專利名稱：治療性肝素及其與白細胞介素4和5以及pecam－1的結(jié)合的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總地涉及用于預(yù)防和/或治療疾病狀況的化學(xué)試劑，特別是慢性疾病狀況例如炎癥包括過敏性疾病、轉(zhuǎn)移癌和由病原體包括細菌、病毒或寄生蟲引起的感染。更明確地，本發(fā)明提供的化學(xué)試劑選自衍生自更大的糖胺聚糖(GAG)的糖胺聚糖分子、GAG樣分子和具有GAG樣復(fù)合結(jié)構(gòu)的分子以及和GAG、GAG樣分子或GAG樣復(fù)合分子一樣結(jié)合相同位點的試劑，所述GAG樣分子在其一些特征上類似GAG，但其可衍生自更大的非GAG多糖。本發(fā)明也提供了鑒定GAG和GAG樣治療劑(包括GAG樣復(fù)合結(jié)構(gòu))以及其類似物、同源物和直向同源物的測定法。
現(xiàn)有技術(shù)的描述在本說明書的結(jié)尾部分匯集本說明書中由著者參考的出版物的詳細書目。
本說明書中對任何現(xiàn)有技術(shù)的參考不被和不應(yīng)當(dāng)被當(dāng)作承認或任何形式的暗示，即該現(xiàn)有技術(shù)在任何國家構(gòu)成了公知常識的一部分。
宿主中許多疾病狀況的發(fā)生涉及細胞或病毒實體或由其產(chǎn)生的分子和特定的宿主中的細胞之間的相互作用。一種透徹研究的相互作用是HIV、gp120和淋巴細胞CD4受體之間的相互作用[Eckert和Kim，Annu.Rev.Biochem.70777-810，2001]。盡管在拮抗或促進這些相互作用上獲得一些成功，然而，鑒定表現(xiàn)足夠廣譜的活性的拮抗劑一直非常困難。
在導(dǎo)致本發(fā)明的工作中，本發(fā)明者研究了肝素樣糖胺聚糖(HLGAG)例如肝素和硫酸乙酰肝素以及由其衍生的寡糖。糖胺聚糖(GAG)普遍存在于人體內(nèi)并在其中許多炎癥過程中起著關(guān)鍵作用。這些大分子量多糖促進這些過程如癌癥轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、移植排斥、過敏性鼻炎和哮喘，從而對這些過程的更多的理解導(dǎo)致產(chǎn)生改進的用于治療這些疾病狀況的藥物。目前，其中一種了解最多的GAG是肝素家族的硫酸化多糖，這些分子的抗凝活性已了解得十分清楚。
然而，HLGAG是不均一的分子組群[Conrad，Heparin bindingproteins.Academic Press，San Diego，1998；Lander和Selleck，J.Cell Biol.148(2)227-232，2000]。肝素和硫酸乙酰肝素，如所有HLGAG一樣，是長線性多糖[Sasisekharan和Venkataraman，Curr.Opin.Chem.Biol.4(6)626-631，2000；Casu，Ann.N.Y.Acad.Sci.5561-17，1989；Casu，Ady.Carbohydr.Chem.Biochem.4351-134，1985]。其以重復(fù)二糖單位(所述二糖單位包含葡糖醛酸(G1cA)和葡糖胺(G1cN))的非硫酸化鏈的形式合成，在高爾基體中，所述鏈沿著其長度方向在許多位點被修飾。肝素被修飾的程度高于硫酸乙酰肝素，大部分G1cN單位被硫酸基團修飾成N-硫酸化G1cN，大部分G1cA單位通過差向異構(gòu)酶的作用被轉(zhuǎn)化成艾杜糖醛酸(IdoA)。由于對硫酸鏈的修飾通常是不完全的，因此HLGAG是不均一的。結(jié)果是廣泛區(qū)域的中間修飾。
因此，例如，硫酸乙酰肝素鏈由高度硫酸化、富含2-O-硫酸化艾杜糖醛酸的結(jié)構(gòu)柔軟的結(jié)構(gòu)域和主要由N-乙酰G1cN和G1cA構(gòu)成的具有剛性結(jié)構(gòu)的低硫酸化區(qū)域交替排布構(gòu)成。
HLGAG的硫酸化模式非常復(fù)雜，特別是在6-O-硫酸的定位上。因此，并非所有的HLGAG分子都是完全相同的。類似地，來自特定細胞或組織的HLGAG制劑中并非所有分子都是完全相同的；更確切地說，這些制劑代表分子家族。
是硫酸化模式在很大程度上決定了特定HLGAG的蛋白結(jié)合特性。一些蛋白只和HLGAG鏈內(nèi)的特定的結(jié)構(gòu)基序結(jié)合，反過來一些GAG只結(jié)合蛋白上的特定位點或區(qū)域。例如，抗凝血酶III結(jié)合展現(xiàn)特定硫酸基團排布的獨特的五糖序列，而肝素五糖結(jié)合抗凝血酶III蛋白上的特異性位點[Whisstock等人，J.Mol.Biol.3011287-1305，2000]。堿性成纖維細胞衍生的生長因子(FGF-2)和肝細胞生長因子(HGF)都結(jié)合肝素，但對于各生長因子，結(jié)合所必需的肝素結(jié)構(gòu)大不相同，并且和抗凝血酶III所需要的結(jié)構(gòu)不同[Maccaranaet等人，J.Biol.Chem.268(32)23898-23905，1993；Lyon等人，JBiol.Chem.26911216-11223，1994]。此外，已顯示肝素結(jié)合FGF-2上的特定區(qū)域[Faham等人，Science 2711116-1120，1996]。在抗凝級聯(lián)反應(yīng)中硫酸化的GAG和蛋白的結(jié)合非常復(fù)雜，肝素和血小板因子IV(PF-IV)的相互作用在一些治療應(yīng)用中已產(chǎn)生問題。精巧的工作已顯示，盡管肝素-PF-IV是非常高的親和相互作用，但是特異性也非常高，因此，通過加入對肝素結(jié)合無害但對PF-IV結(jié)合有害的官能團，可獲得一些選擇性(Petitou等人，Nature 398417，1999.)。通過將高度硫酸化區(qū)域的數(shù)目最小化至末端上的4-5個糖單位和使不帶電的寡糖間隔物分隔帶電荷的部分而實現(xiàn)了該目的。
FGF-2識別在確定的位置中包含單個IdoA 2-O-硫酸的基序，而對于HGF，G1cN 6-O-硫酸基的定位非常重要。制劑中的一些肝素分子將攜帶抗凝血酶III結(jié)合五糖和FGF-2結(jié)合基序，而其他肝素具有HGF結(jié)合基序和FGF-2基序，但沒有抗凝血酶III結(jié)合五糖。事實上，在肝素的制劑中平均只有三分之一的分子具有抗凝血酶III結(jié)合五糖[Conrad，1998，同上]。
因此，HLGAG制劑中的分子在蛋白結(jié)合位點的順序上、數(shù)量上和類型上都不同。挑戰(zhàn)是在結(jié)構(gòu)上鑒定結(jié)合目的蛋白的HLGAG基序和蛋白上的HLGAG結(jié)合位點。該HLGAG基序的分離和純化應(yīng)當(dāng)提供在其結(jié)合行為上有效和更特異的試劑。一旦了解該基序的糖結(jié)構(gòu)后，就可能制造可以包含或可以不包含GAG作為其結(jié)構(gòu)組成部分和可臨床使用的結(jié)構(gòu)類似物或直向同源物(即，功能等同的結(jié)構(gòu))。
存在于從天然來源(豬的肥大細胞)分離的肝素中的不均一性產(chǎn)生許多副作用。對不具有抗凝活性或具有減少的抗凝活性的GAG或結(jié)構(gòu)類似物的尋找可為獲得對上述炎性疾病狀況更有效的治療法鋪平道路。
GAG多糖的來源包括來自天然來源以及合成的或半合成的來源。
許多“天然”類型的糖苷鍵占主導(dǎo)，作為負責(zé)這些寡糖的生物合成的各種酶系統(tǒng)的功能。從天然來源獲取大量的這些復(fù)雜寡糖，需要重復(fù)通過層析進行純化，由于許多這些寡糖的相似性的原因，難以獲得均一的樣品。
來自大腸肝菌K5(E.coli K5)的莢膜多糖由交替的α-N-乙酰葡糖胺(α-G1cNAc)和β-葡糖醛酸(β-G1cA)單位構(gòu)成并且不包含硫酸或其他帶電荷的基團(參見

圖17)。肝素主鏈由下列具有不同硫酸化程度的基序α-G1cNAc、β-G1cA、α-G1cNAc，β-艾杜糖醛酸(β-IdoA)構(gòu)成。G1cA和IdoA之間的唯一不同在于C-5上的羧酸基團的構(gòu)型不同，因此肝素主鏈和大腸桿菌K5主鏈在結(jié)構(gòu)上極其相似(圖17)。事實上K5多糖表現(xiàn)出非常低的免疫原性。大腸桿菌K5能夠從生長培養(yǎng)基中產(chǎn)生大約50mg/L(多糖)，從而理想地適合用于想要的肝素樣主鏈的多克量產(chǎn)生。
用于生產(chǎn)K5多糖的大腸桿菌的合適菌株是NCDC Bi 626-42和NCDC Bi 8337-41，兩者都可從美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得。許多出版物描述了K5多糖的分離。參見，例如，Leali等人，J.Biol.Chem.27637900-37908，2001；和Finke等人，J.Bacteriol.1734088-4094，1991。簡而言之，使用富含甘油優(yōu)于葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌。從晚對數(shù)生長期培養(yǎng)物中收集條件培養(yǎng)基并使用10,000Da截止值的超濾膜進行濃縮。通過丙酮沉淀回收多糖，用蛋白酶II消化任何蛋白，使用超濾和沉淀回收多糖。一些方法也建議采用陰離子交換層析步驟(美國專利號5,341,876)。
根據(jù)本發(fā)明，鑒定與靶配體例如細胞因子或生長因子相互作用的GAG和GAG樣分子，包括GAG樣復(fù)合分子。這些分子，包括其化學(xué)類似物、同源物或直向同源物，據(jù)認為具有有用的治療或診斷特性。
發(fā)明概述在整個說明書中，除非上下文另外要求，術(shù)語“包含/包括”或變化形式，理解為表示包括提到的要素或整數(shù)或要素或整數(shù)的組，而不是排除任何其他的要素或整數(shù)或要素或整數(shù)的組。
本發(fā)明部分地基于對這樣的化學(xué)試劑的鑒定，所述化學(xué)試劑抑制細胞表面HLGAG和無細胞配體或細胞結(jié)合的配體之間、或細胞外HLGAG和細胞結(jié)合的配體之間的相互作用，或抑制細胞外HLGAG和無細胞配體之間的相互作用。方便地，所述化學(xué)試劑是無細胞GAG分子，包括無細胞GAG分子的家族或GAG樣分子或其“功能性”類似物、同源物或直向同源物。此上下文中的“功能性”是指實體表現(xiàn)出親本GAG分子的結(jié)合特性或表現(xiàn)出抗親本GAG的拮抗特性。GAG樣分子包括具有GAG或GAG樣組分和非GAG組分的GAG樣復(fù)合結(jié)構(gòu)。GAG或GAG樣分子或GAG樣復(fù)合分子可從天然存在的HLGAG衍生或可通過化學(xué)修飾非GAG多糖的方法獲得或可以是可能只是部分包含糖主鏈的復(fù)合結(jié)構(gòu)。
這些GAG或GAG樣寡糖或GAG樣復(fù)合分子一般被當(dāng)作半合成物并產(chǎn)生自大的聚合物多糖。半合成寡糖可具有不同程度的帶電基團，例如硫酸和/或磷酸基團。此外，化合物可接受許多其他的修飾，包括修飾例如側(cè)鏈的加入和GAG寡糖的磷酸化。也可制備復(fù)合結(jié)構(gòu)的文庫。在該情況下，在類似GAG的帶負電荷的單位的長度上存在不同，在接頭的長度和組成上存在不同以及在接頭的角度和柔性上存在不同，所述接頭連接類似GAG的帶負電荷的區(qū)域。公開了通過確定充當(dāng)參與疾病狀況的蛋白和其他分子的配體的GAG寡糖、或GAG樣寡糖(其可以是或可以不是分枝的)來篩選文庫的方法。從而這些級分的鑒定允許開發(fā)一系列調(diào)節(jié)所述相互作用的拮抗劑或激動劑。據(jù)認為這些分子在預(yù)防和/或治療疾病狀況上是有用的，所述疾病狀況例如但不限于，炎癥性疾病狀況、轉(zhuǎn)移癌、過敏性疾病狀況如過敏性鼻炎和哮喘以及包括由細菌、病毒或寄生蟲病原體引起的感染的疾病。疾病狀況包括由HIV、SARS病毒引起的感染和流感。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及具有下式的GAG寡糖1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B](I)
或GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物(composite)或式(I)的GAG寡糖的化學(xué)類似物、同源物或直向同源物(ortholog)；其中A是包含糖例如但不限于葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式的寡糖、二糖或單糖單體單位；B可以與A相同或是包含葡糖胺殘基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙?；男问交虬谆⒁一?、丙基或丁基的烷基醚衍生物的單體單位；其中單體單位A和B通過糖苷鍵連接；i[A-B]是相同或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，i表示從一端開始測量的沿著鏈排列的二糖的位置，其中i是整數(shù)，1≤i≤n；n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，n表示位于1[A-B]的相反末端的構(gòu)建部件；和n是從大約2至大約10，其表示重復(fù)A-B單位的鏈的長度；條件是1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B]不是全長HLGAG分子；其中所述GAG寡肽、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或類似物、同源物或直向同源物結(jié)合配體。
本發(fā)明的另一個方面提供了具有下式的GAG樣復(fù)合分子(1P-mX)q-q+1P(II)和(1X-mP)q-q+1X(III)或式(II)或(III)的分子的化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；其中X是由以下通式定義的分子1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B](I)或GAG樣寡糖、式(I)的GAG寡糖的GAG樣化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；其中A是包含糖例如但不限于葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式的寡糖或單糖單體單位；B可以與A相同或是包含葡糖胺殘基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙?；男问交虬谆?、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的單體單位；其中單體單位A和B通過糖苷鍵連接；i[A-B]是相同或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，i表示從一端開始測量，沿著鏈排列的二糖的位置，其中i是整數(shù)，1≤i≤n；n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，n表示位于1[A-B]的相反末端的構(gòu)建部件；和n是從大約2至大約10，其表示重復(fù)A-B單位的鏈的長度；或GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或其化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；條件是1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B]不是全長HLGAG分子；P是肽、多肽或蛋白、化學(xué)部分、飽和或不飽和脂肪酸、脂、樹狀分子(dendrimer)、糖、多元醇、葡聚糖、聚乙二醇或者分枝或不分枝的、飽和的或不飽和的烴鏈或柔性接頭；1和m是整數(shù)，如1，m＝1...q；q是整數(shù)，1≤q≤9；其中所述GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或類似物、同源物或直向同源物結(jié)合配體。
本發(fā)明還提供了GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子，后幾種物質(zhì)結(jié)合的配體上的靶位點與GAG寡糖結(jié)合的靶位點相同。
優(yōu)選的配體是肽、多肽或蛋白，例如細胞因子或生長因子。此處包括的配體包括選自以下的配體βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1，-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體。特別優(yōu)選的配體是IL-5、IL-4和PECAM-1、gp120、IL-5受體的βc鏈和親環(huán)蛋白A。
GAG寡糖可附加單個糖，從而產(chǎn)生長度為[A-B]n-A或B-[A-B]n的寡糖。
B也可以具有附著至羥基例如但不限于第6位羥基或末端糖中的羥基的單糖、二糖或三糖，從而產(chǎn)生分枝結(jié)構(gòu)；這些附著的糖單位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。當(dāng)A是葡糖胺時，那么A也可具有附著至羥基例如但不限于第6位羥基或末端糖中的羥基的單糖、二糖或三糖，從而產(chǎn)生分枝結(jié)構(gòu)；這些附著的糖單位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。
i[A-B]可以具有這樣的末端糖，該糖是4-脫氧-L-蘇型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid)或通過用亞硝酸處理產(chǎn)生的葡糖胺的衍生物，例如2，5-脫水-D-甘露醇或2，5-脫水-D-甘露糖或其衍生物。
本發(fā)明的另一個方面提供了組合物，該組合包含GAG寡糖、GAG樣寡糖和/或GAG樣復(fù)合分子中的一種或多種，和一種或多種藥物可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明還擴展至配體上的位點和特別是GAG、GAG樣分子或GAG樣復(fù)合物或其部分與其相互作用的線性或構(gòu)象結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子，包括結(jié)合肽、多肽或蛋白上的靶位點與GAG寡糖所結(jié)合的靶位點相同的其化學(xué)類似物、同源物或直向同源物。
特別優(yōu)選的靶是IL-4、IL-5、親環(huán)蛋白A和PECAM-1。
靶配體IL-5和GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子與IL-5上的一個或多個殘基限定的三維位點相互作用，所述殘基選自R32、R67、K70、K76、K77、K83、K84、K85、E88、E89、R90、R91和/或R92。
在其他優(yōu)選的實施方案中，GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子包含糖結(jié)構(gòu)ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)5或是其類似物、同源物或直向同源物，或和ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)5一樣結(jié)合相同的位點。
靶配體PECAM-1和GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子結(jié)合由在PECAM-1上的結(jié)構(gòu)域2、3、5或6中任何一個或多個結(jié)構(gòu)域形成的三維結(jié)構(gòu)。在其他優(yōu)選的實施方案中，GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子和PECAM-1上的結(jié)構(gòu)域2和/或3或由其形成的三維結(jié)構(gòu)相互作用。
靶配體IL-4和GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子與IL-4上的一個或多個殘基限定或形成的三維結(jié)構(gòu)相互作用，所述殘基選自E9、K12、R53、E60、K61、H74、R75、K77、Q78、R81、R84、R85、D87和/或R88。在其他優(yōu)選的實施方案中，GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子包含選自以下的糖結(jié)構(gòu)ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)4、ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)3-UAG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS、ΔUA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、或其類似物、同源物或直向同源物或和上述GAG分子一樣結(jié)合相同的位點。
本發(fā)明的另一個方面提供了產(chǎn)生GAG寡糖或GAG樣寡糖(其可以是或可以不是分枝的)或GAG復(fù)合結(jié)構(gòu)的文庫的方法和鑒定結(jié)合特定蛋白的GAG寡糖和/或其部分或局部(portion)、或GAG樣寡糖(其可以是或可以不是分枝的)、或GAG復(fù)合結(jié)構(gòu)的方法。據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的GAG或其他結(jié)構(gòu)可應(yīng)用于治療任何涉及GAG樣分子和配體例如蛋白之間的相互作用的疾病。GAG或其他結(jié)構(gòu)特別適合用于治療炎性或過敏性疾病狀況和轉(zhuǎn)移癌以及由病原體例如細菌、病毒或寄生蟲引起的感染。
本發(fā)明的GAG、GAG樣和GAG樣復(fù)合分子可通過截短和去乙?；?、硫酸化、去硫酸化、磷酸化和側(cè)鏈的附著中的至少之一而從多聚體衍生。
除其他以外，優(yōu)選的起始多聚體特別包括大腸桿菌K5多糖、殼多糖或殼聚糖。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過這樣的方法產(chǎn)生GAG寡糖，該方法包括按大小分級分離起始多聚體例如肝素、硫酸乙酰肝素分子、K5多糖、殼多糖或殼聚糖的群體以產(chǎn)生與配體相互作用的非全長級分。肝素在其中一些二糖單位中包含葡糖醛酸和艾杜糖醛酸的混合物，其硫酸化的程度也是變化的?？赏ㄟ^任何常規(guī)的方法例如通過凝膠過濾柱進行分級分離，并且其基于不同長度糖鏈，一般但非排他地從DP4至大約DP20(包括DP5，DP6，DP7，DP8，DP9，DP10，DP11，DP12，DP13，DP14，DP15，DP16，DP17，DP18，DP19或DP20)。分離的另一種形式基于硫酸化的程度。分離也可以基于這兩種參數(shù)的組合。
本發(fā)明的另一個方面是提供了6-O-磷酸化GAG寡糖。當(dāng)產(chǎn)生GAG寡糖的文庫時，通過包括磷酸化步驟產(chǎn)生這些分子。預(yù)計可對從多聚體例如大腸桿菌K5多聚體、殼多糖或殼聚糖產(chǎn)生的半合成寡糖和通過HLGAG例如肝素或硫酸乙酰肝素的分級分離或其他多聚體例如K5、殼多糖或殼聚體的分級分離產(chǎn)生的寡糖進行該磷酸化步驟和可能是必需的任何相關(guān)的去硫酸化步驟。
本發(fā)明的另一個方面提供了生產(chǎn)用于在受治療者中治療疾病狀況的藥物的方法，所述方法包括根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生一系列GAG寡糖或GAG樣寡糖或復(fù)合結(jié)構(gòu)，和就與配體相互作用或調(diào)節(jié)配體的能力篩選各GAG或GAG樣寡糖或復(fù)合結(jié)構(gòu)。鑒定與配體相互作用或調(diào)節(jié)配體的GAG寡糖，將該寡糖或其類似物、激動劑或拮抗劑用于生產(chǎn)藥物。
本發(fā)明的另一個方面涉及在受治療者中治療疾病狀況的方法，所述疾病由所述宿主中細胞表面上的HLGAG和配體之間、或所述宿主中細胞外基質(zhì)中的HLGAG和配體(該配體可以和或可以不和細胞結(jié)合)之間的相互作用、或所述宿主中的蛋白-配體相互作用造成的，所述蛋白-配體相互作用可被HLGAG破壞，其中所述蛋白可以是和細胞結(jié)合而配體是可溶性的或者蛋白和配體都可以是和細胞結(jié)合的，所述方法包括給所述受治療者施用有效量的藥物，所述藥物是根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)和鑒定的與所述配體相互作用的GAG寡糖、或GAG樣寡糖、或復(fù)合結(jié)構(gòu)，將所述級分摻入藥物，或獲得其化學(xué)類似物或同源物并將其摻入所述藥物中。
