專利名稱：Hiv tat-cd4雜合分子及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及含有HIV Tat多肽和CD4分子的至少一部分(例如，CD4最小 組件、CD4模擬物等)的免疫原性組合物。本文所述的免疫原性組合物結(jié)合于HIVEnv 蛋白(例如單體或低聚的gpl20、 gpl40或gpl60)，并引起Env蛋白中的構(gòu)象變化， 從而暴露出保守的、隱藏的功能性表位。本發(fā)明還涉及采用這些免疫原性組合物作 為^ HIV Env多肽的單分子或雙分子復(fù)合物的一部分來引發(fā)對眾多HIV亞型的免疫發(fā)明背景人免疫缺陷病毒(HIV-1，也稱為HTLV-III、 LAV或HTLV-III/LAV)是一種獲得性 免疫缺陷綜合征(AIDS)及相關(guān)病癥的病原。(參見例如Barre-Sinoussi等，(1983) 220:868-871; Gallo等，(1984) &/e"ce 224:500-503; Levy等，(1984)&/e"ce 225:840-842; Siegal等，(1981) J她d 305:1439-1444; Guyader等，(1987)326:662-669)。HIV-1、 HIV-2和SIV包膜蛋白是一種約160kd的糖蛋白(gp160)。在宿主細(xì)胞受 到病毒感染期間，gpl60經(jīng)宿主細(xì)胞蛋白酶切割形成gpl20和整合膜蛋白gp41。gp41 部分錨定在病毒體的雙層膜中，而gpl20片段則突出于周圍環(huán)境中。gpl20和gp41更為共價地連接，游離的gpl20可從病毒體的表面釋放出來并感染細(xì)胞。此外，--旦結(jié)合到Eiw多肽的受體(即CD4)上，Eiw多肽發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)重排。在該構(gòu)象變化 之后，暴露出CCR5或其它趨化因子結(jié)合的共同受體結(jié)合位點(diǎn)。此趨化因子受體結(jié) 合位點(diǎn)的暴露反過來介導(dǎo)了病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中。參見例如Wyatt， R.等，(1998) tV","m 393:705-711; Kwong， R等，(1998) Ato"w 393:648-659。Env似乎是誘導(dǎo)對HIV的體液免疫應(yīng)答的主要靶標(biāo)。然而，已知抗gpl20的抗體 通常不具有廣泛的抗不同HIV株的抗體應(yīng)答，且單獨(dú)的gpl20不會誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的 中和抗體。參見例如Javaherian， K.等，(1989)尸rac. Ato/. Jc^/. 86:6786-6772; Matsushita, M.等，(1988) / F ra/. 62:2107-2144; Putney， S.等，(1986) Sc/ewce 234:1392-1395; Rushe， J. R.等，(1988) ZVoc.淑Jcac/. 園85: 3198-3202; Matthews, T. (1986)尸rac. Ate/. Jcad Sc/. 83:9709-9713; Nara, P丄.等，(1988) J. F/ra/. 62:2622-2628; Palker， T丄等，(1988) ZVoc. A^/. ^cad Sc/. 85:1932-1936)。并且，雖然中和抗體通常是在人體中發(fā)生HIV感染的情況下產(chǎn)生，這些抗體不能 提供持久的抗病毒效果，其部分原因可能在于"中和逃避"病毒突變體的產(chǎn)生以及 S致病相關(guān)的宿主免疫系統(tǒng)總體上的降低。參見例如Barre-Sinoussi， F.等，(1983) W置e 220:868-871; Robert隱Guroff， M.等，(1985) Atowre (倫敦)316:72-74; Weis， R.等，(1985) Atoi^e(倫敦)316:69-72; Weis， R.等，(1986) A^we (倫敦)324:572-575。 雖然如此，仍然廣為支持初期HIV-1暴露后存在的預(yù)先存在的中和抗體可能具有保 護(hù)作用，例如通過與侵入的病毒體接觸和降低或防止它們對耙細(xì)胞的感染性并防止 體內(nèi)病毒從細(xì)胞到細(xì)胞的傳播。參見例如Hu等，(1992)Sc/e"ce 255:456-459; Burton， D.， R.和Montefiori, D.(1997) AKW ll(增刊A): 587-598; Montefiori和Evans (1999) J/AS^m. //ww. 15(8):689-698; Bolognesi， D.R等，(1994) J朋./"/. M^/. 8:603-611; Haynes， B.， F.等，(1996) Sc,e"ce; 271:324-328。已鑒別了多類可能有效的中和抗體。例如，已從大部分受感染的個體中鑒別出了 千擾gpl20和CD4結(jié)合的眾多活性抗體的亞型。參見例如Kang，C.-Y.等，(1991) /Voc. Ato/. ^cad 88:6171-6175 ; McDougal ， J.S.等，(1986) 乂 /7"ww"0/.137:2937-2944。單克隆抗體，例如IgGlbl2、2G12(Mo等，(1997)J :6869-6874)、 PA14 (Trkola等，(2001) /K/ra/. 75(2):579-88)以及2F5均具有中和效果。還可參見， Trkola等，(1995) / Wra/. 69:6609-6617; D，Sousa等，(1997) J./"/e". Zto. 175:1062-1075。確信在CD4結(jié)合于Env之后，其它抗體也可結(jié)合于趨化因子受體結(jié)合區(qū)。參 見例如Thali等，(1993) / Wra/. 67:3978-3988)。此外，為了產(chǎn)生針對僅在結(jié)合CD4 后暴露的CD4結(jié)合位點(diǎn)區(qū)的抗體，多個研究組已嘗試通過給予Erw與CD4(例如可 溶性CD4，稱為"sCD4")結(jié)合的復(fù)合物或Env與CD4模擬物(例如CD4M33)結(jié)合 的復(fù)合物來產(chǎn)生中和抗體。參見例如Martin等，(2003) Ato說'o&c/mo/. 21(1):71-76。此外，WO 04/037847中描述了可用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的Env-CD4復(fù)合物。可推測， 通過靶向結(jié)合于CD4后暴露在Env蛋白中的構(gòu)象表位，Env-CD4(sCD4)復(fù)合物能夠 誘導(dǎo)眾多的中和抗體。然而，如果將sCD4與佐劑一起給予的話，需要認(rèn)真考慮發(fā)生 自身免疫應(yīng)答的可能性。此外，WO 04/037847中描述了雜交Env-CD4多肽。除了上述的進(jìn)展以外，仍然需要例如在作為疫苗給藥時，能夠在對象中引發(fā)針對 多種HIV株和亞型的免疫應(yīng)答的其它分子(例如中和和/或保護(hù)性抗體)。本發(fā)明通過 提供含有HIV Tat多肽和CD4分子的免疫原性組合物來解決這些和其它問題，所述 CD4分子作為還含有HIV Env多肽的單分子復(fù)合物或者作為含有HIV Tat/CD4小蛋 l'l部分和Env部分的雙分子復(fù)合物的 一部分。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供含有CD4多肽或CD4樣分子及骨架多肽的雜合分子來解決這些 和其它問題。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述骨架多肽是侵襲素多肽或其片段。在 另--個優(yōu)選的實施方式中，所述骨架多肽是Tat多肽或其片段。優(yōu)選地，未產(chǎn)生對 Eiw結(jié)合組分(例如，CD4分子)的免疫應(yīng)答。然而，雜合分子結(jié)合Env從而導(dǎo)致Env 構(gòu)象改變并使Env表位暴露，因而更容易產(chǎn)生該表位的中和抗體。因此，本文所述 的雜合分子可使得用于抗CD4-Env的有用抗體得以產(chǎn)生(包括中和抗體和其它免疫 應(yīng)答)，同時降低或避免不為所需的對CD4非Env結(jié)合區(qū)的免疫應(yīng)答。還提供了Env 與本文所述雜合分子的復(fù)合物，以及抗這些分子的抗體。因此，在一方面，本發(fā)明包括含有CD4蛋白或CD4模擬物和衍生自HIV Tat蛋 白的多肽的雜合體。在某些實施方式中，所述CD4蛋白包含CD4最小組件，而所述 Tat蛋白包含衍生自一種或多種全長Tat蛋白的多肽。在其它實施方式中，所述Tat 多肽包含HIV-lTat蛋白的片段(例如，任何HIV-lTat蛋白的86個氨基酸的片段)。 所述CD4最小組件優(yōu)選是人CD4序列。在某些實施方式中，所述雜合分子還含有一 種或多種其它多肽，例如免疫調(diào)節(jié)多肽(細(xì)胞因子等)，和域一種或多種Eiw多肽。在另一方面，本發(fā)明包括本文所述的雜合分子和HIVEnv多肽的復(fù)合物。優(yōu)選地， 形成所述復(fù)合物以使得隱藏表位在Env多肽中暴露?？赏ㄟ^以下方式使得HIV Eiw 多肽和雜合分子復(fù)合交聯(lián)(例如使用甲醛)；使用固定劑(例如福爾馬林)；和/或在適 宜的條件下自發(fā)地復(fù)合。在另一方面，本發(fā)明包括編碼本文所述雜合分子一個或多個部分的多核苷酸(例 如，操作性連接的編碼CD4和Tat的多核苷酸序列)。所述編碼CD4多肽的多核苷酸 可以是毗連或非毗連的，此外還可位于一種或多種Tat多肽編碼序列的5'端、3'端和 /或內(nèi)部(嵌入其中)。所述Env多肽也可以編碼所述Env多肽的多核苷酸的形式提供， 作為免疫原性組合物的一部分。在一些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多核苷酸被修飾(例如，密碼子優(yōu)化)以提高 在哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)(為給予本發(fā)明的多核酸)或體外(為制造本發(fā)明的多肽)的表達(dá)。任選地，其它序列可包含在本文所述的融合蛋白內(nèi)。此外，當(dāng)文中所述的任何多 核苷酸被表達(dá)時，所述雜合體融合蛋白優(yōu)選與HIVEnv多肽復(fù)合以使隱藏表位在Env 多肽中暴露。再在另一方面，本發(fā)明包括含有任何本文所述分子(例如，多核苷酸和/或多肽)的 免疫原性組合物。在某些實施方式中，所述免疫原性組合物還含有一種或多種佐劑。在還有的另一方面中，本發(fā)明包括含有任何本文所述的分子(例如，多核苷酸 和/或多肽)的細(xì)胞。當(dāng)用作多核苷酸時，所述序列優(yōu)選操作性連接于與在所選細(xì) 胞中表達(dá)相容的控制元件。所述細(xì)胞可為例如哺乳動物細(xì)胞(例如BHK、 VERO、 HT1080、 293、 RD、 COS-7和CHO細(xì)胞)；昆蟲細(xì)胞(例如粉紋夜蛾(7Wc/^/7/M^m')(Tn5)或SW細(xì)胞)；細(xì)菌細(xì)胞；酵母細(xì)胞；植物細(xì)胞；抗原遞呈細(xì)胞；選自以 下的淋巴細(xì)胞巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、干細(xì)胞或 其祖細(xì)胞；原代細(xì)胞；無限增殖細(xì)胞；禾卩/或腫瘤衍生的細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明包括用于哺乳動物對象中的載體，其中所述載體包含操 作性連接于與對象中表達(dá)相容的控制元件的任何本文所述的多核苷酸。再在另一方面，本發(fā)明包括一種產(chǎn)生結(jié)合于HIV Env隱藏表位的抗體的方法， 所述方法包括如下步驟在允許對象中產(chǎn)生抗體(例如中和抗體、單克隆抗體、多克隆抗體)的條件下，將本文所述的任何雜合分子(例如，融合蛋白)給予對象。 在某些實施方式中，隨后對所述對象中產(chǎn)生的抗體進(jìn)行分離。 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括一種產(chǎn)生任何本文所述的雜合體融合蛋白的方法，所述方法包括在適于產(chǎn)生所述融合蛋白的條件下，孵育任何本文所述的細(xì) 胞。在進(jìn)一步的方面，本本發(fā)明包括一種產(chǎn)生本文所述的任何雜合分子與HIV Env 的復(fù)合物的方法，所述方法包括在適于產(chǎn)生融合蛋白與HIVErw的復(fù)合物的條 件下，孵育本文所述的Tat-CD4雜合分子(或編碼所述分子的多核苷酸)。再在另 -方面，本發(fā)明包括一種在對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(例如，體液應(yīng)答如中 和抗體應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答)的方法，所述方法包括給予對象其量足以在所 述對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(例如，針對隱藏Env表位的應(yīng)答)的任一本文所述的分子 (例如，多核苷酸，多肽和/或免疫原性組合物)。在某些實施方式中，所述方法包 括離體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并將該轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新引入所述對象中。在其它實施方式中，所 述方法包括，例如，在與所述表達(dá)盒在所述對象中的表達(dá)和多肽在所述對象中的 產(chǎn)生相容的條件下，通過將任一本文所述的多核苷酸和/或載體遞送入所述對象而 對所述對象進(jìn)行DNA免疫。在其它實施方式中，所述方法包括(a)在初免步驟中給予包含任一本文所述的多核苷酸的第一組合物；禾n(b)以足以在對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量給予包含任一本文所述的多肽的第二組合物作為增強(qiáng)劑。在本文所述 的任一方法中，所述載體可包含非病毒載體或病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(慢 病毒載體)。此外，可采用例如微粒運(yùn)載體(例如包被在金或鉤微粒上，并可使用 基因槍將所述包被的顆粒遞送入所述對象)或包封在脂質(zhì)體制劑中來引入所述多 核苷酸和/或載體。在本文所述的任何方法中，所述對象可為哺乳動物，例如人或非人哺乳動物，所述引入可通過如下方式進(jìn)行肌內(nèi)、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服和/或靜脈內(nèi)方式。本發(fā)明包括以下實施方式1. 一種雜合分子組合物，其含有骨架多肽和CD4小蛋白，當(dāng)所述雜合分子結(jié)合 HIV Erw多肽時所述雜合分子誘導(dǎo)所述HIV Env多肽發(fā)生構(gòu)象改變。2. 實施方式1所述的組合物，，其中，所述骨架多肽選自侵襲素或tat多肽. 2A.實施方式1或2所述的組合物，其中，所述骨架多肽是異源多肽。2B.實施方式1或2所述的組合物，其中，所述骨架多肽是同源(homolgous)多肽。3. —種雜合分子組合物，其含有HIVTat多肽或其片段；和CD4小蛋白，其中， 所述雜合分子結(jié)合HIVEnv多肽。4. 如實施方式1-3中任一項所述的組合物，其中，所述CD4小蛋白是含有CD4 的氨基酸殘基15-85的CD4最小組件。 5. 如實施方式1-3中任一項所述的組合物，其中，所述Tat多肽包括全長Tat多 肽或其變體。6. 如實施方式5所述的組合物，其中，所述Tat多肽是全長Tat多肽或其變體的 片段，其包含Tat蛋白氨基酸殘基1-86，根據(jù)SEQIDNO:2或其變體編號。7. 如實施方式1-6中任一項所述的組合物，其還含有一種或多種其它異源多肽。8. 如實施方式7所述的組合物，其中，所述一種或多種其它異源多肽選自病毒多 肽、免疫調(diào)節(jié)多肽或細(xì)菌多肽。9. 如實施方式8所述的組合物，其中，所述其它異源多肽是病毒多肽，所述病毒 是HIV。10. 如實施方式1-9中任一項所述的組合物，其中，所述HIVtat多肽或其片段、CD4小蛋白和其它異源多肽中的一種或多種以編碼所述多肽、其片段或小蛋白的多 核苷酸提供。11. 一種免疫原性組合物，其含有如實施方式1-9中任一項所述的組合物且還包 含HIV Env多肽。12. 如實施方式11所述的免疫原性組合物，其中，所述Env多肽包括gp120。13. 如實施方式11所述的免疫原性組合物，其中，所述Env多肽包括低聚gp 140。14. 如實施方式11所述的免疫原性組合物，其中，通過將實施方式1-10中任一 所述的組合物與Env交聯(lián)而將實施方式1-10中任一項所述的組合物復(fù)合。15. 如實施方式14所述的免疫原性組合物，其中，如實施方式1-13中任一項所 述的組合物與Eiw用固定劑交聯(lián)。16. 如實施方式15所述的免疫原性組合物，其中，所述固定劑包括甲醛。17. 如實施方式15所述的免疫原性組合物，其中，所述固定劑包括戊二醛 (gluteraldehyde)。18. 如實施方式11所述的免疫原性組合物，其中，如實施方式1-13中任一項所 述的組合物與Env多肽自發(fā)形成復(fù)合物。19. 如實施方式11所述的免疫原性組合物，其中，如實施方式1-13中任一項所 述的組合物包含CD4最小組件-Tat融合蛋白。20. 如實施方式11-19中任一項所述的免疫原性組合物，其還含有佐劑。21. —種多核苷酸，其編碼HIV tat多肽或其片段、CD4小蛋白和其它異源多肽 中的至少一種。22. 如實施方式21所述的多核苷酸，其還編碼Eiw多肽。23. —種細(xì)胞，其含有實施方式21或22所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸 操作性連接于與在所選細(xì)胞中表達(dá)相容的控制元件。24. 如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。25. 如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞選自BHK、 VERO、 HT1080、 293、 RD、 COS-7或CHO細(xì)胞。26. 如實施方式24所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。27. 如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。28. 如實施方式27所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是粉紋夜蛾(7Hctop/認(rèn)'am')(Tn5) 或Sf9昆蟲。29.如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。30.如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。31.如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。32.如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是抗原遞呈細(xì)胞。33.如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是選自以下的淋巴細(xì)胞巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、干細(xì)胞或其祖細(xì)胞。34. 如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是原代細(xì)胞。35. 如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是無限增殖細(xì)胞。36. 如實施方式23所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是腫瘤衍生的細(xì)胞。37. --種用于哺乳動物對象的基因遞送載體，其包含用于所述對象的合適的基因 遞送載體，其中所述載體包括如實施方式21或22所述的多核苷酸，且其中所述多 核苷酸操作性連接于與在所述對象中表達(dá)所述多核苷酸相容的控制元件。38. —種制備結(jié)合于HIVEiw功能性表位的抗體的方法，所述方法包括以下步驟 在允許在所述對象中產(chǎn)生抗體的條件下給予該對象如實施方式11-20中任一項所述 的免疫原性組合物。39. 如實施方式38所述的方法，還包括分離所述對象中產(chǎn)生的抗體的步驟。40. 如實施方式38或39所述的方法，其中，所述抗體是中和抗體。41. 如實施方式38或39所述的方法，其中，所述抗體引起ADCC活性。42. 如實施方式38-41中任一項所述的方法，其中，所述抗體是單克隆抗體。43. 如實施方式38-42中任一項所述的方法，其中，所述抗體是多克隆抗體。44. 一種制備含有與CD4蛋白復(fù)合的HIVEnv多肽序列的多肽的方法，所述方法 包括在產(chǎn)生所述多肽的條件下孵育如實施方式23-36中任一項所述的細(xì)胞。45. —種在對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予其量足以在所述對象 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的如實施方式11-20中任一項所述的組合物。46. —種對對象進(jìn)行DNA免疫的方法，所述方法包括在與在所述對象中表達(dá)所 述表達(dá)盒相容的條件下在所述對象中引入如實施方式37所述的基因遞送載體。47.如實施方式46所述的方法，其中，所述基因遞送載體是非病毒載體。48.如實施方式46所述的方法，其中，所述載體用微粒運(yùn)載體遞送。49.如實施方式48所述的方法，其中，所述載體包被在金或鎢微粒上，并使用基因槍將所述包被的顆粒遞送入所述對象。50.如實施方式46所述的方法，其中，所述載體包封在脂質(zhì)體制劑中。51.如實施方式46所述的方法，其中，所述載體是病毒載體。52.如實施方式51所述的方法，其中，所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。53.如實施方式51所述的方法，其中，所述病毒載體是慢病毒載體。54.如實施方式46所述的方法，其中，所述對象是哺乳動物。55.如實施方式54所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。56.