專利名稱：胱天蛋白酶－2抑制劑及其生物學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胱天蛋白酶-2抑制劑及其生物學(xué)用途，特別是用于治療局部和全面腦缺血的用途。
I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域，并且涉及新型化合物和藥物組合物，其能抑制促進(jìn)細(xì)胞凋亡的(pro-apoptotic)胱天蛋白酶-2(Nedd-2；Ich-1)，以治療與胱天蛋白酶-2活性相關(guān)的疾病和損傷。更確切地(a)本發(fā)明涉及用于阻斷、預(yù)防或治療細(xì)胞死亡，特別是體內(nèi)腦細(xì)胞死亡的手段、方法和產(chǎn)品。
(b)本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)胱天蛋白酶-2是在體外和在體內(nèi)病理學(xué)狀態(tài)中抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡(特別是細(xì)胞凋亡)的上游主要關(guān)卡，所述病理學(xué)狀態(tài)包括腦缺氧-缺血(H-I)損傷和中風(fēng)樣狀態(tài)，其導(dǎo)致了腦損傷(在神經(jīng)元或其他非神經(jīng)元細(xì)胞中)例如，MCAO(大腦中動(dòng)脈閉塞)，全面(由于在心搏停止或心血管損傷期間的血流量減少或缺氧造成)或局部的、短暫或永久的、成年人或新生兒的H-I，有或沒有缺氧和/或低血糖的缺血，有或沒有再灌注的H-I。
(c)本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑(例如，Qco-VDVAD-dfp)能防止或減少體內(nèi)腦細(xì)胞死亡。
(d)本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑(例如，Qco-VDVAD-dfp)能在體內(nèi)病理學(xué)狀態(tài)中防止或減少腦細(xì)胞死亡，所述體內(nèi)病理學(xué)狀態(tài)包括局部短暫新生兒H-I之后的缺血性損傷。
(e)本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑(例如，Qco-VDVAD-dfp)能在體內(nèi)病理學(xué)狀態(tài)中防止或減少腦細(xì)胞死亡，所述體內(nèi)病理學(xué)狀態(tài)包括在心搏停止或心血管損傷期間的血流量減少或缺氧之后的成年人全腦缺血。
(f)本發(fā)明涉及特異的新的胱天蛋白酶-2抑制劑的新用途，包括局部(例如，腦室內(nèi)，海馬內(nèi)...)輸送或全身性(腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)...)施用，以便減少病理學(xué)狀態(tài)期間的腦細(xì)胞死亡，在所述病理學(xué)狀態(tài)中，血流量和氧氣壓力受到干擾，即，腦的(短暫或永久性)局部或全面缺血。
II.支持本發(fā)明的數(shù)據(jù)本發(fā)明涉及用于阻斷、預(yù)防或治療細(xì)胞死亡，特別是神經(jīng)元細(xì)胞死亡的手段、方法和產(chǎn)品。
在胚胎發(fā)生期間出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞死亡，以除去多余的神經(jīng)元，從而確保適當(dāng)?shù)耐挥|前和突觸后連接，和使得能夠形成功能性成體大腦。除了與正常衰老相關(guān)的有絲分裂后死亡之外，環(huán)境或遺傳突變因素可以在急性損傷期間在成年人中誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡(例如，缺氧-缺血，中風(fēng)，脊髓損傷，創(chuàng)傷)或慢性神經(jīng)變性疾病。與這些病癥相關(guān)的細(xì)胞死亡可能通過三種不同的機(jī)制發(fā)生，表現(xiàn)出壞死、自體吞噬或細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。生理學(xué)和病理學(xué)神經(jīng)元死亡通常與缺陷的細(xì)胞凋亡調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)，上述變化在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致了主動(dòng)的細(xì)胞自殺機(jī)制，可以劃分成半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(胱天蛋白酶)-依賴型與胱天蛋白酶-獨(dú)立型途徑。
神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是主動(dòng)的細(xì)胞自殺機(jī)制，它可以劃分成一系列連續(xù)的階段，包括開始、決定、執(zhí)行和降解。這一連串的事件是由特殊機(jī)制的激活驅(qū)動(dòng)的，涉及半胱氨酸-依賴型天冬氨酸特異性蛋白酶(胱天蛋白酶)的激活和可能起著決定性(或放大器)調(diào)節(jié)性細(xì)胞器作用的線粒體。實(shí)際上，線粒體改變包括線粒體內(nèi)膜電化學(xué)梯度(Δψm)的消失，和產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的因子的釋放，如細(xì)胞色素c、Smac/Diablo和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子。一旦從線粒體中釋放，這些效應(yīng)子就會(huì)啟動(dòng)胱天蛋白酶-依賴型和/或胱天蛋白酶-獨(dú)立型細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核分解。因此，線粒體因子與胱天蛋白酶組合，共同引起了細(xì)胞凋亡的降解階段，導(dǎo)致細(xì)胞收縮、細(xì)胞核凝聚、細(xì)胞凋亡體散發(fā)和″吃了我″信號(hào)的出現(xiàn)，如在吞噬作用之前磷脂酰絲氨酸易位到細(xì)胞質(zhì)膜的外部小葉中。
線粒體、胱天蛋白酶和其他事件在體外或體內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡期間的分別的作用仍然有待闡明，特別是相對缺血性或中風(fēng)-樣損傷而言。
正如所指出的，本發(fā)明人提供了能夠在體外或在細(xì)胞中抑制胱天蛋白酶-2活性的有用的手段和分子，通過使用特異的體外胱天蛋白酶測定法和在神經(jīng)元培養(yǎng)中的血清剝奪作為與體內(nèi)缺血相關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 本發(fā)明的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑能識(shí)別胱天蛋白酶-2，并且防止和阻斷其活性，所述抑制劑基于以下主鏈2-喹啉基羰基-L-纈氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-纈氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯(SEQ1)一種優(yōu)選的分子相當(dāng)于SEQ1。
其他優(yōu)選的分子包括特別是在表1-14中所示的結(jié)構(gòu)II至XIX。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能抑制促進(jìn)細(xì)胞凋亡的胱天蛋白酶-2活性并且誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用的產(chǎn)品(分子或制劑)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療與胱天蛋白酶-2相關(guān)的疾病和損傷的產(chǎn)品和藥物組合物以及方法。
本發(fā)明人業(yè)已開發(fā)了藥理學(xué)特異性肽，優(yōu)選基于五肽的分子，但不排除其他分子，用于直接抑制胱天蛋白酶-2活性，以便減弱由胱天蛋白酶-2介導(dǎo)的體外和體內(nèi)細(xì)胞死亡。
這樣的抑制劑能夠防止或阻斷細(xì)胞死亡中的胱天蛋白酶-2活性。所述細(xì)胞是神經(jīng)元，或神經(jīng)元細(xì)胞，或非神經(jīng)元細(xì)胞。
上面定義的抑制劑可用于體內(nèi)抑制胱天蛋白酶-2活性，以提供神經(jīng)保護(hù)或腦保護(hù)作用。它們還可以用于體內(nèi)抑制胱天蛋白酶-2活性，以提供細(xì)胞保護(hù)作用。
根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在(全面或局部)缺血性損傷之后在腦中防止細(xì)胞死亡的方法。
正如由所述例子所表明的，本發(fā)明提供了用于阻斷或預(yù)防或治療細(xì)胞死亡，特別是在受損傷的(缺血的)腦中阻斷或預(yù)防或治療細(xì)胞死亡的手段、方法和產(chǎn)品。
正如所指出的，本發(fā)明人證實(shí)了特異性胱天蛋白酶-2抑制劑(單一腹膜內(nèi)注射劑量)能在新生兒短暫缺氧-缺血腦損傷中誘導(dǎo)顯著的梗塞減少。當(dāng)在缺血發(fā)作之前或之后施用胱天蛋白酶-2抑制劑時(shí)獲得了梗塞體積的減少。由所述抑制劑提供的細(xì)胞保護(hù)作用不是由溫度(低溫或高溫)調(diào)控作用介導(dǎo)的，但是，體內(nèi)胱天蛋白酶-2活性或胱天蛋白酶-2加工在注射所述抑制劑之后終止。
正如所指出的，本發(fā)明人證實(shí)了胱天蛋白酶-2抑制劑(單一劑量)的專一性腦室內(nèi)(ICV)施用，導(dǎo)致了甲酚紫(Cresyl-Violet)強(qiáng)度染色的部分增強(qiáng)，在受損傷的細(xì)胞中沒有攝取入Fluoro Jade B，細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的改善或保持(Hoechst 33342)以及經(jīng)抑制劑處理的大鼠行為的顯著改善(缺血后重新進(jìn)食；在關(guān)于自主活動(dòng)性和反應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)中有較高的得分)。由所述抑制劑提供的細(xì)胞保護(hù)和行為效果不是通過溫度(低溫和高溫)調(diào)控作用介導(dǎo)的。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明還涉及能夠防止胱天蛋白酶-2活性的分子，以及可用于治療與胱天蛋白酶-2相關(guān)的疾病和損傷的藥物組合物。
在對于胱天蛋白酶-2抑制的條件下將合成的分子導(dǎo)入人或動(dòng)物中。所述導(dǎo)入步驟包括作為合適載體的分子的化學(xué)修飾或通過注射進(jìn)行。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含特異性胱天蛋白酶-2抑制劑的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物包含治療有效量的上述至少一種胱天蛋白酶-2抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。
抑制劑的施用是通過(但不局限于)口、鼻、局部(腦室內(nèi)、海馬內(nèi)或其他腦內(nèi)輸送，用于機(jī)械輸送的儀器的腦內(nèi)植入，例如用化合物或藥物組合物浸漬過的Gelfoam)或全身性(腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)...)途徑，或腦內(nèi)輸送或作為氣霧劑來施行的，以便減少體內(nèi)腦細(xì)胞死亡。
本發(fā)明還涉及將所述胱天蛋白酶-2抑制劑用于生產(chǎn)用于預(yù)防或治療與胱天蛋白酶-2活性相關(guān)的病理學(xué)的藥物的用途。
本發(fā)明的藥物組合物特別可用于預(yù)防、減輕和治療具有細(xì)胞死亡的病理學(xué)，特別是在H-I損傷和中風(fēng)-樣狀態(tài)腦損傷中例如，全面或局部的、短暫或永久的、成年人或新生兒的H-I(有或沒有缺氧/低血糖的缺血)，其根源在腦或心臟水平上，有或沒有再灌注，或MCAO(大腦中動(dòng)脈閉塞)。
本發(fā)明的藥物組合物特別可用于-預(yù)防和/或治療在慢性變性疾病例如神經(jīng)變性疾病期間的細(xì)胞凋亡，包括阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病、帕金森病、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓延髓萎縮、朊病毒病、癡呆，或-預(yù)防和/或治療視網(wǎng)膜周細(xì)胞細(xì)胞凋亡、視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、青光眼、由于局部缺血導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷、糖尿病性視網(wǎng)膜病，或-預(yù)防和/或治療癲癇，或-預(yù)防和/或治療脊髓損傷期間的細(xì)胞凋亡，或預(yù)防和/或治療由于創(chuàng)傷性腦損傷、視網(wǎng)膜缺血造成的細(xì)胞凋亡，或-預(yù)防和/或治療在腦局部缺血的病理學(xué)狀態(tài)期間的細(xì)胞凋亡，或-提供腦保護(hù)作用，或-預(yù)防和/或治療與自身免疫性疾病和移植排斥相關(guān)的由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，或-預(yù)防和/或治療心臟細(xì)胞的細(xì)胞死亡，包括心力衰竭、心肌病、心臟的病毒感染或細(xì)菌感染、心肌缺血、心肌梗死、和心肌缺血、冠狀動(dòng)脈旁路移植，或-預(yù)防和/或治療線粒體藥物毒性，例如，由于化療或HIV治療而引起的，-預(yù)防和/或治療病毒感染或細(xì)菌感染期間的細(xì)胞死亡，或
-預(yù)防和/或治療炎癥或炎性疾病，炎性腸病，敗血癥和敗血癥性休克，或-預(yù)防從濾泡到卵母細(xì)胞階段、從卵母細(xì)胞到成熟卵子階段和精子的細(xì)胞死亡(例如，冷凍和移植卵巢組織、人工受精的方法)，或-在化療之后保存女性和男性的生育能力，或-保存雌性和雄性動(dòng)物的生育能力，或預(yù)防和/或治療黃斑變性和青光眼，或預(yù)防和/或治療急性肝炎、慢性活動(dòng)型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎，或-預(yù)防和/或治療脫發(fā)，所述脫發(fā)是由于男性型禿發(fā)、輻射、化療或情緒應(yīng)激而引起的，或-治療或緩解皮膚損傷(由于暴露于大劑量輻射、熱、灼燒、化學(xué)品、陽光和自身免疫性疾病)，或-預(yù)防骨髓異常增生綜合征(MDS)中的骨髓細(xì)胞的細(xì)胞死亡，或-預(yù)防和/或治療胰腺炎，或-預(yù)防和/或治療呼吸綜合征，或-預(yù)防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、腎小球腎炎、動(dòng)脈粥樣硬化和移植物抗宿主病，或-預(yù)防和/或治療與細(xì)胞凋亡增強(qiáng)相關(guān)的疾病狀態(tài)，或-預(yù)防植物性生物體(例如植物、花、藻菌植物(蘑菇，海藻)...)中的細(xì)胞死亡。
本文所使用的術(shù)語“治療”表示獲得有益的或所需的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方法。有益的或所需的臨床結(jié)果可以包括，但不局限于，減輕或緩解一個(gè)或多個(gè)癥狀或病狀，減輕疾病程度，穩(wěn)定(即不再惡化)疾病狀態(tài)，防止疾病擴(kuò)散，推遲或延緩疾病發(fā)展，緩解或減輕疾病狀態(tài)，以及平息(部分或全部)，無論是可檢測的或不可檢測的?！爸委煛边€可以表示與如果不接受治療所預(yù)期的存活時(shí)間相比延長了存活時(shí)間。
本發(fā)明還涉及治療與細(xì)胞死亡相關(guān)的病理學(xué)(特別是缺血和中風(fēng)損傷)的方法，包括施用治療有效劑量的如上文所述的藥物組合物。
在下面結(jié)合附圖給出的數(shù)據(jù)中提供了本發(fā)明的確切的特征和優(yōu)點(diǎn)，所述數(shù)據(jù)為III.胱天蛋白酶-2的肽和假肽抑制劑1.Qco-VDVAD-dfpQco-VDVAD-dfp(SEQ1)是假肽(MW827)，它能在體外選擇性地抑制人重組胱天蛋白酶-2(IC50＝80nM)，但不能抑制其他半胱氨酸-蛋白酶。它組合了五肽VDVAD(在天冬氨酸殘基上被O-甲基(OMe)取代過的L-纈氨酰-L-天冬氨酰-L-纈氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰)部分、喹啉基羰基和2，6-二氟苯酯主鏈。它的結(jié)構(gòu)式是Ia/Ib，相應(yīng)于喹啉核上有取代過的VD(OMe)VAD(OMe)-Oph的情形例如，2-喹啉基羰基-L-纈氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-纈氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯(II，n＝0)。