附圖概述圖1是顯示肝素的部分肝素酶I消化的大小排阻層析的圖解說明。峰尖的數(shù)字是指DP。
圖2A-2D是顯示BIAcore HLGAG-結(jié)合檢測法的圖解說明。將以指定濃度的蛋白注射在固定化到鏈霉抗生物素蛋白傳感芯片上的肝素上。在結(jié)合和解離階段期間監(jiān)測結(jié)合數(shù)據(jù)。小圖A，rhIL-4。小圖B，rhIL-5。小圖C，flag-PECAM-1。小圖D，CypA。
圖3是顯示rhIL-4 HLGAG濾膜結(jié)合試驗的圖解說明。將10nmol(◆)或20nmole(■)rhIL-4和各種量的熒光標(biāo)記的肝素溫育。通過離心除去未結(jié)合的肝素，用2M NaCl重新溶解結(jié)合的肝素。用Wallac Victor1420 96孔板讀板計確定結(jié)合的肝素的量，使用在相同緩沖液中稀釋的熒光肝素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行定量。數(shù)據(jù)是兩次獨立實驗的平均值。
圖4A和4B是顯示IL-4/IL-5肝素相互作用的競爭抑制的圖解說明。將IL-4或IL-5和摩爾數(shù)遠遠過量的指定大小的HLGAG片段一起溫育。將這些混合物注射至載有固定的HLGAG的BIAcore傳感芯片上，記錄結(jié)合水平，并與在無抑制劑的蛋白情況下觀察到的結(jié)合比較。小圖A-IL-4。小圖B-IL-5。針對可減少結(jié)合超過50％的片段集庫(pool)以作進一步分析。
圖5A-5C是顯示蛋白和固定的HLGAG片段的直接結(jié)合的圖解說明。通過其還原末端將所述片段生物素化并將其固定在鏈霉抗生物素蛋白傳感芯片上。將目的蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液注射到表面上，確定結(jié)合的量。小圖A，rhIL-4。小圖B，flag-PECAM-1。小圖C，CypA。結(jié)合數(shù)據(jù)是三個單獨的結(jié)合實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖6是顯示DP10大小集庫(淺色曲線)和經(jīng)IL-4親和純化的DP10的亞級分(深色曲線)的陰離子交換層析的圖解說明。標(biāo)記A-C表示通過MALDI MS分析的級分。
圖7是顯示DP12大小的集庫(淺色曲線)和經(jīng)IL-5親和純化的DP12的亞級分(深色曲線)的陰離子交換層析的圖解說明。
圖8是顯示DP10級分A(來自圖6中的層析圖)的MALDI質(zhì)譜分析的圖解說明。寡糖的質(zhì)量由肽和肽-寡糖復(fù)合物的質(zhì)量推出。
圖9是顯示使用Baf-IL-5細胞的生物學(xué)測定法的圖解說明。小圖A在5μg/mL和50μg/mL肝素、或5μg/mL硫酸軟骨素C存在的情況下或不加入GAG的情況下以顯示的濃度加入rhIL-5。48小時后，測量螢光素酶的活性并表示為每秒的計數(shù)(CPS)。顯示的數(shù)據(jù)為兩次重復(fù)的平均值。小圖B顯示在6ng/ml rhIL-5存在的情況下各種肝素濃度對Baf-IL-5細胞增殖的影響。數(shù)據(jù)表示為和無肝素的對照相比，在各種濃度的肝素存在的情況下增殖的抑制百分比。
圖10是顯示肝素(0.4μM)、肝素片段的DP12集庫(1μM)和選擇的DP12集庫的亞級分(各為1μM)對Ba/F-IL-5細胞的IL-5(0.07ng/ml)依賴性增殖的影響的圖解說明。這些亞級分表現(xiàn)出很強的對IL-5的結(jié)合(DP12.10)，或其具有低結(jié)合活性(DP12.1)。數(shù)據(jù)表示為相對于在肝素或肝素片段不存在的情況下觀察到的增殖的百分比抑制作用。最少三個重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖11是顯示5μg/mL的肝素和5μg/mL和10μg/mL的硫酸軟骨素C對TF1.8細胞的IL-4誘導(dǎo)增殖的影響。數(shù)據(jù)表示為以每秒計數(shù)(CPS)測量的螢光素酶的活性(A)。(B)中的數(shù)據(jù)計算為相對于用合適濃度的細胞因子但在GAG不存在的情況下獲得的增殖的抑制百分比。
圖12是顯示flag-PECAM-1結(jié)合A2058黑色素瘤細胞的圖解說明。在虛線直方圖中顯示由抗PECAM-1多克隆抗體和FITC綴合的抗兔二抗組成的陰性對照。在無肝素酶III處理的情況下(粗體直方圖)和在肝素酶III處理后(細線)，用抗PECAM-1多克隆抗體和FITC綴合的抗兔二抗檢測的flag-PECAM-1結(jié)合。小圖B顯示對A2058細胞的氯酸鹽處理對flag-PECAM-1結(jié)合這些細胞的能力的影響。通過在用抗PECAM-1多克隆抗體和FITC綴合的二抗顯象后用流式細胞儀測量flag-PECAM-1的結(jié)合。陽性對照是flag-PECAM-1結(jié)合未處理的A2058細胞，陰性對照是無flag-PECAM-1的抗PECAM-1多克隆抗體和FITC綴合的二抗。
圖13是顯示影響IL-5結(jié)合HLGAG的氨基酸突變的位置的圖解說明。匯集影響IL-5-HLGAG結(jié)合水平的氨基酸變化，并在三維蛋白模型上作圖。已顯示rhIL-5上的幾個氨基酸對HLGAG的結(jié)合非常重要，即賴氨酸84、賴氨酸85的突變。結(jié)合位點沿著C螺旋延伸并且包括賴氨酸77、賴氨酸76、賴氨酸70和精氮酸67。也可涉及相鄰的β折疊片上的氨基酸即精氨酸90和精氨酸91。
圖14是IL-4靶1的示意說明圖，其由規(guī)則重復(fù)的三硫酸化二糖構(gòu)成。
圖15是IL-4靶2的示意說明圖。
圖16是IL-5靶1的示意說明圖，其由規(guī)則重復(fù)的三硫酸化二糖構(gòu)成。
圖17是大腸桿菌K5莢膜多糖和非硫酸化肝素主鏈多糖的圖解說明。
圖18是顯示在2.5μM外源肝素存在或不存在的情況下，PECAM-1的結(jié)構(gòu)域D1-D6結(jié)合肝素芯片的BIAcore檢測法的結(jié)果的圖解說明。在這些實驗中使用1μM純化的PECAM-1。
圖19是使用Flag表達系統(tǒng)(小圖A)和融合蛋白表達系統(tǒng)(小圖B)的各種PECAM-1構(gòu)建體的圖解說明。
圖20是圖解說明，在小圖A中，顯示表明PECAM-Fc結(jié)構(gòu)域缺失蛋白的純度的電泳凝膠；而在小圖B中，顯示PECAM-Fc融合蛋白與固定在生物傳感芯片上的肝素的結(jié)合。圖例說明ID1-Fc；IID1-2-Fc；III D1-3-Fc；IVD1-4-Fc；VD1-5-Fc和VID1-6-Fc。
圖21是顯示Flag-PECAM-1結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體與固定在BIAcore芯片上的肝素的結(jié)合的圖解說明。要了解各標(biāo)示的蛋白中包含的結(jié)構(gòu)域，參考圖19。
圖22是顯示BIAcore測定法的結(jié)果的圖解說明，其調(diào)查外源肝素對Flag-PECAM-1構(gòu)建體與固定在生物傳感芯片上的肝素的結(jié)合的影響。注意，所有構(gòu)建體與生物傳感芯片的結(jié)合幾乎完全被加入2.5μM肝素所抑制。在所有情況下使用1μM的蛋白。
圖23是顯示Flag-PECAM-1細胞外結(jié)構(gòu)域和A2058黑色素瘤細胞結(jié)合的圖解說明。AFlag-PECAM-1 D1-6；BFlag-PECAM-1 D1-3；CFlag-PECAM D1-2。Flag-PECAM-1結(jié)構(gòu)域(實線)、對照(點線)、Flag-PECAM-1結(jié)構(gòu)域加50μg肝素(虛線)。用抗PECAM-1多克隆抗體和FITC標(biāo)記的二抗檢測PECAM-1結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，通過流式細胞儀定量。
圖24是描述不同濃度的IL-4和固定在生物傳感器芯片上的肝素的結(jié)合(如使用BIAcore測量的)的圖解說明。
圖25顯示使用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的IL-4突變體和通過親和層析在抗IL-4(11B4.6)柱上純化的蛋白的圖解說明。將突變體和肝素偶聯(lián)的生物傳感芯片的結(jié)合與62.5nM-1μM濃度范圍的野生型IL-4的所述結(jié)合進行比較。將野生型IL-4的結(jié)合設(shè)置為100％。
圖26是描述由三硫酸化二糖(Ido2SG1cNS6S)重復(fù)構(gòu)成的肝素五糖結(jié)合IL-4的分子模型的圖解說明。顯示了20個最佳結(jié)合位置。已顯示蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)，以空間結(jié)構(gòu)模型標(biāo)示據(jù)認為對肝素結(jié)合位點有貢獻的氨基酸。
圖27是當(dāng)IL-5在經(jīng)3-OST-3修飾的硫酸乙酰肝素存在或不存在的情況下通過固定的肝素時使用BIAcore 2000獲得的感應(yīng)圖的圖解說明。
圖28是當(dāng)IL-5在經(jīng)3-OST-3修飾的DP12片段存在或不存在的情況下通過固定的肝素時使用BIAcore 2000獲得的感應(yīng)圖的圖解說明。
優(yōu)選的實施方案的詳細描述本發(fā)明總地涉及GAG分子的制備和涉及可用于治療許多疾病狀況的GAG分子的單個成員或級分，包括GAG樣寡糖和由GAG樣結(jié)構(gòu)和非GAG接頭構(gòu)成的GAG復(fù)合分子以及其化學(xué)類似物、同源物或直向同源物，所述疾病狀況例如炎性或過敏性疾病狀況如過敏性鼻炎和哮喘、轉(zhuǎn)移癌或由病原體引起的感染，所述病原體包括細菌、病毒和寄生蟲例如HIV、冠狀病毒包括SARS病毒、禽流感病毒或瘧原蟲。提到“GAG”分子包括提到GAG樣分子，包括在非GAG主鏈上產(chǎn)生的GAG樣分子。本發(fā)明也涉及和GAG分子或GAG復(fù)合分子結(jié)合的配體上的位點。一般地，由配體的三維構(gòu)型決定該結(jié)合位點。
在詳細地描述本發(fā)明之前，要理解，除非另外指出，本發(fā)明不限定于組分的特定制劑、生產(chǎn)方法、劑量方案等，因為這些都是可以改變的。也要理解此處所用的術(shù)語只是為了描述特定的實施方案，而不是想限定。
必須指出的是，如本說明書中所用的，除非上下文清楚地指出不是這樣，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)方面。因此，例如，提到一個“GAG”，包括單個GAG，也包括2個或更多個GAG；提到“一種活性劑”，包括單一活性劑，也包括2種或更多種活性劑；等等。
在描述本發(fā)明和權(quán)利要求中，按照下面提供的定義使用下列術(shù)語。
術(shù)語“化合物”、“活性劑”、“化學(xué)試劑”、“藥理學(xué)活性劑”、“藥物”、“活性物質(zhì)”和“藥”在此可交換使用，其是指誘導(dǎo)想要的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效應(yīng)的化合物。所述術(shù)語也包括此處明確提到的這些活性劑的藥物可接受的和具有藥理學(xué)活性的成分，其包括但不限于鹽、酯、酰胺、前體藥物、活性代謝物、類似物等。當(dāng)使用術(shù)語“化合物”、“活性劑”、“化學(xué)試劑”、“藥理學(xué)活性劑”、“藥物”、“活性物質(zhì)”和“藥”時，那么要理解這包括活性劑本身以及藥物可接受的、具有藥理學(xué)活性的鹽、酯、酰胺、前體藥物、代謝物、類似物等。
提到“化合物”、“活性劑”、“化學(xué)試劑”、“藥理學(xué)活性劑”、“藥物”、“活性物質(zhì)”和“藥”包括兩種或更多種活性物質(zhì)例如兩種或更多種GAG分子或GAG復(fù)合分子或GAG分子和另一種治療劑的組合。“組合”也包括多部分例如兩部分藥物組合物，其中分開地提供藥劑和分開地給藥或分配藥或在分配前混合在一起。
例如，多部分藥物包裝可具有GAG或GAG的群體和一種或多種抗微生物劑或抗病毒藥劑。
此處使用的術(shù)語藥劑“有效量”和“治療有效量”是指這樣的量的藥劑，該量足以提供想要的治療或生理學(xué)效果。不想要的效果，例如副作用，有時伴隨想要的治療效果顯現(xiàn)出來；因此，醫(yī)生在確定合適的“有效量”時要平衡潛在的益處和潛在的風(fēng)險。所需要的確切的量隨受治療者的不同而變化，這依賴于受治療者的物種、年齡和一般身體狀況、給藥的模式等。因此，不可能指定確切的“有效量”。然而，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員只使用常規(guī)的實驗確定在任一個體情況下的合適的“有效量”。