-種在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括在允許所述多核苷酸表達(dá)并產(chǎn)生所述多肽的條件下用實施方式37所述的基因遞送載體轉(zhuǎn)染所述對象的細(xì)胞，從而引起對所述多肽的免疫應(yīng)答。57. 如實施方式56所述的方法，其中，所述載體是非病毒載體。58. 如實施方式57所述的方法，其中，所述載體用微粒運(yùn)載體遞送。59. 如實施方式58所述的方法，其中，所述載體包被在金或鴇微粒上，并使用基 因槍將所述包被的顆粒遞送入所述對象。60. 如實施方式59所述的方法，其中，所述載體包封在脂質(zhì)體制劑中。61. 如實施方式56所述的方法，其中，所述載體是病毒載體。62. 如實施方式61所述的方法，其中，所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。63. 如實施方式62所述的方法，其中，所述病毒載體是慢病毒載體。64. 如實施方式56所述的方法，其中，所述對象是哺乳動物。65. 如實施方式64所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。66. 如實施方式56所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)染離體進(jìn)行且所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被重新引入所述對象。67. 如實施方式56所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)染在所述對象體內(nèi)進(jìn)行。68. 如實施方式56所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答。69. 如實施方式56所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫應(yīng)答。70. 如實施方式56-69中任一項所述的方法，其中，所述基因遞送載體通過肌內(nèi)、 粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服或靜脈內(nèi)方式給予。71. —種在對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括(a) 在初免步驟中給予第一組合物，其中所述第一組合物包含如實施方式21或 22所述的多核苷酸；和(b) 以足以在所述對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量給予第二組合物作為增強(qiáng)劑，其中所 述第——:組合物包含如實施方式1-20中任一項所述的組合物。72. 如實施方式71所述的方法，其中，所述第一組合物或第二組合物還含有佐劑。73. 如實施方式71所述的方法，其中，所述第一組合物還含有編碼HIV Gag多 肽的序列。74. 如實施方式71所述的方法，其中，所述第二組合物還含有HIVGag多肽。 通過本文的揭示，本發(fā)明的這些和其它實施方式對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將會是很容易理解的。附圖簡述圖l描述了人CD4蛋白的基本氨基酸序列(GenBank登錄號NP—000607) (SEQ ID NO: 1)。圖2描述了 B亞型菌株HXB2的示例性H1V-1 Tat蛋白的基本氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。圖3描述了 SF162的另一種示例性HIV-1 Tat蛋白的基本氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。圖4是描述涉及env結(jié)合的CD4小蛋白的示意圖。所示CD4最小組件(深灰色) 對應(yīng)于SEQ ID NO: 1的第15-85號殘基，其通過Cysl6和Cys84間存在的二硫鍵獲 得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化。圖5是描述本文所述示例性CD4最小組件-Tat雜合分子的示意圖。所示第一 CD4 最小組件Tat雜合分子從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1-20， CD4 (SEQID NO: l)的殘基15-85(CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基30-86。所示第二雜合分子 從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1-30， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基40-86。所示第三雜合分子從N末端到C末端方 向包括Tat蛋白的殘基1-40， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)； 和Tat蛋白的殘基50-86。所示第四雜合分子從N末端到C末端方向包括Tat蛋白 的殘基1-50， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基 60-86。圖6描述了 4種示例性CD4最小組件-Tat雜合分子的氨基酸序列。這些雜合分子 的Tat組分衍生自HIV bm隔離群。所示雜合分子的第一氨基酸序列(SEQ ID NO: 4) 從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1-20， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基30-86。所示雜合分子的第二氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1-30， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘 基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基40-86。所示雜合分子的第三氨基酸序 列(SEQ ID NO: 6)從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1 -40， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基50-86。所示雜合分子的第四氨基 酸序列(SEQIDNO:7)從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1-50， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基60-86。圖7描述了 4種示例性CD4最小組件-Tat雜合分子的氨基酸序列。這些雜合分子 的Tat組分衍生自HIV SF 162隔離群。所示雜合分子的第一氨基酸序列(SEQ ID NO: 8)從N術(shù)端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1-20， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基30-86。所示雜合分子的第二氨基酸序列(SEQ ID NO: 9)從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1-30， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘 基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基40-86。所示雜合分子的第三氨基酸序 列(SEQ ID NO: 10)從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1-40， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基50-86。所示雜合分子的第四 氨基酸序列(SEQIDNO: ll)從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基1-50， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基60-86。圖8描述了來自HIVbru隔離群的Tat蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)與來自 HIV SF162隔離群的Tat蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)的比對。圖9描述了各種Tat-CD4融合構(gòu)建物的表達(dá)結(jié)果。
發(fā)明詳述除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白質(zhì)化學(xué)、病 毒免疫生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面的說明。參見例如T.E.Creighton的tf歪^廣，錄賴/〃分f特絲;；f7V^e/".' 5YrM"wes 她/ecw/flr /VopeWe51」(W.H.Freeman and Company, 1993); Nelson L.M.和Jerome H.K.的(f分f J^激方茲0/Z/r貴夠》^//F/Woco/s /" M"/zo^ /" Mo/ecw/wMW/c/"e;，第17巻，1999; Sambrook等，(f分f克摩,實驗皇手U fMo/ecw/or C7om'"gv J Z^6ora/or少(Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); F.M.Ausubel等的(f分f生激^觀,方茲JVCwr"W尸rotoco/5 /" Mo/ecw/ar歷o/og^ ， Greene Publishing Associates & Wiley Interscience New York;禾口 Lipkowitz禾卩Boyd 的祭遂》Wev/ews Comp"tat""fl/ C/zem/Wr^)，第1巻隱現(xiàn)刊(Wiley-VCH， New York, New York, 1999)。必須注意的是在本說明書和所附的權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式"一個"、 " -種"和"所述"包括所涉及對象的復(fù)數(shù)，除非該內(nèi)容清楚地另有說明。因此， 例如作為參考"一個多肽"包括兩個或多個多肽的混合物等。本文引用的所有出版物、專利和專利申請，不論在上文中或下文中，均以其 全文作為參考納入本文。定義在本發(fā)明的描述中使用了以下術(shù)語，這些術(shù)語將具有如下所述的定義。 術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的任意聚 合物。該術(shù)語包括肽、寡肽、二聚體、多聚體等。這些多肽可衍生自天然來源或 可為合成或重組產(chǎn)生的。該術(shù)語還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；?、 磷酸化等。本文所定義的多肽通常由20種天然氨基酸組成Ala(A)、 Arg(R)、 Asn (N)、 Asp(D)、 Cys(C)、 Gln(Q)、 Glu (E)、 Gly (G)、 His (H)、 lie (1)、 Leu (L)、 Lys (K)、 Met(M)、 Phe(F)、 Pro(P)、 Ser (S)、 Thr (T)、 Trp (W)、 Tyr (Y)和Val (V)，也可包括任何多種已知氨基酸類似物，不論是天然存在的或是合成的類似物，例如但 不限于高異亮氨酸、氮亮氨酸(asaleucine)、 2-(亞甲基環(huán)丙基)甘氨酸、S-甲基半 胱氨酸、S-(丙烯-l-基)半胱氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、高精氨酸、3-(3-羧基苯基)丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、含羞草氨酸、六氫吡啶羧酸、 4-甲基谷氨酸、刀豆氨酸、2,3-二氨基丙酸等。在下文中對可用于本發(fā)明的多肽 因子的其它例子進(jìn)行說明。多肽或蛋白質(zhì)的"幾何形狀"、"結(jié)構(gòu)"或"三級結(jié)構(gòu)"是指該蛋白質(zhì)的整體三維結(jié)構(gòu)。如本文所述，可通過例如以下的方法來確定所述幾何形狀晶體學(xué)研究、或者采用基于構(gòu)成一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的氨基酸間相互作用來預(yù)測幾何形 狀的各種程序或算法。"野生型"或"天然"多肽、多肽試劑或多肽藥物是指天然存在的多肽序列， 及其相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)。"分離的"或"純化的"蛋白質(zhì)或多肽是一種從整個有機(jī) 體中分離和分立出來的蛋白質(zhì)，在該有機(jī)體中所述蛋白質(zhì)本質(zhì)上是正常地結(jié)合 的。顯而易見，該術(shù)語表示了各種純度水平的蛋白質(zhì)。典型的含純化蛋白的組合物應(yīng)是所述組合物中全部蛋白質(zhì)中的至少約35%，優(yōu)選至少約40-50%，更優(yōu)選 至少約75-85%，最優(yōu)選至少約90%或更多是所討論的蛋白質(zhì)。術(shù)語"CD4小蛋白"、"CD4最小組件"、"CD4模擬物"和"小CD4蛋白"可互 換使用，表示與env相互反應(yīng)的任何多肽，優(yōu)選由此暴露出CD4中或鄰近CD4的功 能性表位(例如隱藏表位)和/或趨化因子受體或其它關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。因此，CD小蛋白 n丁小fCD4片段的全長，包括截短和缺失。此外，該術(shù)語包括了 CD4片段的功能和 結(jié)構(gòu)同源物，即暴露Env蛋白上的隱藏表位的多肽。將Maddon等，(1985) CW/42:93; 和Littman等，(1988) Ce〃 55:541)中的人CD4的氨基酸序列納入本文，并示于

圖1 中(SEQIDNO: 1)。此外，該術(shù)語包括CD4片段的功能和結(jié)構(gòu)同源物，即暴露Env 蛋卩]h的隱藏表位的模擬物和/或多肽。參見例如Martin等，(2003) 說'ofec/ . 21(1):71-76; Vita等，(1998)說'o/w me^ 47(1):93-100; Vita等，(1999)尸rac.淑/i^固96(23):1309卜13096。"骨架多肽"在文中包括以模擬天然CD4結(jié)合于erw時發(fā)生的構(gòu)象改變的整體 構(gòu)型將最小CD4分子呈遞給Env的多肽。采用這種方式，含CD4最小組件的雜合分 子與Env的結(jié)合被增強(qiáng)，同時減弱了不希望的對CD4非Erw結(jié)合區(qū)的免疫應(yīng)答。除 了提供CD4樣結(jié)構(gòu)(或骨架)，骨架多肽還可賦予本文所述的雜合分子其它功能。骨 架組分的其它功能包括但不限于免疫原性、佐劑性和/或免疫調(diào)節(jié)特性。通過用精 通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的并如文中所述的方法檢索結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫可鑒定與天然CD4
結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)。也可參見國際申請PCT/US05/022801。骨架多肽可以是同源的(含 有單一多肽的序列)或異源的(含有一種以上多肽的序列)。骨架多肽可含有毗連或非 毗連的、天然產(chǎn)生的或人工的序列，只要摻有它們的雜合分子在雜合分子結(jié)合erw 時能夠誘導(dǎo)env發(fā)生構(gòu)象改變，從而暴露用于誘導(dǎo)例如防止或抑制HIV感染的中和 抗體的功能性表位即可。"Tat多肽"是指衍生自病毒反式激活(Tat)蛋白，優(yōu)選衍生自HIV Tat的分子。 HIV Tat蛋白是長度通常在約86-101個殘基之間的小蛋白質(zhì)，已顯示其對HIV感染 和未感染的細(xì)胞有許多功效。參見，例如，Opi等，(2002)/所o/. CAe肌277(39): 35915-35919。 Tat蛋白包括兩個功能性區(qū)域， 一個是富含半胱氨酸(從約氨基酸20到氨基酸 31)的區(qū)域，另一個是堿性(從約氨基酸48到氨基酸47)區(qū)域。參見，例如，Jeang等， (1999) J.肌o/. C/zem. 274:28837-28840。對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員顯而易見的是， 來fl不同菌株的Tat蛋白在全長以及特定殘基上可能與SEQ ID NO:2和3所示的示 例性Tat序列不同。來自任何隔離群的任何Tat蛋白可以方便地與本文所示的以及本 領(lǐng)域"知的序列進(jìn)行比對，以確定相應(yīng)的殘基。文中，tat多肽包括人工造成或天然 產(chǎn)生的本文所述tat的刪除、平截和其它變體。可根據(jù)任何數(shù)量的特性，例如它們作 為骨架的能力，來選擇所述雜合分子的Tat多肽部分，從而以模擬CD4的整體構(gòu)型 的方式將CD4分子呈遞給Env，而無需考慮所用Tat多肽的長度。"Erw多肽"是指衍生自包膜蛋白，優(yōu)選衍生自HIVEiw的分子。HIV-1的包膜 蛋^是-1中約160 kd的糖蛋白(gp160)。在宿主細(xì)胞受到病毒感染期間，gpl60經(jīng)宿 k細(xì)胞蛋白酶切割形成gpl20和整合膜蛋白gp41。 gp41部分錨定于(和跨越)病毒體 的雙層膜，而gpl20片段則突出于周圍環(huán)境中。由于gpl20和gp41間沒有共價連接， 因此游離的gpl20可從病毒體表面釋放出來，并感染細(xì)胞。Env多肽還可包括gpl40 多肽。Env多肽可作為單體、二聚體或多聚體存在。"gpl20多肽"是指衍生自Erw多肽的gpl20區(qū)的分子。所述gpl20多肽優(yōu)選衍 生自HIVEnv。gp120的基本氨基酸序列具有約511個氨基酸，其多肽核心約為60,000 道爾頓。通過N連接糖基化對所述多肽進(jìn)行大幅的修飾，以將其表觀分子量提高到 120,000道爾頓。gpl20的氨基酸序列包含由5個超變區(qū)隔開的5個相對保守區(qū)。 HIV-1hxb—2(以下稱"HXB-2")株gpl20基本序列中的18個半胱氨酸殘基和gpl20序 列中約24個N連接糖基化位點(diǎn)中的13個在大多數(shù)gpl20序列(即便不是在所有g(shù)p120 序列)中的位置是相同的。超變區(qū)含有廣泛的氨基酸取代、插入和缺失。除了這一變
異，大多數(shù)(即便不是所有)gp120序列保持了病毒的結(jié)合于病毒受體CD4的能力。 "gpl20多肽"包括單個亞單元和/或多聚體。Env多肽(例如gpl20、 gpl40和gpl60)包括由形成P折疊的4個反向平行(3-鏈 (strand)(0-2、 P-3、 0-20和e-21)構(gòu)成的"橋接折疊"。由P鏈中的一對(0-2和f3 -3)推擠出兩個環(huán)V1禾口V2。相對于HXB-2， P-2折疊大致存在于第119號氨基酸 殘基(Cys)到第123號氨基酸殘基(Thr)，而|3-3在大致存在于第199號氨基酸殘基(Ser) 到第201號氨基酸殘基201(11e)。相對于HXB-2， "V1/V2區(qū)"大致存在于第126位 氨基酸殘基(Cys)到第196號氨基酸殘基(Cys)。(參見例如Wyatt等，(1995) 乂 Wra/. 69: 5723- 5733; Stamatatos等，(1998) / 72:7840-7845)。由第二對P鏈(P -20和e -21)推擠出的是"小環(huán)"結(jié)構(gòu)，在本文中也稱為"橋接折疊小環(huán)"。在HXB-2中，P -20從約第422號氨基酸殘基(Gln)延伸到第426號氨基酸殘基(Met)，而P -21則從約 第430號氨基酸殘基(Val)延伸到第435號氨基酸殘基(Tyr)。在變體SF162, Met-426 是Arg(R)殘基。相對于HXB-2，所述"小環(huán)"從約第427號氨基酸殘基(Trp)延伸到 第429號氨基酸殘基(Lys)?？上鄬τ谄渌凅w(例如HXB-2)，按例如WO 00/39303 巾所述，測定任何HIV變體的Env多肽gpl60氨基酸序列的比對。此外，本文所定義的"Env多肽"、"gpl20多肽"或"Tat多肽"不限于具有本文 所述的確切序列的多肽。事實上，HIV基因組處于一種持續(xù)變化的狀態(tài)中，并包含 在各種隔離群間具有相對較高程度的變異性的多個可變區(qū)。很容易明白這些術(shù)語包 括獲自任何已鑒別的HIV隔離群、新鑒別的隔離群以及這些隔離群的亞型的Etw(例 如gpl20)多肽和Tat多肽。除非另有說明，否則本文中參考HXB-2對結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行 描述。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過本文公開的內(nèi)容和現(xiàn)有技術(shù)，采用例如序列比對程 序(例如BLAST和本文中所述的其它程序)或?qū)Y(jié)構(gòu)特征進(jìn)行的鑒別和比對(例如本 文所述的可用于鑒別P折疊區(qū)的程序如"ALB")能確定其它HIV變體的相應(yīng)區(qū)域(例 如隔離群HIV Ib、 HIVSF2、 HIV-1SF162、 HIV-lSFm、 HIVLAV、 HIVLAI、 HIV畫、HIV-1CM235、 HIV-1US4，獲自不同亞型(例如亞型A-G和O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不同亞型(例 如HIV-2UC1和HIV-2uc2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV))。(參見例如以下文獻(xiàn)中對這些和 其它相關(guān)病毒的描述(f錄毒學(xué)》(T/ra/ogy入第三版(W.K.Joklik編，1988); (f^^,諒 泰學(xué)》(Fwm^mema/Wra/ogj」，第二版(B.N. Fields和D.M.Knipe編，1991); (f瘋毒學(xué)》 卩K/ra/og^，第三版(Fields， BN， DMKnipe， PMHowley編，1996， Lippincott-Raven， Philadelphia, PA)。修飾Env多肽的實際氨基酸序列可基于任何HIV變體。