2-喹啉基羰基-L-纈氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-纈氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯＝SEQ12.氨基酸側(cè)鏈和官能團(tuán)的修飾本發(fā)明的其他新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑是基于下面的結(jié)構(gòu)III的 其中(i)每一個(gè)氨基酸的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)R1和R2是氫原子，氘原子，C1-20脂族基團(tuán)，取代過的或未取代過的芳基，環(huán)烷基，萘基，取代過的萘基，2-苯并唑基，取代過的2-唑基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基，CH2N2，CH2Y，OH，OR，NH2，NHR，NR2，SR，COR，CO2R，CONR2，CH2OCOR，CH2O-CO芳基，CH2O-C(O)取代過的芳基(例如2，6-二甲基苯甲酰氧基甲基)，CH2O-C(O)取代過的芳基，CH2O-C(O)雜芳基，CH2O-C(O)取代過的雜芳基或CH2OPOR2；
(iii)R3，R4，R5和R6是二十種氨基酸(半胱氨酸除外)之一的側(cè)鏈。例如，所述五肽還可以是Leu-Asp-Glu-Ser-Asp的類似物。R3，R4，R5和R6還可以是C1-20脂族基團(tuán)，環(huán)烷基，萘基，取代過的萘基，2-苯并唑基，取代過的2-唑基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基，CH2N2，(CH2)nZ，CH2OCOR，CH2OCO(芳基)，CH2OCO(取代過的芳基)，CH2OCO(雜芳基)，CH2OCO(取代過的雜芳基)或CH2OPOR2；(iv)R7是氫原子，R8是R，U，CO(CH2)nNH(U)，CO(CH2)nS(U)；(v)U是(未)取代過的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，C1-20直鏈或支鏈烷基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基，或標(biāo)記基團(tuán)，如熒光團(tuán)標(biāo)記或可用于電子顯微術(shù)的標(biāo)記；特別是生物素，二硝基苯基(DNP)，碘乙酰胺，DTNB，COR(例如，2-喹啉基羰基)，COOR，CO(CH2)nNH(Z)，吖啶衍生物(紅色，黃色，橙色...)，熒光素衍生物(熒光素，F(xiàn)ITC，F(xiàn)AM(羧基熒光素)，5-(和-6)-羧基萘并熒光素，羧基熒光素，BCECF，萘熒光素(naptofluorescein)...)，Oregon Green(2′，7′-二氟熒光素)染料(Oregon Green488，OregonGreen514...)，BODIPY(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-引達(dá)省-3-丙酸)染料(BODIPY FL，BODIPY TMR，BODIPY TR，BODIPY 630/650，BODIPY 630/665...)，Bimane，香豆素衍生物(氨甲基香豆素(AMC)，AMCA，氨基香豆素，二乙基氨基香豆素，羥甲基香豆素；羥基香豆素，甲氧基香豆素，AFC，...)，花青苷衍生物(藻藍(lán)素，別藻藍(lán)素(APC)，CY3.18，CY5.18，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7...)，赤蘚素/藻紅素衍生物(R-藻紅素(PE)，B-藻紅素...)，APC/PE-Cy綴合物(PE-Cy5綴合物，PE-Cy7綴合物，APC-Cy7綴合物...)，鈣黃綠素衍生物(鈣黃綠素，SNAFL鈣黃綠素...)，DANS，DANSA，Cascade Blue，螢光黃，NBD，Red 613，F(xiàn)luorX，若丹明衍生物(若丹明123，若丹明110，若丹明B，若丹明6A，若丹明6G，TRITC，X-若丹明，硫代若丹明(sulphorhodamin)，若丹明Red-X，LissamineTM若丹明B，DHR，若丹明Green...)，PerCP，Texas Red，TruRed，Alexa Fluo(Alexa Fluor 350，Alexa Fluor 430，AlexaFluor 488，Alexa Fluor 532，Alexa Fluor 546，Alexa Fluor 555，Alexa Fluor 568，Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 633，Alexa Fluor647，Alexa Fluor 660，Alexa Fluor 680，Alexa Fluor 700，AlexaFluor 750...)，Q-DOTsTM衍生物(655，605，585，525，...)，SNARF，ZenonTM衍生物(ZenonTMAlexa Fluor350，ZenonTMAlexaFluor488，ZenonTMAlexa Fluor555，ZenonTMAlexa Fluor594，ZenonTMAlexa Fluor647，ZenonTM別藻藍(lán)素，ZenonTM生物素-XX，ZenonTMR-藻紅素，...)；NBD，Texas Red，QSY染料(QSY7，QSY9，QSY35，QSY21)，Hoechst(33342，33258)，DAPI，色霉素A3，光神霉素，SYTOX(藍(lán)色，綠色，橙色)，Ethdium，溴化乙錠，7-AAD，TOTO染料，YOYO染料，TO-PRO染料，BOBO染料，JO-PRO染料，LO-PRO染料，PO-PRO染料，YO-PRO染料，噻唑橙，碘化丙啶(PI)，LDS 751，Indo染料(Indo-1...)，F(xiàn)luo染料(Fluo-3...)，DCFH，pNA，SYBR green II，SyPro(Orange，Ruby)，EDANS，IR800，DiI，DiO，DiD，SNARF衍生物，F(xiàn)ura染料，QUIN染料，NANOGOLD顆粒，NANOGOLD馬來酰亞胺，AlexaFluor FluoroNANOGOLD，AlexaFluorFluoroNANOGOLD鏈霉抗生物素蛋白，孔雀石綠，Dabcyl，Dabsyl，Cascade yellow，丹磺酰，Dapoxyl，PyMPO，芘，苯并二唑衍生物，(鏈霉抗生物素蛋白-/中性抗生物素蛋白-)生物素-標(biāo)記的熒光微球，鏈霉抗生物素蛋白的CMNB-籠化的熒光素綴合物，calcofluor white，nile red，Y66F，Y66H，EBFP，GFP野生型，QFP突變體H9/P4/P9/P11/W，GFPuv，ECFP，Y66W，S65A，S65C，S65L，S65T，EGFP，EYFP，ECFP，DsRed1，DsRed2，NANOGOLD顆粒，鏈霉抗生物素蛋白-Nanogold，Monomaleido Nanogold，單-硫代-NHS-Nanogold，單氨基Nanogold，帶正電荷/負(fù)電荷的Nanogold(NN，NHSN，NHSNA，NHSNS)，非-功能化的Nanogold，Monomaleido Nanogold，單-硫代-NHS-Nanogold，單氨基Nanogold，非-功能性Nanogold，Nanogold-綴合物，Nanogold-鏈霉抗生物素蛋白，脂質(zhì)-Nanogold(棕櫚酰Nanogold，DPPE Nanogold，棕櫚酰Undeoagold，DPPEUndecagold)，Ni-NTA-Nanogold，Alexa Fluor488FluoroNanogold，Alexa Fluor594 FluoroNanogold，熒光素FluoroNanogold，HRP底物-Nanogold。
(vi)R7和R8還可以與插入其間的氮一起形成雜環(huán)，如取代過的或未取代過的四氫喹啉，四氫異喹啉，二氫吖啶，苯氮雜(benzazepine)，吡咯烷，嗎啉，thiomortholine，哌嗪，哌啶，二氫吡啶，苯并咪唑，咪唑，咪唑啉，吡咯，吡咯烷，吡咯啉，吡唑，吡唑啉，吡唑烷，三唑，哌啶，嗎啉，硫代嗎啉，哌嗪，咔唑，吩噻嗪，吩嗪，二氫吩嗪，二氫噌啉，二氫喹喔啉，二氫萘啶，四氫萘啶，二氫吖啶，吲哚，異吲哚，二氫吲哚，吲哚啉，吲唑，嘌呤，9，10-二氫菲啶，5H-二苯并[b，f]氮雜，10，11-二氫-5H-二苯并[b，f]氮雜，β-咔啉，吡啶并[4，3-b]吲哚，2，3，9-三氮雜芴(2，3，9-triazofluorene)，9-硫雜-2，10-二氮雜蒽，噻吩并[3，2b]吡咯，二氫菲；(vii)R是氫原子，C1-20脂族基團(tuán)，芳基，取代過的芳基(例如4-硝基苯基或香豆素衍生物)，雜芳基(例如，2-吡啶)，取代過的雜芳基，環(huán)烷基，萘基，取代過的萘基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基(例如2，6-二鹵苯基)，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基或(未)取代過的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，芴甲基；(viii)Y是帶負(fù)電荷的離去基團(tuán)，包括鹵素，如F、Cl、Br或I，芳基或烷基磺酰氧基，三氟甲烷磺酰氧基，OR，SR，COOR，OP(O)R2，其中R是脂族基團(tuán)，芳基，芳烷基，碳環(huán)基團(tuán)，烷基碳環(huán)基團(tuán)，或雜環(huán)基團(tuán)；(ix)Z是鹵素(F、Cl、Br或I)，CN，OH，OR，NH2，NHR，NR2，SR，COR，CO2R，CONR2；
(x)n是0-20。
在本文中，將采用以下定義，除非另有說明?？s寫Q和OPH分別表示喹啉基羰基和2，6-二氟苯氧基。在本文中，術(shù)語“脂族”表示直鏈或支鏈C1-20烴，它是完全飽和的或它包含一個(gè)或多個(gè)不飽和單位。術(shù)語“烷基”單獨(dú)使用或者作為較大部分的一部分使用，都表示包含一至二十個(gè)碳原子的直鏈或支鏈。術(shù)語“芳基”表示具有五至十四個(gè)原子的單環(huán)或多環(huán)芳族環(huán)基團(tuán)，如苯基、萘基或蒽基。術(shù)語“雜環(huán)基團(tuán)”表示飽和的或不飽和的多環(huán)或單環(huán)系統(tǒng)，其包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，并且環(huán)的大小為三至九，例如呋喃基，噻吩基，吡咯基，吡咯啉基，吡咯烷基，二氧戊環(huán)基，唑基，噻唑基，咪唑基，咪唑啉基，咪唑烷基，吡唑基，吡唑啉基，吡唑烷基，異唑基，異噻唑基，二唑基，二烷基，嗎啉基，二噻烷基，硫代嗎啉基，噠嗪基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，三嗪基，三噻烷基，吲嗪基，吲哚基，異吲哚基，吲哚啉基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲唑基，苯并咪唑基，苯噻唑基(benzthiazolyl)，嘌呤基，喹嗪基，喹啉基，異喹啉基，噌啉基，酞嗪基，喹唑啉基，喹喔啉基，1，8-萘啶基，蝶啶基，奎寧環(huán)基，咔唑基，吖啶基，吩嗪基，吩噻嗪基，或吩嗪基?！半s芳基”表示芳香族雜環(huán)。術(shù)語“碳環(huán)基團(tuán)”表示不飽和的單環(huán)或多環(huán)碳環(huán)系統(tǒng)，其具有三至十四個(gè)碳，它可以與芳基或雜環(huán)基團(tuán)稠合。脂族基團(tuán)、烷基、芳基、雜芳基(例如喹啉)、雜環(huán)基團(tuán)或碳環(huán)基團(tuán)單獨(dú)使用或作為較大部分的一部分使用，表示取代過的或未取代過的基團(tuán)。在表示取代過的基團(tuán)時(shí)，這些基團(tuán)可以包含一個(gè)或多個(gè)取代基。這些取代基可以是鹵素(F，Cl，Br，I)，OH，U，CO(CH2)nNH(U)，CO(CH2)nS(U)，OR，SR，NH2，NHR，NR2，OCOR，OP(O)R2，其中，R是脂族基團(tuán)，芳基或取代過的基團(tuán)，芳烷基，碳環(huán)基團(tuán)，烷基碳環(huán)基團(tuán)，雜環(huán)基團(tuán)或放射性同位素(例如I125，H3，S35，C14，P33，P32，Cr51，Ca45，F(xiàn)e59，Ni63，Ba133，Cs137，Eu152，Ra226，Xe133，锝99，鉈201)。FITC表示異硫氰酸熒光素。
3.肽電子等排體或生物電子等排體(a)本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)式IV.1-IV.7的carba類似物(表1)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表1.肽VDVAD的carba類似物(化合物IV.1-IV.7)
(b)本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)式V.1-V.7的酮亞甲基類似物(表2)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表2.五肽VDVAD的酮亞甲基類似物(化合物V.1-V.7)
(c)本發(fā)明還涉及通用結(jié)構(gòu)式VI和VII的縮肽(depsi-peptides)類似物，其中
(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)X是O或NH，并且至少一個(gè)X是氧原子；(iii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的；(iv)R9是氫原子，(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，C1-20直鏈或支鏈烷基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基，OCOR或OCNHR。
(d)本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)式VIII.1-VIII.7的羥基亞乙基類似物(表3)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表3.VDVAD的羥基亞乙基類似物(化合物VIII.1-VIII.7)

