有1到N-1個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)的單糖或二糖衍生物，其中N指獲得衍生物的單糖或二糖的羥基數(shù)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，單糖或二糖衍生物還含有1到N-1個(gè)陰離子基團(tuán)并且其中脂肪酸酯基團(tuán)和陰離子基團(tuán)的組合數(shù)目不超過N。陰離子基團(tuán)和脂肪酸酯基團(tuán)的組合數(shù)目在1到N之間。優(yōu)選地，單糖或二糖衍生物的游離羥基不多于兩個(gè)，羥基、脂肪酸酯和陰離子基團(tuán)的組合數(shù)不超過N。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，二糖衍生物的脂肪酸酯至少有2個(gè)、優(yōu)選3個(gè)、更優(yōu)選4或5個(gè)、最優(yōu)選6個(gè)，并且陰離子基團(tuán)至少有1個(gè)、但不多于N-2個(gè)、優(yōu)選N-3個(gè)、更優(yōu)選N-4個(gè)或N-5個(gè)、最優(yōu)選N-6個(gè)，其中脂肪酸酯和陰離子基團(tuán)的組合數(shù)不超過N，其中N是獲得該衍生物的二糖的羥基數(shù)。
本發(fā)明所述的單糖衍生物優(yōu)選具有至少2個(gè)、更優(yōu)選3或4個(gè)、但不多于N-1個(gè)脂肪酸酯并且至少一個(gè)、但不多于N-2個(gè)，更優(yōu)選N-3個(gè)陰離子基團(tuán)，其中脂肪酸酯和陰離子基團(tuán)總的組合數(shù)不超過N，其中N是獲得該衍生物的二糖的羥基數(shù)。
因此，本發(fā)明所述的、特別優(yōu)選的衍生出的單糖具有至少一個(gè)陰離子基團(tuán)和至少兩個(gè)脂肪酸酯，其中陰離子基團(tuán)和脂肪酸酯的總數(shù)在3-5之間，而且特別優(yōu)選的衍生出的二糖具有至少一個(gè)、優(yōu)選1或4個(gè)陰離子基團(tuán)及至少一個(gè)脂肪酸酯，其中陰離子基團(tuán)和脂肪酸酯的總數(shù)在6-8之間，優(yōu)選7或8。
此處所用的術(shù)語“脂肪酸酯基團(tuán)”或“脂肪酸基團(tuán)”是指由通式-O-C(＝O)-(CH2)x-CH3、其中x至少是4，-OC(＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH3、其中x+y至少是4，或-O-(C＝O)-(CH2)X-CH＝CH-(CH2)y-CH＝CH-(CH2)z-CH3、其中x+y+z在2到20之間代表。此處所用術(shù)語“陰離子基團(tuán)”是指帶負(fù)電荷的部分(即在中性pH或使用該衍生物的環(huán)境pH下帶負(fù)電荷)。例如，這樣的負(fù)電荷基團(tuán)可以是硫酸根、磺酸根或磷酸根。優(yōu)選的陰離子基團(tuán)包括“硫酸酯基團(tuán)”即具有SO2-OR通式的基團(tuán)，“磷酸酯基團(tuán)”即具有PO2-(OR)2，其中R選自形成單價(jià)陽離子的原子和/或分子。術(shù)語“羥基”是指具有-OH化學(xué)式的基團(tuán)。
此處所用泛稱“糖衍生物”是指單糖或二糖的衍生物。
本發(fā)明的糖衍生物可作為乳化劑優(yōu)先用于不溶于水的分子。值得注意的是，考慮到生物可利用性、生物活力和不溶于水分子制劑的穩(wěn)定性，不溶于水的分子與本發(fā)明的糖衍生物的絡(luò)合為此提供了明顯的優(yōu)勢。在糖衍生物和靶標(biāo)分子之間配對的改進(jìn)可以在不溶于水分子的生物可利用性、生物學(xué)和/或藥學(xué)活性和物理性質(zhì)(例如穩(wěn)定性)方面產(chǎn)生協(xié)同改進(jìn)。同陰離子基團(tuán)的反離子性質(zhì)和脂肪酸酯基團(tuán)的類型和性質(zhì)一樣，本發(fā)明所述的單糖和二糖衍生物的物化性質(zhì)依存在的陰離子基團(tuán)的數(shù)目(和比例)及(對)脂肪酸酯基團(tuán)數(shù)目(和對更小程度的羥基數(shù)目)而變。本發(fā)明的單糖衍生物優(yōu)選具有至少1個(gè)、但不多于3或4個(gè)的陰離子基團(tuán)，而二糖衍生物優(yōu)選具有至少1個(gè)、但不多于7個(gè)的陰離子基團(tuán)。
另外，本發(fā)明糖衍生物高度適合用作疫苗的佐劑。值得注意的是，考慮到提高抗原組份制劑的生物可利用性、生物活性和穩(wěn)定性，抗原組份與本發(fā)明所述的糖衍生物的絡(luò)合可以為此提供明顯的優(yōu)勢。在糖衍生物和抗原組份之間配對的改進(jìn)可以提供疫苗效應(yīng)力和/或穩(wěn)定性的協(xié)同改進(jìn)并增強(qiáng)免疫反應(yīng)或激活免疫系統(tǒng)。此處所用術(shù)語抗原組份是指抗原本身的任何組份或材料，例如病毒、細(xì)菌、支原體、寄生蟲或腫瘤細(xì)胞、微生物的亞單位、變應(yīng)原，例如蛋白、多糖、多肽、糖蛋白、多糖-蛋白綴合物、多肽-蛋白綴合物等等或任何其它引發(fā)免疫應(yīng)答的實(shí)體。例如，該抗原組份可由(或含有)一或多個(gè)活的生物體、失活的生物體或所謂的亞單位組成(后者可通過例如合成、重組DNA方法或從生物體中分離的方法進(jìn)行制備)。術(shù)語抗原組份進(jìn)一步指可誘導(dǎo)抗原(例如可被整合進(jìn)免疫主體( )宿主細(xì)胞(的DNA)的DNA或RNA序列)發(fā)生的任何組份，它可于此誘導(dǎo)抗原部分的形成。含有該核酸序列的疫苗也指DNA疫苗或RNA疫苗。
本發(fā)明的單糖衍生物優(yōu)選來自有C5H10O5通式的戊糖或來自有C6H12O6通式的己糖。適合的戊糖可選自阿拉伯糖、核糖、木糖。適合的己糖可選自allolose、altriose、果糖、半乳糖、葡萄糖、古羅糖、肌醇、甘露糖和山梨糖。該新的單糖衍生物優(yōu)選來自果糖、半乳糖或葡萄糖。本發(fā)明的二糖衍生物優(yōu)選來自具有C12H22O11通式的二糖或者可適當(dāng)選自纖維二糖、龍膽二糖、乳糖、乳果糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖和松二糖。該新的二糖衍生物優(yōu)選來自乳糖、麥芽糖或蔗糖。本發(fā)明糖衍生物最優(yōu)選選自蔗糖。
脂肪酸酯基團(tuán)優(yōu)選具有直碳鏈、有-O-(C＝O)-(CH2)x-CH3通用化學(xué)結(jié)構(gòu)的酯基團(tuán)(其中x在4到24之間、優(yōu)選在4到22之間、更優(yōu)選在6到18之間、最優(yōu)選在6到14之間)、具有-O-(C＝O)-(CH2)X-CH＝CH-(CH2)y-CH3通用結(jié)構(gòu)的酯基團(tuán)(其中x+y在4和24之間、優(yōu)選在4和22之間、更優(yōu)選在6和14之間)或-O-(C＝O)-(CH2)X-CH＝CH-(CH2)y-CH＝CH-(CH2)z-CH3通用結(jié)構(gòu)的酯基團(tuán)(其中x+y+z在4和20之間、優(yōu)選在4和18之間、更優(yōu)選在6和14之間)。這些脂肪酸酯基團(tuán)的組合物也可存在。
具有通用結(jié)構(gòu)-O-(C＝O)-(CH2)x-CH3的脂肪酸酯基團(tuán)特別優(yōu)選那些x是4(己酸)、6(辛酸)、8(癸酸)、10(月桂酸)、12(肉豆蔻酸)、14(軟脂酸)和16(硬脂酸)的。具有通用結(jié)構(gòu)-O-(C＝O)-(CH2)X-CH＝CH-(CH2)y-CH3的脂肪酸酯基團(tuán)優(yōu)選那些其中x+y是14(例如油酸)的。具有通用結(jié)構(gòu)-O-(C＝O)-(CH2)X-CH＝CH-(CH2)y-CH＝CH-(CH2)z-CH3的脂肪酸酯基團(tuán)優(yōu)選那些其中x+y+z是12(例如亞油酸)的。
陰離子基團(tuán)優(yōu)選具有O-SO2-OR或-PO2-(OR)2通用結(jié)構(gòu)，其中R選自形成單價(jià)陽離子的的原子和/或分子。它們包括H+、Na+、K+、Li+或NH4+。特定的實(shí)施方案包括具有硫酸酯基團(tuán)O-SO2-OH、O-SO2-ONa或O-SO2-ONH4的糖衍生物。這些硫酸酯基團(tuán)的組合物也可以存在。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種簡便、安全且便宜的制備上述單糖和二糖衍生物的方法。該方法包括使單糖或二糖與酰氯和磺化劑反應(yīng)。該單糖或二糖可以與所說的酰氯和磺化劑以任何順序或同時(shí)反應(yīng)。
如下面將要詳細(xì)討論的那樣，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過下列任何一種方法(1)改變所用單糖或二糖的性質(zhì)；(2)改變各種所用起始材料的數(shù)量(比例)；(3)改變所用酰氯的性質(zhì)；和/或(4)改變用來純化的水溶液中使用的陽離子，都可以獲得不同的、具有特定物化性質(zhì)的單糖或二糖衍生物的制備物。進(jìn)行如此調(diào)整的單糖或二糖衍生物的性質(zhì)包括在水性(水)和非水性(非極性)溶劑中的溶解度、形成膠束和與其它分子形成混合膠束的能力、對疏水表面的吸收能力、對親水表面的吸收能力、對生物材料的吸收能力和表面活性/張力活性。
優(yōu)選的酰氯為己酰氯、辛酰氯、癸酰氯、十二酰氯(月桂酰氯)、十四酰氯(肉豆蔻酰氯)、十六酰氯(軟脂酰氯)、十八酰氯(硬脂酰氯和油酰氯)及其組合物。
在一特定實(shí)施方案中，此處所公開的是具有高水溶解性、低有機(jī)溶劑溶解性、很小的結(jié)合疏水分子能力和很小的結(jié)合疏水表面能力的單糖或二糖。在此方面，酰氯優(yōu)選選自辛酰氯、癸酰氯、十二酰氯、十四酰氯及其組合物。在此方面，酰氯更優(yōu)選選自辛酰氯、癸酰氯和/或十二酰氯。在此方面，酰氯最優(yōu)選選自癸酰氯和/或十二酰氯。
在另一實(shí)施方案中，此處所公開的是具有低水溶解性、高有機(jī)溶劑溶解性、很大的結(jié)合疏水分子能力和很大的結(jié)合疏水表面能力的單糖或二糖。在此方面，酰氯優(yōu)選選自十二酰氯、十四酰氯、十六酰氯、十八酰氯及其組合物。在此方面，酰氯更優(yōu)選選自十四酰氯、十六酰氯和/或十八酰氯。在此方面，酰氯最優(yōu)選選自十六酰氯和/或十八酰氯。
優(yōu)選的磺化劑為氣態(tài)的SO3、HClSO3(氯磺酸)、SO3-吡啶、SO3-2-甲基吡啶、SO3-2，6-二甲基吡啶、SO3-二甲基甲酰胺、SO3-三甲胺、SO3-三乙胺、SO3-二甲基苯胺、SO3-N-乙基嗎啉、SO3-二乙基苯胺、SO3-二噁烷及其組合物?；腔瘎﹥?yōu)選SO3-吡啶或氣態(tài)的SO3。
單糖或二糖優(yōu)選與酰氯以1∶1到1∶N-1之間的比例，并與磺化劑以1∶1到1∶N-1之間的比例進(jìn)行反應(yīng)，其中酰氯酯的數(shù)量加上磺化劑的數(shù)量總數(shù)不超過N，N是該衍生物所來自的單糖或二糖的羥基數(shù)。通過適當(dāng)選自試劑間的摩爾比，技術(shù)人員可方便地制備出具有所需脂肪酸酯和硫酸酯基團(tuán)數(shù)目的單糖或二糖衍生物。
該單糖或二糖優(yōu)選與酰氯和磺化劑在無水疏質(zhì)子介質(zhì)中反應(yīng)。該方法優(yōu)選在體積盡量小的有機(jī)溶劑中進(jìn)行。優(yōu)選那些通過例如沉淀、過濾、結(jié)晶或蒸發(fā)，可容易地從反應(yīng)化合物中除去的有機(jī)溶劑。優(yōu)選的有機(jī)溶劑為吡啶和N-甲基吡咯烷。高度優(yōu)選無水二甲基甲酰胺與無水吡啶的混合物及無水N-甲基吡咯烷與無水吡啶的混合物。
如果使用吡啶的話，其用量優(yōu)選小于酰氯用量的兩倍。更優(yōu)選，吡啶的用量與酰氯的量相當(dāng)。
例如，在與磺化劑反應(yīng)之前，單糖或二糖有可能與酰氯反應(yīng)形成二糖脂肪酸酯。
單糖或二糖優(yōu)選與酰氯在約60到70℃反應(yīng)4到8小時(shí)，優(yōu)選約6小時(shí)。隨后，可以使反應(yīng)混合物于環(huán)境溫度保持18小時(shí)以內(nèi)。該與磺化劑的反應(yīng)優(yōu)選在環(huán)境溫度與70℃之間至少進(jìn)行6小時(shí)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，單糖或二糖與酰氯和磺化劑在約60到70℃同時(shí)反應(yīng)至少6小時(shí)。