另外，術(shù)語"Eiw多肽"(例如"gpl20多肽")和"Tat多肽"包括含有對天然序 列的其它修飾的蛋白質(zhì)，例如其它內(nèi)部缺失、插入、截短和取代。這些修飾可經(jīng)仔 細(xì)考慮，如通過定點(diǎn)誘變，或可為偶然的，例如通過自然發(fā)生的突變事件。因此， 例如如果要對將用于疫苗組合物中的Env多肽修飾時，所述修飾較佳不會導(dǎo)致免疫 活性(即，引發(fā)對所述多肽的抗體應(yīng)答的能力)喪失。類似地，如果要將所述多肽用于 診斷目的時，必須保留這一能力。"修飾的Eiw多肽"是一種已與含有本文所述CD4最小組件的融合蛋白復(fù)合的 Erw多肽(例如如上所述的gpl20)。該Env多肽可為單體或寡聚物。通常，復(fù)合Eiw(例 如gpl20)多肽使得CD4結(jié)合位點(diǎn)中或附近的表位暴露出來，并使得Env多肽得以正 確折疊(例如形成正確的幾何形狀)。此外，還可對VI和V2環(huán)區(qū)進(jìn)行修飾(例如截短)。 雖然本文中沒有窮舉所用可能的Vl/V2修飾，應(yīng)理解的是本發(fā)明中也包括了其它斷 裂修飾。術(shù)語"雜合分子"和"融合分子"是指其中具有通常為共價或非共價連接的兩種 或多種亞單位的分子。所述亞單位分子可為相同化學(xué)類型的分子，或可為不同化學(xué) 類型的分子。因此，如本文中所用，該術(shù)語是指包含CD4小蛋白和至少一種Tat多 肽的任何分子。融合分子包括但不限于融合多肽(例如，CD4多肽和非CD4多肽間 的融合體)以及融合核酸(例如，編碼融合多肽的核酸)。當(dāng)用于指代含有一個或多個 CD4最小組件的蛋ft質(zhì)時，術(shù)語"融合蛋白"或"融合多肽"是指其中所含CD4氨 基酸序列(例如Eiw結(jié)合序列)和一種或多種異源(非CD4)多肽是在單一蛋白中表達(dá)的 多肽。所述CD4多肽可在其一側(cè)或兩側(cè)側(cè)接所述Tat多肽。野生型HIVTat的氨基酸 序列示于圖2(SEQIDNO:2)。也可參見Ratner等，(1985)iVa&re 313:277-284。用于 構(gòu)建本文所述融合蛋白的Tat片段的非限制性例子包括從大約第1-86號氨基酸殘基 延伸的區(qū)域，編號根據(jù)SEQ IDNO:2確定。也可參見GenBank登錄號P04606。"結(jié)合"是指融合分子的一種能力，該能力是融合分子與Eiw多肽發(fā)生特異性相 互作用，從而由該相互作用導(dǎo)致所述Eiw多肽發(fā)生構(gòu)象變化，而該構(gòu)象變化則使得 可使中和抗體更易產(chǎn)生的Env表位暴露出來。正常情況下，融合蛋白能分泌入培養(yǎng)有表達(dá)該蛋白質(zhì)的生物體的生長培養(yǎng)基中。 然而，出于本發(fā)明的目的，也可在胞內(nèi)回收這些多肽?？刹捎枚喾N檢測技術(shù)(例如聚 丙烯酰胺凝膠電泳等)和免疫學(xué)技術(shù)(例如免疫印跡法和免疫沉淀分析法，如國際申請 WO 96/04301中所述)很容易地測定分泌入生長培養(yǎng)基的分泌物。在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)與所述細(xì)胞中的成分結(jié)合(例如與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或高爾基體結(jié)合)的多肽(例如gpl20或其它Env多肽)時，或所述多肽存在于可溶性細(xì)胞成分中時，認(rèn)為該 多肽是"胞內(nèi)"產(chǎn)生的。本發(fā)明的多肽還可分泌入生長培養(yǎng)基，只要細(xì)胞內(nèi)還保留 了足量的所述多肽，從而可采用本文所述的技術(shù)將其從細(xì)胞裂解物中純化出。"免疫原性分子"或"免疫原性組合物"是指包含至少一個表位的分子，從而使 得該分子能在被給予該蛋白的個體中引發(fā)免疫反應(yīng)，或者在診斷的情況下，該分子 能抗所討論的HIV的抗體反應(yīng)。"表位"是指特異性B細(xì)胞和/或T細(xì)胞能對其發(fā)生應(yīng)答的抗原位點(diǎn)，使得包含 這一表位的分子能引發(fā)免疫反應(yīng)或能與生物樣品中存在的HIV抗體反應(yīng)。該術(shù)語還 可與"抗原決定簇"或"抗原決定簇位點(diǎn)"互換使用。表位可包含以該表位獨(dú)有的 空間構(gòu)象存在的3個或更多個氨基酸。通常，表位由至少5個此類氨基酸構(gòu)成，更 常見的是由至少8-10此類氨基酸構(gòu)成。測定氨基酸空間構(gòu)象的方法是本領(lǐng)域已知的， 包括例如X射線晶體學(xué)和二維核磁共振。此外，可采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)很容易 地完成給定蛋白質(zhì)中表位的鑒別，例如通過采用疏水性研究和通過定點(diǎn)血清學(xué)研究。 也可參見，Geysen等，Ato/. ^cflc/. (1984) 81:3998-4002(快速合成肽以測定給定抗原中免疫原性表位的常規(guī)方法)；美國專利4,708,871(用于鑒別和化學(xué)合 成抗原表位的方法)；以及Geysen等，Mo/ecw/w細(xì)m朋o/ogy (1986) 23:709-715 (鑒別 對給定抗體具有高親和力的肽的技術(shù))。可在顯示一種抗體阻斷另一種抗體與耙抗原 結(jié)合的簡單的免疫分析中鑒別識別相同表位的抗體。"隱藏表位"通常是指僅在蛋白 質(zhì)的某些構(gòu)象中暴露出來的表位。"功能性表位"是指可誘導(dǎo)防止或限制HIV感染的抗體產(chǎn)生的表位。在一個具體 實施方式中，所述抗體是中和抗體。在另一實施方式中，所述抗體可例如引發(fā)ADCC 應(yīng)答。本文所用的"免疫學(xué)應(yīng)答"或"免疫應(yīng)答"可包括當(dāng)疫苗組合物中存在Eiw (例 如gpl20)多肽時，在對象中發(fā)生對該多肽產(chǎn)生的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。在免疫應(yīng) 答中產(chǎn)生的抗體還可中和傳染性和/或介導(dǎo)抗體-補(bǔ)體或抗體依賴性細(xì)胞毒作用，從而 為受免疫的宿主提供保護(hù)?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析法測定免疫學(xué)反應(yīng)性， 例如通過競爭分析法。本文所用術(shù)語"抗體"包括獲自多克隆和單克隆制劑以及下述物質(zhì)的抗體(i)雜 交(嵌合)抗體分子(參見例如，Winter等，(1991) 7Va&" 349:293-299;和美國專利 4,816,567); (ii)F(ab，)2和F(ab)片段；(iii) Fv分子(非共價雜二聚體，參見例如，Inbar 等，(1972)尸rac Ato/.」cad t/W 69:2659-2662;禾BEhrlich等，(1980) S/oc/zem 19:4091-4096); (iv)單鏈Fv分子(sFv)(參見例如，Huston等，(1988)尸亂"SL4 85:5879-5883); (v) 二聚和三聚抗體片段構(gòu)建物；(vi)人源化抗體分子(參 見例如，Riechm肌n等，(1988) Atowe 332:323-327; Verhoeyan等，(1988) Sc/e"ce 239: 1534-1536;和公開于1994年9月21日的英國專利申請GB 2,276,169); (vii)小抗體 或小體(minibody)(即在其C端包含寡聚區(qū)的sFv多肽鏈，所述寡聚區(qū)通過絞鏈區(qū)與 所述sFv分隔；參見例如Pack等，(1992) 5/ocfem 31:1579-1584; Cumber等，(1992) J./mm朋o/ogvl49B:120-126);以及(vii)獲自這些分子的任何功能性片段，其中該片 段保留了對親本抗體分子特異性結(jié)合的特性。因此，術(shù)語"抗體"是指含有至少一個抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽或多肽組。"抗原結(jié) 合位點(diǎn)"由 -個或多個抗體分子的可變區(qū)折疊形成，形成具內(nèi)表面形狀和電荷分布 與抗原表位的特性互補(bǔ)的三維結(jié)合位點(diǎn)，其使得特異性結(jié)合得以發(fā)生以形成抗體-抗 原復(fù)合物。可由重鏈和/或輕鏈結(jié)構(gòu)域(分別為VH和VL)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，其形成 了對抗原結(jié)合有作用的超變環(huán)。術(shù)語"抗體"包括但不限于多克隆抗體、單克隆 抗體、嵌合抗體、改變的抗體、單價抗體、Fab蛋白和單結(jié)構(gòu)域抗體。在很多情況下， 抗體與抗原結(jié)合的現(xiàn)象與其它配體/抗配體結(jié)合是等價的。如果需要得到多克隆抗體，用帶有HCV表位的免疫原性多肽免疫所選哺乳動物 (例如小鼠、兔、山羊、馬等)。收集獲自受該免疫動物的血清，并根據(jù)已知方法進(jìn)行 處理。如果含有針對HCV表位的多克隆抗體的血清包含對其它抗原的抗體，可通過 免疫親和色譜純化所述多克隆抗體。產(chǎn)生和處理多克隆抗血清的技術(shù)在本領(lǐng)域中是 已知的，參見例如，Mayer和Walker編(1987) (f潘應(yīng)^7分f ^f激學(xué)^游免度眾學(xué)方法》本領(lǐng)域技術(shù)人員還可很容易的生產(chǎn)抗HCV表位的單克隆抗體。通過雜交瘤制備 單克隆抗體的常規(guī)方法是熟知的?？赏ㄟ^細(xì)胞融合以及其它技術(shù)例如用癌基因DNA 直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞或用埃-巴二氏病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生無限增殖抗體產(chǎn)生細(xì)胞系。 參見例如M. Schreier等，(1980) (f^^)^^^術(shù)》f7/j6nVfoma recAm々"e"; Hammerling 等，(1981)， (f卓克蘑貧沐/〃 r潘應(yīng)染文艨》fMo"oc/o"a/JW T-Ce〃 /fy6n'cfomcw」；Kennett等，(1980) (f卓J^虔貧沐》fMowc/o"fl/^""6oofe^);還可參見， 美國專利4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 和4,493,890?？筛鶕?jù)各種特性即同種型、表位親和力等對所產(chǎn)生的抗HCV表位的單 克隆抗體組進(jìn)行篩選。如本文所用"單結(jié)構(gòu)域抗體"(dAb)是包含與指定抗原特異性 結(jié)合的HL結(jié)構(gòu)域的抗體。dAb不含VL結(jié)構(gòu)域，但可含有已知各種抗體中存在的其 它抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如k和A區(qū)。制備dab的方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見例 如，Ward等，Atowe 341: 544 (1989)?？贵w也可包含VH和VL結(jié)構(gòu)域，以及其它已知的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些類型的 抗體和用于其制備的方法的例子在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如美國專利4,816,467， 該專利納入本文作為參考)，并包括以下抗體和方法。例如，"脊椎動物抗體"是指脊 椎動物的成四聚體形式的抗體或其聚集體，其包含通常聚集為"Y"形且可在鏈間具 有或不具有共價連接的輕鏈和重鏈。在脊椎動物抗體中，所述鏈的氨基酸序列與脊 椎動物中產(chǎn)生的那些抗體序列是同源的，不論是原位或體外產(chǎn)生(例如，在雜交瘤中 產(chǎn)生)。脊椎動物抗體包括例如純化的多克隆抗體和單克隆抗體，它們的制備方法 在下文中有所描述。"雜合抗體"是其中的鏈分別與哺乳動物鏈同源并代表了它們的新組合的抗體， 從而使得兩種不同的抗原通過四聚體或聚合物得以沉淀。在雜合抗體中， 一對重鏈 和輕鏈與抗第一抗原而產(chǎn)生的抗體中存在的重鏈和輕鏈?zhǔn)峭吹模诙︽渼t與 抗第二抗體而產(chǎn)生的抗體中存在的重鏈和輕鏈?zhǔn)峭吹?。這就產(chǎn)生了 "二價"特性， 即同時結(jié)合兩種抗原的能力。還可用下文所述的嵌合鏈來形成這些雜交體。"嵌合抗體"是指其中的重鏈和/或輕鏈?zhǔn)侨诤系鞍椎目贵w。通常，該鏈氨基酸序 列的一部分與衍生自具體物種或具體種類的抗體中對應(yīng)的序列是同源的，而鏈的其 余片段則與衍生自另一物種和/或種類中的序列同源。通常，輕鏈和重鏈的可變區(qū)模 擬衍生自脊椎動物某一物種的可變區(qū)或抗體，而恒定部分則與衍生自另一脊椎動物 物種的抗體中的序列同源。然而，該定義并不限于這一具體例子。還包括的是其中 重鏈和輕鏈中的一條或兩條由模擬不同來源的抗體中的序列的序列組合構(gòu)成，不論 這些來源是來自不同種類或不同起源物種，也不論該融合點(diǎn)是否在可變區(qū)/恒定區(qū)界 限。因此，可能產(chǎn)生其中的恒定區(qū)和可變區(qū)都不模擬已知抗體序列的抗體。因而使 得例如構(gòu)建下述的抗體成為可能其可變區(qū)對特定抗原具有較高特異性親和力的抗 體，或其恒定區(qū)可引發(fā)增強(qiáng)的補(bǔ)體結(jié)合的抗體，或使得具體恒定區(qū)具有的特性具有其它改進(jìn)的抗體。另-一例子是"改變的抗體"，它是指其中在脊椎動物抗體中天然存在的氨基酸序
列已被改變的抗體。采用重組DNA技術(shù)，可對抗體進(jìn)行重新設(shè)計以獲得所需的特性。 可發(fā)生的變化是很多的，從改變一個或多個氨基酸到整個區(qū)域(例如恒定區(qū))的重新設(shè) 計。恒定區(qū)中的改變通常是為了獲得所需的細(xì)胞過程特性，例如改變補(bǔ)體結(jié)合、與 膜相互作用以及其它效應(yīng)子功能?？蓪勺儏^(qū)進(jìn)行改變以改變抗原結(jié)合特性?？贵w 也可經(jīng)工程化改造以有助于將分子或物質(zhì)特異性遞送到特異性的細(xì)胞或組織位點(diǎn)。 可通過分子生物學(xué)中已知的技術(shù)進(jìn)行所需的改變，例如通過重組技術(shù)、定點(diǎn)誘變等。另一例子是"單價抗體"，它是指含有結(jié)合于第二重鏈的Fc(即，干)區(qū)的重鏈/輕 鏈二聚體的聚合物。這類抗體可逃避抗原性調(diào)整。參見例如Glennie等，A^&w 295: 712 (1982)?？贵w定義中還包括抗體的"Fab"片段。"Fab"區(qū)是指重鏈和輕鏈的那 些與含有重鏈和輕鏈分枝部分的序列大致相同或類似的部分，已顯示其可免疫結(jié)合 F特定的抗原，但缺乏效應(yīng)子Fc部分。"Fab"包括一條重鏈和輕鏈(通常稱為Fab') 的聚合物，以及含有2H和2L鏈(稱為F(ab)2)的四聚體，它們能夠選擇性地與指定的 抗原或抗原家族反應(yīng)。可將Fab抗體劃分為上述的亞型類似物，即"脊椎動物Fab"、 "雜交Fab"、"嵌合Fab"和"改變的Fab"。產(chǎn)生抗體Fab片段的方法在本領(lǐng)域中是 已知的，這些方法包括例如蛋白質(zhì)水解和通過重組技術(shù)的合成。"抗原-抗體復(fù)合物"是指由特異性結(jié)合于抗原表位的抗體形成的復(fù)合物。測定氨基酸序列"相似性"的技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的。 一般而言，"相似性" 是指對兩條或多條多肽的適當(dāng)位置進(jìn)行精確的氨基酸與氨基酸的比較，所述的適當(dāng) 位置中氨基酸是相同的或具有類似的化學(xué)和/或物理性質(zhì)，例如電荷或疏水性。然后 可測定比對多肽序列間的所稱的"百分比相似性"。用于測定核酸和氨基酸序列的相 同性的技術(shù)在本領(lǐng)域中也是熟知的，包括測定基因的mRNA的核苷酸序列(通常通過 cDNA中間體)以及測定由其編碼的氨基酸序列，并將此與第二條氨基酸序列相比較。 一般而言，"相同性"是指兩條多核苷酸或多肽序列各自精確的核苷酸與核苷酸或氨 基酸與氨基酸對應(yīng)關(guān)系?？赏ㄟ^測定兩條或多條多核苷酸序列的"百分比相同性"來對它們進(jìn)行比較。同 樣，可通過測定兩條或多條氨基酸序列的"百分比相同性"來對它們進(jìn)行比較。兩 條序列間的百分比相同性(不論是核酸或肽序列)通常描述為兩條比對序列間的精確 配合數(shù)除以較短序列的長度，然后乘以100?？赏ㄟ^Smith和Waterman, (f應(yīng)^教學(xué) 遂應(yīng)^ f^c/vfl"c^ &y^/;//et/A^^emar/ra」2:482-489 (1981)中的局部同源性算法來提供 對核酸序列的大致比對。可使用Dayhoff的(f蛋^^^^f/7潛稱房譜》f^/w 0/尸rato/" Se《wem:es朋d浙i/c^"eXM.0. Dayhoff編,5增干ll 3:353-358， National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.， USA)開發(fā)的評分矩陣，并通過Gribskov (M^/.」c^ 14(6):6745-6763 (1986))所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將該算法延伸到用于肽序 列。用于核酸和肽序列的該算法的執(zhí)行方法由Genetics Computer Group (Madison, WI)在它們的BestFit應(yīng)用程序中提供。用于該方法的默認(rèn)參數(shù)在Wisconsin序列分析 打包程序指南第8版(1995)中有所描述(可購自Genetics Computer Group, Madison, WI)。用于計算序列間百分比相同性或相似性的其它同樣使用的程序在本領(lǐng)域中是廣 為所知的。例如，可采用Smith和Waterman的同源性算法，以默認(rèn)評分表和六核苷酸位點(diǎn) 的缺口罰分來測定具體核苷酸序列與參比序列的百分比相同性。在本發(fā)明上下文中 建立百分比相同性的另一種方法是使用MPSRCH程序包，其版權(quán)屬于愛丁堡大學(xué) (University of Edinburgh), 由 John F. Collins禾口 Shane S. Sturrok開發(fā)，并由 IntelliGenetics ， Inc.(Mountain View ， CA)經(jīng)銷。在這套程序包中，可采用 Smith-Waterman算法，其中將默認(rèn)參數(shù)用于評分表(例如，缺口開放罰分為12，缺口 延伸罰分為l， 一個缺口為6)。從產(chǎn)生的數(shù)據(jù)中，"匹配"值反映了 "序列相同性"。 用于計算序列間百分比相同性或相似性的其它適宜程序在本領(lǐng)域中是廣為所知的， 例如比對程序BLAST,其也可使用默認(rèn)參數(shù)。例如，可在BLASTN禾口 BLASTP中使用以下的默認(rèn)參數(shù)遺傳密碼=標(biāo)準(zhǔn)；過濾=無；鏈=兩條；截止=60;期望=10;矩陣=BLOSUM62;說明=50個序列；分類依據(jù)=HIGH SCORE;數(shù)據(jù) 庫=非冗長，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS翻譯物+ Swiss蛋白 + Spupdate + PIR ?？稍谙率鲆蛱鼐W(wǎng)址上找到這些程序的詳細(xì)描述 http:〃www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能很容易地確定適當(dāng)?shù)乃阉鲄?shù)以用于上述程序中的給定序 列。例如，可根據(jù)所討論序列的大小改變搜索參數(shù)。因此，例如本發(fā)明的代表性實 施方式中包括具有X個鄰接核苷酸的分離的多核苷酸，其中(i)所述X個鄰接核苷酸 與衍生自本文所述任一序列的Y個鄰接核苷酸具有至少約50%的相同性，(ii) X等于 Y;以及(iii) X大于或等于6個、上限為5000個核苷酸，優(yōu)選大于或等于8個核苷 酸到5000個核苷酸，更優(yōu)選10-12個氨基酸、上限為5000個核苷酸，更優(yōu)選15-20 個核苷酸、上限為本文所述的全長序列中存在的核苷酸數(shù)量(例如參見序列表和權(quán)利 要求書)，包括所有落于上述范圍內(nèi)的整數(shù)值。