(e)本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)式IX.1-IX.6的還原的五肽類似物(表4)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表4.VDVAD的還原的類似物(化合物IX.1-IX.6)
(f)本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)式X.1-X.7的不飽和的類似物(表5)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表5.VDVAD的不飽和的類似物(化合物X.1-X.7)

(g)本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)式XI.1-XI.9的β-肽，γ-肽，脲，和氨基甲酸酯類似物(表6)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)X是CH2，NH，O；(iii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表6.不飽和的類似物XI.1-XI.9


4.VDVAD五肽的受約束的類似物本發(fā)明還涉及表7-14所示的VDVAD五肽的受約束的類似物。在這些化合物中，芳基、雜芳基或雜環(huán)基團(tuán)表示取代過的或未取代過的基團(tuán)。在表示取代過的基團(tuán)時(shí)，這些基團(tuán)可以包含一個(gè)或多個(gè)取代基。這些取代基可以是鹵素(F，Cl，Br，I)，OH，U，CO(CH2)nNH(U)，CO(CH2)nS(U)，OR，SR，NH2，NHR，NR2，OCOR，OP(O)R2，其中，R和U是如上文所述的。
(a)本發(fā)明還涉及3-氨基吡啶-2(1H)-酮類，3-氨基吡嗪-2(1H)-酮類，5-氨基嘧啶-4(3H)-酮類，噠嗪-3(2H)-酮類，4-氨基噠嗪-3(2H)-酮類，5-氨基-1，2，4-三嗪-6(1H)-酮類，5-氨基-1，2，3-三嗪-4(3H)-酮類和6-氨基-1，2，3，4-四嗪-5(4H)-酮類，XII.1-XII.15(表7)，作為五肽VDVAD的受約束的類似物，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)W，X和Y是CH，C或N；(iii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表7.VDVAD的受約束的類似物(化合物XII.1-XII.15)


(b)本發(fā)明還涉及3-氨基哌啶-2-酮類，3-氨基哌嗪-2-酮類，5-氨基-四氫嘧啶-4(1H)-酮類，4-氨基哌嗪-3-酮類，6-氨基-1，2，4-三嗪-5-酮類，5-氨基-1，2，4-三嗪-6-酮類，5-氨基-1，2，3-三嗪-4-酮類和6-氨基-1，2，3，4-四嗪-5-酮類，XIII.1-XIII.15(表8)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)W，X和Y是CH2，NH，O或S；(iii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表8.VDVAD的受約束的類似物(化合物XIII.1-XIII.15)



(c)本發(fā)明的化合物還包括3-氨基-3，4-二氫喹啉-2(1H)-酮類，XIV.1-XIV.15(表9)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表9.VDVAD的受約束的類似物(化合物XIV.1-XIV.15)