隨后，可以使反應(yīng)混合物于環(huán)境溫度保持18小時(shí)以內(nèi)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，單糖或二糖首先與酰氯并且與磺化劑在環(huán)境溫度反應(yīng)，然后將溫度提升至約50-70℃、優(yōu)選55-70℃、更優(yōu)選約60℃。
在這方面，值得注意的是，該方法在環(huán)境溫度下執(zhí)進(jìn)行是指溫度對該方法來說并不是非常重要的。這一性質(zhì)使得該方法可以在很廣的溫度范圍內(nèi)及在很廣的、同時(shí)又很節(jié)省的條件下進(jìn)行。我們可以預(yù)期，溫度低至約10℃的也是可以接受的。優(yōu)選的環(huán)境溫度不低于15℃，更優(yōu)選不低于18℃。而且，環(huán)境溫度優(yōu)選不高于50℃，更優(yōu)選不高于40℃，最優(yōu)選不高于25℃。
本發(fā)明的單糖或二糖衍生物以單糖或二糖與酰氯和磺化劑的兩步反應(yīng)獲得。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該反應(yīng)以單糖或二糖與酰氯和磺化劑同時(shí)反應(yīng)的一步法進(jìn)行。當(dāng)然，也有可能由單糖脂肪酸酯或二糖脂肪酸酯起始，例如蔗糖月桂酸酯L-195(Mitsubishi，日本)、蔗糖月桂酸酯L-595(Mitsubishi，日本)或蔗糖硬脂酸酯S-195(Mitsubishi，日本)，而且該起始材料與一或多種磺化劑反應(yīng)以形成所需的單糖或二糖衍生物。
如已提及的那樣，優(yōu)選使用盡可能少的有機(jī)溶劑量。在這方面，優(yōu)選通過加熱將單糖或二糖溶劑在該有機(jī)溶劑中，以產(chǎn)生半透明的、勻質(zhì)溶液。該制備勻質(zhì)溶液的方法尤其適用于那些在有機(jī)溶劑中的溶解度相對很小或很難溶于有機(jī)溶劑的糖，例如蔗糖和乳糖。為將這些糖溶解在最少量或最少體積的有機(jī)溶劑中，溫度增至＞80℃。有機(jī)溶劑的溫度優(yōu)選增至＞90℃。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在反應(yīng)完成之后，將有機(jī)溶劑中的單糖或二糖衍生物用NaOH、NH4OH、KOH進(jìn)行中和，使之形成具有硫酸酯基團(tuán)(包括Na+、K+或NH4+陽離子中的一個(gè))的單糖或二糖衍生物。
可以通過冷卻使之形成兩個(gè)或三個(gè)或更多不同的相(其中一個(gè)富含該單糖或二糖衍生物)來回收目的單糖或二糖衍生物。這可以通過本領(lǐng)域熟知的方法，包括過濾、傾析等等，來進(jìn)行回收。殘余的有機(jī)溶劑可通過例如在增加溫度并減少壓力的條件下進(jìn)行蒸發(fā)或用水相進(jìn)行洗滌從該相中除去。冷卻之后，此有機(jī)溶劑和任何在反應(yīng)中形成的副產(chǎn)品將會(huì)存在于不含或幾乎不含任何該單糖或二糖衍生物的一個(gè)或兩個(gè)相中。該相或這些相可以通過本領(lǐng)域所熟知的方法(包括過濾、傾析等等)除去。衍生出的糖可通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的純化。
單糖或二糖衍生物可以使用與制備該單糖或二糖衍生物中所使用的有機(jī)溶劑不互溶的液體從反應(yīng)混合物中萃取出來。因此，單糖或二糖衍生物得以與副產(chǎn)品和制備中使用的有機(jī)溶劑分開或分離開。在這方面，所說的液體優(yōu)選揮發(fā)性的有機(jī)溶劑或是糖衍生物最終制劑的一種成分。所說的液體更優(yōu)選一種油，最終的制劑為一種乳液。所說的液體最優(yōu)選角鯊?fù)椤?br> 這兩個(gè)涉及本發(fā)明單糖衍生物和二糖衍生物合成的化學(xué)反應(yīng)被認(rèn)為是隨機(jī)的反應(yīng)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生出不同單糖或二糖衍生物的集合，這些單糖或二糖衍生物每分子硫酸酯基團(tuán)的數(shù)目不同，和/或每分子脂肪酸酯基團(tuán)的數(shù)目不同，并因此使得其所具有的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)也不同。
然而，值得注意的是，單糖或二糖衍生物制備物中的化學(xué)上不同的衍生物的數(shù)量比上述詳細(xì)討論過的Hilgers等人(WO96/20222，WO 967/20008)所公開的磺化脂-多糖制備物中的要低的多。如果不把脂肪酸酯基團(tuán)、硫酸酯基團(tuán)和羥基基團(tuán)在二糖分子上的分布計(jì)算在內(nèi)的話，則按本發(fā)明所述，在由具有8個(gè)羥基基團(tuán)的二糖所獲得的制備物中，不同衍生物的數(shù)量為28個(gè)。如果把脂肪酸酯基團(tuán)、硫酸酯基團(tuán)和羥基基團(tuán)在二糖分子上的分布計(jì)算在內(nèi)的話，則按本發(fā)明所述，由具有8個(gè)羥基基團(tuán)的二糖所獲得的不同衍生物的數(shù)量為38＝6,561個(gè)。與硫酸酯-環(huán)糊精的那些(其分別為210和1,494,336,195)比起來，這些數(shù)量的衍生物在其使用與制備方面，具有相當(dāng)大的優(yōu)勢。
因此，該制備單糖或二糖衍生物的方法產(chǎn)生了這樣一種衍生物的混合物。這些衍生物可以通過使用例如結(jié)晶、沉淀、過濾、蒸發(fā)、透析或超濾技術(shù)得以分離。優(yōu)選將去除所使用的有機(jī)乳液和所形成的副產(chǎn)品與獲得的不同單糖和二糖衍生物的分離同時(shí)進(jìn)行。其優(yōu)選通過相分離、層析、沉淀、溶解、萃取或這些技術(shù)的組合來完成。更優(yōu)選地，通過凍干將該單糖或二糖衍生物與有機(jī)乳液分開，從而獲得干的單糖或二糖衍生物制備物。該凍干方法優(yōu)選在室溫、內(nèi)壓小于10mbar并且冷槽低于-25℃的條件下進(jìn)行。
具體說來，此處所公開的是一種制備富含具有一定脂肪酸酯基團(tuán)和陽離子基團(tuán)數(shù)目和類型的二糖衍生物的方法，其步驟為使約1摩爾的二糖與約7摩爾、用于制備每個(gè)二糖分子中每一個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)的酰氯相接觸并與約1摩爾、用于制備每一個(gè)硫酸酯基團(tuán)的磺化劑或與約1摩爾、用于制備每個(gè)二糖分子中每一個(gè)磷酸酯的磷酸化試劑相接觸，其中酰氯和磺化劑的摩爾總數(shù)不超過N，而N是其所接觸二糖的羥基總數(shù)。
本發(fā)明的單糖或二糖衍生物制備物的的水溶解性可以通過如下方法增加(1)增加本發(fā)明方法中所使用的磺化劑或磷酸化試劑的量和/或減少本發(fā)明方法中所使用的酰氯的量，從而使產(chǎn)生的單糖或二糖衍生物具有相對所存在的脂肪酸酯基團(tuán)數(shù)目更多的陽離子基團(tuán)數(shù)。高的水溶解性也可以通過(2)使用具有短碳鏈的酰氯，使其產(chǎn)的單糖或二糖衍生物生具有相對短碳鏈的脂肪酸酯基團(tuán)。具體來說可以通過使用十八酰氯、癸酰氯、十二酰氯(月桂酰氯)和/或十四酰氯作為酰氯試劑來完成。
可以通過執(zhí)行相反的步驟使水溶解性下降或使在非極性溶劑中的溶解性上升。具體來說可以通過使用十二酰氯(月桂酰氯)、十四酰氯和/或十八酰氯作為酰氯試劑來實(shí)現(xiàn)。同樣的方法可使單糖或二糖衍生物與疏水表面的結(jié)合能力增強(qiáng)。
本發(fā)明的單糖或二糖衍生物形成膠束的能力可以通過增加在本發(fā)明方法中使用的磺化或磷酸化試劑的量或通過增加酰氯的量來產(chǎn)生。同樣的方法可使表面活性/張力活性增加。
在這方面值得注意的是，本發(fā)明的單糖或二糖衍生物可與氣態(tài)化合物形成大的混合膠束。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單糖衍生物與硫酸酯/脂肪酸酯(每個(gè)單糖分子1個(gè)硫酸酯基團(tuán)對3個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)的比例)，或二糖衍生物與硫酸酯/脂肪酸酯(每個(gè)二糖分子1個(gè)硫酸酯基團(tuán)對7個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)的比例)可以形成具有聚山梨醇酯80的混合膠束。這些膠束不能通過具有高分子量阻斷的超濾膜。這些具有其它化合物的混合膠束的大小依親水基團(tuán)(即硫酸酯)和疏水基團(tuán)(即脂肪酸酯)的比例及所結(jié)合分子的物理性質(zhì)而定。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，富含具有一定數(shù)目和類型陽離子基團(tuán)(例如硫酸酯基團(tuán)和脂肪酸酯基團(tuán))的單糖或二糖衍生物的制備物能夠與特定的與水不互溶的分子(例如食品配料、染料、調(diào)料、油、藥物分子和抗原，它們具有調(diào)整該特定分子的溫度性、反應(yīng)性、流動(dòng)性和/或生物可利用性的能力)形成復(fù)合物。
本發(fā)明的單糖或二糖衍生物可用于各種醫(yī)學(xué)和藥學(xué)應(yīng)用。
本發(fā)明所述單糖或二糖衍生物，當(dāng)與分子(例如藥物分子或抗原化合物)復(fù)合時(shí)，會(huì)使固體、半固體和/或液體制劑中的該分子的生物可利用性提高。其也可以使穩(wěn)定性增強(qiáng)并使保存期限提高。另外，其也可以減少與其形成復(fù)合物的分子的副面影響(毒性)。最后，其使得(來自難溶藥物的)均勻的、易于操作的、可注射的溶液供應(yīng)品成為可能。
本發(fā)明的單糖和二糖(及其制備物)的使用具有極大優(yōu)勢的醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的一個(gè)例子為在疫苗佐劑中的應(yīng)用。適合的佐劑包括通常指的那些水包油乳液(包括水包角鯊?fù)槿橐?、水包礦物油乳液、水包十六烷、水包大豆油乳液、水包蔗糖脂肪酸酯乳液等)、油包水乳液(包括礦物油包水、角鯊?fù)榘?、蔗糖脂肪酸酯包水?或水包油包水乳液(包括水包礦物油包水、水包角鯊?fù)榘?、水包蔗糖脂肪酸酯包水?。
接種疫苗是人及動(dòng)物健康中費(fèi)用最低廉的防止和控制傳染疾病的方法。接種疫苗或免疫包括使適當(dāng)類型的、抗相關(guān)抗原成分和/或抗原決定簇的免疫反應(yīng)產(chǎn)生足夠的水平和時(shí)間長度。該免疫反應(yīng)可通過例如測定血清中的抗體滴度、淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)、抗人工或天然感染的保護(hù)級數(shù)、保護(hù)時(shí)間、無反應(yīng)動(dòng)物數(shù)等等進(jìn)行測定。
在許多靶標(biāo)動(dòng)物物種(例如豬、牛、家禽、狗、貓、馬、人等)中，由病毒、細(xì)菌、寄生蟲或任何其它感染媒介(例如流感病毒、肝炎病毒、麻疹病毒、脊椎灰質(zhì)炎病毒、細(xì)小病毒、狂犬病毒、鏈球菌、腦膜炎雙球菌、梭狀芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、放線桿菌、利斯塔氏菌、瘧疾、錐體蟲、肺蠕蟲、原生動(dòng)物、枝原體、衣原體等等)引起的疾病都可以通過接種疫苗得以防止或控制。
大多數(shù)情況下，抗滅活抗原及有些情況下也抗活抗原的免疫反應(yīng)太低而無法建立起足夠的保護(hù)水平或足夠的保護(hù)時(shí)間長度。因此，就要向這些抗原中添加刺激該免疫反應(yīng)的佐劑。