通常而言，當(dāng)把本發(fā)明的序列用作查詢序列時，本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸能或 可包括與本文所述的分子(例如與本發(fā)明要求保護(hù)的序列或其它序列)具有約80%-100%，大于80-85%，優(yōu)選大于90-92%，更優(yōu)選大于95%，最優(yōu)選大于98%的 序列(包括落于這些所述范圍內(nèi)的整數(shù)值)相同性的相關(guān)序列。也存在測定特定多肽形成某種結(jié)構(gòu)(例如0折疊)的可能性的計算機(jī)程序。本文中 所述的一個此類程序是用于蛋白質(zhì)和多肽二級結(jié)構(gòu)計算和預(yù)測的"ALB"程序。此 外，可從基本氨基酸序列預(yù)測出蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，例如采用蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和比對 涉及晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列(例如采用可購自Chemical Computing Group Inc., Montreal, P.Q.， Canada的分子操作環(huán)境(MOE)程序)。在以下文獻(xiàn)中描述了預(yù)測二級 結(jié)構(gòu)的其它方法，例如Gamier等，(1996) Me^oA 266:540-553; Geourjon等，(1995)Com/n^. ^ p//c. 5/(wc/. 11:681-684; Levin (1997)尸ra,e/"10:771-776; 以及Rost等，(1993)Tkfo/ec.所o/. 232:584-599。還可通過如下方法測定同源性在可使同源區(qū)之間形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下，使 多核苷酸雜交，然后用一種或多種單鏈特異性核酸酶消化，測定消化片段的大小。當(dāng)通過上述的方法測定出兩條DNA或兩條多肽序列對于確定的分子長度具有至少 約80%-85%，優(yōu)選至少約90%，最優(yōu)至少約95%-98%的序列相同性時，則這兩條 DNA或兩條多肽序列是"基本上同源的"。如本文所用，基本上同源還指對特定的 DNA或多肽序列具有完全相同性的序列。可在例如對具體體系確定的嚴(yán)格條件下， 在Southern雜交實驗中鑒別基本上同源的DNA序列。確定適宜的雜交條件是本領(lǐng)域 中的技術(shù)。參見例如Sambrook等，同上；(fZ)A^克虔j) fZWJ C/om'"gj，同上；tf樣 麼染文》(We"c/e/c//盧/cfcfl"o"」，同上。"編碼序列"或"編碼"所選蛋白質(zhì)的序列是置于適宜的調(diào)控序列的控制下時， 可在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(在DNA的情況下)并翻譯(在mRNA的情況下)成多肽的核酸序 列。所述編碼序列邊界是通過位于5'(氨基)端的起始密碼子和位于3'(羧基)端的翻譯 終止密碼子確定的。編碼序列可包括但不限于病毒核苷酸序列的cDNA，以及合成 和半合成的DNA序列和包含堿基類似物的序列。轉(zhuǎn)錄終止序列可位于所述編碼序列 的3'端。"控制元件"是啟動子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄終止序 列、上游調(diào)控結(jié)構(gòu)域、增強(qiáng)子等的總稱，其在總體上提供用于宿主細(xì)胞中編碼序列 的轉(zhuǎn)錄和翻譯。所有這些控制元件并不是都總需存在，只要所需基因能轉(zhuǎn)錄和翻譯 即可。當(dāng)RNA聚合酶結(jié)合啟動子序列并將所述編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，后者隨后被翻 譯為由該編碼序列編碼的多肽時，控制元件在細(xì)胞中"引導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄"。"操作性連接"是指一種元件的排列方式，其中對所述元件進(jìn)行配置以執(zhí)行它們 的常規(guī)功能。因此，操作性連接于編碼序列的控制元件在RNA聚合酶的存在下能影 響該編碼序列的表達(dá)。所述控制元件無需與該編碼序列鄰接，只要控制元件起到指 導(dǎo)編碼序列表達(dá)的功能即可。因此，例如插入的未翻譯但已轉(zhuǎn)錄的序列可存在于例 如啟動子序列和編碼序列之間，而該啟動子序列仍可被認(rèn)為"操作性連接"于該編 碼序列。"重組體"在本文中用于描述核酸分子時是指基因組、cDNA、半合成或合成來 源的多核苷酸，按照其來源或生產(chǎn)方法分為(l)不與其天然結(jié)合的多核苷酸的全部 或部分結(jié)合；和/或(2)與其天然連接以外的多核苷酸連接。術(shù)語"重組體"用于描述蛋白質(zhì)或多肽時是指由重組多核苷酸表達(dá)而產(chǎn)生的多肽。"重組宿主細(xì)胞"、"宿主細(xì) 胞"、"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"、"細(xì)胞培養(yǎng)物"及用于原核微生物或真核細(xì)胞系培養(yǎng)物作 為單細(xì)胞單元的其它此類術(shù)語可互換使用，是指能夠或已經(jīng)用作重組載體或其它轉(zhuǎn)化DNA的受體的細(xì)胞，也包括已被轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞的后代。應(yīng)理解，由于隨機(jī)突變 或刻意進(jìn)行的突變的原因，單個親本細(xì)胞的后代在形態(tài)學(xué)上或基因組中可不必完全 相同，或可不必與原始親本的總DNA完全互補(bǔ)。通過有關(guān)特性(例如編碼所需肽的 核苷酸序列的存在)辨別出的與親本足夠類似的親本細(xì)胞的后代包含在本定義所預(yù)期 的后代中，并由上述的定義所覆蓋。"脊椎動物對象"是指脊索動物亞門中的任何成員，包括但不限于人和其它靈 長類，包括非人靈長類，例如黑猩猩和其它猿和猴的種類；畜牧動物，例如牛、綿 羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物，例如狗和貓；實驗動物包括嚙齒類，例如小鼠、 大鼠和豚鼠；鳥類，包括家養(yǎng)鳥類、野生鳥類和獵鳥，例如雞、火雞和其它鶇雞類 鳥類、鴨、鵝等。該術(shù)語不限定具體的年齡。因此，同時覆蓋了成體和新生個體。如本文所述"生物樣品"是指從個體中分離的組織或液體樣品，包括但不限于例 如血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髓、膽汁、穿刺液、淋巴液、皮膚樣品、皮 膚外部分泌物、呼吸道、腸內(nèi)和生殖泌尿道樣品、獲自胃上皮和胃粘膜的樣品、淚 液、唾液、乳汁、血細(xì)胞、器官、活組織，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)成分，包括但不限于 由培養(yǎng)基中細(xì)胞和組織的生長得到的條件培養(yǎng)基質(zhì)，例如重組細(xì)胞和細(xì)胞組分。
術(shù)語"標(biāo)記"和"可檢測標(biāo)記"是指能被檢測的分子，包括但不限于放射性同 位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶、酶的底物、酶的輔因子、酶抑制劑、發(fā)色團(tuán)、染 料、金屬離子、金屬溶膠、配體(例如生物素或半抗原)等。術(shù)語"熒光劑"是指在可 檢測范圍中可顯示熒光的物質(zhì)或其部分?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記的具體例子包括但不限于熒光素、羅丹明、丹酰、傘形花內(nèi)酯、得克薩斯紅、魯米諾、吖啶(acradimum) 酯、NADPH、 P-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶和脲酶。概述本發(fā)明涉及包含CD4蛋白和/或CD4模擬物及Tat蛋白的融合分子、這些分子與 HIVEnv多肽的復(fù)合物，以及制備和使用這些分子和復(fù)合物的方法。在不受限于具體 的理論的條件下，由于CD4結(jié)合位點(diǎn)(和/或CCR結(jié)合位點(diǎn))埋藏在Env的外部結(jié)構(gòu) 域、內(nèi)部結(jié)構(gòu)域和Vl/V2結(jié)構(gòu)域之間，因此產(chǎn)生針對Env的免疫應(yīng)答似乎曾經(jīng)很困 難。因此，雖然V1/V2結(jié)構(gòu)域的缺失可使病毒更易被針對CD4位點(diǎn)的單克隆抗體中 和，但是與CD4結(jié)合前的Env的構(gòu)象仍可阻止抗體應(yīng)答。此外，當(dāng)將全長或接近全 長的CD4(例如可溶性CD4或sCD4)用于誘導(dǎo)Env中的構(gòu)象變化時，免疫系統(tǒng)還建立 了針對CD4非結(jié)合部分的應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了含有與Tat蛋白組合的CD4的片段或模擬物的分子。所述 CD4組分通常不包括對其產(chǎn)生CD4免疫應(yīng)答的區(qū)域但仍包括參與結(jié)合Eiw的序列。 因此，所述融合分子結(jié)合于Env但不引起不希望的免疫應(yīng)答，例如對全長CD4的免 疫應(yīng)答。此外，這些融合蛋白在Env中引起了暴露出CD4結(jié)合位點(diǎn)中或附近的一個 或多個表位(例如隱藏表位)的構(gòu)象變化，然后使得針對Env的免疫應(yīng)答(例如中和抗 體應(yīng)答)得以發(fā)生，而不發(fā)生對CD4的不為所需的免疫應(yīng)答?？蓪⒈疚乃龅亩喾N形式的不同實施方式結(jié)合起來。CD4分子在本發(fā)明的實踐中，雜合分子包含CD4分子。該雜合分子可與Env多肽復(fù)合以 改變Eiw多肽的構(gòu)象并暴露引發(fā)中和抗體的表位。CD4的氨基酸序列是已知的(圖1)，對CD4的結(jié)構(gòu)研究顯示該分子由4個胞 外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(三個結(jié)構(gòu)域含有二硫鍵連接的環(huán))組成。也已知gpl20與 其受體(CD4)的結(jié)合誘導(dǎo)了 Env蛋白中的構(gòu)象變化。然而，對于與gpl20的相互
作用而言，只有CD4的結(jié)構(gòu)域l(Dl)才是決定性的(Arthos等，(1989) CW/57(3): 469-481; Truneh等，(1991) JS/o/C7zem 266(9):5942-5948)。結(jié)合CD4三維結(jié)構(gòu)信息的突變分析、抗體競爭實驗已顯示與Dl中免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)同源的區(qū)域在結(jié)合gp 120中起到重要的作用(Ryu等，(1994)2(1): 59-74， Sullivan等，(1998) J閃W)/ 72(8):6332-6338)。事實上，gpl20:CD4復(fù)合物 的結(jié)構(gòu)分析證實了 CD4的CDR2樣環(huán)在CD4-gpl20相互作用中是很關(guān)鍵的(Choe & Sodroski (1992) J J，,>/mw騰De//c 5(2):204-210， Gizachew等，(1998)腸c/ 醒勿37(30): 10616-10625)。對與CD4和中和單克隆抗體17b的Fab部分復(fù)合的gpl20的結(jié)晶學(xué)結(jié)構(gòu)分析 (Kwong等，(1998) tV"化"393:648-659)表明CD4結(jié)構(gòu)域Dl的大表面(742 A2)與 即120上大的凹陷(800 A2)相結(jié)合。CD4界面由22個殘基組成，通過混合的疏水 性、靜電、氫鍵相互作用對結(jié)合gpl20發(fā)揮作用。該界面的大尺寸和復(fù)雜性使得 在小分子中再現(xiàn)該功能性表位成為一種挑戰(zhàn)，并解釋了開發(fā)gpl20-CD4相互作用 的小分子抑制劑的難度。Vita等，(1998) S/o，/;/we^ 47: 93-100。然而，盡管在 gpl20-CD4相互作用表面上存在著眾多的殘基，對激素-受體系統(tǒng)的研究顯示蛋白 質(zhì)-蛋白質(zhì)界面處的結(jié)合能可能僅由少數(shù)殘基主導(dǎo)。Clackson和Wells (1995) Sc/e"ce 267(5196):383腳386。gpl20結(jié)合于CD4后，似乎也暴露出了獨(dú)特的中和表位，例如由單克隆抗體 CG10識別的表位(Gershoni等，(1993) F證6 / 7(12):1185-1 187)。事實上，雖然 獲自實驗株的單體gpl20蛋白引發(fā)初級隔離群中和抗體的免疫原性很差(Mascola 等，(1996)/173:340-348)，但是似乎可識別暴露在Env表面的某些表 位的單克隆抗體一旦結(jié)合于其CD4受體，也已顯示出可中和不同初級隔離群。 參見例如命名為17b的抗體(Thali等，(1993) J K>o/ 67(7):3978-3988)。然而，采 用與受體/復(fù)合受體復(fù)合的Env進(jìn)行的交叉分化(cross-clade)初級隔離群中和抗體 應(yīng)答已對gp41融合結(jié)構(gòu)域的免疫原性起到作用。Lacasse等，(1999) Sc/wce 283: 357-362。此外，對評估gpl20-CD4復(fù)合物作為用于誘導(dǎo)高親合力和初級隔離群中和抗 體的潛在疫苗候選物的嘗試已受到了以下關(guān)切的阻礙即可能會針對CD4自身 產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并由此產(chǎn)生自身免疫和安全性問題。(D'Souza等，(1997)J/w/e" 流175:1056-1062， DeVico等，(1995) PW柳21 1(2):583-588)。因此，本發(fā)明優(yōu)選采用小于全長的CD4蛋白或CD4模擬物。所述CD4分子與 HIV Tat蛋白組合形成不誘導(dǎo)對CD4的免疫應(yīng)答的雜合體Env-結(jié)合分子。該雜合分 子優(yōu)選通過CD4最小組件結(jié)合于Env蛋白或與Erw蛋白復(fù)合。在某些實施方式中， 該融合蛋白的所述CD4最小組件部分包含SEQIDNO: 1的第15-85號氨基酸殘基或 與CD4最小組件具有結(jié)構(gòu)相似性的分子(例如在Martin等，(2003) Ato. 21(1): 71-76中所述的CD4模擬物)。可根據(jù)本文所述測定結(jié)構(gòu)相似性。如圖4所示，包含 SEQ ID NO: 1第15-85號氨基酸殘基的CD4小蛋白幾乎完全埋藏在gpl20結(jié)合口袋 中。此外，該CD最小組件是通過存在于Cysl6和Cys84間的二硫橋來穩(wěn)定的。通過本說明書，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能很容易地測定與本文所述CD4最小組件具 有結(jié)構(gòu)和/或氨基酸相似性的氨基酸序列。此外，可對這些同系物(結(jié)構(gòu)或序列)中的 任何一種進(jìn)行進(jìn)一步的修飾。該修飾可影響結(jié)構(gòu)和/或功能。例如，可對小蛋白進(jìn)行 氨基酸取代、添加和/或缺失，從而保護(hù)或增強(qiáng)gpl20結(jié)合結(jié)構(gòu)?？苫瘜W(xué)合成用于本發(fā)明實施中的任一 CD4分子。優(yōu)選i也，該合成是在允許和促 進(jìn)該小蛋白有效折疊為結(jié)合gpl20和暴露CD4結(jié)合位點(diǎn)中或附近的表位的條件下進(jìn) 行的。例如，可在產(chǎn)生類似于CD4的圓二色性的條件下合成該小蛋白，而不考慮天 然序列中的突變。Tat多肽本文所述雜合分子的Tat多肽組分可衍生自任何已知的HIV隔離群、新鑒別的隔 離群以及這些隔離群的亞型。本文中參考SF162或HXB-2對結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行描述。本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過本文公開的內(nèi)容和現(xiàn)有技術(shù)，采用例如序列比對程序(例如 BLAST和本文中所述的其它程序)或?qū)Y(jié)構(gòu)特征進(jìn)行的鑒別和比對(例如本文所述的 可用于鑒別P折疊區(qū)的程序如"ALB")能確定其它HIV變體的相應(yīng)區(qū)域(例如隔離 群HIV肌、HIV-1SF162、 HIV-1SFI7。、 HIVLAV、 HIVLAI、 HIV顧、HIV-1CM235、 HIV-1US4， 獲自不同亞型(例如亞型A-G禾P O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不同亞型(例如 HIV-2uc,和HIV-2uc2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV))。(參見例如以下文獻(xiàn)中對這些和其 它相關(guān)病毒的描述(f瘋毒學(xué)》Wra/ogKJ，第三版(W. K. Joklik編，1988); if基欲錄 毒學(xué)》fF,t/awe"to/Wra/ogy」，第二版(B. N. Fields和D. M. Knipe編，1991); f瘋毒 學(xué)》(T/ra/ogy」，第三版(Fields， BN， DM Knipe， PM Howley編，1996， Lippincott-Raven， Philadelphia, PA)。 Tat多肽的實際氨基酸序列可基于任何HIV變體。
因此，可根據(jù)它們作為骨架的能力在內(nèi)的許多特性選擇所述雜合分子的Tat多肽 部分，從而以模擬CD4的整體構(gòu)型的方式將CD4分子呈遞給Eiw。采用這種方式， 含CD4最小組件的雜合分子與Erw的結(jié)合被增強(qiáng)，同時減弱了不希望的對CD4非 Erw結(jié)合區(qū)的免疫應(yīng)答。通過用精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的并如文中所述的方法檢 索結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫可鑒定與野生型CD4結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)。也可參見2004年6月提交的 美國臨時申請序列號60/578,151。Tat組分除了能提供CD4樣結(jié)構(gòu)(或骨架)外，Tat多肽可能還賦予本文所述的雜合 分子其它功能。Tat組分的其它功能包括但不限于免疫原性、佐劑性和/或免疫調(diào)節(jié) 特性。已知HIV-1 Tat能誘導(dǎo)強(qiáng)體液和細(xì)胞應(yīng)答，且還知道用Tat疫苗免疫動物能抵 抗病原性SHIV感染。參見，例如，Agwale等，(2002)尸rac. A^/.」cad WSvl 99(15):10037-10041; Opi等，(2002) 乂 C/zew. 277(39):35915-35919。因此，在某 些實施方式中，優(yōu)選Tat組分(例如全長或接近全長的Tat多肽)在對象中誘導(dǎo)免疫 應(yīng)答(例如，Tat特異性免疫應(yīng)答)?；蛘?，在某些實施方式中，所述Tat多肽的一個 或多個免疫原性區(qū)域或表位優(yōu)選被修飾以降低或消除其免疫原性和/或毒性。因此，設(shè)計了含有插入Tat多肽不同區(qū)域(例如，用于CD4的Erw結(jié)合部分的Tat 多肽"骨架")編碼序列的CD4最小組件的融合分子。圖5顯示了本文所述的示例性 融合分子。也可參見實施例1以及圖6和7。圖5所示的第一雜合分子從N末端到C 末端方向包括Tat蛋白的殘基1-20， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組 件)；和Tat蛋白的殘基30-86。圖5所示的第二雜合分子從N末端到C末端方向包 括Tat蛋白的殘基1-30， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat 蛋白的殘基40-86。圖5所示的第三雜合分子從N末端到C末端方向包括Tat蛋白 的殘基1-40， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基 50-86。圖5所示的第四雜合分子從N末端到C末端方向包括Tat蛋白的殘基l-50， CD4 (SEQ ID NO: l)的殘基15-85 (CD4最小組件)；和Tat蛋白的殘基60-86。本文所述的融合蛋白還可含有其它多肽，其中包括但不限于 一種或多種病原體(例如，病毒如HIV、 HBC、 HCV、 HAV、 RSV、流感病毒等，或細(xì)菌)的抗原性多肽、 免疫調(diào)節(jié)多肽如細(xì)胞因子、趨化因子，等等。例如，所述融合蛋白可包含Tat-CD4 雜合分子能夠結(jié)合的Erw多肽。采用這種方式，單個融合蛋白可作為復(fù)合物以暴露 被CD4暴露的表位。該融合蛋白還可包含其它HIV多肽，例如來自相同或不同HIV 毒株的Gag、尸o/、繪/、 / ev、 Taf、 F戸、^/"或其免疫原性片段中的一種