(d)本發(fā)明還涉及4-氨基-1，2-二氫異喹啉-3(4H)-酮類，XV.1-XV.15(表10)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表10.VDVAD的受約束的類似物(化合物XV.1-XV.15)



(e)本發(fā)明還涉及1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酰胺類，XVI.1-XVI.15(表11)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表11.受約束的VDVAD類似物(化合物XVI.1-XVI.15)




(f)本發(fā)明還涉及4-氨基-1，2，4，5-四氫苯并[c]氮雜-3-酮類，XVII.1-XVII.15，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表12.受約束的VDVAD類似物(化合物XVII.1-XVII.15)




(g)本發(fā)明涉及1，2，3，4-四氫化萘類，XVIII.1-XVIII.15，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表13.受約束的氨基酸XVIII.1-XVIII.15




(h)本發(fā)明還涉及2，3-二氫-1H-茚類，XIX.1-XIX.15(表14)，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
表14.受約束的VDVAD類似物(化合物XIX.1-XIX.15)



所述胱天蛋白酶-2-抑制劑有利地是通過實(shí)施例中所舉例說明的合成途徑獲得的。具有在流程1-3中所給出的結(jié)構(gòu)的衍生物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用化學(xué)合成的經(jīng)典方法獲得。
下面將結(jié)合圖1-11提供本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)，這些附圖分別為-圖1Qco-VDVAD-dpf的體外特異性和效力；-圖2制劑的穩(wěn)定性HPLC測定。Qco-VDVAD-dfp；-圖3由Qco-VDVAD-dfp選擇性抑制胱天蛋白酶-2，可強(qiáng)有力地防止經(jīng)歷缺血性腦損傷的大鼠新生幼體的細(xì)胞死亡和腦梗死；-圖4在新生兒缺血性腦損傷期間，Q-VDVAD-OPH對胱天蛋白酶-2活性和胱天蛋白酶-2加工的體內(nèi)抑制作用；-圖5在缺血性大鼠(4VO)模型的海馬和皮層中的細(xì)胞死亡；-圖6缺血對CA3、齒狀回(dentus gyrus)(DG)和皮層(COR)的影響；-圖7在缺血之后72小時(shí)對細(xì)胞死亡的定量；-圖8Qco-VDVAD-dfp在非缺血性大鼠中無毒性；-圖9在年幼成年大鼠的海馬中缺血(4VO)之后72小時(shí)，Qco-VDVAD-dfp的神經(jīng)保護(hù)作用；-圖10在缺血之后72小時(shí)，Qco-VDVAD-dfp的定量的效用；和-圖11生理學(xué)和行為測試。
5.Qco-VDVAD-dfp是選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑5.1實(shí)驗(yàn)部分5.1.1體外胱天蛋白酶活性分析。將人重組胱天蛋白酶1-10(25U；QuantiZymeTMAssay System，BIOMOL，Plymouth，Pennsylvania，USA)在37℃下，與Qco-VDVAD-dfp一起在分析緩沖液(50mM HEPES，pH 7.4，100mM NaCl，0.1％CHAPS，10mM DTT，1mM EDTA，10％甘油)中預(yù)溫育30分鐘，并且與相應(yīng)的產(chǎn)生熒光的胱天蛋白酶底物(500μM；BIOMOL)混合Ac-YVAD-AMC(胱天蛋白酶-1)，Ac-VDVAD-AMC(胱天蛋白酶-2)，Ac-DEVD-AMC(胱天蛋白酶-3/7)，Ac-WEHD-AMC(胱天蛋白酶-4/5)，Ac-VEID-AMC(胱天蛋白酶-6)，Ac-IETD-AMC(胱天蛋白酶-8)，Ac-LEHD-AMC(胱天蛋白酶-9)，或Ac-IETD-AMC(胱天蛋白酶-10)。在熒光微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(TECAN，Genios；發(fā)射510nm，激發(fā)405nm)上評估底物的切割，并且根據(jù)劑量-反應(yīng)S形曲線測定出IC50值。每一種胱天蛋白酶的比活性用相應(yīng)的特異性抑制劑(1-2μM，BIOMOL和MPBioMedicals)進(jìn)行內(nèi)部控制。其他體外分析是在CEREP進(jìn)行的，或?qū)τ诨谛桠}蛋白酶和粒酶的測試用CEREP方案進(jìn)行。
IC50測定是通過在100μl分析緩沖液(50mM HEPES，pH 7.4，100mM NaCl，0.1％CHAPS，10mM DTT，1mM EDTA，10％甘油)中溫育濃度逐漸提高的Qco-VDVAD-dfp與重組胱天蛋白酶-2而測定的。在37℃下溫育30分鐘之后，在熒光微量培養(yǎng)板讀數(shù)器上測量重組胱天蛋白酶-2(125U)對50μM VDVAD-AMC的切割，通過在405nm的激發(fā)波長的情況下監(jiān)測510nm處的熒光發(fā)射來進(jìn)行。
5.1.2原代皮層神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)，和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元是從E14 SWISS小鼠胚胎(Janvier)培養(yǎng)的。通過頸脫位法處死小鼠，并且通過剖腹產(chǎn)取出胚胎。提取大腦皮質(zhì)，并用1000μl尖頭(Eppendorf)在L15培養(yǎng)基(Gibco BRL)中對組織進(jìn)行機(jī)械研磨，然后除去碎片，并且以850rpm的速度將細(xì)胞懸浮液離心10分鐘。神經(jīng)元以在補(bǔ)充了1％谷氨酰胺、5％馬血清(HS，Eurobio)和2.5％胎牛血清(FCS，Eurobio)的Eagle′s基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Eurobio)中的高密度(7×105活細(xì)胞/cm2)置于6或24孔平板(Sarstedt)中2天，或置于4-孔-Lab-Tek分室的蓋玻片(Nalge Nunc Internationnal)上2天，事先用1mg/ml聚氮丙啶(Sigma)進(jìn)行包被。在DIV3，每天更換培養(yǎng)基，并且將神經(jīng)元保持在含有180mg/l葡萄糖、5％HS和1％FCS、和3μM胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Sigma)以及1μM 5-甲基-10，11-二氫-5H-二苯并環(huán)庚烯-5，10-亞胺馬來酸鹽(MK-801，Sigma)的N5完全培養(yǎng)基中。用抗-微管相關(guān)蛋白2的單克隆抗體(MAP-2，Sigma)和抗-膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白的多克隆抗體(GFAP，Dako)控制培養(yǎng)物的純度(＞95％)。在24-孔平板上培養(yǎng)神經(jīng)元直至6DIV，并且進(jìn)行血清剝奪。簡而言之，在N5完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經(jīng)元用缺少血清的N5快速洗滌3次，并且在不含血清的N5培養(yǎng)基中，在沒有或有Qco-VDVAD-dfp的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
5.1.3細(xì)胞凋亡分析。分析是使用配備有100W水銀短弧光燈和X40N PLAN L物鏡或水浸X 100N PLAN物鏡的熒光顯微術(shù)(FM)(DM IRB倒置熒光顯微鏡，Leica，Rueil-malmaison，F(xiàn)rance)對先前染色的貼壁神經(jīng)元進(jìn)行的。通常，定量研究是通過FM對于大約200-600個(gè)細(xì)胞/視野而進(jìn)行的，每個(gè)實(shí)驗(yàn)中對5-10個(gè)隨機(jī)選擇的視野進(jìn)行評分，并且將流式細(xì)胞術(shù)(FC)用于較大的樣品通量。細(xì)胞凋亡的FC分析是在對染色的神經(jīng)元進(jìn)行胰蛋白酶消化之后進(jìn)行的，通過使用裝備有15mW空氣冷卻的488nm氬激光器的3-色FACSCalibur細(xì)胞計(jì)數(shù)器(BectonDickinson)。激活的胱天蛋白酶-2的檢測使用特異的FAM-綴合的肽(稱為FLICACaspaTagTM熒光素胱天蛋白酶活性試劑盒，Q-Biogen，Illkirch，F(xiàn)rance；ApoFluorTM胱天蛋白酶檢測試劑盒，MPBioMedicals)FAM-VDVAD-fmk。通過7-AAD(Sigma)整合來評估生存力喪失。
5.1.4制劑研究。將化合物Qco-VDVAD-dfp(SEQ1)溶于Tween 20或Pluronc F-68賦形劑中。在室溫下在整整7天，或在冷凍/融化包含多種10-100％的賦形劑的水溶液之后，使用HPLC(Varian ProStar 410，裝備有Nucleosile C18(8μm，3.9×150mm)，在214nm處檢測)追蹤測定穩(wěn)定性。
5.2結(jié)果Qco-VDVAD-dfp是選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑(IC50＝65-80nM)，對其他胱天蛋白酶或者至少32種其他相關(guān)的蛋白酶或參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)元代謝、一氧化氮途徑或前列腺素代謝的酶沒有交叉反應(yīng)性(圖1)。Qco-VDVAD-dfp是能滲透入細(xì)胞的，因?yàn)樗谄由窠?jīng)元培養(yǎng)物中的血清剝奪期間能防止胱天蛋白酶-2活性。另外，在該實(shí)驗(yàn)性胱天蛋白酶-2依賴性細(xì)胞死亡范例中，Qco-VDVAD-dfp在24小時(shí)能防止神經(jīng)元死亡(圖1)。另外，Qco-VDVAD-dfp適合于施用給動(dòng)物或人類，因?yàn)樗诨赥ween 20或Pluronic-F68的混合物中具有高溶解度。在室溫下放置7天或者在冷凍/融化之后沒有發(fā)現(xiàn)Qco-VDVAD-dfp降解(圖2)。
通過以下