理想的佐劑可增強(qiáng)抗該抗原和/或抗原決定簇相關(guān)保護(hù)的相關(guān)類型的免疫反應(yīng)(體液的和/或細(xì)胞的)，而不會(huì)有明顯的副反應(yīng)。刺激某一免疫的類型的佐劑可能適于某些用途，但不適于其它用途。強(qiáng)的佐劑會(huì)增強(qiáng)例如抗許多不同抗原的抗體介導(dǎo)的和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。佐劑對不同抗原的不同效果是個(gè)明顯的缺點(diǎn)，尤其是涉及含幾種不同抗原的組合接種中。在抗原類型、動(dòng)物物種、免疫反應(yīng)類型方面有很強(qiáng)活性的佐劑具有重要的優(yōu)勢。
在DNA或RNA疫苗中使用的佐劑可以于胞內(nèi)誘導(dǎo)抗原，其也優(yōu)選幫助該DNA或RNA序列成功地整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA(轉(zhuǎn)染)。
已知有許多不同類型的佐劑，但僅有幾個(gè)用于市售的人或獸醫(yī)疫苗。選作疫苗的佐劑類型由幾個(gè)因素決定，包括靶標(biāo)動(dòng)物物種、佐劑的效應(yīng)力、佐劑的毒性、佐劑的質(zhì)量、佐劑的價(jià)格等等。如人們所熟知的，佐劑的效應(yīng)力和毒性是與相關(guān)的，高效應(yīng)力伴有高毒性，而低毒性則效應(yīng)力也低。高毒性是作為局部反應(yīng)，例如發(fā)炎、腫脹、膿腫形成、肉芽腫、壞死等等和/或系統(tǒng)反應(yīng)，例如疼痛、發(fā)燒、高血壓、過敏、厭食。體重下降等等而出現(xiàn)的。佐劑的毒性是限制其使用的重要因素，而且其可以為一些動(dòng)物物種所接受時(shí)，可能對其它動(dòng)物物種則是不能接受的。
在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，標(biāo)準(zhǔn)的佐劑是Freund完全佐劑，其是一種強(qiáng)佐劑。由于其毒性的緣故，尤其是其局部效應(yīng)，其無法在人類或食用動(dòng)物(food animals)或伴生動(dòng)物(companion animals)中進(jìn)行應(yīng)用。在，例如牛、綿羊和豬中，經(jīng)常以礦物油乳液作為佐劑。例如水包礦物油乳液(O/W)、礦物油包水乳液(W/O)和水包礦物油包水乳液(W/O/W)。這些佐劑會(huì)產(chǎn)生高的免疫反應(yīng)(但比Freunde完全佐劑的要小)。包括局部和系統(tǒng)副作用在內(nèi)的毒性使它們在伴生動(dòng)物和人身上的應(yīng)用受到了限制。在伴生動(dòng)物例如貓、狗和馬中，使用的是相對安全的佐劑，例如ISCOM、Al(OH)3和聚丙烯酸酯?？傮w來說，這些佐劑所誘導(dǎo)的反應(yīng)要比礦物油乳液的低，而且嚴(yán)重的副作用也要低的多。在人身上，鋁鹽是唯一許可使用的佐劑。它們誘發(fā)的反應(yīng)要比許多在獸醫(yī)疫苗中使用的佐劑低，而且被認(rèn)為是相對安全的。
因此，強(qiáng)佐劑的一個(gè)缺點(diǎn)就是它們的毒性相對較高。安全佐劑的缺點(diǎn)則是它們的效應(yīng)力相對較低。
除了效應(yīng)力和毒性以外，佐劑和含佐劑疫苗的質(zhì)量也是十分重要的。質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)包括粘度、化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性、物化穩(wěn)定性等等。粘度高會(huì)妨礙產(chǎn)品的操作，例如將產(chǎn)品吸入針筒或?qū)a(chǎn)品對動(dòng)物給藥。粘度低會(huì)有利于產(chǎn)品的操作。低的化學(xué)、物理或物化穩(wěn)定性會(huì)減少疫苗的保存期限并需要嚴(yán)格的產(chǎn)品貯藏和運(yùn)輸條件。高的化學(xué)、物理和物化穩(wěn)定性會(huì)使保存期限延長并對產(chǎn)品的后勤運(yùn)輸有利。正如人們所熟知的，在食用動(dòng)物中使用的含礦物油乳液的疫苗具有粘度高并且不穩(wěn)定。
由以上敘述我們清楚地認(rèn)識到對具有高效應(yīng)力且低毒性、有效地抗各種抗原并且容易操作的佐劑仍然具有迫切的需求。
本發(fā)明提供了這樣的佐劑。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，上述的單糖或二糖衍生物高度適于在各種類型疫苗作為佐劑使用。因此，本發(fā)明也涉及以本發(fā)明所述的單糖或二糖衍生物形式出現(xiàn)的佐劑，并涉及制備含一或多種所說單糖或二糖衍生物疫苗的佐劑配方。該佐劑配方可進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體。例如，適合的載體包括生理鹽水和水包油乳液，優(yōu)選水包角鯊烯乳液。
按本發(fā)明所述，特別優(yōu)選的佐劑配方含有本發(fā)明所述的單糖或二糖衍生物(I)、與水不互溶的液相或固相(II)、乳化劑或穩(wěn)定劑(III)及任選地水相(IV)。
任何本發(fā)明所述的糖衍生物都可作為佐劑使用。例如，該衍生物可以是具有1-3個(gè)、優(yōu)選1或2個(gè)脂肪酸基團(tuán)和0-3個(gè)、優(yōu)選1或2個(gè)陰離子基團(tuán)的戊糖，其中陰離子和脂肪酸基團(tuán)的總數(shù)不超過4個(gè)。
按本發(fā)明所述，具有1-4個(gè)、優(yōu)選1-3個(gè)脂肪酸基團(tuán)和0-4個(gè)、優(yōu)選1-3個(gè)陰離子基團(tuán)(其中陰離子和脂肪酸基團(tuán)的總數(shù)不超過5個(gè))的己糖也特別適合作為佐劑使用。
優(yōu)選的作為佐劑的二糖衍生物可以含有1-7個(gè)、更優(yōu)選3-7個(gè)、最優(yōu)選4-7個(gè)脂肪酸基團(tuán)和0-7個(gè)、更優(yōu)選0-6個(gè)、最優(yōu)選1-5個(gè)陰離子基團(tuán)，其中陰離子和脂肪酸基團(tuán)的總數(shù)不超過8個(gè)。
用具有一個(gè)陰離子基團(tuán)、優(yōu)選一個(gè)硫酸酯基團(tuán)和5-7個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)的二糖衍生物已經(jīng)取得了特別好的結(jié)果。一個(gè)具有4個(gè)陰離子基團(tuán)、優(yōu)選硫酸酯基團(tuán)和4個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)的衍生二糖作為佐劑也有非常令人滿意的表現(xiàn)。
一或多種本發(fā)明所述的糖衍生物，在本發(fā)明所述佐劑配方中作為佐劑存在的濃度通常為0.1-1000g/l、優(yōu)選0.5-500g/l、更優(yōu)選1-320g/l。
與水不互溶的液相優(yōu)選油。適合的油包括，例如大豆油、花生油、canola油、橄欖油、紅花油、玉米油、mazola油、鱈魚肝油、扁桃油、棉籽油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、軟脂酸異丙酯、礦物油、肉豆蔻醇、辛基十二烷醇(octyldodecanol)、杏仁油、芝麻油、油酸肉豆蔻酯、十六烷基油酸酯(cetyl oleate)和軟脂酸肉豆蔻酯。其它適合的油包括由飽和的、不飽和的和/或部分氫化的脂肪酸硅基油、合成油(例如由飽和和不飽和C12-C24脂肪酸鏈組成的甘油三酸酯，例如油酸的甘油三酸酯、萜烯、linolene、角角鯊烯、角鯊?fù)?、squalamine)和氟化油(包括稱作FC-40、FC-43、FC-72、FC-77、FC-70、FC-75的全氟化物、全氟己烷、全氟辛基溴化物(perfluorooctylbromide)(也叫perfluorobron)、全氟辛烷碘或其混合物組成的生物親和油。
用一種與水不互溶的相(II)為角鯊?fù)椤⒔墙酋徬?、礦物油、植物油、十六烷、碳氟化合物或硅油的佐劑配方已經(jīng)取得了很好的結(jié)果。
通常存在于佐劑配方中的與水不互溶相(II)的濃度為0-640g/l，優(yōu)選0-480g/l，更優(yōu)選10-320g/l。
如果該佐劑配方含有與水不互溶的固相(II)，那么該固相優(yōu)選不溶于水的鹽。特別適合的是不溶的鋁鹽或鈣鹽或其混合物。優(yōu)選的鹽包括氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣二氧化硅及其混合物。
乳化劑的穩(wěn)定劑(III)可以是去污劑。適宜的乳化和/或穩(wěn)定化試劑包括，例如，膽固醇、二乙醇胺、單硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、單和二甘油酯、單乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆184、泊洛沙姆181)、非離子嵌段共聚物(例如BASF的PLURONICS)、聚氧乙烯50硬脂酸、polyoxyl 35蓖麻油、polyoxyl 10油烯醚、polyoxyl 20 cetostearyl醚、polyoxyl 40硬脂酸、多乙氧基醚20、多山梨醇酯40、多山梨醇酯60、多乙氧基醚80、丙二醇二乙酸酯、丙二醇單硬脂酸酯、月桂基硫酸鈉、硬脂酸鈉、單月桂酸山梨醇酯、單油酸山梨醇酯、單軟脂酸山梨醇酯、單硬脂酸山梨醇酯、硬脂酸、Triton X-100、皂角苷、純皂角苷、(例如QS21)、多聚物(例如聚丙烯酸脂)。
用一種乳化劑或穩(wěn)定劑(III)是非離子去污劑(親水-親脂平衡值大于10)、糖脂肪酸酯或陰離子去垢劑(親水-親脂平衡值大于10)的佐劑配方已經(jīng)取得了非常好的結(jié)果。
優(yōu)選的乳化劑或穩(wěn)定劑(III)包括多山梨醇20、多山梨醇80、多山梨醇85、Triton-X 100、皂角苷、卵磷脂、非離子嵌段共聚物、蔗糖脂肪酸酯、糖月桂酸酯(例如Mitsubishi-Kagaku食品有限公司的Ryoto糖酯1695)。特別優(yōu)選的是多山梨醇80和蔗糖脂肪酸酯。
本發(fā)明所述的單糖或二糖也可以優(yōu)先用作佐劑配方中的乳化劑或穩(wěn)定劑(III)。用具有至少3個(gè)、優(yōu)選至少4個(gè)單不多于N-1個(gè)陰離子基團(tuán)并且有至少1個(gè)但不多于N-3個(gè)、優(yōu)選不對于于N-4個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)的單糖或二糖衍生物(其中N是衍生出該衍生物的該單糖或二糖的羥基數(shù)，而且脂肪酸和陰離子基團(tuán)的組合數(shù)不超過N個(gè))已經(jīng)取得了特別好的結(jié)果。
通常存在于本發(fā)明所述的佐劑配方中的一或多種乳化劑或穩(wěn)定劑額總濃度為0到640g/l、優(yōu)選1-480g/l、更優(yōu)選1-320g/l。
適合的水相(IV)包括，例如鹽水、磷酸緩沖鹽溶液、檸檬酸緩沖鹽溶液、等滲離子溶液、等滲非離子溶液等等。水相的量可以在很大范圍內(nèi)變化，通常從0到999.9g/l、優(yōu)選10-990g/l、更優(yōu)選640-990g/l。
本發(fā)明還涉及于本發(fā)明所述的佐劑配方中最優(yōu)的、含有抗原化合物和本發(fā)明單糖或二糖衍生物的疫苗。該疫苗可以含有0.05-250g/l、優(yōu)選0.25-125g/l、更優(yōu)選1-80g/l的單糖或二糖衍生物或該衍生物的混合物作為佐劑。其可再含有一或多種總濃度從0到640g/l、優(yōu)選1-480g/l、更優(yōu)選1-320g/l的乳化劑或穩(wěn)定劑及一種濃度為0到640g/l、優(yōu)選1-480g/l、更優(yōu)選1-320g/l的與水不互溶液相(優(yōu)選油)。
該疫苗可以含有如上所述的任何抗原組份。對于該疫苗的制備來說，其抗原組份或者是在使用前就混好了的或者剛好在使用前混合。
例如，本發(fā)明所述的疫苗可以用于人和動(dòng)物的免疫(后者包括例如哺乳動(dòng)物、鳥和嚙齒類動(dòng)物例如豬、牛、綿羊、馬、狗、牛和家禽)。
該疫苗、佐劑或佐劑配方可以通過腸道外的或非腸道的途徑，例如肌肉內(nèi)的、皮內(nèi)的、經(jīng)皮的、皮下的、腹膜內(nèi)的、皮內(nèi)的、鼻內(nèi)的、鼻的、口的、陰道內(nèi)的、泄殖腔內(nèi)的等等，進(jìn)行應(yīng)用。
值得注意的是，本發(fā)明也預(yù)示了一種已知佐劑與以本發(fā)明單糖或二糖形式出現(xiàn)的佐劑的組合物的用途。