或多種。所述tat多肽可作為多肽或編碼該tat多肽的多核苷酸提供。在一些實施方式中， 所用Tat多核苷酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化。Env多肽本文所述復(fù)合物的Erw多肽部分可衍生自包膜蛋白，優(yōu)選衍生自HIVEnv。如上 所述，HIV-1的包膜蛋白是約160 kd的糖蛋白(gp160)。在宿主細(xì)胞受到病毒感染期 間，gpl60經(jīng)宿主細(xì)胞蛋白酶切割形成gp120和整合膜蛋白gp41。gp41部分錨定于(并 跨越)病毒體的雙層膜中，而gpl20片段則突出于周圍環(huán)境中。由于gpl20和gp41 間沒有共價連接，游離的gpl20可從病毒體的表面上釋放出來并感染細(xì)胞。Env多肽 還可包括gpl40多肽。在某些實施方式中，復(fù)合物中的Erw多肽組分是單體或二聚體。在優(yōu)選的實施方 式中，所述Erw多肽組分是低聚的Eiw多肽。HIV-lsF2株(以下稱為"SF2")的Erw 多肽前體的基本序列是已知的。參見例如國際申請WO04/037847的圖1，該申請全 文納入本文作為參考。gpl20氨基酸序列(包括前導(dǎo)序列)約從第1號氨基酸延伸到第 509號氨基酸。所述多肽含有約24個N連接的糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在大部分(即使 不是所有)的gpl20序列中是相同的。正如它們的名稱所表示，不同株之間的超變區(qū) 含有眾多氨基酸取代、插入和缺失。盡管有這一變異，大部分(即便不是所有)Erw多 肽序列保持了病毒的結(jié)合病毒受體CD4的能力。此外，可相對于其它變體(例如 HXB-2)對任一 HIV變體的Env多肽氨基酸序列的比對進(jìn)行測定，如WO 00/39303 中所述。在另一實施方式中，所述Env多肽包含低聚形式的Env，例如低聚的gpl40 (o-gpl40)。結(jié)合或復(fù)合于本文所述CD4-Tat雜合分子的Env多肽可衍生自任何已知的HIV 隔離群，以及新鑒別的隔離群及這些隔離群的亞型。在本文中參考SF2或HXB-2來 描述結(jié)構(gòu)特征。釆用例如，序列比對程序(例如BLAST和本文中所述的其它程序)或 對結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒別和比對(例如本文所述的可鑒別P折疊區(qū)的程序如"ALB")，本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過本文公開的內(nèi)容和現(xiàn)有技術(shù)能確定其它HIV變體(例如隔離群 HIV lb、 HIV-1SF162、 HIV-lSF17o、 HIVLAV、 HIVlai、 HIV麗、HIV-1CM235、 HIV-1US4， 獲自不同亞型(例如亞型A-G和O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不同亞型(例如 HlV-2ud和HIV-2uc2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV))中的相應(yīng)區(qū)域。(參見例如以下文獻(xiàn) 中對這些和其它相關(guān)病毒的描述(f諒毒學(xué)》r^o/og^，第三版(W.K.Joklik編，1988);(f基磁錄毒,J1 (Fw"^me"M/ F ro/ogy」，第二版(B.N. Fields和D.M.Knipe編，1991);(f錄毒學(xué)JYK/ra/ogv」，第三版(Fields， BN， DM Knipe， PM Howley編，1996， Lippincott-Raven， Philadelphia, PA)。 Env多肽的實際氨基酸序列可基于任何HIV變體。與本文所述的融合蛋白結(jié)合和/或復(fù)合的所述Eiw多肽可包括對天然序列的其它 修飾，例如其它內(nèi)部缺失、插入和取代。這些修飾可經(jīng)仔細(xì)考慮，如通過定點(diǎn)誘變， 或可為偶然的，例如通過自然發(fā)生的突變事件。因此，例如如果要將Erw多肽用于 疫苗組合物中時，所述修飾必須不會導(dǎo)致免疫活性(即，引發(fā)針對所述多肽的抗體應(yīng) 答的能力)的喪失。類似地，如果要將所述多肽用于診斷目的時，必須保留這一能力。 本文所述的Erw多肽可為單體或寡聚物。多肽的產(chǎn)生可采用各種方法來產(chǎn)生本發(fā)明的CD4分子(例如CD4最小組件)、Tat多肽、Eiw 多肽和融合蛋白，這些方法都是本領(lǐng)域熟知的。在一個實施方式中，采用本領(lǐng)域中熟知的重組技術(shù)來產(chǎn)生所述多肽。從這一角度 可在感興趣多肽的已知序列的基礎(chǔ)上設(shè)計寡核苷酸探針，并用于探測基因組 或cDNA文庫中編碼所述多肽的基因。然后，可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對該基因進(jìn)行進(jìn)一步 的分離，例如在全長序列的所需部分用限制性內(nèi)切酶截短該基因。類似地，可采用 已知的技術(shù)從含有該基因的細(xì)胞和組織中直接分離出該基因，例如苯酚抽提并對序 列進(jìn)行進(jìn)一步的操作以產(chǎn)生所需的截短物。參見例如Sambrook等，同上，關(guān)于用于 獲得和分離DNA的技術(shù)的描述?？苫谒戎男蛄校ㄟ^合成法產(chǎn)生編碼所述融合蛋白的組分和/或Env多肽的 基因?？蓪⒃摵塑账嵝蛄性O(shè)計為具有用于所需具體氨基酸序列的合適密碼子。通常 使以標(biāo)準(zhǔn)方法制備的寡核苷酸的重疊來組裝完整的序列，并組裝成完整的編碼序列。 參見例如Edge (1981) Atowre 292:756; Nambair等，(1984)腸騰223:1299; Jay等， (1984)J說'o/.C7^附.259:6311; Stemmer等，(1995) 164:49-53。可很容易地采用重組技術(shù)來克隆編碼所選多肽的基因，然后可通過置換適宜的堿 基，在體外對基因進(jìn)行誘變，以獲得所需氨基酸的密碼子。該變化可包括小至造成 單個氨基酸變化的一個堿基對的改變，或可包括多個堿基對的變化。或者，可用與 親本核苷酸序列(通常為對應(yīng)于RNA序列的cDNA)雜交的錯配引物，在低于錯配雙 鏈解鏈溫度的條件下，引起該突變?？赏ㄟ^將引物長度和堿基組合保持在相對較窄的范圍內(nèi)，以及將突變堿基保持在中心位置來使得該引物具有特異性。參見例如Innis 等，(1990)，《PCR應(yīng)用用于功能性基因組的方法》(PCRApplications: Protocols for Functional Genomics); Zoller和Smith, M"/20tfcfe，0/. (1983) 100:468?？捎肈NA聚合酶來實現(xiàn)引物延伸，克隆出產(chǎn)物，并選出通過引物延伸鏈的分離而得到的含有 突變DNA的克隆。可采用突變引物作為雜交探針來完成篩選。也可將該技術(shù)應(yīng)用于 產(chǎn)生多位點(diǎn)突變。參見例如Dalbie-McFarland等，尸rac. Ato/. Jcad (1982) 79:6409。一旦所需多肽的編碼序列被分離或合成，就可將它們克隆到用于表達(dá)的任何適合載體或復(fù)制子中。通過本文的教導(dǎo)將很明確的是可通過構(gòu)建以各種組合操作性連接編碼CD4小蛋白和異源序列的多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建物來產(chǎn)生編碼多肽和/或融合蛋白的多種載體。這些組合的非限制性例子在實施例中有所討論。 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種克隆載體，對于適當(dāng)克隆載體的篩選只是選擇的問題。用于克隆的重組DNA載體以及它們可轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的例子包括人噬菌體(大腸桿 菌(Eco//))、 pBR322 (大腸桿菌)、pACYC177(大腸桿菌)、pKT230 (革蘭氏陰性菌)、 pGV1106 (革蘭氏陰性菌)、pLAFRl(革蘭氏陰性菌)、pME290 (非大腸桿菌革蘭氏陰 性菌)、pHV14 (大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(^c/〃^犯tofe))、 pBD9 (桿菌屬)、pIJ61 (鏈 霉菌屬)、pUC6(鏈霉菌屬)、YIp5(酵母菌屬)，YCpl9(酵母菌屬)和牛乳頭瘤病毒(哺 乳動物細(xì)胞)?？傮w上可參見，(fDA^克/t^(DA^ C7om'"g)巻1&11，同上；Sambrook 等，同上；B.Perbal，同上。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(例如桿狀病毒系統(tǒng))為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并在例如 Summers和Smith, f第"55號淳jg"/F;l^農(nóng)f試驗公叛》(Texw爿ghcw/^ra/五x; en'we^ 1Stat/cW&//e^Wa755" (1987)中有所描述。用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料 和方法可從諸如Invitrogen， SanDiegoCA以試劑盒形式購得("MaxBac"試劑盒)。也可用植物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生本文所述的蛋白質(zhì)。通常而言，這類系統(tǒng)采用以病毒為 基礎(chǔ)的載體轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，使其具有異源基因。關(guān)于這類系統(tǒng)的描述可參見例如Porta 等，艦說她c/z. (1996) 5:209-221;和Hackland等，AcA. (1994) 139:1-22。病毒系統(tǒng)(例如Tomei等，《/ Wra/. (1993) 67:4017-4026和Selby等， / F ra/. (1993) 74:1103-1113中描述的基于牛痘的感染/轉(zhuǎn)染系統(tǒng))也可用于本發(fā)明。在該系統(tǒng) 中，首先在體外用編碼噬菌體T7 RNA聚合酶的牛痘病毒重組體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。該聚合
酶顯示出精密的特異性其僅轉(zhuǎn)錄帶有T7啟動子的模板。感染后，用感興趣的由T7啟動子驅(qū)動的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過牛痘病毒重組體在胞質(zhì)中表達(dá)的聚合酶將轉(zhuǎn) 染的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，然后由宿主的翻譯機(jī)制將該RNA翻譯成蛋白質(zhì)。該方法提 供了高水平的、瞬時的、由細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生的大量的RNA及其翻譯產(chǎn)物?？蓪⒃摶蛑糜趩幼?、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(用于細(xì)菌表達(dá))和任選的操縱子(本文將 這些元件總稱為"控制"元件)的控制下，從而使得編碼所需多肽的DNA序列在用 含該表達(dá)構(gòu)建物的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成RNA。所述編碼序列可含有或不含信號肽 或前導(dǎo)序列。在本發(fā)明中，可使用天然存在的信號肽或異源序列。可由宿主在翻譯 后加工過程中去除所述前導(dǎo)序列。參見例如美國專利4,431,739; 4,425,437; 4,338,397。 該序列包括但不限于TPA前導(dǎo)序列以及蜜蜂二甲雙胍(mellitin)信號序列。能調(diào)控與宿主細(xì)胞的生長相關(guān)的蛋白質(zhì)序列表達(dá)的其它調(diào)控序列也是需要的。這 些調(diào)控序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，其例子包括響應(yīng)化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)控化 合物的存在)時，能使基因表達(dá)起始或停止的那些調(diào)控序列。載體中也可存在其它類 型的調(diào)控元件，例如增強(qiáng)子序列。可在插入載體前，將控制序列和其它調(diào)控序列與所述編碼序列連接?；蛘撸蓪?該編碼序列直接克隆入已含有控制序列和適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)的表達(dá)載體中。在某些情況下，可能需要對編碼序列進(jìn)行修飾，從而使其能以適宜的方向與控制 序列連接；S卩，保持正確的閱讀框?？赏ㄟ^使編碼該蛋白質(zhì)的序列部分缺失、插入 序列和/或取代該序列中的一個或多個核苷酸來制備突變體或類似物。用于修飾核苷 酸序列的技術(shù)(例如定點(diǎn)誘變)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。參見例如Sambrook等，同上； (TZ)M4克麿》(DA^ C/o"/"gj，巻I和II，同上；(f^^^j^^fTVewc/e/c/^^Vfea^^, 同上。然后用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞。多種哺乳動物細(xì)胞系是本領(lǐng)域中已知的， 包括可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的無限繁殖細(xì)胞系，例如但不限于中 國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì) 胞癌細(xì)胞(例如Hep G2)、 Vero293細(xì)胞等。類似地，可將細(xì)菌宿主(例如大腸桿菌、 枯草芽孢桿菌和鏈球菌屬)用于本表達(dá)構(gòu)建物中?？捎糜诒景l(fā)明中的酵母宿主除其它 外特別包括啤酒酵母(Sacc/zaraw;;cM cereWw'ae)、白色念珠菌(Cawcfe/fl a/6/cara)、 麥芽聚糖念珠菌(Ca"J/(ia wa/fc^a)、多態(tài)漢遜酵母(7/arae"wa/;7o/3;mw77/za)、脆性克魯 維酵母(A7w"eromj;ce5/rag"/力、乳糖克魯維酵母(^7M"era/^c^ /acto)、吉利蒙德氏 畢赤酵母(尸/cWa gw/〃e〃'ww7c///)、甲醇畢赤酵母(尸/c/w'a/ flWon's)、裂殖稷酒酵母(Sc/w'zo Sacc/zaramyces /ww6e)禾口角率月旨耳卩氏酵母(rarraw/a /^o/>^/cfl)。使用桿狀病毒表達(dá)載體 的昆蟲細(xì)胞除其它外特別包括埃及伊蚊(^^fey aegKp^、苜蓿尺蠖(」^ogra; /^ ca/z》r"/ca)、 家蠶won9 、 黑月復(fù)果蟲竜(Z>osop/2〃a me/a"ogafWe/^ 、 草i也夜蟲我 (5^oc/o,ra如g一油」禾口粉紋夜蛾。根據(jù)所選的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，可通過在可使得感興趣的蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng) 經(jīng)上文所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。對適宜培養(yǎng)條件的 選擇在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。在一個實施方式中，例如為了產(chǎn)生Erw多肽，轉(zhuǎn)化細(xì)胞將多肽產(chǎn)物分泌到周圍的 培養(yǎng)基中。所述載體中可包含某些調(diào)控序列以促進(jìn)所述蛋白產(chǎn)物的分泌，例如采用 組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)前導(dǎo)序歹lJ、干擾素(？或oc-)信號序列或獲自己知分泌 蛋白的其它信號肽序列。然后可采用本文所述的各種技術(shù)分離該分泌的多肽產(chǎn)物， 例如采用標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，例如(但不限于)羥磷灰石樹脂、柱層析、離子交換色譜、 分子排阻色譜、電泳、HPLC、免疫吸附技術(shù)、親和層析、免疫沉淀法等。或者可采用可裂解細(xì)胞但能保持所述多肽(例如Env)基本上完整的化學(xué)、物理或 機(jī)械方法來破裂轉(zhuǎn)化細(xì)胞。還可采用例如去污劑或有機(jī)溶劑去除細(xì)胞壁或膜的成分 以發(fā)生多肽滲漏來獲得胞內(nèi)蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并描述于例如 (f蛋y^質(zhì)/密必應(yīng)L. 實錄遂展》(7Vote/"尸w〃y ca"o"」/ ; //ca"o"5.'爿/Vac/Zca/ /i/7/7roflc/2」(E丄.V. Harris和S. Angal編，1990)。例如，用于本發(fā)明的細(xì)胞破裂方法包括但不限于聲裂法或超聲波破裂法；攪動 法；液相或固相萃??；熱處理；凍融法；干燥法；爆發(fā)性減壓法；滲透休克法；用 包括蛋白酶(例如胰蛋白酶、神經(jīng)氨酸苷酶和溶菌酶)在內(nèi)的裂解酶處理；堿處理；以 及使用去污劑和溶劑，例如膽汁鹽、十二烷基磺酸鈉、Triton、 NP40和CHAPS。用 于破裂細(xì)胞的具體方法很大程度上只是一個選擇的問題，其取決于其中有多肽表達(dá) 的細(xì)胞的類型、培養(yǎng)條件和任何所用的預(yù)處理。細(xì)胞破碎后，通常通過離心去除細(xì)胞碎片，采用標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)對胞內(nèi)產(chǎn)生的 多肽進(jìn)行進(jìn)一步純化，所述技術(shù)包括但不限于柱色譜、離子交換色譜、分子排阻 色譜、電泳、HPLC、免疫吸附技術(shù)、親和層析、免疫沉淀法等。例如，獲得本發(fā)明的胞內(nèi)Env多肽的一種方法涉及親和純化，例如采用抗Erw 特異性抗體進(jìn)行的免疫親和層析，或凝集素親和層析。尤為優(yōu)選的凝集素樹脂是識
別甘露糖部分的那些樹脂，例如但不限于源自以下物質(zhì)的樹脂雪花蓮(Gfl/fl"^M w'vafc)凝集素(GNA)、兵豆(丄era cw/Z"a〃X)凝集素(LCA或小扁豆凝集素)、豌豆(尸&wm ra"vwm)凝集素(PSA或豌豆凝集素)、黃水仙(A^^'^Ry /wewcfo"(^c/M^y)凝集素(NPA) 和熊蔥04///"附w"/m^m)凝集素(AUA)。適宜的親和樹脂的選擇在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍 內(nèi)。親和純化后，可采用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)(例如上述的任何技術(shù))對多肽進(jìn)行進(jìn) 一步的純化。很容易化學(xué)合成相對較小的多肽(即長度最大約為50個氨基酸)，例如通過肽領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的任何一種來合成。 一般而言，這些方法將一個或多個 氨基酸順序添加到正在增長的肽鏈。通常，用適宜的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)第一個氨基酸的 氨基或羧基。然后可在適于形成酰胺鍵的條件下，通過加入具有適當(dāng)保護(hù)的互補(bǔ)(氨 基或羧基)基團(tuán)的序列中下一個氨基酸，將受保護(hù)或衍生的氨基酸附著于惰性固相載 體或用于溶液中。然后從新添加的氨基酸殘基上去除保護(hù)基團(tuán)，然后加入下一個氨 基酸(適當(dāng)保護(hù)的)，依此類推。在所需的氨基酸已以適當(dāng)?shù)捻樞蜻B接后，依次去除或 同時去除剩余的保護(hù)基團(tuán)(如果采用了固相合成技術(shù)的話，去除任何固相載體)，以得 到最終的多肽。通過對該通用步驟做出簡單改變，可一次性將多個氨基酸加入生長 鏈，例如通過將受保護(hù)的三肽與適當(dāng)?shù)氖鼙Ｗo(hù)的二肽偶聯(lián)(在不使手性中心外消旋的 條件下)，以在脫保護(hù)之后形成五肽。關(guān)于固相肽合成技術(shù)可參見例如J. M. Stewart 和J. D. Young， (f^V^/t^成j) fSo/W P/zaw^",/z^^(Pierce Chemical Co.， Rockford， IL 1984)和G. Barany和R.B. Merrifield， (f嚴(yán)游分界、^成*主激,》f77ze 尸e/^/tfe.'y4"a(y57J， 5y"f/zew'" 5/o/ogy」，E. Gross禾口 J. Meienhofer編，巻2， (Academic Press, New York, 1980)，第3-254頁；關(guān)于經(jīng)典溶液合成可參見例如M. Bodansky， (f嚴(yán)^^^^"夠》(7V/"";p/M 。/尸印"cfe ^"A^^)(Springer-Verlag， Berlin 1984)和E. Gross禾口 J. Meienhofer編的(f嚴(yán)游分橋、^成/〃全欽學(xué);；(TAe^"a/"&， /5_y"，歷o/ogy」，巻1 。典型的保護(hù)基團(tuán)包括叔丁氧羰基(Boc)、 9-芴甲氧羰基(Fmoc)、芐氧羰基(Cbz); 對-甲苯磺?；?Tx); 2,4-二硝基芐基；芐基(Bzl);聯(lián)苯異丙氧基羧基-羰基、叔-戊氧 基羰基、異冰片基羰基、o-溴苯氧基羰基、環(huán)己基、異丙基、乙?；-硝基苯磺?；取５湫偷墓滔噍d體是交聯(lián)聚合載體。其可包括二乙烯基苯交聯(lián)的苯乙烯基聚合物，例如二乙烯基苯-羥甲基苯乙烯共聚物、二乙烯基苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯 基苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。也可通過其它方法化學(xué)制備本發(fā)明多肽的類似物，例如通過同時多重肽合成方法。參見例如Houghten尸rac.編.^cad 腦(1985) 82: 5131-5135;美國專利 4,631,211。Env-雜合分子復(fù)合物可通過多種方式使Env與本文所述的Tat-CD4分子復(fù)合。在某些實施方式中，采 用一種或多種交聯(lián)劑或固定劑如甲醛、福爾馬林、戊二醛(glutyraldehyde)等復(fù)合Eiw 和Tat-CD4分子。出于免疫目的，需要將Tat-CD4與Env交聯(lián)以保持暴露Env蛋白 中CD4可誘導(dǎo)表位，以靶向疫苗應(yīng)用中的功能性表位。存在以下方法1) 經(jīng)典交聯(lián)傳統(tǒng)的共價交聯(lián)蛋白質(zhì)的方法是采用優(yōu)先與賴氨酸側(cè)鏈反應(yīng)的非 特異性交聯(lián)劑，如甲醛或戊二醛。由于CD4和env界面上存在一些賴氨酸殘基，因 此這些交聯(lián)劑對于交聯(lián)CD4-env復(fù)合物有效。然而，在初步研究中，我們已顯示這 些反應(yīng)劑還會修飾env的抗原性表面，這表現(xiàn)為部分保留17b和4.8d活性。因此， 為確定最佳條件，我們需要測試不同條件，如pH、緩沖液和交聯(lián)接頭濃度。2) 改進(jìn)的交聯(lián)策略基于較新的化學(xué)機(jī)制評價了其它交聯(lián)劑，如具有不同接頭 長度和反應(yīng)性的同-和異-雙官能試劑。然而，較為理想的是通過單個氨基酸殘基的特 異性共價鍵連接Tat-CD4和Eiw，從而可保存Env暴露的抗原性表面。3) 使Env中的特定氨基酸殘基突變以交聯(lián)特異性交聯(lián)Tat-CD4與Erw的一種 可用方法是將涉及半胱氨酸殘基硫醇基的特定的連接(linkage)策略性地?fù)饺雃nv。然 而，這種策略將涉及Tat-CD4和env之間的二硫鍵，這將必然涉及CD4結(jié)合位點(diǎn)。 此外，二硫鍵不是最穩(wěn)定的共價鍵。另一種策略是，通過特異性共價鍵將含CD4小蛋白的融合蛋白與包膜連接，所 述共價鍵不會干擾包膜暴露的抗原表面，卻能暴露出通常不可接近的隱藏保守表位， 從而可例如產(chǎn)生抗體應(yīng)答。此外，還可通過用編碼本文所述融合蛋白和/或一種或多種Erw多肽的構(gòu)建物共 轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞來產(chǎn)生適宜的復(fù)合物。在某些實施方式中，所述Env多肽是融合蛋白 的一部分。因此，可順式或反式完成共轉(zhuǎn)染，即通過使用獨(dú)立的載體或使用同時帶 有Erw和含CD4及Tat的組合物的單一載體來完成共轉(zhuǎn)染。如果使用單一載體完成 的話，兩種基因可由單套控制元件驅(qū)動?；蛘?，Env-和CD4/Tat-編碼序列可存在于 獨(dú)立的表達(dá)盒中的載體上，由獨(dú)立的控制元件驅(qū)動。表達(dá)后，蛋白質(zhì)可自發(fā)結(jié)合。 或者，可通過將不論是純化形式或半純化形式的分別形成的獨(dú)立蛋白質(zhì)混合在一起 來形成復(fù)合物，甚至可通過將其中培養(yǎng)過表達(dá)所述蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基混合來形成該復(fù)合物。參見1996年2月15日提交的國際申請WO 96/04301中對此類復(fù)合物的描述?？贵w抗Env-雜合CD4-Tat分子復(fù)合物表位(以及因CD4結(jié)合于Env而暴露的隱藏表位) 的單克隆和多克隆抗體在診斷和治療應(yīng)用中尤為有用，例如中和抗體可用于被動免 疫治療。單克隆抗體尤可用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。抗獨(dú)特型抗體是載有需要為其產(chǎn)生保護(hù)的感染劑的抗原的"內(nèi)部圖像"的免疫球 蛋白。產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。參見例如Grzych(1985)，A^& 316:74; MacNamara等，(1984)， S"'e"ce 226:1325， Uytdehaag等，(1985)， J/纖,/. 134:1225。這些抗獨(dú)特型抗體也可用于HIV的治療和/或診斷。對病毒抗原的免疫分析可采用例如針對病毒表位的單克隆抗體、針對一種病毒 多肽表位的單克隆抗體的組合、針對不同病毒多肽表位的單克隆抗體、針對相同病 毒抗原的多克隆抗體、針對不同病毒抗原的多克隆抗體、或單克隆和多克隆抗體的 組合。免疫分析實驗方法可基于例如競爭或直接反應(yīng)或夾心型分析。實驗方法也可例 如，使用固相載體或可通過免疫沉淀而進(jìn)行。大部分分析涉及使用標(biāo)記的抗體或多 肽。該標(biāo)記可為例如熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性或染料分子。擴(kuò)增探針的信號的分 析法也是已知的。其中的例子是使用生物素和抗生物素蛋白、酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫 分析(例如ELISA分析法)的分析法。可將酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)用于測定抗原或抗體濃度。該方法取決于酶與 抗原或抗體的結(jié)合，并采用所結(jié)合酶的活力作為定量標(biāo)記。為了測定抗體，將己知 的抗原固定于固相(例如微量培養(yǎng)板或塑料杯)，與測試血清稀釋液一起孵育，洗滌， 與用酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白一起孵育，再次洗滌。適于標(biāo)記的酶在本領(lǐng)域中是已知 的，包括例如辣根過氧化物酶。通過加入特定的底物來測定結(jié)合于固相的酶活力， 并通過比色法測定產(chǎn)物的形成或底物的消耗。結(jié)合的酶的活力與結(jié)合的抗體的量是 直接的函數(shù)關(guān)系。