了上述數(shù)據(jù)圖1.Qco-VDVAD-dpf的體外特異性和效力。(a)Qco-VDVAD-dfp對一組人重組胱天蛋白酶(1-10；50U)的體外特異性。用0.1μM的Qco-VDVAD-dfp進(jìn)行體外切割試驗(yàn)(n＝3；柱狀圖表示胱天蛋白酶活性％±SD)。(b)針對重組人胱天蛋白酶-265-80nM(n＝3，不同的批次)，測定IC50(能阻止50％的由人重組C2(125U)對于Ac-VDVAD-AMC的切割的濃度)的范圍。(c)Qco-VDVAD-dfp對24h-血清剝奪(SD)的神經(jīng)元的細(xì)胞保護(hù)作用。Qco-VDVAD-dfp能在24小時(shí)防止胱天蛋白酶-2活性和細(xì)胞死亡(n＝3)。(d)Qco-VDVAD-dfp(1μM)的抑制特性，是在32個(gè)其他與蛋白酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)元代謝、一氧化氮途徑或前列腺素代謝相關(guān)的體外藥理學(xué)分析中測定的(n-2)。
圖2.制劑的穩(wěn)定性HPLC測定。Qco-VDVAD-dfp(5×10-3M，在含有20％的Tween 20的生理學(xué)緩沖液中)在室溫下在7天之后都不會(huì)降解。
IV.在局部腦缺血之后，Qco-VDVAD-dfp在大鼠中的作用介紹中風(fēng)是發(fā)達(dá)國家導(dǎo)致成年人死亡的第三種最常見的病因，并且是在兒童中造成死亡和慢性神經(jīng)病態(tài)的重要原因。很多兒童中風(fēng)發(fā)生在在圍產(chǎn)期，即將出生之前或出生之后一個(gè)月內(nèi)。母親的缺血性中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)在接近分娩時(shí)同樣會(huì)增加，并且在即將生產(chǎn)前2天和生產(chǎn)后1天的發(fā)病率比在懷孕早期或在非懷孕狀態(tài)下的發(fā)病率高34倍。在母親和嬰兒中對于缺血性中風(fēng)以及對于在非腦部位形成血栓的易損性的提高，有可能與分娩激活了凝血機(jī)制相關(guān)，這可能是為了降低在這一關(guān)鍵時(shí)刻的出血風(fēng)險(xiǎn)而形成的進(jìn)化適應(yīng)機(jī)制。
圍產(chǎn)期缺血性中風(fēng)是在生產(chǎn)時(shí)刻左右的腦血管事件，具有局部動(dòng)脈梗塞的病理學(xué)或放射學(xué)征象。大部分圍產(chǎn)期中風(fēng)出現(xiàn)在大腦中動(dòng)脈(MCA)范圍內(nèi)。左半球損傷更為突出，其原因是血液動(dòng)力學(xué)差異，所述血液動(dòng)力學(xué)差異來自動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，或牽涉左頸總動(dòng)脈的更直接的途徑。腦梗死的分布隨著妊娠年齡而略有不同，早產(chǎn)嬰兒傾向于具有涉及MCA的皮層支或豆?fàn)詈思y狀體支的多灶性損傷，而足月嬰兒傾向于具有主干的閉塞。
1.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?.1短暫單側(cè)局部缺血模型新生的Wistar大鼠(母畜+9只幼崽/胎)是從Janvier(LeGenest-St-Isle，F(xiàn)rance)獲得的，此時(shí)所述幼崽為3-4天大。所述幼崽與它們的母畜一起圈養(yǎng)，采用12:12小時(shí)的光照-黑暗周期，可以自由地取食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是按照法國和歐共體有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的指南進(jìn)行的。缺血是按照以前所披露的方法(Renolleau等人，1998)用7天大的大鼠(17-21g)進(jìn)行的。通過腹膜內(nèi)注射水合氯醛(350mg/kg)對大鼠幼崽進(jìn)行麻醉。將麻醉的大鼠后背向下放置，并且在頸部形成中央切口，以便暴露出左頸總動(dòng)脈。然后將大鼠右側(cè)向下放置，并且在耳朵和眼睛之間形成斜的皮膚切口。在切除顳肌之后，將顱骨從額縫中取出，達(dá)到低于顴弓的水平。然后，就在其出現(xiàn)在嗅裂上之后暴露出來的左側(cè)大腦中動(dòng)脈凝結(jié)(coagulate)在低于大腦靜脈的水平上。在該過程之后，放置夾子以封閉左頸總動(dòng)脈。然后將大鼠放置在保溫箱中，以避免體溫過低。50分鐘之后，去掉夾子。借助于顯微鏡證實(shí)頸動(dòng)脈血流恢復(fù)。然后縫合頸部和顱部皮膚切口。在手術(shù)過程中，將體溫保持在37-38℃。將幼崽轉(zhuǎn)移到保溫箱(32℃)中，直到恢復(fù)，然后送回到它們的母畜那里。
在缺血發(fā)作之前5-15分鐘或缺血之后1小時(shí)，通過腹膜內(nèi)施用Qco-VDVAD-dfp，施用劑量為0.001-10mg/kg。對照動(dòng)物接受等體積的含有10％DMSO的0.9％鹽水(n＝15)，要求該媒介物(vehicle)可溶解胱天蛋白酶抑制劑(媒介物-處理組)。在缺血期間或殺死之前的大鼠死亡率在Qco-VDVAD-dfp和媒介物-處理組之間沒有差別(＜4％)。在再灌注之后48小時(shí)殺死大鼠，并且取出腦。由不了解動(dòng)物處理的觀察者用肉眼對梗塞損傷(蒼白區(qū))進(jìn)行評分。在放大鏡下觀察沒有明顯的缺血性蒼白區(qū)的腦。放棄那些沒有表現(xiàn)出明顯MCA閉塞的腦。
選擇從前紋狀體到后海馬的十六個(gè)切片(相應(yīng)于Paxinos′大鼠腦圖冊的圖版9-27)，以0.5-mm的相等的間隔獲得。使用圖像分析儀(NIH圖像軟件)在甲酚紫-染色的切片上測量損傷面積，并且將各個(gè)冠狀切片(coronal section)之間的距離用于計(jì)算梗塞體積。對腦切片進(jìn)行處理，以便進(jìn)行DNA鏈分解(TUNEL測定)，使用原位熒光素細(xì)胞死亡檢測試劑盒(Roche，Meylan，F(xiàn)rance)并按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。
對于Tunnel分析來說，然后將腦在4％緩沖的甲醛中固定2天。在恒冷切片機(jī)上切出五十微米的冠狀腦切片，并且收集在明膠包被的載玻片上。
按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。假設(shè)β風(fēng)險(xiǎn)為0.2，α風(fēng)險(xiǎn)為0.05，那么估計(jì)在每一組中需要15-16只動(dòng)物以檢測兩組之間50％的梗塞體積減少。因?yàn)樵谠搶?shí)驗(yàn)中比較了三組動(dòng)物，所以這些值只是參考性質(zhì)的。將具有六只動(dòng)物一組的預(yù)定列表用于對這三組中的動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)化。讓不了解處理?xiàng)l件的研究人員進(jìn)行所有測量。評估平均值之間的差異，方法是進(jìn)行Kruskall-Wallis的非參數(shù)多重比較檢驗(yàn)，然后對非參數(shù)值進(jìn)行Newman-Keul′s檢驗(yàn)。我們認(rèn)為差異的顯著水平為5％(P＜0.05)。
1.2通過Western印跡分析來檢測腦裂解液中的體外VDVAD-AMC切割和胱天蛋白酶-2切割蛋白質(zhì)提取和Western印跡分析大腦半球在補(bǔ)充了完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Meylan，F(xiàn)rance)的10mM Hepes，5mM MgCl2，42mM KCl，1mM DTT，0.5％CHAPS中通過在冰上進(jìn)行手工磨漿(potter)而裂解。勻漿物以10000g的速度在4℃下離心10分鐘，然后保持漂浮。通過BCA測試確定蛋白質(zhì)濃度。在12.5％聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白質(zhì)(50μg)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Amersham)上。使用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)顯示免疫染色。以1∶1000的稀釋度使用抗小鼠胱天蛋白酶-2的單克隆抗體(52kDa；11B4，Alexis Biochemicals)；將肌動(dòng)蛋白(42kDa；Sigma；抗體以1∶5000的比例稀釋)用作相等的加樣對照。
在100μl分析緩沖液(50mM HEPES，pH 7.4，100mM NaCl，0.1％CHAPS，10mM DTT，1mM EDTA，10％甘油)中評估胱天蛋白酶-2活性(100μg蛋白大腦樣品)。重組胱天蛋白酶-2對50μM VDVAD-AMC的切割是在37℃下溫育2小時(shí)之后在熒光微量培養(yǎng)板讀數(shù)器上測量的，通過在405nm的激發(fā)波長的情況下監(jiān)測510nm處的熒光發(fā)射來進(jìn)行。為了抑制VDVADase活性，在存在胱天蛋白酶-2的條件下，將抑制劑(2μM)在37℃下進(jìn)行預(yù)溫育30分鐘，然后再進(jìn)行與50μM VDVAD-AMC的溫育(30分鐘，37℃)。在單獨(dú)使用VDVAD-AMC時(shí)沒有觀察到明顯的熒光背景。
2.結(jié)果在該短暫單側(cè)局部缺血模型中，大鼠幼崽經(jīng)歷永久性左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞，其與具有再灌注的左頸總動(dòng)脈的短暫閉塞相關(guān)。然后在48小時(shí)之后分析大腦，在該時(shí)間點(diǎn)上梗塞是穩(wěn)定化的，沒有明顯的水腫(不超過1.5％)。缺血誘導(dǎo)出了55.0±3.4mm3的梗塞體積，表示在受損傷的同側(cè)半球中的22.1±1.4％的損害。梗塞體積看上去是正態(tài)分布的(15％-26％)(圖3)。在缺血發(fā)作之前，給大鼠幼崽施用單一劑量的Qco-VDVAD-dfp(5mg/kg；i.p.)。該單一劑量誘導(dǎo)了梗塞體積的非常顯著的74％的減少(5.7±2.3％，p＜0.01，(中間值＝0.5)，與對照組(V＝22.1±1.4％，中間值＝21)相比，在Newman-Keul′s檢驗(yàn)中)(圖3)。有趣的是，在12只研究過的動(dòng)物中，4只經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的動(dòng)物表現(xiàn)出中等保護(hù)作用(V＝16.5±1.32％)，和8只動(dòng)物表現(xiàn)出完全保護(hù)作用或非常明顯更小的梗塞(中間值＝0.5％)，只能在大腦中動(dòng)脈的水平(相應(yīng)于圖版12和13的水平)上可以看到，而在背側(cè)和海馬的水平(圖版21)上看不到，相對于缺血性對照動(dòng)物(圖3)。
在MCAO之后1小時(shí)(相當(dāng)于再灌注開始)給大鼠幼崽施用單一劑量的Qco-VDVAD-dfp(0.1mg/kg；i.p.)。該單一劑量誘導(dǎo)了梗塞體積的非常顯著的44％的減少(9.95±2.8％，p＜0.01，與對照組(V＝22.64±1.6％)相比，在Newman-Keul′s檢驗(yàn)中)(圖3)。
另外，在經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的動(dòng)物中，末端轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)顯著減弱(圖3)。
由Qco-VDVAD-dfp提供的保護(hù)作用不是由體溫調(diào)控介導(dǎo)的(圖3)。
最后，Qco-VDVAD-dfp在體內(nèi)能很好地靶定胱天蛋白酶-2它能在缺血性大鼠幼崽大腦中有效地抑制胱天蛋白酶-2活性以及胱天蛋白酶-2加工(圖4)。
我們證實(shí)，胱天蛋白酶-2是與新生兒中風(fēng)中的良好神經(jīng)保護(hù)預(yù)后相關(guān)的靶標(biāo)，因?yàn)殡滋斓鞍酌?2的體內(nèi)失活導(dǎo)致了在短暫局部缺血期間腦梗塞體積的大量減少。我們認(rèn)為，胱天蛋白酶-2可能是體內(nèi)預(yù)防在分娩和圍產(chǎn)期中風(fēng)時(shí)的缺氧-缺血性腦病的正確靶標(biāo)，所述預(yù)防是人類新生兒的主要衛(wèi)生保健。
通過以下