“藥物可接受的”載體、賦形劑或稀釋劑是指由非生物學(xué)或非其他不想要的材料構(gòu)成的藥物載體，即可將該材料和選擇的活性劑一起給受治療者施用而不產(chǎn)生任何或明顯的不良反應(yīng)。載體可包括賦形劑和其他添加劑例如稀釋劑、去污劑、著色劑、濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑、防腐劑等。依賴于制劑，也可將藥物組合物描述為疫苗組合物。
類似地，化合物(此處提供的)的“藥理學(xué)可接受的”鹽、酯、酰胺、前體藥物或衍生物是非生物學(xué)的或非其他不想要的鹽、酯、酰胺、前體藥物或衍生物。
此處使用的術(shù)語“治療”和“療法”是指疾病狀況或感染的癥狀的嚴(yán)重程度和/或頻率上的減少、癥狀和/或潛在的病因的消除、疾病狀況或感染的癥狀的發(fā)生和/或其潛在病因的阻止以及疾病狀況或感染引起的傷害的改善或補救。
“治療”患者可包括在易感個體中預(yù)防疾病狀況或感染或其他疾病狀況或不良的生理事件以及通過抑制病原體(例如病毒、原核生物或真核生物)引起的疾病狀況或感染或下游病況來治療具有臨床癥狀的個體。因此，例如，“治療”患有感染或具有發(fā)病傾向的患者的本方法包括預(yù)防感染或其他疾病狀況和治療已產(chǎn)生的感染或其他疾病狀況。在任何情況下，本發(fā)明提供了對由病原體生物或病毒引起的感染的治療或預(yù)防或?qū)α硪环N疾病狀況的治療。原核生物的示例包括沙門氏菌屬(Salmonella)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(包括炭疽桿菌(Bacillus anthracis))、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、支原體(Mycoplasma)、脲原體屬(Ureaplasma)、放線菌屬(Actinomyces)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、衣原體(Chlamydia)、Chlamydophila、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、螺旋體屬(Spirochaeta)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、密螺旋體屬(Treponema)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、Dichelobacter、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、Ralstonia、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、摩拉氏菌屬(Moraxella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、金氏桿菌屬(Kingella)、歐氏桿菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、Arozona、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、耶爾森菌屬(Yersinia)、志賀菌屬(Shigella)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、弧菌(Vibrio)、立克次氏體(Rickettsia)、柯克斯氏體屬(Coxiella)、埃里希氏體屬(Ehrlichia)、Arcobacteria、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、念珠菌屬(Candida)、曲霉屬(Aspergillus)、毛滴蟲屬(Trichomonas)、擬桿菌(Bacterioides)、Coccidiomyces、肺囊蟲(Pneumocystis )、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、Porphyromonas、放線桿菌屬(Actinobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillua)、Zymononas、酵母菌(Saccharomyces)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、青霉屬(Penicillum)、奈瑟球菌屬(Neisseria)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、彎曲菌屬(Campylobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)或螺桿菌屬(Helicobacter)。病毒的示例包括人免疫缺陷病毒(HIV)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、單純皰疹病毒(HSV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、鼻病毒、?？刹《救?、柯薩奇[腸道]病毒、巨細胞病毒、黃病毒、埃博拉病毒、副粘病毒屬、流感病毒、腸道病毒、EB病毒、馬爾堡病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、風(fēng)疹病毒、天花病毒、麻疹病毒、痘病毒、腺病毒、冠狀病毒包括SARS病毒、流感病毒包括禽流感病毒和輪狀病毒。在優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是過敏性鼻炎。
此處所用的“患者”是指可從本發(fā)明的藥物制劑和方法獲得益處的動物，優(yōu)選地是指哺乳動物，更優(yōu)選地是人。對可從目前描述的藥物制劑和方法獲得益處的動物的類型沒有限定?；颊?，無論人或非人動物，可以稱為個體、受治療者、動物、宿主或接受者。本發(fā)明的化合物和方法在人醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)以及一般地，馴養(yǎng)或野生動物飼養(yǎng)管理上具有用途。為了方便，“動物”包括禽類例如家禽、鳥禽(aviary bird)或獵禽(game bird)。家禽例如鴨子是禽類的優(yōu)選示例。
如上面所指出的，優(yōu)選的動物是人或其他靈長類動物例如猩猩、大猩猩、狨猴、家畜類動物、實驗室實驗動物、伴侶動物或抓獲的野生動物以及禽類。
實驗室實驗動物的示例包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和倉鼠。兔子和嚙齒動物例如大鼠和小鼠，提供了方便的實驗系統(tǒng)或動物模型。家畜動物包括綿羊、牛、豬、山羊、馬和驢。也包括非哺乳動物例如禽類(例如鴨子)、斑馬魚、兩棲類(包括cane toads)和果蠅類例如黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)。
在本說明書中，術(shù)語“GAG”用于在屬類上確定糖胺聚糖類的分子，其確定性結(jié)構(gòu)特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。如本說明書中所用的，術(shù)語GAG寡糖是任何這樣的GAG分子，如通過單糖殘基的數(shù)目所測量的，所述分子比對應(yīng)的其衍生來源的GAG多糖短。如上面所指出的，“GAG”包括GAG樣分子，如在非GAG主鏈上產(chǎn)生的分子，以及包含一個或多個由非GAG接頭連接的GAG樣部分的GAG樣復(fù)合分子。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及具有下式的GAG寡糖(1P-mX)q-q+1P(II)和(1X-mP)q-q+1X(III)或式(II)或(III)的分子的化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；其中X是由以下通式定義的分子1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B](I)或GAG樣寡糖、式(I)的GAG寡糖的GAG樣化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；其中A是包含糖例如但不限于葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖尿病、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式的寡糖或單糖單體單位；B可以和A相同或是包含葡糖胺殘基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化形式和/或其乙酰化形式或包含甲基、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的單體單位；其中單體單位A和B通過糖苷鍵連接；i[A-B]是相同或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，i表示從一端開始測量的沿著鏈排列的二糖的位置，其中i是整數(shù)，1≤i≤n；n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，n表示位于1[A-B]的相反末端的構(gòu)建部件；和n是從大約2至大約10，其表示重復(fù)A-B單位的鏈的長度；或GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或其化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；條件是1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B]不是全長HLGAG分子；P是肽、多肽或蛋白、化學(xué)部分、飽和或不飽和脂肪酸、脂質(zhì)、樹狀分子、糖、多元醇、葡聚糖、聚乙二醇或者分枝或不分枝的、飽和的或不飽和的烴鏈或柔性接頭；1和m是整數(shù)，如1，m＝1...q；q是整數(shù)，1≤q≤9；其中所述GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或類似物、同源物或直向同源物結(jié)合配體，例如但不限于這樣的配體，所述配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1、-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體。特別優(yōu)選的配體是IL-4、IL-5和PECAM-1、gp120、IL-5受體的βc鏈和親環(huán)蛋白A。
寡糖可附著單個糖，從而產(chǎn)生長度為n[A-B]-A或B-n[A-B]的寡糖。
B也可在羥基例如但不限于6位或末端糖上的羥基上附著單糖、二糖或三糖，從而產(chǎn)生分枝的結(jié)構(gòu)；這些附著的糖單位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。當(dāng)A是葡糖胺時，則A也可也在羥基例如但不限于6位或末端糖上的羥基上附著單糖、二糖或三糖，從而產(chǎn)生分枝結(jié)構(gòu)；這些附著的糖單位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。
i[A-B]可以具有這樣的末端糖，該糖是4-脫氧-L-蘇型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸或通過用亞硝酸處理產(chǎn)生的葡糖胺的衍生物例如2，5-脫水-D-甘露醇或2，5-脫水-D-甘露糖或其衍生物。
本發(fā)明還提供了GAG寡糖，結(jié)合肽、多肽或蛋白上的靶位點和GAG寡糖結(jié)合的靶位點相同的GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子。