為了測定抗原，將已知的特異性抗體固定于固相，加入含抗原的測試材料，孵育 后洗滌固相，加入酶標(biāo)記的二抗。洗滌后，加入底物，比色分析酶活力，并與抗原 濃度相聯(lián)系?？赏ㄟ^將融合蛋白給予哺乳動物(例如小鼠、兔、山羊或馬)來產(chǎn)生多克隆抗體。 收集獲自受免疫的動物的血清，采用例如用硫酸銨沉淀，然后進(jìn)行層析(優(yōu)選親和層 析)的方法，從血漿中純化抗體。用于產(chǎn)生和處理多克隆抗血清的技術(shù)在本領(lǐng)域中是 已知的。也可生產(chǎn)針對Env與CD4結(jié)合后所暴露表位的單克隆抗體?？蓪@自用例如本 文所述的Evn-CD4復(fù)合物免疫的哺乳動物(例如小鼠)的正常B細(xì)胞與例如HAT敏感 型小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤?？赏ㄟ^RIA或ELISA鑒別生產(chǎn)對CD4小蛋 白與Eiw結(jié)合時暴露出的表位具有特異性的抗體的雜交瘤，并通過在半固體瓊脂中 克隆或通過有限稀釋來對其進(jìn)行分離。通過另一輪的篩選分離產(chǎn)生所需特異性抗體 的克隆。針對表位的抗體(單克隆和多克隆)在檢測樣品(例如獲自HIV感染的人體的血清 樣品)中抗原的存在中尤為有用。用于HIV抗原的免疫分析法可采用一種抗體或多種 抗體。對于HIV抗原的免疫分析可采用例如針對HIV表位的單克隆抗體、針對一 個Eiw或Eiw-含CD4最小組件的融合多肽的表位的單克隆抗體組合、針對不同多肽 的表位的單克隆抗體、針對相同HIV抗原的多克隆抗體、針對不同HIV抗原的多克 隆抗體、或單克隆和多克隆抗體的組合。免疫分析實驗方法可基于例如競爭、直接 反應(yīng)或采用例如標(biāo)記抗體的夾心型分析。該標(biāo)記可為例如熒光、化學(xué)發(fā)光或放射 性。還可通過免疫親和層析柱，利用多克隆或單克隆抗體分離Env或與融合蛋白復(fù)合 的Eiw。可通過例如吸附或通過共價連接鍵將抗體固定到固相載體上，從而使得抗體 保留它們的免疫選擇活性?？扇芜x地包含間隔基團(tuán)以使抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)易于接 近。然后可將固定化抗體用于結(jié)合生物樣品(例如血液或血漿)的靶標(biāo)。通過例如改變 pH從柱基質(zhì)回收結(jié)合的蛋白質(zhì)或復(fù)合物。診斷、疫苗和治療用途可將本發(fā)明的CD4-Tat分子以及含這些雜合分子的復(fù)合物(例如具有Env的復(fù)合 物)或其編碼多核苷酸用于多種診斷和治療目的。例如，可將蛋白質(zhì)和多核苷酸或針 對它們而產(chǎn)生的抗體用于各種分析，以測定生物樣品中活性抗體和/或Env蛋白的存 在，以幫助診斷HIV感染或疾病狀態(tài)或作為對免疫應(yīng)答的測定。如上所述，可采用標(biāo)準(zhǔn)的電泳和免疫診斷技術(shù)來檢測與Env(例如gpl20)多肽反應(yīng) 的抗體的存在，或反之與針對其產(chǎn)生的抗體反應(yīng)的抗原的存在，所述技術(shù)包括免疫 分析法，例如競爭、直接反應(yīng)或夾心型分析法。這些分析法包括但不限于免疫印 跡法；凝集測試；酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫分析，例如ELISA;生物素/抗生物素蛋白型 分析；放免分析；免疫電泳；免疫沉淀等。該反應(yīng)通常包括顯示標(biāo)記，例如熒光、 化學(xué)發(fā)光、放射性或酶標(biāo)記或染料分子，或檢測抗原和抗體之間或與它們反應(yīng)的抗 體間復(fù)合物的形成的其它方法?？蓪⒗缫韵碌墓滔噍d體用于分析中膜或微量滴定孔形式的硝基纖維素；片狀 或微量滴定孔形式的聚氯乙烯；珠或微量滴定板形式的聚苯乙烯橡膠；聚偏二氟乙 烯樹脂(polyvinylidine fluoride);重氮化紙；尼龍膜；活性珠等。通常，首先使固相載體與生物樣品(或gpl20蛋白)反應(yīng)，洗滌，然后施用抗體(或 懷疑含有抗體的樣品)。在洗滌去除任何未結(jié)合的配體后，在適于結(jié)合的條件下加入 第二結(jié)合劑部分，從而使得該第二結(jié)合劑能選擇性地與結(jié)合的配體結(jié)合。然后可采 用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)檢測第二結(jié)合劑的存在。通常，第二結(jié)合劑包含針對該抗體配 體的抗體。多種抗人免疫球蛋白(Ig)分子在本領(lǐng)域中是已知的(例如市售的山羊抗人Ig 或兔抗人Ig)。用于本文的Ig分子優(yōu)選為IgG或IgA型，然而，在某些情況下IgM 也適用?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，使Ig分子能夠很容易地與可檢測酶標(biāo) 記結(jié)合，例如辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、e-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和脲酶。 然后采用適宜的酶底物來產(chǎn)生可檢測信號。或者，可采用"兩種抗體夾心"分析法來檢測本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在該技術(shù)中，首 先將固相載體與一種或多種抗Erw(例如gpl20)的抗體反應(yīng)，洗滌，并暴露于測試樣 品。再次加入抗體，采用直接的顏色反應(yīng)或采用標(biāo)記的二抗(例如辣根過氧化物酶、 堿性磷酸酶或脲酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白)使反應(yīng)可見化。也可在溶液中進(jìn)行分析，從而使病毒蛋白與其抗體在沉淀條件下形成復(fù)合物。然 后從測試樣品中通過例如離心的方法分離沉淀的復(fù)合物?？刹捎枚喾N標(biāo)準(zhǔn)方法中的 任何一種(例如上文所述的免疫診斷方法)來分析反應(yīng)混合物以得到是否存在抗體-抗 原復(fù)合物?？稍谠噭┖兄刑峁┍疚乃龅娜缜八霎a(chǎn)生的復(fù)合物或該復(fù)合物的抗體，在試劑
盒中附有說明書和其它必需的試劑，以如上所述地進(jìn)行免疫分析。根據(jù)所用的具體 免疫分析法，該試劑盒還可包含適宜的標(biāo)記和其它包裝好的試劑和材料(即洗滌緩沖 液等)?？刹捎眠@些試劑盒來進(jìn)行諸如上文所述的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析。還可將復(fù)合物和編碼該多肽的多核苷酸單獨(dú)或組合用于疫苗組合物中，用于例如 預(yù)防性(即為了預(yù)防感染)或治療性(為了治療感染后的HIV)疫苗。所述疫苗可包含一種或多種修飾Env蛋白(或編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列)的混合物，例如衍生自一個以 上病毒隔離群的Eiw(例如gpl20)蛋白。還可將該疫苗與其它抗原和免疫調(diào)節(jié)劑(例如，免疫球蛋白、細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，包括但不限于IL-2、修飾的IL-2(cysl25-ser125)、 GM-CSF、 IL-12、-干擾素、IP-IO、 MIP1和RANTES)—起給藥。 可將該疫苗作為多肽或作為裸核酸疫苗(例如DNA)，采用病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體)或非病毒載體(例如脂質(zhì)體、用核酸或蛋白質(zhì)包 被的顆粒)來給予。該疫苗還可包含蛋白和核酸的混合物，然后使用相同或不同的載 體對其進(jìn)行遞送?？啥嘤谝淮蔚亟o予所述疫苗(例如"初免"(prime)給藥，然后進(jìn)行 一次或多次的"增強(qiáng)"(boost))以獲得所需的效果?？山o予相同的組合物作為初免和 給予一次或多次作為增強(qiáng)。此外，在初免和增強(qiáng)給藥中可采用不同的組合物。疫苗將通常含有一種或多種"藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體"，如水、鹽水、甘 油、乙醇等。此外，這種載體中也可存在輔助性物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物 質(zhì)等。任選存在運(yùn)載體，運(yùn)載體是本身不會導(dǎo)致對接受組合物的個體產(chǎn)生有害抗體的一 種分子。適宜的運(yùn)載體通常是大且代謝慢的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、 聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂質(zhì)聚集物(例如油滴或脂質(zhì)體)，以及無活性 的病毒顆粒。此類運(yùn)載體對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是熟知的。此外，可將Eiw 多肽與細(xì)菌類毒素偶聯(lián)，例如獲自白喉、破傷風(fēng)、霍亂等的類毒素。還可使用佐劑來增強(qiáng)疫苗的效果。佐劑本發(fā)明的疫苗可與其它免疫調(diào)節(jié)劑一起施用。具體地說，組合物將通常包含佐劑。用于本發(fā)明的佐劑包括但不限于 一種或多種下述的佐劑 A.含無機(jī)物的組合物適于用作佐劑的含無機(jī)物的組合物包括無機(jī)鹽，例如銨鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括無
機(jī)鹽，例如氫氧化物(例如氫氧化合物)、磷酸鹽(例如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等等，(例如參見(f度滯設(shè)z:六.j (Tacc/"e Z)ew'g".J的第8禾n 9章(1995) Powell & Newman編，ISBN: 030644867X. Plenum.)或不同無機(jī)化合物的混合物(例如磷酸鹽和氫氧化物佐劑的混合物，任選具有過量的磷酸鹽)，該化合物可以任何適宜的形式存 在(例如膠態(tài)、結(jié)晶、無定形等等)，優(yōu)選吸附到該鹽上。還可將含無機(jī)物的組合物配 制成具體的金屬鹽(W000/23105)?？砂X鹽從而使得A產(chǎn)的劑量為每劑0.2-1.0 mg。B.油乳劑適于用作佐劑的油乳劑組合物包括但不限于鯊烯-水乳劑，例如MF59 (5%鯊烯、 0.5% Tween 80和0.5% Span 85，通過使用微流化儀制備成亞微粒)。參見 WO90/14837。也可參見Podda，"含有新型佐劑的輔助流感疫苗利用MF59-輔助疫 苗白勺經(jīng)驗"(The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants: experience with the MF59-adjuvanted vaccine), Facc/"e (2001) 19: 2673-2680; Frey等，"用MF59-輔助的 流感疫苗和無輔助的流感疫苗在非老年成人中的安全性、耐受性和免疫原性比較" (Comparison of the safety, tolerability， and immunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-adjuvanted influenza vaccine in non-elderly adults), P^cc/"e (2003) 21:4234-4237。在FLUADTM流感病毒三價亞單位疫苗中，將MF59用作佐劑。用于組合物中的尤為優(yōu)選的佐劑是亞微粒水包油乳劑。在本文中優(yōu)選的亞微粒水 包油乳劑是任選地含有可變量的MTP-PE的鯊烯/水乳劑，例如含有4-5% w/v鯊烯、 0.25-1.0% w/v Tween 80 (聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)和/或0.25-1.0% Span 85tm (去水山梨糖醇三油酸酯)以及任選的N-乙酰胞壁?；?L-丙氨酰基-D-異谷氨酰 胺?；?L-丙氨酸-2-(r-2'-二棕櫚酰基-s"-甘油-3-羥基磷酸磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)的亞 微粒水包油乳劑，例如，已知稱為"MF59"的亞微粒水包油乳劑(國際申請 WO90/14837;美國專利6,299,884和6,451,325，以及Ott等，(f資度沒7^, 皮效遂展》(％cc/"e De57'g".. 7Tze Sw6wmY a咖vc^ ^praacW (Powell ， M.F.禾口 Newman， M丄編)中的"MF59—設(shè)計以及在人用疫苗中的安全性和有效輔助性評估" (MF59 -- Design and Evaluation of a Safe and Pot ent adjuvant for Human Vaccines) Plenum Press,New York, 1995，第277-296頁)。MF59含有4-5% w/v鯊烯(例如4.3%)、 0.25-0.5% w/v Tween 80，和0.5% w/v Span 85頂以及任選含有不同量的MTP-PE，采 用微流化儀(例如llOY型微?；瘍x(Microfluidics， Newton， MA))配制成亞微粒顆粒。 例如，MTP-PE的量可為約0-500嗎/齊U，更優(yōu)選為0-250 (ig/劑，最優(yōu)選0-100 pg/劑。 如本文中所用，術(shù)語"MF59-0"是指上述亞微粒水包油乳劑中沒有MTP-PE，而術(shù) 語MF59-MTP則表示含有MTP-PE的制劑。例如，"MF59-100"為每劑中含有100 (ig MTP-PE，依此類推。MF69是本文中所用的另一種亞微粒水包油乳劑，它含有4.3% w/v鳘烯、0.25% w/v Tween 8()tm和0.75% w/v Span 85很以及任選的MTP-PE。另一 種亞微粒水包油乳劑是MF75，也稱為SAF，其含有10%鯊烯、0.4% Tween 80 、 5。/o普流羅尼(pluronic)封端的聚合物L(fēng)121以及thr-MDP,它也是通過微流化成為亞微 粒乳劑。MF75-MTP表示包含MTP的MF75制劑，例如每劑中含100-400貼MTP-PE。用于組合物中的亞微粒水包油乳劑、其制備方法以及免疫刺激劑(例如胞壁酰肽) 在國際申請WO90/14837和美國專利6,299,884以及6,451,325中有詳細(xì)描述。也可將弗氏完全佐劑(CFA)和弗氏不完全佐齊附FA)用作本發(fā)明中的佐劑。C.皂苷制劑也可將皂苷制劑用作佐劑。皂苷是甾醇糖苷類(glycoside)和三萜系糖苷類的異種 類型，其存在于眾多植物種類的樹皮、葉、莖、根以及甚至花中。已對從皂樹皮(^w/〃"/a 犯戶"a^ Molina )中分離的皂苷作為佐劑的用途進(jìn)行了廣泛的研究。皂苷還可從商業(yè) 途徑獲自麗花菝葜(Sm//ax (墨西哥菝葜，sars叩rilla)、滿天星(Qy;wo/^/〃a/ am'cw/ato) (brides veil)禾口月巴阜草(Sa/xwfln'a q^ c/a"afo)(皇根，soap root)。阜苷佐齊U帝寸 劑包括純化的制劑，例如QS21，以及脂質(zhì)制劑，例如ISCOM。已通過高效薄層色譜(HP-TLC)和反相高效液相色譜(RP-HPLC))純化了皂苷組合 物。匕對用這些技術(shù)獲得的特定純化部分進(jìn)行了鑒別，包括QS7、QS17、QS18、QS21、 QH-A、 QH-B禾PQH-C。優(yōu)選地，所述皂苷是QS21。生產(chǎn)QS21的方法在美國專利 5,057,540中有所揭示。皂苷制劑還可包括甾醇，例如膽固醇(參見W096/33739)?？蓪⒃碥蘸湍懝檀嫉慕M合用于形成被稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒。 ISCOM通常還包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或卵磷脂?？蓪⑷魏我阎脑碥沼糜?ISCOM中。優(yōu)選地，ISCOM包括一種或多種Quil A、 QHA和QHC。 ISCOM在 EP0109942、 W096/11711和W096/33739中有進(jìn)一步的描述。任選地，ISCOMS可 不含一種或多種其它去污劑。參見WO00/07621。關(guān)于基于皂苷的佐劑的發(fā)展的綜述可參見Barr等，"ISCOM和其它基于皂苷的佐 齊U "(ISCOMs and other saponin based adjuvant), JcAwzcedZ>wg De//ve^y i ev/e鄉(xiāng)(1998) 32:247-271。還可參見Sjolander等，"口服皂苷和ISCOM疫苗的吸收和輔助活性" (Uptake and adjuvant activity of oral delivered saponin and ISCOM vaccines),」cfw"cet/ i>wg De//veo^ev/ewy (1998) 32:321-338。D. 病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可將病毒體和病毒樣顆粒(VLP)用作佐劑。這些結(jié)構(gòu)物中通常含有任選與磷脂 組合或一起配制的一種或多種獲自病毒的蛋白質(zhì)。它們通常是非病原性、不可復(fù)制 且通常不含任何天然病毒基因組。可重組產(chǎn)生病毒蛋白或從全病毒中分離病毒蛋白。 適用于病毒體或VLP中的這些病毒蛋白包括衍生自下組的蛋白質(zhì)流感病毒(例如 HA或NA)、乙型肝炎病毒(例如核心或衣殼蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德 畢斯病毒、呼腸孤病毒、口蹄病病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭瘤病毒、 HIV、 RNA噬菌體、Qfi噬菌體(例如衣殼蛋白)、GA噬菌體、fr噬菌體、AP205噬 菌體和Ty (例如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pl)。關(guān)于VLP的進(jìn)一步討論見WO03/024480、 WO03/024481和Niikura等，"作為口服疫苗載體遞呈外源表位的嵌合重組戊型肝炎 病毒樣顆粒"(Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting Foreign Epitopes), K>o/ogy (2002) 293:273-280; Lenz等，"誘導(dǎo)樹 突狀細(xì)胞急性激活的乳頭瘤病毒樣顆粒"(Papillomarivurs-Like Particles Induce Acute Activation of Dendritic Cells), Jo固a/。/7顯層/ogy (2001) 5246-5355; Pinto等，"用 重組HPV-16L1病毒樣顆粒免疫的健康志愿者中，對人乳頭瘤病毒(HPV)-16L1的細(xì) 胞免疫應(yīng)答"(Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus (HPV)-16 LI Healthy Volunteers Immunized with Recombinant HPV-16 LI Virus-Like Particles), Jbwr朋/ o/7"/ec"ow ZXyeww (2003) 188:327-338;以及Gerber等，"人乳頭瘤病毒樣 顆粒與大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素突變體R192G或CpG共同給予時是有效的口服免疫 原"(Human Papillomavrisu Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens when Coadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG)， Jow"a/ o/ P ra/ogy (2001) 75(10):4752-4760。關(guān)于病毒體的進(jìn)一步討論可見例如， Gluck等，"未來疫苗開發(fā)中的新技術(shù)平臺"(New Technology Platforms in the Development of vaccines for the Future), Facc/"e (2002) 20:B10-B16。在鼻內(nèi)三f介 INFLEXAL 產(chǎn)品{Mischler & Metcalfe (2002) K"cc/"e 20增干U 5:B17-23}和 INFLUVAC PLUSTM產(chǎn)品中，將免疫增強(qiáng)的重新配制的流感病毒體(IRIV)用作亞單位 抗原遞送系統(tǒng)。E. 細(xì)菌或微生物衍生物