了以上數(shù)據(jù)圖3由Qco-VDVAD-dfp選擇性抑制胱天蛋白酶-2，可強(qiáng)有力地防止經(jīng)歷缺血性腦損傷的大鼠新生幼體的細(xì)胞死亡和腦梗死。(a，左圖)在經(jīng)媒介物處理的大鼠(n＝17)和經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的大鼠(i.p.，5mg/kg；n＝12)中，在缺血之后48小時(shí)的平均梗塞體積(平均值±SEM)。當(dāng)在缺血發(fā)作之前5-15分鐘施用時(shí)，Qco-VDVAD-dfp誘導(dǎo)了74％的減少(***＝p＜0.001，Kruskall-Wallis檢驗(yàn))；(a，右圖)Qco-VDVAD-dfp處理提供了2個(gè)組，其表現(xiàn)出高的/總的(高度)或低的保護(hù)作用(4)。對單個(gè)的梗塞體積數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。粗的和細(xì)的水平線條分別表示組中間值和平均值。(b)代表性的甲酚紫-染色的冠狀切片來自再灌注之后48小時(shí)的動(dòng)物，位于背側(cè)海馬(圖版21，Paxinos′大鼠腦圖冊)和前連合(圖版12)的水平上。點(diǎn)劃線標(biāo)明梗塞區(qū)域。箭頭標(biāo)明在經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的動(dòng)物中沒有梗塞。線條表示130μm。(c，左圖)在經(jīng)媒介物處理的大鼠(n＝22)和經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的大鼠(i.p.，0.1mg/kg；n＝19)中，在缺血之后48小時(shí)的平均梗塞體積(平均值±SEM)。當(dāng)在缺血發(fā)作之后1小時(shí)施用時(shí)，Qco-VDVAD-dfp誘導(dǎo)了44％的減少(***＝p＜0.001，Kruskall-Wallis檢驗(yàn))。(c，右圖)對單個(gè)的梗塞體積數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。粗的和細(xì)的水平線條分別表示組中間值和平均值。(d)在經(jīng)媒介物和經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理過的動(dòng)物的同側(cè)皮層中的細(xì)胞死亡。在原位3′OH末端DNA標(biāo)記之后的代表性的熒光顯微照片(來自圖版12)(線條100μm)。(e)在施用Qco-VDVAD-dfp之前和之后測量體溫(缺血之前和之后)。
圖4用5mg/kg(i.p.)的Qco-VDVAD-dfp處理缺血性大鼠幼崽。24小時(shí)之后處死動(dòng)物。將腦勻漿物進(jìn)行胱天蛋白酶-2活性測定和Western印跡分析。IL同側(cè)的受損傷的半球，CL對側(cè)的未受損傷的半球。(a)在經(jīng)媒介物處理的大鼠中對在經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的大鼠中測定的胱天蛋白酶-2活性。(b)胱天蛋白酶-2加工的Western印跡分析，在來自經(jīng)媒介物處理的大鼠對來自經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的大鼠的腦勻漿物中。
V.在全腦缺血之后，Qco-VDVAD-dfp在大鼠中的作用全腦缺血是在心搏停止或心血管障礙之后可以引起的病狀，并且它會(huì)導(dǎo)致血流量減少和缺氧。損傷出現(xiàn)在選擇性地易受損的大腦區(qū)域，并且神經(jīng)元可能由于在這樣的全腦缺血期間的細(xì)胞凋亡而受到損害。全面缺血還導(dǎo)致了能量代謝物的廣泛和全面的喪失，以及擴(kuò)散的腦水腫和全面損傷。與損傷生長相關(guān)的機(jī)制可能尤其包括半胱氨酸-蛋白酶(胱天蛋白酶)激活，興奮性中毒，梗塞周圍去極化，乳酸中毒(lactacidosis)，微循環(huán)紊亂，和流動(dòng)-代謝解偶聯(lián)等。如果在全面缺血期間某些(執(zhí)行者)胱天蛋白酶可能被激活，人們無法評論胱天蛋白酶-2在這樣的病理學(xué)狀態(tài)中的作用。最近，我們已經(jīng)開發(fā)出了新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑(2-喹啉基羰基-L-纈氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-纈氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯，稱為Qco-VDVAD-dfp，它在新生兒腦缺血期間提供了強(qiáng)效的體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)作用。在本文中，我們研究了它的針對在心搏停止之后出現(xiàn)的腦損傷的細(xì)胞保護(hù)介導(dǎo)的作用，以及行為相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。因此，我們用年幼成年大鼠在全面和短暫腦缺血(4VO，4血管閉塞)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袦y試了Qco-VDVAD-dfp的作用，基于Pulsinelli的方法(1979)。
1.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?.1VO模型全腦缺血是通過4-血管閉塞(four-vessel occlusion)(4VO)誘導(dǎo)的，按照Pulsinelli的衍生方法(Pulsinelli等人，1982；Pulsinelli和Buchman，1988)在年幼成年大鼠(雄性Wistar，10-12周齡，320g+/-10g；Janvier)中進(jìn)行。第一天，將麻醉的大鼠的頭放入立體定位的耳棒中，并且向下傾斜與水平方向形成30°角。在頸椎水平上形成中線切口之后，在顯微鏡下暴露兩個(gè)脊椎動(dòng)脈，然后通過電烙針進(jìn)行凝結(jié)，其穿過在第一頸椎骨水平上的翼孔(alarforamina)。24小時(shí)后暴露兩個(gè)頸總動(dòng)脈，并夾住20-30分鐘(在很好地對兩個(gè)脊椎動(dòng)脈進(jìn)行電烙之后，大鼠陷入昏迷)。然后除去夾住頸動(dòng)脈的夾子，以便使血流再灌注。在缺血(頸動(dòng)脈閉塞)的第一個(gè)五分鐘內(nèi)在左側(cè)腦室的水平上施用媒介物和Qco-VDVAD-dfp(II，n＝0)。然后將大鼠放置在它們的籠子中，可以隨意飲水和進(jìn)食。
1.2細(xì)胞保護(hù)作用的評估在72小時(shí)評價(jià)了易受損傷的細(xì)胞的選擇性損失和Qco-VDVAD-dfp的作用(腦室內(nèi)(ICV)施用)。處死大鼠，并且用低聚甲醛通過經(jīng)心灌注來固定腦。用甲酚紫對大腦前部(frontal brain)切片(25μm)進(jìn)行染色，或用Hoechst 33342和Fluorojade B進(jìn)行共同染色，以便評估海馬和皮層中的細(xì)胞死亡。甲酚紫是粉紅色染料，它能標(biāo)記活細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)體(cytoplamic body)Nissl(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu))和細(xì)胞核，因此在死亡的細(xì)胞中產(chǎn)生蒼白色的染色或沒有染色。Fluoro Jade B(綠色熒光)攝取只有在具有可滲透的質(zhì)膜的細(xì)胞中是可能的，因此死亡細(xì)胞才更具有這樣的特征。Hoechst 33342(藍(lán)色熒光)能標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞核，并且使得能夠在細(xì)胞死亡期間的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。
在套管的水平上以及在左側(cè)大腦半球中的套管(前后軸)之后650μm和780μm的水平上計(jì)數(shù)細(xì)胞。在三個(gè)連續(xù)切片上計(jì)數(shù)細(xì)胞，在海馬(CA1，CA3，齒狀回)和皮層這樣的水平上進(jìn)行。在白光下觀察甲酚紫染色的切片(Nikon Eclipse E 800M顯微鏡，裝備有x40和x20物鏡和LEICA IM50軟件)。Fluoro Jade B和Hoechst染色的切片在LeicaDMIRB倒置熒光顯微鏡下觀察，該顯微鏡上裝備有x40物鏡和LEICAIM1000/Qfluorobase軟件(BP 340-80激發(fā)過濾器與LP 425發(fā)射過濾器組合用于Hoechst；BP 480/40激發(fā)過濾器與BP 515-560發(fā)射過濾器組合用于Fluoro Jade B)。
1.3行為增益(gain)的評估在第1天于手術(shù)過程中測量體溫(從麻醉到手術(shù)過程的步驟1(脊椎電烙術(shù)和套管拿起(putting up))和步驟2(頸動(dòng)脈的分離))。還在第2天于缺血開始之后0、10、20分鐘測量體溫。在缺血之后24、48、72小時(shí)以及在第5天為了進(jìn)行灌注的最終麻醉之前測量體溫。進(jìn)行行為研究(進(jìn)食、自主活動(dòng)性和反應(yīng)性)，并且通過評分進(jìn)行評估。進(jìn)食在第5天觀察胃內(nèi)容物。
如果重新進(jìn)食＝1；如果不重新進(jìn)食＝0。
自主活動(dòng)性動(dòng)物在它們的籠子中的一般行為(活動(dòng)對不活動(dòng)階段的改變以及對于捕捉的反應(yīng))。
活潑＝1；更活潑或更不活潑＝0.5；不活潑或活潑性差＝0。
反應(yīng)性動(dòng)物對噪音敏感并且有反應(yīng)，和向噪音的來源移動(dòng)。
如果好奇＝1；如果相對好奇＝0.5；如果不很好奇＝0。
2.結(jié)果圖5-7表示，細(xì)胞死亡出現(xiàn)在缺血之后72小時(shí)的成年大鼠的海馬的CA1水平上(以及少數(shù)出現(xiàn)在皮層中)90-100％的細(xì)胞已經(jīng)喪失了它們的甲酚紫標(biāo)記，并且具有異常的細(xì)胞形態(tài)學(xué)，40-60％表現(xiàn)出細(xì)胞核改變，40-50％在缺血性大腦的CA1(CA1a、b和c亞區(qū))中保留了FluoroJade B。在CA3、DG(齒狀回)中(還在CA2和CA4中，數(shù)據(jù)未示出)沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡的跡象。缺血還受小膠質(zhì)細(xì)胞的存在的控制，所述小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出棒狀(駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞)或鐮刀狀(遷移的小膠質(zhì)細(xì)胞，在血腦屏障破裂之后侵入大腦)。
圖8表示，在用60-600ng的Qco-VDVAD-dfp處理的非缺血性大鼠(icv)中沒有細(xì)胞死亡(低于基礎(chǔ)閾值10％)，無論在海馬或皮層中的觀察水平如何沒有甲酚紫陰性細(xì)胞，沒有異常的細(xì)胞核，無Fluoro Jade B整合。因此，在60-600ng的劑量下，Qco-VDVAD-dfp沒有局部毒性。
圖9-10表示Qco-VDVAD-dfp在缺血性大腦中的CA1水平上的細(xì)胞保護(hù)作用。與缺血性大鼠形成鮮明對比的是，經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理過的動(dòng)物具有較少的異常細(xì)胞核(細(xì)胞核更大并且較少收縮)，和具有少數(shù)整合了Fluorojade B的細(xì)胞(占10-20％，而不是50-60％)。因此，彩色切片看上去更像是非缺血性切片。另外，甲酚紫染色強(qiáng)度部分恢復(fù)到非缺血性動(dòng)物的水平，但是沒有細(xì)胞形態(tài)學(xué)的總體恢復(fù)。
Qco-VDVAD-dfp的作用不取決于溫度的調(diào)控作用(圖11)。
Qco-VDVAD-dfp對缺血性處理的大鼠的一般行為具有有益的作用，因?yàn)檫@些大鼠比未處理過的大鼠具有更好的得分它們更活潑，對噪音更具有反應(yīng)性，并且它們能夠自我進(jìn)食(圖11)。
通過以下