對于食用動(dòng)物來說，本發(fā)明的佐劑與已經(jīng)得到應(yīng)用的佐劑比較的優(yōu)勢在于，例如局部和系統(tǒng)副作用較小、對動(dòng)物接種疫苗的不舒適度較小、由于減少了按體重獲利動(dòng)物的致命性影響而使經(jīng)濟(jì)損失較小、由于含殘留疫苗的肉類損失而使經(jīng)濟(jì)損失較小、對疫苗施用者自動(dòng)注射的危險(xiǎn)性較低、疫苗的易操作性提高、產(chǎn)品的穩(wěn)定性提高等等。
對伴生動(dòng)物而言，本發(fā)明的佐劑與已經(jīng)得到應(yīng)用的、已知的佐劑比較的優(yōu)勢在于，例如免疫反應(yīng)的水平較高、免疫時(shí)間的提高、應(yīng)答動(dòng)物數(shù)量的提高、可與該佐劑組合的抗原數(shù)量更多等等。
本發(fā)明將通過下面的、非限制性實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例 下面實(shí)施例中描述的一些實(shí)驗(yàn)是同時(shí)進(jìn)行的。為便于比較，每個(gè)實(shí)施例都對列出了所選組的結(jié)果。重要的是，在幾個(gè)實(shí)施例中有對照組的結(jié)果。
實(shí)施例#1 如前面對所謂的硫酸酯-多糖所述(Hilgers等，1986)，合成蔗糖衍生物。簡單地說，通過在90℃、＜50mbar條件下加熱并加入無水N-甲基吡咯酮(NMP；Merck)和無水吡啶(Merck)，對細(xì)粉狀蔗糖(Merck)進(jìn)行干燥。將混合物于80℃攪拌直至獲得澄清溶液。加入十二酰氯(Merck)，并將反應(yīng)混合物于60℃保持約6小時(shí)。加入SO3-吡啶(Merck)，并將反應(yīng)混合物于室溫溫浴約18小時(shí)。用4M NaOH將其pH調(diào)至7.0(±0.3)。以增加溫度(＜80℃)、減少壓力(＜10mbar)的方法進(jìn)行廣泛性蒸發(fā)(＞6h)，并于4℃冷凝，直至殘留的重量損失小于0.1g/30分鐘為止，以除去N-甲基吡咯酮和吡啶。不同衍生物所使用的起始材料的量被列于表#1.1。
表#1.1 #摩爾比例L/蔗糖每摩爾蔗糖的十二酰氯摩爾數(shù)；S/蔗糖每摩爾蔗糖的SO3-吡啶摩爾數(shù)。
通過薄層色譜(TLC)對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。將0.5g衍生物樣品溶于4.5ml NMP，所得每種溶液各取2μl點(diǎn)在TLC硅膠板上(HPLC-TLC，正常相；Anatech，Newark；DElaware；美國)并用233ml二乙醚+100ml正己烷+3.3ml乙酸的混合物展開。用溶于甲醇的50％v/v的硫酸溶液噴灑此硅膠板并于120℃加熱10-30分鐘，以對板上的斑點(diǎn)進(jìn)行顯色。結(jié)果列于圖#1。
表#1.1中的不同蔗糖衍生物的配方由10g蔗糖衍生物與10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鯊?fù)?Merck)、190g 0.01w/v％硫柳汞(Sigma)磷酸緩沖鹽溶液(PBS-硫柳汞；pH 7.0)混合制得。于環(huán)境溫度下、以至少400巴的內(nèi)壓，三次通過Y110型微流化裝置(Microfluidics公司，Newton，美國)對所得的每一種混合物進(jìn)行乳化。于顯微鏡下對每一乳液進(jìn)行檢測。如果在放大1000倍的顯微鏡下，每10個(gè)受檢視野中有多于10個(gè)直徑大于1μm的油滴，那就重復(fù)進(jìn)行該乳化過程。將所得的乳液保存于4℃直至使用。
在豬身上對這些制劑的佐劑活力進(jìn)行了測定。將一體積的抉擇制劑與一體積的含由昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的(如Hulst等人(1994)所述)、32μg/ml典型豬瘟病毒糖蛋白E2(CSFV-E2；ID-DLO，Lelystad，荷蘭)的抗原制劑混合制得疫苗。
五頭豬為一組(10周齡)，以2ml疫苗/頭進(jìn)行肌肉內(nèi)注射免疫。三周以后，用同樣的疫苗重復(fù)免疫。在二次免疫三周之后，以Terpstra等(微生物獸醫(yī)學(xué)，1984，9，113-120頁)所述的病毒中和試驗(yàn)測定血清中抗CSFV-E2的抗體滴度。計(jì)算每組的幾何平均滴度(GMT)、標(biāo)準(zhǔn)偏差(STDEV)和反對數(shù)(2階GMT)。結(jié)果列于表1.2。
在該動(dòng)物試驗(yàn)中包括了硫酸酯-環(huán)糊精/水包角鯊?fù)槿橐?SL-CD/角鯊?fù)?多乙氧基醚80；Hilgers等，疫苗，1999，17，219-228頁)。
表1.2 GMT＝幾何平均滴度，即同組單個(gè)動(dòng)物2對數(shù)滴度的平均值； STDEV標(biāo)準(zhǔn)偏差；反對數(shù)＝2次冪(GMT)。
實(shí)施例#2 將34.2g(0.1摩爾)無水蔗糖(Merck)、149g(1.5摩爾)無水N-甲基-吡咯酮和79g(1摩爾)無水吡啶放在圓底燒瓶中，然后將其連到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器TM(Buchi，瑞士)上旋轉(zhuǎn)混合。將該混合物加熱到90℃直至得到澄清的溶液。然后將溫度調(diào)到60℃并向該蔗糖溶液中加入153.3g(0.7摩爾)的十二酰氯。將燒瓶中的反應(yīng)混合物于60℃保持6小時(shí)。向燒瓶中的反應(yīng)混合物中加入15.9g(0.1摩爾)SO3-吡啶，并與60℃保持6小時(shí)，然后與環(huán)境溫度保持12小時(shí)。將該反應(yīng)混合物于4℃保持24小時(shí)，從而形成晶體沉淀和兩個(gè)液相。收集上相并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器TM上以增加溫度(＜60℃)、減少壓力(＜10mbar)的方法進(jìn)行蒸發(fā)，并于4℃冷凝，直至殘留的重量損失小于0.1g/30分鐘為止，以除去溶劑(組份I)。向組份I的樣品中加入正己烷和N-甲基吡咯酮。將該混合物于1000g離心10分鐘從而形成了透明的黃色上相(組份II)、乳白色的中間相(組份III)和透明的下相。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器TM上以增加溫度(＜60℃)、減少壓力(＜10mbar)的方法進(jìn)行蒸發(fā)，并于4℃冷凝，直至殘留的重量損失小于0.1g/30分鐘為止，以除去組份II和組份III的溶劑。
通過實(shí)施例1中所述的TLC對所得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
制備幾種制劑并按上述實(shí)施例1中所述的方法測定它們對CSFV-E2的抗體反應(yīng)。結(jié)果列于表#2.2。
取該蔗糖衍生物各組份(組份I、組份II和組份III)各10g與10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鯊?fù)?Merck)和190g PBS-硫柳汞，按實(shí)施例#1中所述的方法制備制劑。這些制劑分別于組3、6和18中進(jìn)行檢測。
按實(shí)施例#1中所述的方法制備10g實(shí)施例#1中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖與10g多乙氧基醚80、40g角鯊?fù)楹?90g PBS-硫柳汞的制劑。該制劑于組2和5中進(jìn)行檢測。
按實(shí)施例#1中所述的方法制備10g表#1.1中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖與10g多乙氧基醚80、10g角鯊?fù)楹?20g PBS-硫柳汞的制劑。該制劑于組4中進(jìn)行檢測。
按實(shí)施例#1中所述的方法制備10g蔗糖衍生物表#1.1中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖與10g多乙氧基醚80和230g無角鯊?fù)镻BS-硫柳汞的制劑。該制劑于組7中進(jìn)行檢測。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備10g多乙氧基醚80、40g角鯊?fù)?Merck)和200g PBS-硫柳汞的制劑。該制劑于組9中進(jìn)行檢測。
本實(shí)驗(yàn)包括了一種礦物油包水浸水CSFV-E2疫苗(ID-Lelystad，Lelystad，荷蘭)，其為陽性對照。該制劑于組10中進(jìn)行檢測。
表#2.2 該水浸水包礦物油乳液獲自ID-Lelystad，Lelystad，荷蘭。
除了抗體反應(yīng)以外，用外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖分析來對這些佐劑中的一些在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面的效應(yīng)進(jìn)行測定。二次免疫6天之后，從組1、組2和組10的每只豬身上收集12ml肝素血。用3倍體積的PBS對該血樣進(jìn)行稀釋并在12ml50-ml聚丙烯管(Falcon)里的Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上涂層。以1000g離心20分鐘，然后收集含PBMC的界面并用PBS將細(xì)胞洗滌兩次，然后對該懸液于1000g離心10-15分鐘。通過放大100倍的臺盼藍(lán)排除法測定活細(xì)胞數(shù)，并將懸液調(diào)整至5×106細(xì)胞/ml介質(zhì)[補(bǔ)加100IE/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、4μl β-巰基乙醇/L和10％正常豬血清的RPMI 1640介質(zhì)(Flow10-601-22)]。將每個(gè)懸液中100μl的樣品以6倍放在平底96孔板的孔里。用50μl RPMI介質(zhì)對三個(gè)副本進(jìn)行補(bǔ)加(陰性對照)，并用50μl 7.1μg CSFV-E2/ml介質(zhì)溶液對三個(gè)副本進(jìn)行添加。將細(xì)胞于37℃、5％CO2(于CO2培養(yǎng)箱中)條件下培養(yǎng)4天。培養(yǎng)之后，向每個(gè)孔里添加25μl含50μ Ci甲基3H-胸苷(Amersham TRA120；1mCi/ml)/ml介質(zhì)的介質(zhì)。培養(yǎng)4小時(shí)以后，使用細(xì)胞收獲機(jī)(Tomtec Harvester 96 match IIIM)在濾器(Wallac)上對細(xì)胞的DNA進(jìn)行收集。于70℃對濾器進(jìn)行干燥并將其放在濾器袋里(Wallac)。加入5ml閃爍液(Wallac bataplate scint；Wallac，Turku，芬蘭)并將袋子封住，以β-計(jì)算器(Wallac 1450型Microbeta PLUSβ-計(jì)算器，Wallac)對每個(gè)樣品的放射性進(jìn)行測定。用僅以介質(zhì)培養(yǎng)的2或3個(gè)副本每分鐘數(shù)的平均數(shù)(cmp)減去用抗原刺激的2或3個(gè)副本每分鐘數(shù)的平均數(shù)，算出各頭動(dòng)物淋巴細(xì)胞懸液的刺激指數(shù)。算出每組動(dòng)物刺激指數(shù)的數(shù)學(xué)平均值(AMT)及其標(biāo)準(zhǔn)偏差(STDEV)。結(jié)果列于表#2.3。
表#2.3 實(shí)施例#3 如實(shí)施例#1所述，合成各種蔗糖衍生物。通過在90℃、＜50mbar條件下加熱6小時(shí)并加入無水N-甲基吡咯酮(Merck)和無水吡啶(Merck)，對細(xì)粉狀蔗糖(Merck)進(jìn)行干燥。將混合物于80℃攪拌直至獲得澄清溶液。加入十二酰氯(Merck)、十四酰氯(Merck)、十六酰氯(Merck)或十八酰氯(Merck)，并將反應(yīng)混合物于60℃溫浴6小時(shí)。加入SO3-吡啶(Merck)，并將反應(yīng)混合物于室溫溫浴18小時(shí)。將該反應(yīng)混合物于4℃保持24小時(shí)，使其形成二或三相。收集上相，并以增加溫度(＜60℃)、減少壓力(＜10mbar)的方法進(jìn)行蒸發(fā)，并于4℃冷凝，直至殘留的重量損失小于0.1g/30分鐘為止，以除去N-甲基吡咯酮和吡啶。