適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，例如 (1 )厲^麥潔多薪(i尸》游求毒絲欲仝激這些衍生物包括單磷?；|(zhì)A(MPL)和3-0-脫酰基MPL(3dMPL)。 3dMPL是 3脫-0-乙酰化單磷?；|(zhì)A與4、 5或6酰化鏈的混合物。3脫-O-乙?；瘑瘟柞?基脂質(zhì)A的優(yōu)選"小微粒"形式在EP 0 689 454中有所揭示。這些3dMPL的"小顆 粒"小到足以無菌濾過0.22微米膜(參見EP 0 689 454)。其它無毒性的LPS衍生物包 括單磷酰基脂質(zhì)A模擬物，例如氨基垸基氨基葡萄糖苷磷酸衍生物例如RC-529。參 見Johnson等，(1999)MW C7zem 9:2273-2278。(2) 微^ ,姓激脂質(zhì)A衍生物包括獲自大腸桿菌的脂質(zhì)A衍生物，例如OM-174。 OM-174在例 如Meraldi等，"OM-174， 一種具有人用潛力的新佐劑，與合成的來自瘧原蟲環(huán)子孢 子蛋白的C端片段242-310 —起給予時引發(fā)保護(hù)性應(yīng)答"(OM-174, a New Adjuvant with a Potential for Human Use, Induces a Protective Response with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310 from the circumsporozoite protein of Plasmodium berghei)， ^cc/"e (2003) 21:2485-2491;禾卩Pajak等，"體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠樹突 狀細(xì)胞遷移和成熟的佐劑OM-174" (The Adjuvant OM-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cells in vivo), &cc/we (2003) 21:836-842中有所描 述。(3) 被W纖寡凝微適于用作本發(fā)明的佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(一種包含未甲基 化胞嘧啶、其后通過磷酯鍵連接有鳥苷的序列)的核苷酸序列。包含palindromic或 poly(dG)序列的細(xì)菌雙鏈RNA或寡核苷酸也已顯示具有免疫刺激性。CpG可包含核苷酸修飾/類似物(例如硫代磷酸酯修飾)，可為雙鏈或單鏈?？扇芜x 地以類似物(例如2'-脫氧-7-去氮雜鳥苷取代鳥苷。參見Kandimalla等，"分枝合成核 苷酸基序識別模式具有細(xì)胞因子誘導(dǎo)性的有效免疫調(diào)節(jié)劑設(shè)計和進(jìn)展"(Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern: design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles), A^c/e/c爿c/^ 7 ^earc/z (2003) 31(9): 2393-2400; WO02/26757和W099/62923中關(guān)于可能的類似取代。CpG寡核苷酸的佐劑效果在以下文獻(xiàn)中有進(jìn)一步討論Krieg， "CpG基序細(xì)菌提取物中的活性成分？ " (CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts ), Atowe Me<afc/"e (2003) 9(7): 831-835; McCluskie等，"小鼠中采 用乙型肝炎表面抗原和CpG DNA的非胃腸道和粘膜初免-增強(qiáng)免疫策略"(Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA)， /mm麗o/ogy Mecfca/ M/craWo/ogy (2002) 32:179-185;WO98/40100;美國專利6,207,646;美國專利6,239,116和美國專利6,429,199。CpG序列可針對TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。參見Kandimalla等，"Toll 樣受體9:采用新合成的CpG DNA對識別和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)"(Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic CpG DNAs)， S/oc/ze顯'ca/Soc/e(y 7>wwa"/ora (2003) 31 (第3部分)654-658。該CpG序列可特異性 誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，例如CpG-AODN，或可更特異性地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，例如CpG-B ODN。 CpG-A和CpG-B ODN在以下文獻(xiàn)中有所討論Blackwell等，"CpG-A-誘導(dǎo) 的單核細(xì)胞可由IFN-Y誘導(dǎo)的蛋白-10的產(chǎn)生是由類槳樹突狀細(xì)胞衍生的IFN-a調(diào) 節(jié)的"(CpG-A-Induced Monocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated by Plasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha)，J /wmw"o/. (2003) 170(8): 4061-4068; Krieg， "CpG的A-Z"(From Ato Z on CpG)， 7T^iVZ^ /" /mm,o/ogy (2002) 23(2): 64-65和WO01/95935。優(yōu)選地，所述CpG是CpG-AODN。優(yōu)選構(gòu)建CpG寡核苷酸以使得5'端易于接受受體識別。任選地，可將兩種CpG 寡核苷酸序列連接在它們的3'端以形成"免疫物"(immunomer)。參見例如，Kandimalla 等，"影響免疫刺激活性的CpG寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)"(Secondary structures in CpG oligonucleotides affect immunostimulatory activity) ， 5朋C (2003) 306:948-953 ; Kandimalla等，"Toll樣受體9:采用新合成的CpG DNA對識別和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的調(diào) 節(jié)"(Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic GpG DNAs)，歷oc/zem/ca/So".e^ rraraac"o朋(2003) 3l(第3部分):664-658; Bhagat等，"作為強(qiáng)效免疫調(diào)節(jié)劑的CpG戊和己脫氧核苷酸"(CpG penta- and hexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents),朋i C (2003) 300:853-861和WO03/035836。(4)爿1)尸-拔薪基眾毒#及,去毒欲主激可將細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選地，所述 蛋白質(zhì)衍生自大腸桿菌(即大腸桿菌不耐熱腸毒素"LT")、霍亂("CT")或百日咳 ("PT")。去毒ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的用途在W095/17211有所描述， 作為胃腸道外佐劑的用途在W098/42375中有所描述。優(yōu)選地，所述佐劑是去毒LT 突變體，例如LT-K63、 LT-R72和LTR192G。 ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物(尤 其是LT-K63和LT-R72)作為佐劑的用途可見以下參考文獻(xiàn)Beignon等，"共同施用 于裸露皮膚后能增強(qiáng)肽抗原引發(fā)CD4+ T細(xì)胞和分泌Y干擾素能力的大腸桿菌熱不 穩(wěn)定腸毒素LTR72突變體"(The LTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Enhances the Ability of Peptide Antigens to Elicit CD4+ T Cells and Secrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin), /"yfeWcw朋t/ 7mm扁'(y (2002) 70(6):3012- 3019; Pizza等，"粘膜疫苗作為粘膜佐劑的LT和CT的非毒性 衍生物"(Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants), &cc/"e (2001) 19: 2534-2541; Pizza等，"LTK63 and LTR72，兩種已準(zhǔn)備用于臨床試 驗的粘膜佐劑"，(LTK63 and LTR72， two mucosal adjuvants ready for clinical trials)， /W. J. Met/. M/craWo/ (2000) 290(4-5):455-461; Scharton-Kersten等，"采用細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素、亞單位和無關(guān)佐劑的經(jīng)皮免疫"(Transcutaneous Immunization with Bacterial ADP-Ribosylating Exotoxins, Subunits and Unrelated Adjuvants), ow/ /wmm//y(2000) 68(9):5306-5313; Ryan等，"作為鼻內(nèi)遞送無細(xì)胞百日咳疫苗的有效 粘膜佐劑的大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素突變體無毒性AB復(fù)合物的鑒別及其對Thl和 Th2細(xì)胞的酶活性"(Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Ace歸ar Pertussis Vaccine: Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Thl and Th2 Cells),a t//wwwm'(y (1999) 67(12):6270-6280; Partidos等，"大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒 素及其定位突變體LTK63對T細(xì)胞應(yīng)答鼻內(nèi)共免疫的合成肽的增殖和細(xì)胞毒性的促 進(jìn)，，(Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli and its site-directed mutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized synthetic peptides), /mmw"o/.(1999) ^2(3):209-216; Peppoloni等，"作為鼻內(nèi)遞 送疫苗的安全強(qiáng)效佐劑的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素"(Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines), Face/"" (2003) 2(2):285-293;以及Pine等，(2002)"采用流感疫苗和去毒化的大腸 桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LTK63)的鼻內(nèi)免疫"(Intranasal immunization with influenza vaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxin from Escherichia coli (LTK63))， 乂 Cow加/Z^/ea化(2002) 85(l-3):263-270。氨基酸取代的數(shù)目參考優(yōu)選以 Domenighini等，Mo/. A//croZ>/o/(1995) 15(6):1165-1167中所述的ADP-核糖基化毒素 A和B亞單位比對為基礎(chǔ)進(jìn)行。F. 生物粘附劑和粘膜粘著劑也可將生物粘附劑和粘膜粘著劑用作本發(fā)明的佐劑。適宜的生物粘附劑包括酯化 的透明質(zhì)酸微球(Singh等，(2001口Ow ./ efe 70:267-276)，或粘膜粘著劑例如聚乙 烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、羧甲基纖維素、聚丙烯酸的交聯(lián)衍生物。殼聚糖及 其衍生物也可在本發(fā)明中用作佐劑。見例如WO99/27960。G. 微粒還可將微粒用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選由生物可降解和無毒性材料形成的微粒(即 直徑為約lOOnm到約150pm，更優(yōu)選直徑為約200nm到約30pm，最優(yōu)選直徑為約 500nm到約10pm的顆粒)，所述材料如聚(a-羥酸)、聚羥丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚 已酸內(nèi)酯等等，其中優(yōu)選聚(丙交酯-共-乙交酯)，任選地對其處理，使其具有帶負(fù)電 荷表面(例如用SDS處理)或帶正電荷表面(例如用陽離子型去污劑，例如CTAB處理)。H. 脂質(zhì)體適于用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子在美國專利6,090,406、美國專利5,916,588和 EP0 626 169中有描述。/.纖Z微微奪乙微應(yīng)適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。W099/52549。此類制劑還 包括與辛苯聚醇(octoxynol)組合的聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑 (WO01/21207),以及與至少一種其它非離子型表面活性劑(例如辛苯聚醇)組合的聚氧 乙烯烷基醚或酯表面活性齊U(W001/21152)。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰 基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和 聚氧乙烯-23-月桂醚。J.聚磷腈(PCPP)PCPP制劑在例如Andrianov等，"通過使聚磷腈溶液共凝聚制備水凝膠微球" (Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions),歷omafen'a^ (1998) 19(1-3):109匿115和Payne等，"從聚磷腈基質(zhì)中釋放蛋 白質(zhì)"(Protein Release from Polyphosphazene Matrices),/>wg. Z)e/Zverj i ev/ew (1998) 31(3):185-196中有所描述。 K.胞壁酰肽適于在本發(fā)明中用作佐劑的胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷酰胺(thr-MDP)、 N-乙?；?正胞壁酰-l-丙氨酰基-d-異谷酰胺(nor-MDP)和N-乙酰 胞壁酸基-l-丙氨?；?d-異谷氨酰胺酰基-l-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚?；?sn-甘油-3-羥基 磷酸磷酰氧)-乙胺MTP-PE)。 L.咪唑并喹啉化合物適于用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫特及其類似物，其進(jìn)一步的描述見Stanley,"咪喹莫特和咪唑并喹啉的作用機(jī)制和治療效果"(Imiquimod and the imidazoquinolines: mechanism of action and therapeutic potential), C7/w ￡x/ Z)erw"to/(2002) 27(7):571-577; Jones,"咪喹莫特3M" (Resiquimod 3M)， C群一" /匿Wg/>啷(2003) 4(2): 214-218;和美國專利4,689,338、 5,389,640、 5,268,376、 4,929,624、 5,266,575、 5,352,784、 5,494,916、 5,482,936、 5,346,905、 5,395,937、 5,238,944 和5,525,612。M.縮氨基硫脲化合物適于用作本發(fā)明中佐劑的縮氨基硫脲化合物及其配制、生產(chǎn)和篩選方法的例子包 括WO04/60308中所描述的那些?？s氨基硫脲在刺激人外周血單核細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞 因f (例如TNF- a )中尤為有效。N.色胺酮化合物。適于用作本發(fā)明中佐劑的色胺酮化合物及其配制、生產(chǎn)和篩選方法的例子包括 WO04/64759中所描述的那些。色胺酮化合物在刺激人外周血單核細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因 子(例如TNF- a )中尤為有效。本發(fā)明還可包括一種或多種上述鑒定佐劑的組合。例如，在本發(fā)明中可使用以下 佐劑組合(1) 皂苷和水包油乳劑(W099/11241);(2) 皂苷(例如QS21) +無毒性LPS衍生物(例如3dMPL)(參見WO94/00153);(3) 皂苷(例如(^21)+無毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4) 皂苷(例如QS21)十3dMPL+IL陽12(任選地+甾醇)(W098/57659);(5) 3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑的組合(參見歐洲專利申請0835318、 0735898和0761231);(6) SAF:含10%鯊烯、0.4% Tween 80、 5%普流羅尼封端的聚合物L(fēng)121和
thr-MDP，微流化成亞微粒乳劑或經(jīng)渦旋產(chǎn)生較大粒徑的乳劑。(7) RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)， (Ribi Immunochem):含有2%鯊烯、0.2。/oTween80和一種或多種選自下組的細(xì)菌細(xì)胞壁成分單磷酰基脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯 (TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS (Detox );以及(8) —種或多種無機(jī)鹽(例如鋁鹽)+ LPS的無毒性衍生物(例如3dPML)。(9) 一種或多種無機(jī)鹽(例如鋁鹽)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的 核苷酸序列)。O.人免疫調(diào)節(jié)劑適于用作本發(fā)明中佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，例如白介素(例如IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-12等等)、干擾素(例如干擾素-力、巨噬細(xì)胞集落 刺激因子和腫瘤壞死因子。鋁鹽和MF59是用于注射用流感疫苗的優(yōu)選佐劑。細(xì)菌毒素和生物粘附劑是用于 粘膜遞送疫苗(例如鼻內(nèi)疫苗)的優(yōu)選佐劑。上文引用的全部專利、專利申請和期刊文章中的內(nèi)容以其全文納入本文作為參考。通常，疫苗組合物以液體溶液或懸液形式配制成供注射用的組合物；也可制備成 適于在注射前溶解或懸浮在液體載體中的固體形式。如前所述，還可乳化或在脂質(zhì) 體中包封該制劑以增強(qiáng)佐劑的效果。疫苗將包含治療有效量的本文所述的雜合分子或復(fù)合物、或這些復(fù)合物的其它復(fù) 合物、或其編碼核苷酸序列、抗這些復(fù)合物的抗體以及上述任何其它組分，根據(jù)需 要而定。"治療有效量"是指可在接受給藥的未感染的、感染的或未暴露的個體中誘 導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的量。該應(yīng)答通常會使得對象中發(fā)生針對疫苗的分泌型細(xì)胞和/或 抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，該應(yīng)答包括但不限于一種或多種以下效果產(chǎn)生任何 免疫類型的抗體，例如免疫球蛋白A、 D、 E、 G或M; B和T淋巴細(xì)胞的增殖；為 免疫細(xì)胞提供活化、生長和分化信號；輔助T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的擴(kuò)增。例如，抗體在天然狀況下可被中和、可產(chǎn)生抗體依賴性細(xì)胞、介導(dǎo)細(xì)胞 毒性、或者可與具有這種活性的其它抗體或與介導(dǎo)對病毒感染和/或復(fù)制的反應(yīng)的細(xì) 胞發(fā)生協(xié)同反應(yīng)。優(yōu)選地，所述有效量足以對疾病癥狀形成治療或預(yù)防作用。所需的確切量隨以下 因素而變化治療對象；待治療個體的年齡和總體情況；個體免疫系統(tǒng)合成抗體的