在一個優(yōu)選的實施方案中，靶蛋白是IL-5，GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子和IL-5上的一個或多個殘基限定的三維位點相互作用，所述殘基選自；R32、R67、K70、K76、K77、K83、K84、K85、E88、E89、R90、R91和/或R92。在其他優(yōu)選的實施方案中，GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子包含糖結(jié)構(gòu)△UA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)5或其類似物、同源物或直向同源物、或和結(jié)構(gòu)△UA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)5一樣與相同的位點結(jié)合或相互作用的分子。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，靶蛋白是PECAM-1，GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子結(jié)合PECAM-1上的結(jié)構(gòu)域2、3、5或6中任何一個或多個結(jié)構(gòu)域所限定或促成的三維位點。在其他優(yōu)選的實施方案中，GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子和PECAM-1上的結(jié)構(gòu)域2和/或3相互作用。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，靶蛋白是IL-4，GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子和IL-4上的任何一個或多個殘基限定的三維位點相互作用，所述殘基選自E9、K12、R53、E60、K61、H74、R75、K77、Q78、R81、R84、R85、D87和/或R88。在其他優(yōu)選的實施方案中，GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子包含這樣的糖結(jié)構(gòu)，該糖結(jié)構(gòu)選自ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)4、ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)3-UAG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS、ΔUA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、或其類似物、同源物或直向同源物、或和這樣的三維結(jié)構(gòu)結(jié)合或相互作用的分子，該三維結(jié)構(gòu)由上述GAG分子的結(jié)合限定。
就其結(jié)合肝素和就其誘導(dǎo)生長因子依賴性細胞系TF1.8的增殖的能力對一組IL-4突變體的分析表明，肝素結(jié)合位點和IL-4Rα結(jié)合位點重疊。對于兩者都極其重要的殘基是R88。參與肝素結(jié)合和IL-4Rα結(jié)合的其他殘基是R81、R84、R53和可能地E9。E9是IL-4Rα結(jié)合的關(guān)鍵性殘基但其在肝素結(jié)合位點的邊緣。
術(shù)語“HLGAG”(肝素樣糖胺聚糖)用作表示普通細胞表面GAG分子的術(shù)語。如在本上下文中所用的，該術(shù)語是指該類型的全長分子例如肝素和硫酸乙酰肝素。是這些細胞表面GAG與配體相互作用和可導(dǎo)致疾病狀況如炎性疾病、轉(zhuǎn)移癌或?qū)τ刹≡w引起的感染的易感性。
肝素和硫酸乙酰肝素由重復(fù)的二糖單位構(gòu)成，所述二糖單位包括彼此連接和通過1→4鍵連接至其他二糖的己糖醛酸(HexA)和D-葡糖胺(G1cN)。糖醛酸可以是β-D-葡糖醛酸(G1cA)或α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)。兩者作為未衍生的單糖或作為2-O-硫酸化殘基存在。葡糖胺(G1cNAc)可以被N-硫酸化或N-乙?；?、或極少以游離胺存在。N-硫酸-葡糖胺可在C3(極少)、或在C6、或在C3和C6被O-硫酸化，或不含有硫酸基團。類似地，N-乙?；钠咸前房梢栽贑6上被O-硫酸化或未被硫酸化。
本發(fā)明部分基于化學(xué)試劑的鑒定，所述化學(xué)試劑抑制細胞表面HLGAG和無細胞配體或細胞結(jié)合的配體之間、或細胞外HLGAG和細胞結(jié)合的配體之間、或細胞外HLGAG和無細胞配體之間的相互作用。便利地，首先使用無細胞GAG分子或無細胞GAG分子的家族鑒定所述化學(xué)試劑，其可以從天然存在的HLGAG產(chǎn)生或通過對非GAG多糖的化學(xué)修飾的方法產(chǎn)生。
到目前為止，特別方便的HLGAG分子是硫酸乙酰肝素或肝素。硫酸乙酰肝素和肝素是不同長度分子的不均一混合物，其具有不同的硫酸化模式，其中重復(fù)性二糖HLGAG的糖醛酸組分也可以是艾杜糖醛酸。作為不均一性混合物的結(jié)果，不容易顯現(xiàn)負責(zé)與配體相互作用的級分。從而，不容易顯現(xiàn)與該配體相互作用的分子的部分。
提到“GAG”或“GAG的群體”可以指同一種實體。因此，GAG可以包含相同的或不同的GAG的群體。然而，一般地，GAG代表GAG分子包括GAG樣分子的不均一性群體。
因此，在第一實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生GAG寡糖文庫的方法和鑒定GAG寡糖或其能夠結(jié)合配體的部分或區(qū)域的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的GAG可用于治療任何這樣的疾病，該疾病涉及GAG樣分子和配體之間的相互作用。優(yōu)選的疾病包括炎性或過敏性疾病和轉(zhuǎn)移癌以及由病原體引起的感染。
優(yōu)選地，配體是肽、多肽或蛋白，盡管本發(fā)明擴展至配體為糖、脂質(zhì)、糖蛋白或從天然產(chǎn)物篩選或從化學(xué)文庫獲得的分子。蛋白配體的示例包括，但不限于細胞因子包括白細胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14或IL-15)、干擾素(例如α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素)或生長因子包括但不限于G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、KC、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、胰島素等；酶；趨化因子例如嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1、-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合的或病毒結(jié)合的受體。
可從許多糖多聚體中的任一種產(chǎn)生本發(fā)明的GAG寡糖。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，預(yù)期作為起始材料的多糖包括大腸桿菌K5多糖或來自另一種原核生物或真核生物的其等同物、殼多糖和/或殼聚糖。此外，起始材料可以是不同結(jié)構(gòu)的多糖例如葡聚糖?；诜荊AG多糖的分子和通過非GAG結(jié)構(gòu)連接的非GAG樣部分(其可以是或可以不是GAG)構(gòu)成的分子在此處被稱為“GAG復(fù)合分子”或“復(fù)合分子”。
如此處所用的，術(shù)語“GAG復(fù)合”結(jié)構(gòu)或分子或“復(fù)合物”結(jié)構(gòu)或分子可交換使用；在一個實施方案中，GAG復(fù)合結(jié)構(gòu)包含結(jié)合靶蛋白的糖結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，糖結(jié)構(gòu)包含通過接頭隔開的2種或更多種高度帶電荷(例如硫酸化的或磷酸化的)的三糖或二糖或四糖或五糖或己糖或七糖或八糖或這些糖的任何組合。優(yōu)選地所述接頭不基于GAG樣主鏈。相反地，接頭例如烷基鏈或多元醇結(jié)構(gòu)或聚乙二醇是優(yōu)選的。此外，高度帶電荷的糖不必基于GAG結(jié)構(gòu)。其他糖，例如甘露聚糖、或殼聚糖、或葡聚糖，可用作在其上展現(xiàn)帶電荷的基團的骨架。
通過截短和至少一次去乙?；?、硫酸化、去硫酸化、磷酸化和/或側(cè)鏈的附著從這些多聚體產(chǎn)生本發(fā)明的寡糖。
除了只使用上述衍生作用中的一種外，還可使用2、3、4或所有5種所述衍生步驟。
這些衍生步驟中沒有一種需要以任何特定的順序發(fā)生。特定寡糖的產(chǎn)生依賴于文庫的制備中所使用的額外步驟的順序和數(shù)目。
可通過許多機制實現(xiàn)將多糖截短成寡糖。例如可在不同階段獲得K5莢膜多糖的截短在天然的多糖上、在去N-乙?；亩嗵巧匣蛟诹蛩峄亩嗵巧稀Ｓ糜诮囟潭嗵堑姆椒ò复?、化學(xué)、熱和超聲波方案，例如由Alban和Franz，Biomacromolecules 2354，2001描述的方法。
也可能在不同的階段酶促截短多糖。肝素酶III、肝素酶II和肝素酶I切割硫酸化的K5多糖，從而產(chǎn)生更低分子量的片段。肝素酶III可將天然的K5多糖截短成想要的聚合長度(Nader等人，Glycoconjugate Journal 16265-270，1999)。β-D-葡糖苷酸酶和軟骨素酶AC也降解天然的未經(jīng)修飾的K5多糖(Lidholt等人，J.Biol.Chem.2722682，1997)。
葡糖胺單位上的N-乙酰基的存在，在當(dāng)其暴露于亞硝酸時有效地保護該糖苷鍵免受切割。可通過本領(lǐng)域已知的方法實現(xiàn)通過肼的介導(dǎo)選擇性地除去N-乙?；⒁?，例如，Shaklee和Conrad，Biochem.J.235225，1986；Shively和Conrad，Biochemistry153932-3939，1976；和Shaklee和Conrad，Biochem.J.217187-197，1984。然后可能通過使用能夠使葡糖胺殘基的α糖苷鍵斷裂的亞硝酸來截短K5葡糖胺-葡糖醛酸多聚體。通過改變反應(yīng)條件，可能獲得不同大小的衍生于K5的寡糖。使用大小排阻層析能夠獲得合理量由K5衍生的DP4-DP20。
殼多糖內(nèi)葡糖胺單位上的N-乙?；拇嬖冢诋?dāng)其暴露于亞硝酸時有效地保護該糖苷鍵免受切割。通過肼的介導(dǎo)選擇性地除去N-乙酰基在本領(lǐng)域是熟知的操作。參見Shaklee和Conrad，1986，同上；Shively和Conrad，1976，同上；和Shaklee和Conrad，1984，同上。然后可能使用能夠使硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素和硫酸軟骨素中的α糖苷鍵斷裂的亞硝酸來截短己糖胺多聚體。殼聚糖的糖苷鍵是β糖苷鍵，因此可產(chǎn)生不同于α糖苷鍵的反應(yīng)性和斷裂反應(yīng)。
已經(jīng)詳盡地研究了肝素型寡糖主鏈的化學(xué)硫酸化作用。使用改變的反應(yīng)條件已獲得一些程度的選擇性，已確定了某些羥基的反應(yīng)性(參見Ogamo等人，Carbohydr.Res.193165-172，1989)。此外，首先通過使寡糖過硫酸化，然后選擇性地使某些位置去硫酸化，已獲得一些選擇性。
本發(fā)明人的研究，目標(biāo)在于確定蛋白結(jié)合所必需的硫酸化程度，已顯示一些非硫酸化區(qū)域可提高GAG-配體結(jié)合事件的特異性。為了能實現(xiàn)對寡糖的硫酸化程度的一些控制，使用受控肼解，遞送部分去N-乙?；亩嗵?。在亞硝酸切割期間，N-乙?；拇嬖跒橄噜彽奶擒真I提供了保護作用，并不被硫酸化。因此，一些N-乙?；拇嬖趯?dǎo)致在整個寡糖中一些非硫酸化區(qū)域。在抗凝級聯(lián)反應(yīng)中硫酸化GAG和蛋白的結(jié)合是非常復(fù)雜的，肝素和血小板因子IV(PF-IV)的相互作用在一些治療性應(yīng)用中已產(chǎn)生一些問題。然而，盡管肝素-PF-IV相互作用以極高的親和力發(fā)生，但特異性也非常高，因此通過加入對肝素結(jié)合無害而對PF-IV結(jié)合有礙的官能團可獲得一定的選擇性。Petitou等人，1999，同上描述了這一點。可通過使高度硫酸化區(qū)域的數(shù)目最小化至末端上的4-5個糖單位并使不帶電荷的寡糖分隔子分隔帶電荷部分來實現(xiàn)該目的。