所使用的起始材料的量被列于表#3.1。
表#3.1 #摩爾比例L/蔗糖每摩爾蔗糖的酰氯摩爾數(shù)；S/蔗糖每摩爾蔗糖的SO3-吡啶摩爾數(shù)。
通過上述實(shí)施例#1中所述的TLC方法對一些獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備10g表#3.1中的蔗糖衍生物與10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鯊?fù)?Merck)和190g PBS-硫柳汞的制劑。
如上述實(shí)施例#1中所述，在豬身上測定這些制劑中的幾種在抗CSFV-E2免疫反應(yīng)方面的效果。按上述實(shí)施例#1中所述的病毒中和試驗(yàn)測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#3.2。
另外，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定抗CSFV的抗體滴度。為此，通過將50μl含2.5μg/ml免疫親和色譜純CSFV-E2的碳酸緩沖液(pH9.6)分到每個(gè)孔里對ELISA板進(jìn)行涂布，然后于4℃溫浴18小時(shí)或37℃溫浴2小時(shí)。用0.02％Tween 20對平板洗滌5次，并用200μl/孔的溶于磷酸鹽緩沖液(PBS；pH7.2；0.05M)中的2％(w/v)脫脂牛奶(Difco)進(jìn)行封閉，然后于37℃溫浴1小時(shí)。用含2％(w/v)脫脂牛奶的PBS(PBS/SM)對血清樣品預(yù)稀釋10或100倍，并在ELISA平板上以PBS/SM按順序?qū)?0μl預(yù)稀釋液稀釋兩倍。接下來，于37℃溫浴平板1小時(shí)。在用0.02％Tween20洗滌5個(gè)循環(huán)之后，向孔中加入50μl含與過氧化物酶(Dako；按廠商說明書進(jìn)行稀釋)共軛的兔抗豬Ig抗血清PBS/SM，并于37℃再次溫浴該平板1小時(shí)。用0.02％Tween 20洗滌平板10次，并向孔里加入100μl含2，2’-aziono-二-[3-乙基-benzthiazoline磺酸(ABTS)+H2O2(kirkegaard&Perry Labs，Inc.，Gaithersburg，MA)的底物溶液。將平板于20℃溫浴1小時(shí)并用Titertek Multiscan(ICN/Flow，Oxfordshire，英國)測定405nm的吸收?？贵w滴度以血清濃度曲線圖線性部分的退化系數(shù)對相當(dāng)于血清樣品稀釋因子的吸收值(其給出了在ELISA中高于背景值1個(gè)吸收單位的最適密度；吸收值0.0至1.4之間的線性化非常明顯)來表示。表#3.3和#3.4分別列出了增強(qiáng)免疫3周和12周之后的抗體滴度。
按上述實(shí)施例#2中所述方法測定這些制劑對細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV-E2的效應(yīng)。結(jié)果列于表#3.5。
表#3.2 表#3.3 表#3.4 表#3.5 在豬身上測定了幾種制劑在抗失活流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11(下面分別叫做A/Swine和MRC-11)和抗失活假狂犬病病毒(PRV)血清中的抗體反應(yīng)效應(yīng)。用有或無佐劑的4.4μgA/Swine、4μg MRC-11和108.3TCID 50(TCID 50是胞外引起50％組織培養(yǎng)物感染的劑量)的失活PRV(Fort DodgeAnimal Health Holland，Weesp，荷蘭；Hilger等，疫苗1994)于0周和3周對動(dòng)物進(jìn)行注射。第一次免疫(3周)三周之后和第二次免疫(6周)三周之后，以ELISA測定抗A/Swine和MRC-11的抗體反應(yīng)。為此，通過將50μl含5μg HA/ml的碳酸緩沖液(pH9.6)分散到每個(gè)孔里，用以蔗糖梯度純化的流感病毒對ELISA板進(jìn)行涂布，然后于4℃溫浴18小時(shí)或37℃溫浴2小時(shí)。用0.02％Tween 20對平板洗滌5次，并用200μl/孔的溶于磷酸鹽緩沖液(PBS；pH7.2；0.05M)中的2％(w/v)脫脂牛奶(Difco)進(jìn)行封閉，然后于37℃溫浴1小時(shí)。用含2％(w/v)脫脂牛奶的PBS(PBS/SM)對血清樣品預(yù)稀釋10或100倍，并在ELISA平板上以PBS/SM按順序?qū)?0μl預(yù)稀釋液稀釋兩倍。接下來，于37℃溫浴平板1小時(shí)。在用0.02％Tween 20洗滌5個(gè)循環(huán)之后，向孔中加入50μl含與過氧化物酶(ID-Lelystad；于PBS/SM進(jìn)行1/2000稀釋)共軛的鼠抗豬總IgG單克隆抗體，并于37℃再次溫浴該平板1小時(shí)。用0.02％Tween 20洗滌平板10次，并向孔里加入100μl含2，2’-連氮-雙-[3-乙基-苯并噻唑啉磺酸(ABTS)+H2O2(Kirkegaard&Perry Labs，Inc.，Gaithersburg，MA)的底物溶液。將平板于20℃溫浴60分鐘并用Titertek Multiscan(ICN/Flow，Oxfordshire，英國)測定405nm的吸收。抗體滴度以血清濃度曲線圖線性部分的退化系數(shù)對相當(dāng)于血清樣品稀釋因子的吸收值(其給出了在ELISA中高于背景值1個(gè)吸收單位的最適密度；吸收值0.0至1.4之間的線性化非常明顯)來表示。表#3.6和#3.7分別列出了首次免疫(基礎(chǔ))和二次免疫(增加)3周之后的抗體滴度。
在6周，以Hilgers等(疫苗，1994，12，653-660頁)所述的病毒中和試驗(yàn)測定抗iPRV的抗體反應(yīng)。結(jié)果列于表#3.8。
按上述實(shí)施例#2中所述方法在豬身上測定這些制劑對細(xì)胞介導(dǎo)的抗流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11的免疫應(yīng)答。PBMC受濃度為0.5和1.5μg HA/ml細(xì)胞培養(yǎng)基的A/Swine和MRC-11激發(fā)。結(jié)果分別列于表#3.9和#3.10。
表#3.6 表#3.7 表#3.8 表#3.9 表#3.10 實(shí)施例#4 如實(shí)施例#3中所述，合成各種蔗糖衍生物。所使用的起始材料的量被列于表#4.1。
表#4.1 #摩爾比例L/蔗糖每摩爾蔗糖的十二酰基氯摩爾數(shù)；S/蔗糖每摩爾蔗糖的SO3-吡啶摩爾數(shù)。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備10g表#4.1中不同的蔗糖衍生物與10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鯊?fù)?Merck)和190gPBS-硫柳汞的制劑。
實(shí)施例#5 如實(shí)施例#3中所述，合成各種蔗糖衍生物，所使用的起始材料的量被列于表#5.1。
表#5.1 #摩爾比例L/蔗糖每摩爾蔗糖的十二?；饶枖?shù)；S/蔗糖每摩爾蔗糖的SO3-吡啶摩爾數(shù)。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備10g表#5.1中的蔗糖衍生物與10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鯊?fù)?Merck)和190g PBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2的免疫應(yīng)答的效應(yīng)。疫苗簡單地由一體積佐劑配方和一體積抗原制劑混合制得。按上述實(shí)施例#1中所述的病毒中和試驗(yàn)測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#5.2。
以上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定二次免疫3周和12周后(增強(qiáng)后)的抗體滴度。結(jié)果列于表#5.3和#5.4。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#5.5。
表#5.2 表#5.3 表#5.4 表#5.5 通過上述實(shí)施例#3中所述的ELISA在豬身上測定這些不同制劑在抗失活流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11血清中抗體反應(yīng)的效應(yīng)。結(jié)果列于表#5.6和#5.7。
表#5.6 表#5.7 實(shí)施例#6 如實(shí)施例#4中所述，合成各種二糖衍生物，起始材料的量被列于表#6.1。
表#6.1 #摩爾比例L/糖每摩爾二糖的十二?；饶枖?shù)；S/糖每摩爾二糖的SO3-吡啶摩爾數(shù)。
麥芽糖＝麥芽糖單水合物(Merck)，乳糖＝α-乳糖單水合物(Acros)。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備表#6.1中不同的蔗糖衍生物與多乙氧基醚80(ICI)、角鯊?fù)?Merck)和PBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。疫苗簡單地由一體積佐劑配方和一體積抗原制劑混合制得。按上述實(shí)施例#1中所述的病毒中和試驗(yàn)測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#6.2。
以上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定二次免疫3周和12周后(增強(qiáng)后)的抗體滴度。結(jié)果列于表#6.3和#6.4。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#6.5。
表#6.2 表#6.3 表#6.4 表#6.5 通過上述實(shí)施例#3中所述的ELISA在豬身上測定這些不同制劑在抗失活流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11血清中抗體反應(yīng)的效應(yīng)。結(jié)果列于表#6.6和#6.7。
表#6.6 表#6.7 實(shí)施例#7 通過使蔗糖脂肪酸酯L195(Mitsubishi-Kagaku食品公司，東京，日本)與SO3-吡啶在60℃接觸約6小時(shí)，合成各種二糖衍生物。起始材料的量被列于表#7.1。
表#7.1 #摩爾比例L/糖＝每摩爾L195的十二?；饶枖?shù)；S/糖＝每摩爾L195的SO3-吡啶摩爾數(shù)。
*參照L195的供應(yīng)商。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備10g表#7.1中的蔗糖衍生物、10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鯊?fù)?Merck)和190g PBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。疫苗簡單地由一體積佐劑配方和一體積抗原制劑混合制得。按上述實(shí)施例#1中所述的病毒中和試驗(yàn)測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#7.2。
以上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定二次免疫3周和12周后(增強(qiáng)后)的抗體滴度。結(jié)果列于表#7.3和#7.4。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#7.5。
表#7.2 表#7.3 表#7.4 表#7.5 通過上述實(shí)施例#3中所述的ELISA在豬身上測定這些不同制劑在抗失活流感病毒H1N1菌株A/Swine和H3N2菌株MRC-11血清中抗體反應(yīng)的效應(yīng)。結(jié)果列于表#7.6和#7.7。