了以上數(shù)據(jù)圖5在缺血性大鼠(4VO)模型的海馬和皮層中的細(xì)胞死亡。A在缺血之后72小時(shí)的成年大鼠的海馬(CA1，CA3，DG)和皮層中的細(xì)胞死亡。通過4血管閉塞(4VO；n＝5)誘導(dǎo)全面和短暫腦缺血。用DMSO(在這里，7.255％；0.7255％，未示出)處理大鼠(icv)。用甲酚紫對切片進(jìn)行染色。B缺血之后72小時(shí)的成年大鼠的海馬(CA1)中的細(xì)胞死亡。通過4血管閉塞(4VO；n＝5)誘導(dǎo)全面和短暫腦缺血。用DMSO(7.255％)處理大鼠(icv)。用Hoechst 33432(藍(lán)色細(xì)胞核)和Fluoro Jade B(綠色細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì))對細(xì)胞進(jìn)行染色。C高放大倍數(shù)的Hoechst和Fluoro Jade B熒光顯微照片(尺寸分別增加了2和6倍)。D作為缺血的標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞激活。小膠質(zhì)細(xì)胞具有棒狀(駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞)或鐮刀狀(遷移的小膠質(zhì)細(xì)胞，在血腦屏障破裂之后侵入大腦)。
圖6缺血對CA3、齒狀回(DG)和皮層(COR)的影響。在成年大鼠中缺血之后72小時(shí)在海馬(CA3，DG)和皮層(COR)中的細(xì)胞死亡。通過4血管閉塞(4VO；n＝5)誘導(dǎo)全面和短暫腦缺血。用DMSO(在這里，7.255％；0.7255％，未示出)處理大鼠(icv)。用Fluoro JadeB/Hoechst在CA1水平上對切片進(jìn)行共同染色(n＝5)。
圖7在缺血之后72小時(shí)對細(xì)胞死亡進(jìn)行定量。在成年大鼠中缺血之后72小時(shí)在海馬(CA1，CA3，DG)和皮層(COR)中的細(xì)胞死亡。通過4血管閉塞(4VO；n＝5)誘導(dǎo)全面和短暫腦缺血。用DMSO(在這里，7.255％；0.7255％，未示出)處理大鼠(icv)(n＝5)。A在DMSO或TRP6注射點(diǎn)(1)、注射點(diǎn)之后650μm(2)或注射點(diǎn)之后780μm(3)的水平上對甲酚紫陽性細(xì)胞進(jìn)行定量。B異常細(xì)胞核的定量，通過在缺血性和非缺血性大腦的海馬(CA1a，b，c，CA3，DG)和皮層(COR)中的Hoechst染色進(jìn)行評估。C在缺血性和非缺血性大腦的海馬(CA1a，b，c，CA3，DG)和皮層(COR)中對Fluoro Jade B陽性細(xì)胞進(jìn)行定量。
圖8Qco-VDVAD-dfp在非缺血性大鼠中的無毒性。在icv施用DMSO(在這里，7.255％；0.7255％，未示出)或Qco-VDVAD-dfp(60或600ng)(n＝5)之后72小時(shí)，在非缺血性大鼠的海馬(CA1，CA3，DG)和皮層(COR)中的細(xì)胞死亡。A在存在劑量逐漸加大的TRP6的條件下，在DMSO或Qco-VDVAD-dfp注射點(diǎn)(1)、注射點(diǎn)之后650μm(2)或注射點(diǎn)之后780μm(3)的水平上對甲酚紫陽性細(xì)胞進(jìn)行定量。B異常細(xì)胞核的定量，通過在經(jīng)媒介物處理的或經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的大鼠的海馬(CA1a，b，c，CA3，DG)和皮層(COR)中的Hoechst染色進(jìn)行評估。C在缺血性和非缺血性大腦的海馬(CA1a，b，c，CA3，DG)和皮層(COR)中對Fluoro Jade B陽性細(xì)胞進(jìn)行定量。
圖9在缺血(4VO)之后72小時(shí)，在年幼成年大鼠的海馬中Qco-VDVAD-dfp的神經(jīng)保護(hù)作用。A顯微照片(x400)，表示CA1以及它的亞區(qū)(CA1a，CA1b，CA1c)，使用的是經(jīng)媒介物處理的(DMSO0.7255％)或經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的(60ng)缺血性大鼠對非缺血性動(dòng)物(經(jīng)媒介物處理的)。用甲酚紫(上部的線)、Hoechst(左側(cè)欄中的藍(lán)色細(xì)胞核)或Fluoro Jade B(右側(cè)欄中的綠色熒光)對切片進(jìn)行染色)。B高放大倍數(shù)(6倍)的Hoechst和Fluoro Jade B熒光顯微照片。
圖10在缺血之后72小時(shí)，Qco-VDVAD-dfp的定量的效用。在缺血之后72小時(shí)，在成年大鼠的海馬(CA1，CA3，DG)和皮層(COR)中的細(xì)胞死亡。通過4血管閉塞(4VO；n＝5)誘導(dǎo)全面和短暫腦缺血。用DMSO(在這里，7.255％；0.7255％，未示出)或Qco-VDVAD-dfp(60或600ng)(n＝5)處理大鼠(icv)。A在存在劑量逐漸加大的TRP6的條件下，在DMSO或Qco-VDVAD-dfp注射點(diǎn)(1)、注射點(diǎn)之后650μm(2)或注射點(diǎn)之后780μm(3)的水平上對甲酚紫陽性細(xì)胞進(jìn)行定量。B異常細(xì)胞核的定量，通過在經(jīng)媒介物處理的或經(jīng)Qco-VDVAD-dfp處理的大鼠的海馬(CA1a，b，c，CA3，DG)和皮層(COR)中的Hoechst染色進(jìn)行評估。C在缺血性和非缺血性大腦的海馬(CA1a，b，c，CA3，DG)和皮層(COR)中對Fluoro Jade B陽性細(xì)胞進(jìn)行定量。
圖11生理學(xué)和行為測試。A生理學(xué)研究。在第1天，從麻醉到手術(shù)過程的步驟1(脊椎電烙術(shù)和套管拿起)和步驟2(頸動(dòng)脈的分離)測量體溫；在第2天于缺血開始之后0、10、20分鐘測量體溫；在缺血之后24、48、72小時(shí)以及在第5天為了進(jìn)行灌注的最終麻醉之前測量體溫。B行為研究每組的參數(shù)平均值。進(jìn)食在第5天觀察胃內(nèi)容物，如果重新進(jìn)食＝1，如果不重新進(jìn)食＝0；自主活動(dòng)性動(dòng)物在它們的籠子中的一般行為(活動(dòng)對不活動(dòng)階段的改變以及對于捕捉的反應(yīng))，活潑＝1，更活潑或更不活潑＝0.5，不活潑或活潑性差＝0；反應(yīng)性動(dòng)物對噪音敏感并且有反應(yīng)，和向噪音的來源移動(dòng)，如果好奇＝1；如果相對好奇＝0.5；如果不很好奇＝0。C行為研究總體評分(每組總得分之和)。
實(shí)施例獲得結(jié)構(gòu)II的胱天蛋白酶-2抑制劑用于合成的主要步驟概括在流程1-3中。
(a)THF，NMM，-15℃.(b)EtOCOCl.(b)CH2N2.(c)Et2O/THF，HBr/ArOH.(d)DMF，KF，2，6-二氟苯酚.(e)TFA，DCM.
流程1 (a)DCC，HOBt，DIEA，DCM.(b)TFA/DCM(1∶1)，raflmc，3h.
流程2
(a)DCM，DIEA，Boc-Val-OH，DCC，HOBt.(b)DCM/TFA(1∶1).1h.(c)DCM，DIEA，Boc-Asp(OMe)-OH，BOP，HOBt.(d)DCM，DIEA，Qco-Val-OH，BOP，HOBt.
(e)MeOH，cat.H2，Pd/C，rt，1-2天.(t)DCM，DIEA，TFA.H-Asp(OMe)-CH2-O-(2，6-二氟苯基)，BOP，HOBt.
流程3
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權(quán)利要求
1.新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，它能識(shí)別胱天蛋白酶-2，并且防止和阻斷其活性，所述抑制劑基于以下主鏈2-喹啉基羰基-L-纈氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-纈氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯(SEQ 1)及其衍生物，SEQ 1相當(dāng)于結(jié)構(gòu)式Ia或Ib
2.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)II的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑
3.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)III的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑 其中(i)每一個(gè)氨基酸的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)R1和R2是氫原子，氘原子，C1-20脂族基團(tuán)，取代過的或未取代過的芳基，環(huán)烷基，萘基，取代過的萘基，2-苯并唑基，取代過的2-唑基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基，CH2N2，CH2Y，OH，OR，NH2，NHR，NR2，SR，COR，CO2R，CONR2，CH2OCOR，CH2O-CO芳基，CH2O-C(O)取代過的芳基(例如2，6-二甲基苯甲酰氧基甲基)，CH2O-C(O)取代過的芳基，CH2O-C(O)雜芳基，CH2O-C(O)取代過的雜芳基或CH2OPOR2；(iii)R3，R4，R5和R6是二十種氨基酸(半胱氨酸除外)之一的側(cè)鏈；例如，所述五肽還可以是Leu-Asp-Glu-Ser-Asp的類似物；R3，R4，R5和R6還可以是C1-20脂族基團(tuán)，環(huán)烷基，萘基，取代過的萘基，2-苯并唑基，取代過的2-唑基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基，CH2N2，(CH2)nZ，CH2OCOR，CH2OCO(芳基)，CH2OCO(取代過的芳基)，CH2OCO(雜芳基)，CH2OCO(取代過的雜芳基)或CH2OPOR2；(iv)R7是氫原子，R8是R，U，CO(CH2)nNH(U)，CO(CH2)nS(U)；(v)U是(未)取代過的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，C1-20直鏈或支鏈烷基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基，或標(biāo)記基團(tuán)，如熒光團(tuán)標(biāo)記或可用于電子顯微術(shù)的標(biāo)記；(vi)R7和R8還可以與插入其間的氮一起形成雜環(huán)，如取代過的或未取代過的四氫喹啉，四氫異喹啉，二氫吖啶，苯氮雜，吡咯烷，嗎啉，thiomortholine，哌嗪，哌啶，二氫吡啶，苯并咪唑，咪唑，咪唑啉，吡咯，吡咯烷，吡咯啉，吡唑，吡唑啉，吡唑烷，三唑，哌啶，嗎啉，硫代嗎啉，哌嗪，咔唑，吩噻嗪，吩嗪，二氫吩嗪，二氫噌啉，二氫喹喔啉，二氫萘啶，四氫萘啶，二氫吖啶，吲哚，異吲哚，二氫吲哚，吲哚啉，吲唑，嘌呤，9，10-二氫菲啶，5H-二苯并[b，f]氮雜，10，11-二氫-5H-二苯并[b，f]氮雜，β-咔啉，吡啶并[4，3-b]吲哚，2，3，9-三氮雜芴，9-硫雜-2，10-二氮雜蒽，噻吩并[3，2b]吡咯，二氫菲；(vii)R是氫原子，C1-20脂族基團(tuán)，芳基，取代過的芳基(例如4-硝基苯基或香豆素衍生物)，雜芳基(例如，2-吡啶)，取代過的雜芳基，環(huán)烷基，萘基，取代過的萘基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基(例如2，6-二鹵苯基)，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基或(未)取代過的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，芴甲基；(viii)Y是帶負(fù)電荷的離去基團(tuán)，包括鹵素，如F、Cl、Br或I，芳基或烷基磺酰氧基，三氟甲烷磺酰氧基，OR，SR，COOR，OP(O)R2，其中R是脂族基團(tuán)，芳基，芳烷基，碳環(huán)基團(tuán)，烷基碳環(huán)基團(tuán)，或雜環(huán)基團(tuán)；(ix)Z是鹵素(F、Cl、Br或I)，CN，OH，OR，NH2，NHR，NR2，SR，COR，CO2R，CONR2；(x)n是0-20。
4.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)IV的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式IV.1-IV.7的carba類似物，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