實現(xiàn)6-OH的選擇性保護，這樣可使2和4羥基得以選擇性地硫酸化?？蛇x擇地，6-O硫酸是最具反應(yīng)性的和最易水解的，從而提供了獲得游離的6-OH的另一種方法。此外，可使用銅(II)離子實現(xiàn)2-氨基和3-羥基的保護，從而可使6-OH選擇性硫酸化(Terbojevich等人，Makromol.Chem.1902847-2855，1989)。
此外，游離6-OH基的存在是進一步將單糖、二糖或三糖附著至游離OH基以產(chǎn)生分枝結(jié)構(gòu)的機會。已顯示β-1，3硫酸葡聚糖的分枝版本展現(xiàn)比對應(yīng)的具有相同分子量和硫酸化程度的線性版本更高的抗凝血活性(Alban和Franz，Biomacromolecules 2354-361，2001)。這些附著的糖單位按需要可以是硫酸化或非硫酸化的、或可以是磷酸化的或非磷酸化的。
硫酸化K5，然后肼解，以除去NHAc但留下O-硫酸化和N-硫酸化保持完整，然后選擇性地N-硫酸化，為K5的去乙?；缓驨和O-硫酸化提供了不同的硫酸化模式。
已詳盡地研究了殼聚糖類型寡糖主鏈的化學(xué)硫酸化作用。參見，例如，Hirano等人，Chitin.Nat.Tecnol.，[Proc.Int.Conf.Chitin Chitosan]，第3版，(Pub 1986)461-468，1985)。首先通過使寡糖過硫酸化，然后以類似于針對肝素乙酰硫酸和K5多糖的方式(Baumann等人，Carbohydr.Res.308381-388，1998)選擇性地使某些位置去硫酸化來獲得一些選擇性。
在本發(fā)明的備選實施方案中，通過這樣的方法產(chǎn)生GAG寡糖，該方法包括按大小分級分離肝素或硫酸乙酰肝素分子或其他多聚體例如K5多糖、殼多糖或殼聚糖的群體以產(chǎn)生與配體相互作用的非全長級分。肝素在其中一些二糖單位中包含葡糖醛酸和艾杜糖醛酸的混合物，并且在硫酸化程度上也是變化的?？赏ㄟ^任何便利的方法例如凝膠過濾柱進行分級分離，分級分離基于一般但非排外地從DP4至大約DP20(如DP5，DP6，DP7，DP8，DP9，DP10，DP11，DP12，DP13，DP14，DP15，DP16，DP17，DP18或DP19)的不同長度的糖鏈。分離的另一種形式基于硫酸化的程度。分離也可以基于這兩種參數(shù)的組合。
本發(fā)明的另一個方面是提供了新的磷酸化GAG寡糖。當(dāng)產(chǎn)生GAG寡糖的文庫時，通過包括磷酸化步驟產(chǎn)生這些分子?？蓪亩嗑垠w例如大腸桿菌K5多聚體、殼多糖或殼聚糖產(chǎn)生的半合成寡糖和通過對HLGAG例如肝素或硫酸乙酰肝素的分級分離產(chǎn)生的寡糖進行該磷酸化步驟和可能是必需的任何相關(guān)的去硫酸化步驟。
6-O硫酸是最容易水解的O-硫酸，從而提供了獲得游離的6-OH的方法。然后對游離6-OH磷酸化以產(chǎn)生6-O磷酸。已顯示硫酸酯和磷酸酯在許多化合物中等效，盡管在其他化合物中磷酸化改變了活性。也可能N磷酸化葡糖胺殘基。
通過使用氨基磷酸酯氧化法(Vieira de Almeida等人，Tetrahedron 557251-7270，1999；Dubreuil等人，Tetrahedron 557573-7582，1999，及其中引用的參考文獻)容易地獲得羥基的選擇性磷酸化。該方法已廣泛地用于形成磷酸肌醇、核苷酸和寡核苷酸?？蛇x擇地，可使用幾種其他更快速的引入磷酸基團的方法，例如在吡啶存在的情況下磷?；妊趸铮缓笤龠M行水解。也可能通過混雜的己糖激酶的作用酶促地磷酸化這些寡糖。
然后就其與配體相互作用或與配體結(jié)合的能力檢測根據(jù)以上描述的方法產(chǎn)生的各寡糖集庫(pool)?；趯で笾委焺┑募膊顩r選擇配體。例如，IL-4和IL-5是用于過敏性鼻炎和哮喘的配體，PECAM-1是用于炎癥和黑色素瘤的配體，gp120或親環(huán)蛋白A是用于HIV感染的配體。很明顯，可使用和特定疾病狀況關(guān)聯(lián)的任何蛋白或非蛋白配體。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了用于鑒定與配體相互作用的GAG寡糖的群體的方法。
可通過任何常規(guī)的方法鑒定與配體的相互作用，所述方法是例如凝膠阻留法、親和共電泳法、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)測定法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)測定法、熒光偏振(FP)測定法、閃爍迫近測定法或在生物芯片或其他表面(包括與質(zhì)譜檢測偶聯(lián)的表面)上的固定。
可通過首先將GAG寡糖固定在芯片上，然后加入配體來進行后一種方法。可選擇地，可將配體固定在芯片上，使用其篩選GAG寡糖與其結(jié)合的能力。
另一種選擇是將HLGAG例如肝素固定在固體支持物上，然后篩選根據(jù)上述方法產(chǎn)生的GAG寡糖抑制配體和固定的肝素結(jié)合的能力。
因此，特別有用的測定法是將配體和GAG寡糖混合并篩選GAG寡糖抑制配體和結(jié)合在芯片上的HLGAG(例如，肝素或硫酸乙酰肝素)結(jié)合的能力。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了產(chǎn)生與配體例如蛋白相互作用的GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子的方法，所述方法包括產(chǎn)生GAG寡糖、或GAG復(fù)合分子的文庫，然后就與所述配體相互作用或抑制配體和已知與所述配體相互作用的HLGAG之間的相互作用的能力篩選所述文庫的各成員。
在一個優(yōu)選的實施方案中，GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子結(jié)合分泌的細胞產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以是蛋白，這樣就抑制了配體和HLGAG例如肝素之間的相互作用。
當(dāng)然，存在許多其他測定法，所述測定法可用于篩選GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子和配體之間相互作用或用于篩選對配體和已知結(jié)合該配體的HLGAG之間的相互作用的抑制作用。另一個測定法是濾膜結(jié)合測定法。在該測定法中，用能夠提供可鑒定的信號的報告分子例如熒光染料標(biāo)記GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子、或配體中的一種，使兩種分子在溶液中相互作用。然后將所得的混合物通過能夠阻滯GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子或配體中的一種分子或只阻滯GAG寡糖-配體復(fù)合物或GAG樣復(fù)合分子-配體復(fù)合物的濾膜。
在一個實施方案中，該濾膜是例如阻滯蛋白的硝酸纖維素濾膜。在該情況下，如果由報告分子標(biāo)記的GAG級分不能通過濾膜，那么濾膜中存在報告信號就表明GAG和蛋白的結(jié)合。
在另一個實施方案中，用報告分子標(biāo)記肝素或硫酸乙酰肝素并在不同的GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子存在的情況下將其與蛋白反應(yīng)。肝素或硫酸乙酰肝素通過濾膜表明GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子已抑制了肝素/硫酸乙酰肝素與蛋白之間的相互作用。
不同的GAG會和不同的配體相互作用，或不同的配體會和不同的GAG相互作用或兩種情況同時存在。因此，另一種測定法包括使用載有固定的配體的親和柱。然后將GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子通過該柱，并確定GAG寡糖的阻滯的存在。便利地使用鹽梯度來洗脫結(jié)合的GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子。一旦鑒定結(jié)合柱子上的配體的級分后，可進一步分析該級分以獲得其中不同結(jié)構(gòu)實體的數(shù)目的指示。這樣的分析可包括，例如，陰離子交換層析、質(zhì)譜或電泳。
本發(fā)明不限定于此處描述的步驟的任何特定順序。
關(guān)于該后一種實施方案，在一個示例中，在IL-5親和柱上檢測肝素的級分。根據(jù)本發(fā)明已確定包含DP12的GAG寡糖的級分結(jié)合IL-5。更明確地，對所述DP12級分的隨后的陰離子交換層析顯示，在整個DP12級分/集庫中只有一個亞組的結(jié)構(gòu)結(jié)合IL-5?？赡茉谠摻Y(jié)合IL5的結(jié)構(gòu)亞組中存在分別的實體，這些分別的實體可能在其硫酸化的模式上存在差異。
在另一個示例中，在通過固定IL-4制備的親和柱上檢測肝素的級分。根據(jù)本發(fā)明已確定包含DP10的GAG的級分結(jié)合IL-4。隨后對DP10級分的陰離子交換層析顯示在整個DP10級分中只有一個結(jié)構(gòu)亞組結(jié)合IL-5。根據(jù)質(zhì)譜分析證明這些結(jié)構(gòu)在其硫酸化的模式上存在差異。
IL-4上結(jié)合肝素的位點和IL-4上結(jié)合IL-4Rα所需的位點被提出是重疊的。這對于尋靶和功能分析非常重要。
一旦鑒定結(jié)合特定配體的GAG寡糖后，該級分本身可用作抑制蛋白(或其他配體)和細胞表面HLGAG(例如，肝素或硫酸乙酰肝素)之間相互作用的治療劑。所述蛋白(或其他配體)可以是不合細胞的或和細胞或病毒例如細胞表面或病毒表面結(jié)合的。所述GAG寡糖也可用作調(diào)節(jié)分泌的細胞產(chǎn)物和細胞外基質(zhì)組分之間或細胞表面蛋白和細胞外基質(zhì)組分之間、或蛋白和其配體(兩者或其中任一者可以是細胞表面的或細胞結(jié)合的)之間相互作用的治療劑?？蛇x擇地，GAG寡糖可用作鑒定天然的產(chǎn)物或來自化學(xué)文庫的產(chǎn)物的靶，所述產(chǎn)物在結(jié)合配體方面模擬GAG寡肽或者抑制或促進HLGAG和配體之間的相互作用。這些分子可以是GAG的拮抗劑或激動劑或化學(xué)類似物。因此“類似物”擴展至和包括功能上等同的任何結(jié)構(gòu)，其功能等同性在于其以類似的方式結(jié)合和/或調(diào)節(jié)配體。
此處提到“調(diào)節(jié)”或“調(diào)控”擴展至和包括抑制和/或促進相互作用。
因此，本發(fā)明的另一個方面涉及用于產(chǎn)生用于在受治療者中治療疾病狀況的藥物的方法，所述方法包括根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)一系列GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子，并就和配體相互作用或調(diào)節(jié)配體的能力篩選各GAG。鑒定與配體相互作用或調(diào)節(jié)配體的GAG寡糖，在所述藥物的生產(chǎn)中使用其或其類似物、激動劑或拮抗劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)是抑制。
此處預(yù)計的配體的類型包括上面列出的類型例如PECAM-1、親環(huán)蛋白A、gp120和細胞因子例如白細胞介素(IL)-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12和13、G-CSF、GM-CSF、LIF和M-CSF以及趨化因子例如嗜酸細胞活化趨化因子-1、嗜酸細胞活化趨化因子-2和嗜酸細胞活化趨化因子-3。此處涉及的疾病包括過敏性鼻炎、哮喘、特應(yīng)性皮炎和其他過敏性疾病、HIV(人、犬科動物、貓科動物、馬科動物等)、炎性疾病、深靜脈血栓形成和黑色素瘤和其他癌癥。
被治療的受治療者包括人、家畜動物(例如，牛、綿羊、豬、馬、驢)、實驗室實驗動物(例如，兔子、豚鼠、小鼠、大鼠)和伴侶動物(例如，狗、貓)。
在本發(fā)明的另一個方面提供了在受治療者中治療疾病狀況的方法，所述疾病狀況由所述宿主中細胞表面上的HLGAG和配體之間、或所述宿主中細胞外基質(zhì)中的HLGAG和配體(其可以是或可以不是和細胞結(jié)合的)之間的相互作用、或所述宿主中可被HLGAG破壞的蛋白-配體相互作用(其中，所述蛋白可以和細胞結(jié)合而配體是可溶性的，或蛋白和配體都可以和細胞結(jié)合)造成的，所述方法包括給所述受治療者施用有效量的藥物，所述藥物是根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生和鑒定的與所述配體相互作用的GAG寡糖，和將所述級分摻入藥物中，或獲得其化學(xué)類似物或同源物并將其摻入所述藥物中。