表#7.6 表#7.7 實(shí)施例#8 按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備40g L195(Mitsubishi-Kagaku食品公司，東京，日本)、10g多乙氧基醚80(ICI)和200g PBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備10g實(shí)施例#5的(硫酸酯)1-(十二?；?7-蔗糖與10g多乙氧基醚80(ICI)、40g L195(Merck)和190g PBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。疫苗簡單地由一體積佐劑配方和一體積抗原制劑混合制得。按上述實(shí)施例#1中所述的病毒中和試驗(yàn)測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#8.2。
以上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定二次免疫3周和12周后(增強(qiáng)后)的抗體滴度。結(jié)果列于表#8.3和#8.4。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#8.5。
表#8.2 表#8.3 表#8.4 表#8.5 實(shí)施例#9 通過使0.02摩爾蔗糖與0.15摩爾油酰氯(Merck)在60℃接觸約6小時(shí)，合成(油酰)8-蔗糖。該蔗糖衍生物以正己烷進(jìn)行抽提。通過上述實(shí)施例#2中所述的增加溫度、減少壓力的蒸發(fā)方法去除正己烷。通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
制備了3種不同的蔗糖octaoleate酯乳液。按表#9.1中所示的量將(油酰)8-蔗糖、角鯊?fù)椤⒍嘁已趸?0和PBS-硫柳汞混在一起，并按上述實(shí)施例#1中所述方法進(jìn)行乳化。此外，按表#9.1中所示的角鯊?fù)?、多乙氧基?0和PBS-硫柳汞的量混在一起，制備無蔗糖octaoleate的角鯊?fù)?多乙氧基醚80乳液。
表#9.1 按上述實(shí)施例#1中所述方法測定表#9.1中乳液對抗CSFV-E2病毒中和抗體反應(yīng)的效應(yīng)。SL-CD/角鯊?fù)榻?Fort Dodge AnimalHealth Holland，Weesp，荷蘭)被包括在內(nèi)以作參考。結(jié)果列于表#9.2。
表#9.2 不同佐劑的配制被列于表#9.1。CSFV-E2的劑量為32μg/動(dòng)物。
實(shí)施例#10 將市售的、含4.0和4.4μg HA/劑量的失活流感病毒菌株MRC-11和A/Swine及108.3TCID50/劑量的失活假狂犬病病毒的假狂犬病/流感病毒疫苗(Fort Dodge Animal Health Holland的SuvaxynO/W，Weesp，荷蘭)與實(shí)施例#1的(硫酸酯)-(十二酰基)7-蔗糖/角鯊?fù)?多乙氧基醚80佐劑配方按體積比100/0、33/66、20/80和10/90混合。將各組豬免疫兩次并按Hilgers等(疫苗，1994，12，653-660頁)所述的病毒中和試驗(yàn)方法測定抗假狂犬病病毒的抗體反應(yīng)。結(jié)果列于表#10.1。按實(shí)施例#3中所述的ELISA測定抗流感病毒菌株A/Swine和MRC-11的抗體反應(yīng)。結(jié)果分別列于表#10.2和#10.3。
表#10.1 表#10.2 表#10.3 實(shí)施例#11 按實(shí)施例#1中所述，合成蔗糖衍生物。所用起始材料的量被列于表#11.1。
表#11.1 #摩爾比例L/蔗糖每摩爾蔗糖的酰氯摩爾數(shù)；S/蔗糖每摩爾蔗糖的SO3-吡啶摩爾數(shù)。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備表#10.1中的蔗糖衍生物與多乙氧基醚80(ICI)、角鯊?fù)?Merck)和PBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。疫苗簡單地由一體積佐劑配方和一體積抗原制劑混合制得。按上述實(shí)施例#1中所述的病毒中和試驗(yàn)測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#11.2。
以上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定抗體滴度。結(jié)果列于表#11.3。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#11.4。
表#11.2 表#11.3 表#11.4 實(shí)施例#12 按實(shí)施例#1中所述，合成幾種蔗糖衍生物。將蔗糖與十二酰氯(Merck)、癸酰氯(Merck)、十八酰氯(Merck)或十六酰氯(Merck)接觸，并與SO3-吡啶接觸。所用起始材料的量被列于表#12.1。
表#12.1 #摩爾比例L/蔗糖每摩爾蔗糖的酰氯摩爾數(shù)；S/蔗糖每摩爾蔗糖的SO3-吡啶摩爾數(shù)。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備表#12.1中的蔗糖衍生物與多乙氧基醚80(ICI)、角鯊?fù)?Merck)和PBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。結(jié)果列于表#12.2。
以上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定抗體滴度。結(jié)果列于表#12.3。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#12.4。
表#12.2 表#12.3 表#12.4 實(shí)施例#13 按上述實(shí)施例#中所述的方法制備蔗糖酯L195(Mitsubishi-Kagaku食品公司，東京，日本)、多乙氧基醚80(Merck)、角鯊?fù)?Merck)、實(shí)施例#9中的(油酰)8-蔗糖、二甲基二-十八烷基溴化銨(DDA；Eastman Kodak公司，Rochester，NY)、聚羧乙烯934 PH(BFGoodrich，Cleveland，OH)的制劑。所用起始材料的量被列于表#13.1。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。結(jié)果列于表#13.2。
以上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定抗體滴度。結(jié)果列于表#13.3。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#13.4。
表#13.1 表#13.2 表#13.3 表#13.4 NT＝未檢測 實(shí)施例#14 按實(shí)施例#1中所述，合成甘露糖衍生物。所用起始材料的量被列于表#14.1。
表#14.1 #摩爾比例L/甘露糖每摩爾甘露糖的酰氯摩爾數(shù)；S/甘露糖每摩爾甘露糖的SO3-吡啶摩爾數(shù)。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備10g表#14.1中的甘露糖衍生物與10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鯊?fù)?Merck)和190gPBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。結(jié)果列于表#14.2。
以上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定抗體滴度。結(jié)果列于表#14.3。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#14.4。
表#14.2 表#14.3 表#14.4 實(shí)施例#15 按實(shí)施例#1中所述，合成(硫酸酯)1-(十二酰)2-甘油。將4.6g無水甘油(Merck)溶于無水N-甲基-吡咯酮(Merck)和無水吡啶(Merck)中。加入21.9g的十二酰氯(Merck)并將反應(yīng)混合物于60℃溫浴6小時(shí)。加入8.0g SO3-吡啶(Merck)并將反應(yīng)混合物于室溫溫浴18小時(shí)。將該反應(yīng)混合物于4℃保持24小時(shí)，使其形成兩相。收集上相，并以增加溫度(＜60℃)、減少壓力(＜10mbar)的方法進(jìn)行蒸發(fā)，并于4℃冷凝，直至殘留的重量損失小于0.1g/30分鐘為止，以除去N-甲基吡咯酮和吡啶。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的(硫酸酯)1-(十二酰)2-甘油進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備10g甘油衍生物、10g多乙氧基醚80(ICI)、40g角鯊?fù)?Merck)和190g PBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。結(jié)果列于表#15.1。
以上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定抗體滴度。結(jié)果列于表#15.2。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#15.3。
表#15.1 表#15.2 表#15.3 NT＝未檢測 實(shí)施例#16 按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備1.3g蔗糖酯L195(Mitsubishi-Kagaku食品公司，東京，日本)、1.3g多乙氧基醚80(Merck)、10.8g角鯊?fù)?Merck)、237.7g PBS-硫柳汞的制劑。
按上述實(shí)施例#1中所述的方法制備1.3g實(shí)施例#12中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖、1.3g多乙氧基醚80(Merck)、10.8g角角鯊烯(Merck)和238.1g PBS-硫柳汞的制劑。
在豬身上測定了這幾種制劑在抗失活人流感病毒菌株A/Panama、A/New CAledonia和B/Yamanashi血清中的ELISA抗體反應(yīng)效應(yīng)。為此，將一劑(0.5ml)市售Solvay藥廠(Weesp，荷蘭)的流感病毒疫苗INFLUVACTM與1ml任一佐劑配方混合，并對5組豬進(jìn)行免疫。首次免疫三周后，以實(shí)施例#3中所述的ELISA測定抗體反應(yīng)。通過測定用沒有佐劑的Solvay藥廠INFLUVACTM二次免疫后的抗體反應(yīng)，來測定免疫記憶的誘導(dǎo)作用。
首次免疫后抗A/Panama、A/New CAledonia和B/Yamanashi抗體滴度的結(jié)果分別列于表#16.1、#16.2和#16.3。無佐劑的二次免疫一周后，抗A/Panama、A/New CAledonia和B/Yamanashi抗體滴度的結(jié)果分別列于表#16.4、#16.5和#16.6。無佐劑的二次免疫三周后，抗A/Panama、A/New CAledonia和B/Yamanashi抗體滴度的結(jié)果分別列于表#16.7、#16.8和#16.9。
表#16.1 表#16.2 表#16.3 表#16.4 表#16.5 表#16.6 表#16.7 表#16.8 表#16.9 實(shí)施例#17 按實(shí)施例#1中所述方法，通過使205.2g蔗糖與198g十二酰氯和98g SO3-吡啶接觸，合成(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖。該蔗糖酯按上述實(shí)施例#2中所述方法用正己烷進(jìn)行抽提。
按實(shí)施例#1中所述方法，通過使23.9g蔗糖與67.5g十二酰氯和45.6g SO3-吡啶接觸，合成(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