5.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)V的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式V.1-V.7的五肽VDVAD的酮亞甲基類似物，其中(i)每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；(ii)n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
6.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)VI的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式VI的縮肽類似物-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-X是O或NH，并且至少一個(gè)X是氧原子；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的；-R9是氫原子，(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，C1-20直鏈或支鏈烷基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基，OCOR或OCNHR。
7.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)VII的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式VI的縮肽類似物-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-X是O或NH，并且至少一個(gè)X是氧原子；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的；-R9是氫原子，(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，C1-20直鏈或支鏈烷基，(CH2)n環(huán)烷基，(CH2)n苯基，(CH2)n取代過的苯基，(CH2)n(1-或2-萘基)，(CH2)n雜芳基，OCOR或OCNHR。
8.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)VIII的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式VIII.1-VIII.7的羥基亞乙基類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
9.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)IX的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式IX.1-IX.6的還原的五肽類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
10.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)X的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式X.1-X.7的不飽和的類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
11.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)XI的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式XI.1-XI.9的β-肽，γ-肽，脲和氨基甲酸酯類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-X是CH2，NH，O；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
12.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)XII的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式XII.1-XII.15的VDVAD的受約束的類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-W，X和Y是CH，C或N；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
13.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)XIII的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式XIII.1-XIII.15的VDVAD的受約束的類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-W，X和Y是CH2，NH，O或S；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
14.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)XIV的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式XIV.1-XIV.15的VDVAD的受約束的類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
15.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)XV的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式XV.1-XV.15的VDVAD受約束的類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
16.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)XVI的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式XVI.1-XVI.15的VDVAD的受約束的類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
17.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)XVII的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式XVII.1-XVII.15的VDVAD的受約束的類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
18.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)XVIII的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式XVIII.1-XVIII.15的VDVAD的受約束的類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
19.如權(quán)利要求1的基于結(jié)構(gòu)XIX的新的選擇性胱天蛋白酶-2抑制劑，包括結(jié)構(gòu)式XIX.1-XIX.15的VDVAD的受約束的類似物，其中-每一個(gè)氨基酸或其電子等排體的絕對構(gòu)型是L或D；-n，R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，U，Y和Z是如上文所述的。
20.藥物組合物，包含有效量的至少一種如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所限定的化合物，與或者不與藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)合。
21.如權(quán)利要求20的藥物組合物，用于通過以下方式進(jìn)行施用口、鼻、局部(腦室內(nèi)、海馬內(nèi)、其他腦內(nèi)輸送，用于機(jī)械輸送的儀器的腦內(nèi)植入)或全身性(例如腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)...)施用，或者皮內(nèi)輸送，鞘內(nèi)輸送或作為氣霧劑，以便減少體內(nèi)腦細(xì)胞死亡。
22.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于防止或阻斷細(xì)胞死亡中的胱天蛋白酶-2活性。
23.如權(quán)利要求22的藥物組合物，其中，所述細(xì)胞是神經(jīng)元，或神經(jīng)元細(xì)胞或非神經(jīng)元細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于提供神經(jīng)保護(hù)或腦保護(hù)作用。
25.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于提供細(xì)胞保護(hù)作用。
26.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于治療病理學(xué)狀態(tài)，包括在腦局部缺血之后的缺血性損傷。
27.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于治療病理學(xué)狀態(tài)，包括在由于MCAO導(dǎo)致的腦局部缺血之后的缺血性損傷。
28.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于治療病理學(xué)狀態(tài)，包括在由于在分娩時(shí)或在圍產(chǎn)期中中風(fēng)導(dǎo)致的腦局部缺血之后的缺血性損傷。
29.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于治療病理學(xué)狀態(tài)，包括在由于在非腦部位處形成血栓造成的腦局部缺血之后的缺血性損傷。
30.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于治療局部動(dòng)脈梗塞。
31.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于治療大腦中動(dòng)脈(MCA)或左側(cè)大腦半球范圍內(nèi)的缺血性損傷，造成該缺血性損傷的原因是血液動(dòng)力學(xué)差異，所述血液動(dòng)力學(xué)差異來自動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，或牽涉左頸總動(dòng)脈的更直接的途徑。
32.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于治療涉及MCA的皮層支或豆?fàn)詈思y狀體支的缺血性多灶性損傷，或主干的閉塞。
33.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于治療病理學(xué)狀態(tài)，包括在由于心搏停止或心血管損傷期間的血流量減少或缺氧造成的全腦缺血之后的缺血性損傷。
34.如權(quán)利要求20或21的藥物組合物，用于治療病理學(xué)狀態(tài)，包括這樣的病理學(xué)狀態(tài)，其中血流量和氧氣壓力受到了干擾，由此導(dǎo)致了腦的(短暫或永久性)損傷。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的選擇性胱天蛋白酶－2抑制劑，它能識(shí)別胱天蛋白酶－2，并且防止和阻斷其活性，所述抑制劑基于以下主鏈2－喹啉基羰基－L－纈氨酰－L－天冬氨酰(甲酯)－L－纈氨酰－L－丙氨酰－L－天冬氨酰(甲酯)2，6－二氟苯酯(SEQ 1)及其衍生物，SEQ 1相當(dāng)于結(jié)構(gòu)式(Ia)或(Ib)。將所述抑制劑用于預(yù)防和治療與胱天蛋白酶－2相關(guān)的疾病。
文檔編號(hào)C07K7/00GK101052651SQ200580020446
公開日2007年10月10日 申請日期2005年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者D·肖維爾, R·卡齊米爾, E·雅科托特, D·勒布萊特 申請人:薩拉普托斯股份公司