本發(fā)明的另一個方面提供了組合物，該組合物包含以下物質(zhì)中的一種或多種(i)此處所定義的GAG寡糖；(ii)此處所定義的GAG樣復(fù)合分子；(iii)此處所定義的GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子；(iv)(i)、(ii)或(iii)的激動劑；(v)(i)、(ii)或(iii)的拮抗劑；(vi)(i)或(ii)或(iii)或(iv)或(v)的化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；和/或(vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)的天然或化學(xué)文庫類似物、同源物或直向同源物。
所述組合物也包含一種或多種藥物可接受載體和/或稀釋劑。
所有上面這些試劑被稱為“活性成分”，建議將所述組合物用作藥物。
適合用于注射用途的藥物形式包括無菌水溶液(可溶于水的情況下)、用于臨時配制無菌注射液的無菌粉劑和可吸入形式。優(yōu)選地這些形式在生產(chǎn)和貯存的條件下是穩(wěn)定的，而且一般進行防腐處理以抵抗微生物例如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或稀釋介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油?？赏ㄟ^例如使用表面活性劑保持恰當(dāng)?shù)牧鲃有?。可通過使用各種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、柳硫汞等來預(yù)防微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選地包含等滲劑，例如，糖或氯化鈉。可通過在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)來延長可注射組合物的吸收。
通過將所需量的活性成分以及所需的任選地其他活性成分一起摻入合適的溶劑，然后通過滅菌或至少這樣的方法來制備無菌注射液，該方法將污染性病毒、細菌或其他生物學(xué)實體減少至對于給人或動物受治療者施用是可接受的水平。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，合適的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù)產(chǎn)生活性成分和任何其他想要的成分的粉劑。
當(dāng)活性成分受到適當(dāng)?shù)谋Ｗo時，其可經(jīng)口施用，例如，用惰性稀釋劑或用可吸收食用的載體進行保護，或其可被包封在硬殼或軟殼明膠膠囊中，或其可被壓制成片劑。對于口服治療施用，可將活性成分摻入賦形劑并以可攝入的片劑、口含片劑、藥錠、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、紙囊劑等形式使用。這些組合物和制劑按重量計算應(yīng)當(dāng)包含至少1％的活性化合物。當(dāng)然，組合物和制劑的百分比可以變化，便利地，可在單位的重量的大約5至大約80％之間。這些治療上有用的組合物中的活性成分的量是可獲得合適的劑量的量。這樣制備本發(fā)明的優(yōu)選的組合物或制劑以使口服劑量單位形式包含大約0.1μg至200mg的活性化合物?？蛇x擇的劑量包括從大約1μg至大約1000mg和從大約10μg至大約500mg。這些劑量可以是每個體或每kg體重。施用可以是每秒、每分鐘、每小時、每天、每周、每月或每年。
片劑、藥錠、丸劑和膠囊劑等也可包含下面列出的成分?？杉尤胝澈蟿├鐦淠z、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑例如磷酸二鈣；崩解劑例如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸等；潤滑劑例如硬脂酸鎂；和甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精。當(dāng)劑量單位形式為膠囊時，除了上述類型的材料，其還可包含液體載體。各種其他材料可以包衣的形式存在或以其它方式修飾劑量單位的物理形式。例如，可用紫膠、糖或兩者同時包被片劑、丸劑或膠囊。糖漿劑或酏劑可包含活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯、染料和調(diào)味劑例如櫻桃或柑橘調(diào)料。當(dāng)然，用于配制任何單位劑型的任何材料應(yīng)當(dāng)是藥物純的并且以施用量基本上無毒。此外，可將活性化合物摻入持續(xù)釋放的制備物和制劑。
藥物可接受載體和/或稀釋劑包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑以及吸收延遲劑等。這些用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的用途在本領(lǐng)域是熟知的，除了和所述活性物質(zhì)不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑外，預(yù)期其在治療性組合物中的應(yīng)用。也可將補充性活性成分整合入組合物。
也可配制供局部或外用施用的組合物?？稍凇錜emington′sPharmaceutical Sciences″，Mack Publishing Co.，Easton PA.，第16版，1980，Ed.By Arthur Osol中查找到配制和施用的技術(shù)。因此，對于局部或外用給藥，可以任何適合的方式配制本組合物，包括但不限于，乳膏劑、凝膠、油脂、軟膏劑、溶液、混懸液、粉劑、噴霧劑或氣霧劑。對于透粘膜給藥，在制劑中使用適合于要透過的屏障的滲透劑。這些滲透劑在本領(lǐng)域中是公知的，包括但不限于苯扎氯銨、洋地黃皂甙、二氫細胞松弛素B和癸酸。
以洗劑、乳膏劑或凝膠形式存在的本發(fā)明的組合物可包含提供想要的質(zhì)地、稠度、粘度和外觀的可接受的稀釋劑或載體?？山邮艿南♂寗┖洼d體對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，其包括，但不限于，乙氧基化和非乙氧基化的表面活性劑、脂肪醇、脂肪酸、碳氫油(例如棕櫚油、椰子油和礦質(zhì)油)、可可脂蠟、硅油、緩沖劑、纖維素衍生物、乳化劑例如非離子有機和無機堿、防腐劑、蠟酯、甾醇、甘油三酯、磷脂例如卵磷脂和腦磷脂、多元醇酯、脂肪醇酯、親水性羊毛脂衍生物和親水性蜂蠟衍生物。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了可吸入的藥物組合物。
一旦鑒定結(jié)合特定配體的GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子后、或在獲得化學(xué)類似物或在獲得天然產(chǎn)物類似物(其以和GAG寡糖相同的方式起作用，或充當(dāng)激動劑或拮抗劑)后，產(chǎn)生能夠和該特定分子或分子群相互作用的免疫學(xué)試劑可能是非常有用的。產(chǎn)生其中抗原性區(qū)域?qū)?yīng)于配體的HLGAG結(jié)合區(qū)或其部分的免疫學(xué)試劑也是有用的。優(yōu)選的免疫學(xué)試劑是抗體，這些抗體特別適合用于免疫測定法。這些免疫測定法可用于監(jiān)測靶試劑的水平、純化靶試劑或抑制靶試劑的功能。
單克隆抗體在免疫測定法中的應(yīng)用是特別優(yōu)選的，因為能大量產(chǎn)生和產(chǎn)物的均一性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備用于單克隆生產(chǎn)的雜交瘤細胞系，通過將永生化細胞系和針對免疫原制劑致敏的淋巴細胞融合來產(chǎn)生所述雜交瘤細胞系。(參見，例如，Douillard和Hoffman，Basic Facts about Hybridomas，in Compendium ofImmunology第2卷，ed.by Schwartz，1981；Kohler and Milstein，Nature 256495-499，1975；Kohler和Milstein，EuropeanJournalof Immunology 6511-519，1976)。
本發(fā)明的另一個方面提供了用于在樣品中檢測HLGAG級分的方法，所述方法包括將所述樣品和對于所述HLGAG級分或其同源物或類似物特異性的抗體在足以形成抗體-HLGAG復(fù)合物的條件下接觸一段時間，然后檢測所述復(fù)合物。在下面的描述中，“HLGAG”分子或其類似物或同源物被稱為“抗原”。也可使用標(biāo)記的結(jié)合HLGAG或其類似物或同源物的蛋白檢測HLGAG分子或其類似物或同源物。用于該用途的理想的蛋白是抗生物素蛋白或乳鐵蛋白。這些蛋白可用熒光衍生物例如熒光素或Alexafluor 488標(biāo)記。
可通過許多方法例如通過Western印跡法和ELISA法進行HLGAG級分的檢測?？色@得許多免疫測定技術(shù)，如通過參考美國專利號4,016,043、4,424,279和4,018,653可看到的技術(shù)。
夾心測定法是其中最有用和最廣泛使用的測定法之一，本發(fā)明也有利地使用這種方法。存在許多夾心測定法技術(shù)的變體，本發(fā)明包含所有變體。簡而言之，在一般的正向測定法中，將未標(biāo)記的抗體固定在固體基質(zhì)上，將含有待檢測的抗原的待測樣品與結(jié)合的分子接觸。在適合的溫育時間(該時間段足以使抗體-抗原復(fù)合物形成)后，然后加入二抗(該二抗對于抗原是特異性的，標(biāo)記有能夠產(chǎn)生可檢測信號的報告分子)并進行溫育，使時間足以形成另一種復(fù)合物抗體-抗原-標(biāo)記的抗體。洗去任何未反應(yīng)的材料，通過觀察由報告分子產(chǎn)生的信號確定抗原的存在。可通過可視信號的簡單觀察對結(jié)果定性，或可通過和含有已知量的抗原的對照樣品比較來進行定量。正向測定法中的變體包括同時測定法，在于向結(jié)合的抗體中同時加入樣品和標(biāo)記的抗體。這些技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，包括很容易看出的任何小的變化。
固體表面一般是玻璃或聚合物，最普遍使用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可以管、珠子、盤或微量培養(yǎng)板、或適合進行免疫測定法的任何其他表面的形式存在。
如在本說明書中所用的，“報告分子”是因其化學(xué)性質(zhì)提供允許檢測結(jié)合抗原的抗體的可分析鑒定的信號的分子。檢測可以是定性的或可以是定量的。在該類型的測定法中最普遍使用的報告分子是酶、熒光團或包含放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化學(xué)發(fā)光分子。
在酶免疫測定的情況下，通常通過戊二醛或高碘酸的方法將酶綴合至二抗。然而，容易地看出，存在多種不同的本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易獲得的綴合技術(shù)。除其他以外，普遍使用的酶特別包括辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。和特定的酶一起使用的底物一般根據(jù)在被對應(yīng)酶水解后產(chǎn)生可檢測的顯色變化來選擇。合適的酶的示例包括堿性磷酸酶和過氧化物酶。也可能使用產(chǎn)生熒光的底物，該底物產(chǎn)生熒光產(chǎn)物而不是上面指出的顯色底物。在所有情況下，將酶標(biāo)記的抗體加入至一抗-抗原復(fù)合物，使其結(jié)合，然后洗去過量的試劑。然后向抗體-抗原-抗體的復(fù)合物中加入包含合適底物的溶液。底物將和被連接至二抗的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性可視的信號，也可對其進一步定量(一般通過分光光度計)，從而給出存在于樣品中的肝素的量的指示?！皥蟾娣肿印币矓U展至使用細胞凝集或凝集反應(yīng)的抑制，例如膠乳珠上的紅細胞等。