用角鯊?fù)?Merck)、角鯊烯(Merck)、十六烷(Acros，Geel，比利時(shí))、三油精(Sigma，St.Louis，MI)、Markol(Esso)、全氟辛基溴化物(perfluorooctylbromide)(Acros)或硅油作為油，多乙氧基醚80(Merck)、多乙氧基醚20(Baker)、L1695(Mitsubishi-Kagaku)、Triton X-100(Sigma)、皂角苷(Fluka，Zwijndrecht，荷蘭)或(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖作為乳化劑及PBS-硫柳汞或WFI(ID-Lelystad的注射用水，Lelystad，荷蘭)作為水相，按下述表#17.1中所示的量制備(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖佐劑配方。
這些制劑按上述實(shí)施例#1中所述方法進(jìn)行乳化。
表#17.1 按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。1組和2組各有5頭豬，3組和10組各有4頭豬。疫苗簡單地由一體積佐劑配方和一體積抗原制劑混合制得。按上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#17.2。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#17.3。
表#17.2 表#17.3 NT＝未檢測 實(shí)施例#18 按實(shí)施例#1中所述方法，通過使23.9g蔗糖與94g癸酰氯和11.1g SO3-吡啶接觸，合成(硫酸酯)1-(癸酰)7-蔗糖。該蔗糖酯按上述實(shí)施例#2中所述方法用正己烷進(jìn)行抽提。
按實(shí)施例#1中所述方法，通過使24g蔗糖與54.4g癸酰氯和45g SO3-吡啶接觸，合成(硫酸酯)4-(癸酰)4-蔗糖。通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果列于圖#18。
用角鯊?fù)榛蚪酋徬┳鳛橛?，多乙氧基?0、L1695(Mitsubishi-Kagku)或(硫酸酯)4-(癸酰)4-蔗糖作為乳化劑和/或穩(wěn)定劑及PBS-硫柳汞，按表#18.1中所示的量制備這些蔗糖酯的幾種佐劑配方。這些制劑按上述實(shí)施例#1中所述方法進(jìn)行乳化。
表#18.1 表#18.1之說明角鯊?fù)?Merck)、角鯊烯(Merck)、多乙氧基醚80(Merck)、多乙氧基醚20(Baker)、L1695(Mitsubishi-Kagaku食品公司，東京，日本)，WFI為注射用水(ID-Lelystad，Lelystad，荷蘭)。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些(幾個(gè))制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。1組有5頭豬，2組和3組各有4頭豬。疫苗簡單地由一體積佐劑配方和一體積抗原制劑混合制得。按上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#18.2。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#18.3。
表#18.2 表#18.3 NT＝未檢測 實(shí)施例#19 用L195(Mitsubishi)、角鯊烯(Merck)、L1695(Mitsubishi)和PBS-硫柳汞或WFI，按表#19.1中所示的量制備制劑。這些制劑按上述實(shí)施例#1中所述方法進(jìn)行乳化。
麥#19.1 角鯊烯(Merck)、L195和L1695(Mitsubishi-Kagaku)、PBS-硫柳汞和WFI(ID-Lelystad，Lelystad，荷蘭)。
按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這兩個(gè)制劑抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。1組有5頭豬，2組和3組各有4頭豬。疫苗簡單地由一體積佐劑配方和一體積抗原制劑混合制得。按上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#19.2。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#19.3。
表#19.2 表#19.3 NT＝未檢測 實(shí)施例#20 按實(shí)施例#1中所述方法合成(癸酰)7-蔗糖酯。使23.9g細(xì)粉狀蔗糖(Merck)與94g癸酰氯(Merck)接觸。該蔗糖酯按上述實(shí)施例#2中所述方法用正己烷進(jìn)行抽提。
通過實(shí)施例#1中所述的TLC方法對獲得的產(chǎn)物進(jìn)行分析。
按上述實(shí)施例#1中所述方法，用(癸酰)7-蔗糖酯、角鯊烯、多乙氧基醚80和PBS-硫柳汞，按表#20.1中所示的量制備這些制劑并進(jìn)行乳化。
表#20.1 按上述實(shí)施例#1中所述方法在豬身上測定這些制劑中的一個(gè)抗CSFV-E2免疫應(yīng)答的效應(yīng)。1組有5頭豬，2組有4頭豬。按上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#20.2。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#20.3。
表#20.2 表#20.3 NT＝未檢測 實(shí)施例#21 研究了首次免疫和二次免疫之間的時(shí)間間隔對免疫應(yīng)答的影響。用實(shí)施例#17的CSFV-E2+(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鯊烯/多乙氧基醚80[40/160/40]，以間隔三周(第0周和第3周)和間隔兩周(第1周和第3周)對幾組豬免疫兩次。按上述實(shí)施例#3中所述的ELISA測定血清中抗CSFV的抗體滴度。結(jié)果列于表#21.1。
按上述實(shí)施例#2中所述的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞介導(dǎo)的抗CSFV的應(yīng)答。結(jié)果列于表#21.2。
表#21.1 表#21.2 實(shí)施例#22 按實(shí)施例#13中所述方法制備的L195//角鯊?fù)?多乙氧基醚80[40/160/40]佐劑配方與相似體積的含3μg/ml口蹄疫病毒菌株O/Taiwan的抗原溶液混合。用2ml疫苗對3組豬免疫兩次。按vanMaanen和Terpstra所述的病毒中和抗體檢測(免疫方法雜志，1989，124，111-119頁)以不同時(shí)間間隔測定抗O/Taiwan病毒中和抗體反應(yīng)。
結(jié)果列于表#22.1。
表#22.1 實(shí)施例#23 按實(shí)施例#1中所述方法對160g L195、640g角鯊?fù)椤?60g多乙氧基醚80和40g注射用水(L195/角鯊?fù)?多乙氧基醚80[160/640/160])佐劑配方進(jìn)行乳化。用一體積的該佐劑配方與一體積含3μg/ml口蹄疫病毒菌株O/Taiwan的抗原溶液混合。用2ml疫苗對5組豬免疫一次并按實(shí)施例#22中所述方法以不同時(shí)間間隔測定抗體反應(yīng)。結(jié)果列于表#23.1。
表#23.1 實(shí)施例#24 將實(shí)施例#2中的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III/角鯊?fù)?多乙氧基醚80[40/160/40]佐劑與按Oonk等(疫苗，1998，16，1074-1082)所述制備的、與卵清蛋白共軛的促性腺釋放激素肽(G6k-GnRH-串聯(lián)-二聚體-OVA綴合物)混合。用187μgG6k-GnRH-串聯(lián)-二聚體-OVA綴合物+(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III/角鯊?fù)?多乙氧基醚80[40/160/40]對10頭豬(第一組)免疫兩次，并用無抗原的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III/角鯊?fù)?多乙氧基醚80[40/160/40]對5頭豬(第二組；對照)免疫。以第10周首次免疫和第17周二次免疫之后不同的時(shí)間間隔，用購自Amersham醫(yī)藥生物技術(shù)公司(Buckinghamshire，英格蘭)的碘化GnRH，按Meloen等(疫苗，1994，12，741-746)所述的RIA方法測定血清樣品(1/2000稀釋)中抗GnRH的抗體滴度。結(jié)果列于表#24.1。按Meloen等(疫苗，1994，12，741-746)所述方法測定第24周的睪丸重量。結(jié)果列于表#24.2。
表#24.1 NT＝未檢測。
表#24.2 實(shí)施例#25 將實(shí)施例#17的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖、角鯊?fù)?、多乙氧基?0和PBS-硫柳汞按表#25.1中所列的量混合，制備佐劑配方。這些混合物按實(shí)施例#1中所述的方法進(jìn)行乳化。
表#25.1 實(shí)施例#26 將10g實(shí)施例#17的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖、10g多乙氧基醚80(Baker)和230ml 3w/v％氫氧化鋁懸液(Alhydrogel ofSuperfos Biosector a/s，Vedbaeck，丹麥)混合，制備佐劑配方。
圖例

圖1a按實(shí)施例#1所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#1的(十二酰)7-蔗糖； 3道實(shí)施例#1的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖； 4道實(shí)施例#1的(十二酰)-蔗糖； 5道實(shí)施例#1的(硫酸酯)1-(十二酰)5-蔗糖； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖1b按實(shí)施例#1所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#1的(十二酰)3-蔗糖； 3道實(shí)施例#1的(硫酸酯)1-(十二酰)3-蔗糖； 4道實(shí)施例#1的(十二酰)1-蔗糖； 5道實(shí)施例#1的(硫酸酯)1-(十二酰)1-蔗糖； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖2a按實(shí)施例#3所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#3的(十二酰)7-蔗糖； 3道實(shí)施例#3的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖； 4道實(shí)施例#3的(十四酰)7-蔗糖； 5道實(shí)施例#3的(硫酸酯)1-(十四酰)7-蔗糖； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖2b按實(shí)施例#3所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#3的(十六酰)7-蔗糖； 3道實(shí)施例#3的(硫酸酯)1-(十六酰)7-蔗糖； 4道實(shí)施例#3的(十八酰)7-蔗糖； 5道實(shí)施例#3的(硫酸酯)1-(十八酰)7-蔗糖； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖3a按實(shí)施例#4所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#4的(十二酰)8-蔗糖； 3道實(shí)施例#4的(硫酸酯)0.5-(十二酰)7-蔗糖； 4道實(shí)施例#4的(硫酸酯)1.0-(十二酰)6-蔗糖； 