能力；所需的保護(hù)程度；所治療病癥的嚴(yán)重程度；所選復(fù)合物及其給藥模式以及其 它因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地確定適宜的有效量。"治療有效量"落于可通過 常規(guī)試驗確定的相對寬泛的范圍內(nèi)。一旦配制完成，可如上所述地通過用常規(guī)注射器或基因槍(例如Accelf基因遞送 系統(tǒng)(PowderJectTechnologies, Inc., Oxford, England))的注射，利用病毒載體或不利 用病毒載體來施用該核酸疫苗。將DNA遞送入表皮是尤為優(yōu)選的給藥方式，因為該 給予方式為皮膚相關(guān)的淋巴細(xì)胞提供了通路，并在接受者中提供了瞬時存在的DNA。 可注射核酸和/或肽，或通過皮下、表皮、皮內(nèi)、粘膜內(nèi)例如鼻內(nèi)、直腸、陰道、腹 膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服或肌內(nèi)方式給藥。給藥的其它模式包括口服和肺部給藥、栓劑、 無針注射、經(jīng)表皮和經(jīng)真皮施用。藥量治療可為單劑方案或多劑方案。還可將肽或 其它物質(zhì)與核酸聯(lián)合給藥。雖然已結(jié)合優(yōu)選的特定實施方式描述了本發(fā)明，應(yīng)理解上述描述以及下文的實施 例是用于說明，而不是限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明范圍中的其它方面、優(yōu)點(diǎn)和改變 對于本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。實施例以下是實施本發(fā)明的特定實施方式的實施例。提供這些實施例是僅為說明的目 的，而不是為了以任何方式限定本發(fā)明的范圍。已盡可能確保所用數(shù)值(例如數(shù)量、溫度等等)的精確性，但理所當(dāng)然應(yīng)允許存在 某些試驗誤差和偏差。實施例1設(shè)計含TAT多肽和CD4最小組件的雜合蛋白如下設(shè)計含有人CD4 env結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新的雜合蛋白。分析CD4-gpl20的三維 (3D)結(jié)構(gòu)并鑒定了與erw結(jié)合有關(guān)的CD4區(qū)域。具體地說，對應(yīng)于CD4氨基酸殘基 15-85的區(qū)域基本上完全埋入eiw的CD4結(jié)合口袋(圖4)。該片段被稱為CD4最小組 件，且Cysl6和Cys84之間存在二硫鍵可穩(wěn)定該片段。隨后采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將CD4最小組件(殘基15-85)克隆入各種表達(dá)盒以 表達(dá)Tat-CD4融合蛋白。該表達(dá)盒包含編碼CD4最小組件的序列和在側(cè)接此序列的 編碼Tat多肽的序列。具體地說，如圖5所示，該表達(dá)盒從5'到3，方向上包括編 碼Tat的殘基1-20、 CD4的殘基15-85(CD4最小組件)、Tat的殘基30-86的序列；或 編碼Tat的殘基1-30、 CD4的殘基15-85(CD4最小組件)、Tat的殘基40-86的序列； 或編碼Tat的殘基l-40、CD4的殘基15-85(CD4最小組件)、Tat的殘基50-86的序列； 或編碼Tat的殘基1-50、 CD4的殘基15-85(CD4最小組件)、Tat的殘基60-86的序列。 用上述不同Tat-CD4融合構(gòu)建物(具有與Tat基因融合的一部分CD4)轉(zhuǎn)染293細(xì) 胞。按照Srivastava等(2003) ( / F/ra/. 77(20): 11244-11259)的描述使細(xì)胞生長在常規(guī) 293培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染72小時后收集上清液，并用含NP40(0.5。/。)(Sigma， St.Louis， MO)的緩沖液制備裂解液。按照Srivastava等(2003) (J Kra/. 77(20): 11244-11259)的 描述將裂解液和上清液樣品(每道15 (il)加入Bis Tris凝膠(Invitrogen， Carlsbad， CA)。 將凝膠材料轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上，并用抗-CD4單克隆抗體以及抗-Tat小鼠多克隆 抗血清(1:400稀釋)和抗-B肌動蛋白(1:500稀釋)探測印跡，如Srivastava等(20(B) ( / Wra/. 77(20): 11244-11259)所述(抗小鼠熒光(florescence)偶聯(lián)的抗體以1:30000稀釋， 用Odyssey法檢測)。如圖9所示，Tat被抗Tat抗體識別，說明在Tat基因的不同位置引入CD4最小 結(jié)構(gòu)域不會影響Tat的表達(dá)。有證據(jù)表明，含或不含組織纖溶酶原激活劑前導(dǎo)(tPA) 序列的構(gòu)建物的表達(dá)曲線之間存在一些差異。除了構(gòu)建物#31，不含tPA時Tat-CD4 的表達(dá)可以忽略。然而，加入tPA前導(dǎo)序列似乎可增強(qiáng)表達(dá)?？蛇M(jìn)行研究以證實 Tat-CD4融合蛋白保留了結(jié)合HIVEnv并誘導(dǎo)構(gòu)象改變的能力。當(dāng)表達(dá)時，該融合蛋白包含CD4的Env結(jié)合位點(diǎn)并減少了不需要的CD4表位， 同時還包含可引起Tat特異性免疫應(yīng)答的Tat多肽。Env蛋白單體和低聚體的各種實 施方式可結(jié)合于Tat-CD4雜合體融合分子，其中包括gpl20、 gpl40和gpl60以及它 們的變體。實施例2制備ENV-融合蛋白復(fù)合物在用甲醛處理和不用甲醛處理的條件下，制備穩(wěn)定的純化的env-雜合蛋白復(fù)合 物。例如，為了在env中誘導(dǎo)構(gòu)象變化，將等摩爾濃度的env(例如SF2或SF162)以 及含CD4最小組件和一種或多種Tat多肽的雜合分子在37。C下一起孵育1小時。在 細(xì)胞水平上，這些相互反應(yīng)是瞬時的。因此，在孵育結(jié)束后， 一半的復(fù)合物經(jīng)甲醛 固定，而另一半則保持為未處理。在Superdex-200柱上分離處理和未經(jīng)處理的復(fù)合 物。在HPLC柱和SDS-PAGE上分析純化部分。該純化復(fù)合物同時包含env和融合 蛋白。此外，這些復(fù)合物可望是均勻的并將包含不超過2-3%的游離融合蛋白。
通過對可由CD4誘導(dǎo)的表位的誘導(dǎo)來監(jiān)測Erw與雜合分子的復(fù)合能力，所述可 由CD4誘導(dǎo)的表位是采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用MAb 17b和4.8d識別的。具體而言，隨后通 過表面質(zhì)譜共振(SPR)對在SF162 Env背景下產(chǎn)生的純化嵌合物(chimerae)進(jìn)行表征 以評估CD4i表位的暴露，并通過共同受體結(jié)合測試評估它們的結(jié)合親和力。也可參 見Devico等，(1996) F ra/ogv 218:258-263和Zhang等，(1999)所ocAew&^y 38(29): 9405-9416，這些文獻(xiàn)顯示對另一CD4小蛋白的SPR測試，通過采用單克隆抗體17b 的檢測顯示該CD4小蛋白能與sCD4競爭結(jié)合相同的env位點(diǎn)，并誘導(dǎo)包膜構(gòu)象變 化(Sullivan等，(1998) / F ra/ 72(8):6332-6338)。該抗體識別位于gpl20 V3環(huán)附近且 主要由Vl/V2保守莖部組成的表位，該表位可能被側(cè)接的Vl/V2和V3環(huán)所掩蓋 (Kwong等，(1998)Atoww (倫敦)393:648-659;Rizzuto等，(1998) Sc/^ce 280:1949-1953) 但在與CD4復(fù)合的env中暴露出來。小蛋白的加入對抗體最大結(jié)合和結(jié)合速率提高 的影響是很小的，可能反映了它的env結(jié)合親和力較低，但具有特異性和易于檢測。 這些操作可應(yīng)用于gpl20、 gpl40和gpl60單體、寡聚物及其變體(例如制備穩(wěn)定純化的雜合蛋白復(fù)合物)。此類變體包括例如env中f3折疊的缺失以及V2/V3環(huán)的缺失坐寸o實施例3產(chǎn)生中和抗體可通過多種本領(lǐng)域熟知的途徑來遞送含有本發(fā)明組合物的疫苗，這些途徑包括， 例如在一種或多種制劑中遞送多肽抗原和/或遞送表達(dá)所述多肽的多核苷酸。例如， DNA初免/蛋白質(zhì)強(qiáng)化策略允許在兔和非人靈長類中篩選多種具有在作為DNA疫苗 送遞時在宿主中原位呈遞表位的能力的Env結(jié)構(gòu)。DNA接種可包括給予裸DNA、 與微粒(如PLG顆粒)復(fù)合的DNA或作為病毒載體的一部分的DNA，然后進(jìn)行蛋白 質(zhì)強(qiáng)化。使用病毒載體的電穿孔或DNA接種法以及本文所述的其它方法可用于有效 地將編碼雜合蛋白和/或Erw多肽的多核苷酸遞送給非人哺乳動物(例如靈長類)。A. CD4-TAT雜合蛋白-ENV復(fù)合物在第0、 4、 12和24周對4-5只/組或更多只/組的兔分別進(jìn)行免疫。兩周一次 (bhveekly)收集血清并通過針對例如SF2 gpl20或SF162 gpl20進(jìn)行ELISA分析。這 些動物對gpl20發(fā)生強(qiáng)的免疫應(yīng)答。不出所料，除了抗-gpl20反應(yīng)，這些復(fù)合物還 誘導(dǎo)強(qiáng)的抗-CD4反應(yīng)。因此，合理設(shè)計的含CD4小蛋白的融合蛋白能以高親和力結(jié)合于不同包膜形式 (包括帶有和不帶有V2缺失的低聚和單體形式的SF162)，在這些蛋白質(zhì)中誘導(dǎo)構(gòu)象 變化并誘導(dǎo)完全暴露出保守隱藏的、CD4可誘導(dǎo)的表位和/或共同受體結(jié)合位點(diǎn)。因 此，該融合蛋白可用于與包膜蛋白復(fù)合以將包膜表位暴露給中和抗體，從而可在疫 苗制劑中具有潛在的用途。B. ENV-CD4/TAT蛋白構(gòu)建物在第O、 4、 12和24周免疫4-5只/組或更多只/組的兔。兩周收集血清一次并進(jìn) 行ELISA分析。然后在恒河猴中對這些兔的研究中鑒別出的復(fù)合物進(jìn)行測定。C. 猴用帶有佐劑的Env-CD4/Tat復(fù)合物或Env-CD4/Tat蛋白構(gòu)建物免疫5只/組或更多 只/組的猴子，并同時設(shè)立僅采用Env蛋白和僅采用CD4/Tat分子的對照組。用帶有 和不帶有V2缺失的單體和低聚形式的SF162 Env制備復(fù)合物，與兔中的抗體應(yīng)答進(jìn) 行比較。免疫方案是在第O、 4和24周時進(jìn)行免疫；認(rèn)為需要時，可在以后的時間 點(diǎn)給予額外的增強(qiáng)劑。實施例4低聚包膜蛋白中GP41亞單位的隱藏表位的暴露CD4最小組件和包含這些最小組件的融合蛋白可誘導(dǎo)低聚(o-gpl40)包膜蛋白構(gòu) 型的轉(zhuǎn)化，暴露出接近gpl20亞單位中的共同受體位點(diǎn)的隱藏表位，并有效提高在 不同gpl20包膜蛋白中的共同受體結(jié)合親和力。采用SPR技術(shù)和2F5 mAb或DP178 肽(或同源物)對通過本文CD4最小組件和含有這些CD4小蛋白的融合蛋白誘導(dǎo)的這 種構(gòu)象轉(zhuǎn)變進(jìn)行了測試。還檢測了加上獲自CCR5共同受體N端結(jié)構(gòu)域的肽(已顯示 該肽結(jié)合于gpl20)的效果。如果證實了gp41表位的暴露，則將該肽化學(xué)偶聯(lián)于CD4融合蛋白，以產(chǎn)生新型 的在暴露gp41表位中具有提高潛能的雙官能配體。也采用化學(xué)或遺傳學(xué)方法產(chǎn)生摻 入了該雙官能配體的新型嵌合低聚包膜蛋白，并對其進(jìn)行了測試。然后在動物中測 試具有優(yōu)良暴露gpl20和gp41隱藏表位特性的候選包膜蛋白對中和抗體的誘導(dǎo)作 用。實施例5產(chǎn)生靶向ENV隱藏保守表位的單克隆抗體按照標(biāo)準(zhǔn)操作，將所選融合蛋白和含有這些融合蛋白的復(fù)合物免疫原注射入大鼠 以制備單克隆抗體。在ELISA中篩選抗CD4小蛋白-gpl20復(fù)合物、抗與o-gpl40、o-gpl40復(fù)合的CD4小蛋白融合蛋白以及抗單獨(dú)的gpl20禾t] o-gpl40的克隆。在 Biacore中進(jìn)一步測試與單獨(dú)的包膜蛋白相比對于復(fù)合物具有最高親和力的克隆。選 擇在Biacore中抗CD4M33-gp120和/或CD4M33-o-gpl40復(fù)合物的評分為陽性的克 隆，并用于大量生產(chǎn)腹水。
權(quán)利要求
1. 一種雜合分子組合物，其含有骨架多肽和CD4小蛋白，當(dāng)所述雜合分子結(jié)合 HIV Env多肽時所述雜合分子誘導(dǎo)所述HIV Env多肽發(fā)生構(gòu)象改變。
2. 如權(quán)利要求1所述的雜合分子組合物，其特征在于，所述骨架多肽選自侵襲素 多肽或tat多肽。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的雜合分子組合物，其特征在于，所述骨架多肽是異源多肽。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的雜合分子組合物，其特征在于，所述骨架多肽是同源多肽。
5..種雜合分f組合物，其含有HIV Tat多肽或其片段；和CD4小蛋白，其中 所述雜合分子結(jié)合于HIVEnv多肽。
6. 如權(quán)利要求1-5中任一項所述的雜合分子組合物，其特征在于，所述CD4小 蛋白是含有CD4的氨基酸殘基15-85的CD4最小組件。
7. 如權(quán)利要求2-5中任一項所述的雜合分子組合物，其特征在于，所述Tat多肽 包括全長Tat多肽或其變體。
8. 如權(quán)利要求7所述的雜合分子組合物，其特征在于，所述Tat多肽是包含Tat 蛋廣i!氨基酸殘基1-86的全長Tat多肽的片段或其變體，根據(jù)SEQ ID NO:2或其變體 編號。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的雜合分子組合物，還包含一種或多種其它異源 多肽。
10. 如權(quán)利要求9所述的雜合分子組合物，其特征在于，所述一種或多種其它異 源多肽選自病毒多肽、免疫調(diào)節(jié)多肽或細(xì)菌多肽。
11. 如權(quán)利要求IO所述的雜合分子組合物，其特征在于，所述其它異源多肽是病 毒多肽，所述病毒是HIV。
12. 如權(quán)利要求1-11中任一項所述的雜合分子組合物，其特征在于，所述HIVtat 多肽或其片段、CD4小蛋白和其它異源多肽中的一種或多種以編碼所述多肽、其片 段或小蛋白的多核苷酸提供。
13. —種免疫原性組合物，其含有如權(quán)利要求1-12中任一項所述的雜合分子組合 物和HIV Env多肽。
14.如權(quán)利要求13所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述HIVEnv多肽包 括gpl20或低聚gpl40。
15. —種免疫原性組合物，其含有如權(quán)利要求1-12中任一項所述的雜合分子組合 物和HIVEnv多肽，其中所述雜合分子組合物通過交聯(lián)與所述HIVEnv多肽復(fù)合。
16. 如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述雜合分子組合物通 過用固定劑交聯(lián)而與所述HIV Env多肽復(fù)合。
17. 如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述固定劑包括甲醛或戊—r.醛。
18. -種免疫原性組合物，其含有如權(quán)利要求1-12中任一項所述的雜合分子組合 物和HIVEnv多肽，其中所述雜合分子組合物和所述HIVEnv多肽自發(fā)形成復(fù)合物。
19. --種免疫原性組合物，其含有如權(quán)利要求1-12中任一項所述的雜合分子組合 物、HIV Env多肽和CD4最小組件-Tat融合蛋白。
20. 如權(quán)利要求13-19中任一項所述的免疫原性組合物，還包含佐劑。
21. —種多核苷酸，其編碼HIV tat多肽或其片段、CD4小蛋白和異源多肽中的 亍:少一種。
22. 如權(quán)利要求21所述的多核苷酸，還編碼HIVEnv多肽。
23. —種細(xì)胞，其含有權(quán)利要求21或22所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸 操作性連接于與在所述細(xì)胞中表達(dá)所述多核苷酸相容的控制元件。
24. —種載體，其含有權(quán)利要求21或22所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸 操作性連接于與在對象中表達(dá)所述多核苷酸相容的控制元件。
25. —種制備結(jié)合于HIVEnv功能性表位的抗體的方法，所述方法包括在允許在 所述對象中產(chǎn)生抗體的條件下給予該對象如權(quán)利要求13-20中任一項所述的免疫原 性組合物。
26. 如權(quán)利要求25所述的方法，還包括分離所述對象中產(chǎn)生的抗體的步驟。
27.
28. —種制備含有與CD4蛋白復(fù)合的HIVEnv多肽序列的多肽的方法，所述方法 包括在允許表達(dá)所述多核苷酸并產(chǎn)生含有所述HIV Eiw多肽的所述多肽的條件下孵 育如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞。
29. —種在對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述對象其量足以在 所述對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的如權(quán)利要求13-20中任一項所述的免疫原性組合物。
30. —種DNA免疫方法，所述方法包括在對象中引入如權(quán)利要求24所述的載體。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述載體是非病毒載體。
32. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，用微粒運(yùn)載體將所述載體引入所述對象。
33. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述載體是病毒載體。
34. 如權(quán)利要求29-33中任一項所述的方法，其特征在于，所述對象是哺乳動物。
35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
36. —種在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括在允許在所述對象中表達(dá) 所述多核苷酸并產(chǎn)生編碼的多肽的條件下用權(quán)利要求24所述的載體轉(zhuǎn)染所述對象的 細(xì)胞。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述載體是非病毒載體。
38. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述載體用微粒運(yùn)載體遞送。
39. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述載體是病毒載體。
40. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述對象是哺乳動物。
41. 如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
42. 如權(quán)利要求36-41中任一項所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染離體進(jìn)行且 所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被重新引入所述對象。
43. 如權(quán)利要求36-41中任一項所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染在所述對象 體內(nèi)進(jìn)行。
44. 一種在對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括(a) 在初免步驟中給予所述對象第一組合物，其中所述第一組合物包含編碼HIV tat多肽或其片段、CD4小蛋白和異源多肽中至少一種的多核苷酸；和(b) 以足以在所述對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量給予所述對象第二組合物作為增強(qiáng) 劑，其中所述第二組合物包含如權(quán)利要求1-20中任一項所述的組合物。
45. 如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述第一組合物的多核苷酸還編碼 HIV Env多肽。
46. 如權(quán)利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述第一組合物或第二組合 物還含有佐劑。
47. 如權(quán)利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述第一組合物還含有編碼 HIV Gag多肽的序列。
48. 如權(quán)利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述第二組合物還含有HIV
全文摘要
描述了一種含有與一種或多種HIV Tat多肽組合的CD4最小組件或模擬物的雜合分子，所述CD4最小組件或模擬物與HIV Env多肽結(jié)合。還描述了這些雜合分子與Env的復(fù)合物以及用所述多核苷酸和多肽進(jìn)行診斷、治療和預(yù)防的方法。
文檔編號C07K19/00GK101146827SQ200680008974
公開日2008年3月19日 申請日期2006年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者I·斯里瓦斯塔瓦, R·拉普奧里, S·巴尼特, V·沙馬 申請人:諾華疫苗和診斷公司