5道實(shí)施例#4的(硫酸酯)1.5-(十二酰)5-蔗糖； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖3b按實(shí)施例#4所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#4的(硫酸酯)2.0-(十二酰)4-蔗糖； 3道實(shí)施例#4的(硫酸酯)2.5-(十二酰)3-蔗糖； 4道實(shí)施例#4的(硫酸酯)3.0-(十二酰)2-蔗糖； 5道實(shí)施例#4的(硫酸酯)3.5-(十二酰)1-蔗糖； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖4a按實(shí)施例#5所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#5的(十二酰)8-蔗糖； 3道實(shí)施例#5的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖； 4道實(shí)施例#5的(硫酸酯)2-(十二酰)6-蔗糖； 5道實(shí)施例#5的(硫酸酯)3-(十二酰)5-蔗糖； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖4b按實(shí)施例#5所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#5的(硫酸酯)4-(十二酰)4-蔗糖； 3道實(shí)施例#5的(硫酸酯)5-(十二酰)3-蔗糖； 4道實(shí)施例#5的(硫酸酯)6-(十二酰)2-蔗糖； 5道實(shí)施例#5的(硫酸酯)7-(十二酰)1-蔗糖； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖5按實(shí)施例#6所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#6的(十二酰)7-麥芽糖； 3道實(shí)施例#6的(硫酸酯)1-(十二酰)7-麥芽糖； 4道實(shí)施例#6的(十二酰)7-乳糖； 5道實(shí)施例#6的(硫酸酯)1-(十二酰)7-乳糖； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖6按實(shí)施例#7所述方法制備的衍生物的薄層色譜。
1道(左)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III； 2道實(shí)施例#7的L195； 3道實(shí)施例#7的(硫酸酯)1-L195； 4道實(shí)施例#7的(硫酸酯)2-L195； 5道實(shí)施例#7的(硫酸酯)2.3-L195； 6道(右)實(shí)施例#2的(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖組份III。
圖7本發(fā)明蔗糖衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中R1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’3和R’4是H或-O-S(＝O)(＝O)-OR(其中R是H、Na、K或NH4)或-O-C(＝O)(-CH2)n-CH3(其中n在6到24之間)。
圖8-12肌內(nèi)注射含本發(fā)明佐劑，尤其是(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖/角鯊?fù)?多乙氧基醚80乳液，的CSFV-E2疫苗(實(shí)施例#2的第5組)3周(a)和6周(b)后，5頭動(dòng)物中局部反應(yīng)的宏觀表現(xiàn)。對輕微的纖維化和水腫進(jìn)行了記錄。
圖13-17肌內(nèi)注射含礦物油包水浸水佐劑的CSFV-E2疫苗(實(shí)施例#2的第10組)3周(a)和6周(b)后，5頭動(dòng)物中局部反應(yīng)的宏觀表現(xiàn)。對Granumola、膿腫和壞死進(jìn)行了記錄。
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權(quán)利要求
1.一種疫苗，其包含抗原組份和單糖或二糖衍生物，所說的衍生物具有至少一個(gè)但不多于N-1個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)，其中N是衍生該衍生物的單糖或二糖的羥基數(shù)目。
2.權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述單糖或二糖衍生物進(jìn)一步包括至少一個(gè)但不多于N-1個(gè)陰離子基團(tuán)，其中脂肪酸酯和陰離子基團(tuán)的組合數(shù)不超過N。
3.權(quán)利要求2所述的疫苗，其中所述單糖或二糖衍生物具有至少2個(gè)但不多于N-1個(gè)脂肪酸基團(tuán)并且具有至少1個(gè)但不多于N-2個(gè)陰離子基團(tuán)。
4.權(quán)利要求3所述的疫苗，其中所述單糖或二糖衍生物具有至少3個(gè)但不多于N-1個(gè)脂肪酸基團(tuán)并且具有至少1個(gè)但不多于N-3個(gè)陰離子基團(tuán)。
5.權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述單糖或二糖衍生物具有至少4個(gè)但不多于N-1個(gè)脂肪酸基團(tuán)并且具有至少1個(gè)但不多于N-4個(gè)陰離子基團(tuán)。
6.權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述的衍生的單糖具有至少一個(gè)陰離子基團(tuán)和至少兩個(gè)脂肪酸酯，其中陰離子基團(tuán)和脂肪酸酯的總數(shù)在3-5范圍內(nèi)。
7.權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述的衍生的二糖具有至少一個(gè)陰離子基團(tuán)，和至少一個(gè)脂肪酸酯，其中陰離子基團(tuán)和脂肪酸酯的總數(shù)在6-9范圍內(nèi)。
8.權(quán)利要求7所述的疫苗，其中所述的衍生的二糖具有1或4個(gè)陰離子基團(tuán)。
9.權(quán)利要求7所述的疫苗，其中陰離子基團(tuán)和脂肪酸酯的總數(shù)為7或8個(gè)。
10.權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述的單糖衍生物衍生自具有C5H10O5通式的戊糖或具有C6H12O6通式的己糖。
11.權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述的單糖衍生物來自N是3或4的單糖。
12.權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述的二糖衍生物來自具有通式C12H22O10的二糖。
13.權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述的單糖或二糖衍生物衍生自allolose、altriose、果糖、半乳糖、葡萄糖、古羅糖、肌醇、甘露糖、山梨糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、乳果糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、松二糖、蜜二糖。
14.權(quán)利要求2所述的疫苗，其中所述的單糖或二糖衍生物的至少一個(gè)陰離子基團(tuán)為具有通式-SO2-OR的硫酸酯，或具有通式-PO2-(OR)2的磷酸酯，其中R為單價(jià)陽離子。
15.權(quán)利要求14所述的疫苗，其中所述的單糖或二糖衍生物的任何一個(gè)R都獨(dú)立地選自H+、K+、Na+、Li+和NH4+。
16.權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述的單糖或二糖衍生物的每一個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)由通式-O-C(＝O)-(CH2)x-CH3、其中x至少是4，-OC(＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH3、其中x+y至少是4，或-O-(C＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH＝CH-(CH2)z-CH3、其中x+y+z在2到20之間代表。
17.權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述的單糖或二糖衍生物的每一個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)由通式-OC(＝O)-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH3代表，其中x+y至少是4并不多于24。
18.權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述的單糖或二糖衍生物的每一個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)由通式-OC(＝O)-(CH2)x-CH3代表，其中x在6到14之間。
19.權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述的單糖或二糖衍生物的每一個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)由通式-OC(＝O)-(CH2)x-CH3代表，其中x是6或8或10或12。
20.權(quán)利要求1所述的疫苗，其中其進(jìn)一步含有與水不互溶的液相(II)和乳化劑或穩(wěn)定劑(III)。
21.權(quán)利要求20所述的疫苗，其中該與水不互溶的液相(II)為油。
22.權(quán)利要求20所述的疫苗，其中該與水不互溶的液相(II)為角鯊?fù)?、角鯊烯、礦物油、植物油、十六烷、碳氟化合物或硅油。
23.權(quán)利要求20所述的疫苗，其中該乳化劑或穩(wěn)定劑(III)為親水-親脂平衡值大于10的非離子去污劑、糖脂肪酸酯或親水-親脂平衡值大于10的陰離子去污劑。
24.權(quán)利要求20所述的疫苗，其中該乳化劑或穩(wěn)定劑(III)為一種單糖或二糖衍生物，所述衍生物具有至少一個(gè)但不多于N-1個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)，其中N是衍生該衍生物的單糖或二糖的羥基數(shù)目。
25.權(quán)利要求1所述的疫苗，其含有與水不互溶的固相(V)。
26.權(quán)利要求25所述的疫苗，其中該與水不互溶的固相(V)為不溶鹽。
27.權(quán)利要求26所述的疫苗，其中該不溶鹽為鋁鹽或鈣鹽。
28.權(quán)利要求27所述的疫苗，其中所述鋁鹽或鈣鹽是氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣、二氧化硅或其混合物。
29.權(quán)利要求20所述的疫苗，其進(jìn)一步含有水相(IV)。
30.權(quán)利要求25所述的疫苗，其進(jìn)一步含有水相(IV)。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的單糖衍生物和二糖衍生物的家族并涉及其制備方法。本發(fā)明所述的單糖和二糖衍生物包括至少一種脂肪酸酯，并可進(jìn)一步包括一種或多種陰離子基團(tuán)，而且其可用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化妝品和食品應(yīng)用中。
文檔編號C07H13/06GK101108250SQ20071012719
公開日2008年1月23日 申請日期2000年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月30日
發(fā)明者盧卡斯·阿方修斯·特奧多魯斯·希爾格斯, 安內(nèi)科·喬治亞娜·布洛姆 申請人:科瓦奇娜公司