可選擇地，可將熒光化合物，例如熒光素和羅丹明通過化學(xué)方法偶聯(lián)至抗體而不改變其結(jié)合能力。當(dāng)被特定波長的光照射激活時，熒光染料標(biāo)記的抗體吸收光能，在分子中誘導(dǎo)激發(fā)態(tài)，然后發(fā)射可用光學(xué)顯微鏡可視檢測的特征顏色的光。如在EIA中，讓熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合第一抗體-抗原復(fù)合物。在洗去未結(jié)合的試劑后，將剩下的三元復(fù)合物暴露于合適波長的光，觀察到的熒光表明目的抗原的存在。在本領(lǐng)域中已建立了完善的免疫熒光和EIA技術(shù)，該技術(shù)特別優(yōu)選地適合于本方法。然而，也可使用其他報告分子，例如放射性同位素、化學(xué)發(fā)光劑或生物發(fā)光分子。
此外，可使用識別配體的GAG結(jié)合區(qū)域或其部分的抗體測定保留在外源配體上的GAG結(jié)合位點的比例來間接地檢測GAG的存在。
對廣泛的不同類型的蛋白上的肝素結(jié)合位點存在相當(dāng)大的興趣，已有許多描述在蛋白一級序列中的肝素結(jié)合基序的嘗試。Cardin和Weintraub首先將肝素結(jié)合基序描述為XBBBXXBX和XBBXBX，其中B是堿性殘基，X是親水性(hydropathic)殘基(Cardin和Weintraub，Arteriosclerosis 921-32，1989)。Hileman等人將這些基序擴展至包括將堿性相互作用殘基拉近的轉(zhuǎn)角并描述了新的共有序列，TXXBXXTBXXXTBB，其中T是轉(zhuǎn)角(Hileman等人，Bioessays 20156-67，1998)。然而，這些基序不適合于所有蛋白，因為GAG結(jié)合位點由蛋白的溶液結(jié)構(gòu)決定并且肝素結(jié)合位點不顯示對特定序列或蛋白折疊的絕對依賴性。正是肝素上的硫酸基團和恰當(dāng)?shù)胤植荚诘鞍妆砻嫔系膲A性斑片(patches)相互作用。因為溶液中沿肝素螺旋一側(cè)的硫酸簇之間的距離是17，所以溶液中蛋白表面上其間具有17的間隔的兩片堿性殘基是朝向定位肝素結(jié)合位點的良好起始點(Mulloy和Forster，Glycobiology 101147-56，2000)。
為了鑒定靶蛋白上的GAG結(jié)合區(qū)域，必需表征該蛋白的一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。除了其他以外，這將要求考慮
1.酸性/堿性殘基的數(shù)目和位置。
2.極性/非極性殘基的數(shù)目和位置。
3.帶電荷的/不帶電荷的殘基的數(shù)目和位置。
4.疏水性/親水性殘基的數(shù)目和位置。
5.天然存在的殘基化學(xué)修飾的數(shù)目和位置，所述修飾即，羥化、磷酸化、甲基化、乙?；?、甲?；?、糖的加入、脂質(zhì)的加入和輔因子例如吡哆醛-5-磷酸和亞鐵血紅素的共價附著。
6.共價和非共價結(jié)合(即二硫鍵、氫鍵、離子鍵、疏水鍵、范德瓦爾斯力等)的數(shù)目和位置。
7.個體和/或成組殘基之間的物理距離。
8.殘基的立體異構(gòu)作用。
9.α螺旋和β折疊形成的數(shù)目和位置。
10.形成同型二聚體和異二聚體的潛能。
此外，也可就諸如以下的特征來表征碳水化合物結(jié)合伴侶(例如GAG)的特征1.鏈長即聚合的程度。
2.側(cè)鏈的修飾。
3.立體異構(gòu)作用。
4.環(huán)結(jié)構(gòu)的數(shù)目和位置。
5.糖苷鍵的數(shù)目和位置。
6.二級結(jié)構(gòu)(如果存在)，即螺旋。
在分析蛋白和碳水化合物結(jié)合伴侶的特征中，所用的方法可包括1.比較序列分析。
2.醇母雙雜交研究。
3.免疫共沉淀技術(shù)和其他親和方法。
4.核磁共振(NMR)。
5.X射線晶體學(xué)。
6.計算機建模。
7.定點誘變和結(jié)構(gòu)域缺失研究。
8.配體和GAG的化學(xué)交聯(lián)。
結(jié)構(gòu)域缺失分析是低分辨率方法，該方法用于大的蛋白，例如PECAM-1，以確定蛋白上對于結(jié)合GAG是重要的總體區(qū)域。結(jié)構(gòu)域缺失包括蛋白的DNA編碼序列的截短，這樣，可使表達的蛋白縮短確定的長度。使用在本文中描述的測定法，就其結(jié)合GAG的能力篩選整個分子長度內(nèi)的系列結(jié)構(gòu)域缺失。包含GAG結(jié)合位點的區(qū)域?qū)⒔Y(jié)合GAG，但該位點被刪除的區(qū)域不能結(jié)合GAG。通過檢查喪失HLGAG結(jié)合的結(jié)構(gòu)域缺失，可鑒定對GAG結(jié)合非常重要的整個蛋白上相對較小的區(qū)域[Conrad，1998，同上]?？煞蛛x表達該區(qū)域以進行進一步分析，例如定點誘變或NMR研究。
定點誘變包括蛋白的DNA編碼序列內(nèi)的一個或多個核苷酸的突變以使表達的蛋白在至少一個氨基酸上發(fā)生了改變。然后在本文描述的肝素結(jié)合測定法中就對肝素結(jié)合的影響篩選突變體?？蓪⒂绊懜嗡亟Y(jié)合的突變體在二維或三維蛋白模型上作圖以確定其彼此相對位置，和其相對于蛋白整體的位置。該技術(shù)可用于任何GAG結(jié)合蛋白以收集關(guān)于該蛋白上的任何GAG結(jié)合位點的信息[Tsiang等人，J.Biol.Chem.27016854-16863，1995]。
使用NMR收集關(guān)于蛋白和其他分子的三維結(jié)構(gòu)信息。用非放射性同位素例如13C和15N標(biāo)記要研究的分子，之后將分子接受強磁場。將這些磁場中的分子的行為用于收集關(guān)于所述分子的結(jié)構(gòu)信息。為使用NMR確定蛋白上的GAG結(jié)合位點，首先確定無GAG時的蛋白的結(jié)構(gòu)。然后在GAG存在的情況下確定結(jié)構(gòu)，比較兩種結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)受到最大干擾的氨基酸很可能是結(jié)合GAG的氨基酸?？蓪Ψ肿恿康陀?0kDa的蛋白例如IL-4和PECAM-1的單個結(jié)構(gòu)域進行NMR研究[Chuang等人，Biochem.393542-3555，2000]。
其他用于確定結(jié)合位點的方法包括使用這樣的肽進行的結(jié)合的競爭抑制，該肽模擬靶蛋白內(nèi)的推定的肝素結(jié)合序列?？赏ㄟ^肽合成或通過特定的內(nèi)切蛋白酶或化學(xué)試劑例如溴化氰切割靶蛋白來產(chǎn)生這些肽。然后可通過反相HPLC[Conrad，1998，同上]純化所述肽。可選擇地，在某些條件下可將GAG和蛋白直接交聯(lián)。在碳化二亞胺催化劑存在的情況下用N-羥基琥珀酰亞胺酯活化糖醛酸的羧基?；罨腉AG與靶蛋白結(jié)合。如果活化的GAG與蛋白(該蛋白的GAG結(jié)合位點在非常臨近的范圍內(nèi)包含賴氨酸)結(jié)合，那么將發(fā)生共價交聯(lián)[Lyon等人，J.Biol Chem.277(2)1040-1046，2002]?？删托揎椀奈稽c檢查HLGAG-蛋白復(fù)合物以說明蛋白內(nèi)和GAG鏈交聯(lián)的賴氨酸?？蓪⑦@些賴氨酸在二維或三維蛋白模型上作圖以確定其在蛋白上的位置，相對于其他堿性氨基酸(所述堿性氨基酸可能是對GAG結(jié)合有貢獻的候選者)的位置。
因此，本發(fā)明提供了鑒定目的配體上的GAG結(jié)合區(qū)域的方法，所述方法包括獲得配體的一個或多個變體形式以及將配體的所述變體形式和GAG分子的結(jié)合與野生型配體和相同GAG分子的結(jié)合相比較，其中和野生型變體與相同的GAG分子的結(jié)合相比，變體配體和該GAG分子之間的結(jié)合親和力的降低表示配體的該變體形式在該配體的GAG結(jié)合位點中包含改變。
優(yōu)選地，目的配體是蛋白，甚至更優(yōu)選地，所述蛋白是細胞因子、白細胞介素、干擾素或可溶性的或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體。
如此處所用的，關(guān)于目的配體的術(shù)語“變體”是指結(jié)構(gòu)上區(qū)別于或不同于野生型目的配體的配體分子的任何形式，該野生型配體是就結(jié)合親與力和變體進行比較的配體。提供了本發(fā)明包括的結(jié)構(gòu)變化的示例。優(yōu)選地，配體是蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子，在本方法的本實施方案中，“變體”配體包括這樣的蛋白，相對該蛋白的野生型，其包含一個或多個氨基酸插入、缺失或置換。變體蛋白配體中的結(jié)構(gòu)域插入、缺失或置換也可構(gòu)成這些氨基酸置換。
本發(fā)明還擴展至配體上的位點和特別是GAG或其部分與之相互作用的線性或構(gòu)象結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子，所述GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合分子或非GAG或非GAG樣分子結(jié)合肽、多肽或蛋白上的位點和GAG寡糖結(jié)合的位點相同。
通過下列非限定性實施例進一步描述本發(fā)明。
實施例1來自大腸桿菌K5多聚體的DP4-DP20寡糖的文庫的產(chǎn)生大腸桿菌K5多聚體的長度的裁減在各階段中的一個階段截短K5莢膜多糖在天然的多糖上、去N-乙?；亩嗵巧匣蛄蛩峄亩嗵巧稀Ｓ糜诮囟潭嗵堑姆椒ò复?、化學(xué)、熱和超聲波方案。(Alban和Franz，2001，同上)。
酶促截短也可能在各階段進行多糖的酶促截短。肝素酶III、肝素酶II和肝素酶I切割硫酸化的K5多糖，從而產(chǎn)生更低分子量的片段。肝素酶III將天然的K5多糖截短成想要的聚合長度(Nader等人，1999，同上)。β-D-葡糖醛酸糖苷酶和軟骨素酶AC將降解天然的未修飾的K5多糖(Lidholt等人，1997，同上)。
酶促截短
化學(xué)截短葡糖胺單位上的乙?；拇嬖?，在當(dāng)其暴露于亞硝酸時，有效地保護該糖苷鍵免受切割。通過肼的介導(dǎo)選擇性地除去N-乙酰基對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知(Shaklee和Conrad，1986，同上；Shively和Conrad，1976，同上；和Shaklee和Conrad，1984，同上)。可能通過使用能夠使葡糖胺殘基的α糖苷鍵斷裂的亞硝酸來截短葡糖胺-葡糖醛酸多聚體。通過改變反應(yīng)條件，可能獲得不同大小的衍生自K5的寡糖，使用大小排阻層析獲得適當(dāng)量的衍生自K5的DP4-DP20。

大腸桿菌K5寡糖/多糖的硫酸化目標(biāo)在于確定蛋白結(jié)合所需的硫酸化程度的初步研究已顯示，一些非硫酸化區(qū)域可提高結(jié)合的特異性。為了實現(xiàn)對DP12寡糖的硫酸化程度的一些控制，使用受控肼解反應(yīng)遞送部分去N-乙?；亩嗵恰Ｔ趤喯跛崆懈钇陂gN-乙?；拇嬖跒橄噜彽奶擒真I提供了保護作用，并且其不被硫酸化。因此，一些N-乙?；拇嬖趯?dǎo)致在整個寡糖中產(chǎn)生一些非硫酸化區(qū)域。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于選擇性保護6-OH的方法，該保護從而使得能夠選擇性地硫酸化2和4位羥基?？蛇x擇地，6-O硫酸是最活躍的和最易水解的，從而提供了獲得游離的6-OH的另一種方法。
此外，游離6-羥基的存在為將其他單糖、二糖或三糖附著至游離羥基，從而產(chǎn)生分枝結(jié)構(gòu)提供了機會。已顯示β-1，3硫酸葡聚糖的分枝版本展現(xiàn)出比對應(yīng)的具有相同分子量和硫酸化程度的線性版本更高的抗凝活性(Alban和Franz，2001，同上)。這些附著的糖單位可以是硫酸化的或非硫酸化的、或磷酸化的或非磷酸化的。
R＝H、SO3、PO32-、糖部分、烷基、保護基團。
其他化學(xué)修飾硫酸化K5，然后肼解，以除去NHAc(但保留O-硫酸化和N-硫酸化的完整性)，然后選擇性N硫酸化，可用來產(chǎn)生與K5的去乙?；驨和O-硫酸化不同的硫酸化模式。
實施例2來自殼聚糖的DP4-DP20寡糖的文庫的產(chǎn)生裁減殼聚糖多糖的長度
酶促截短使用殼多糖酶對殼多糖和殼聚糖的酶促降解是公知的[Horwitz等人，Chitin，Chitosan and related enzymes，Zikakis J.，(ed.)Academic Press，Orlando，F(xiàn).L.(1984)]。
化學(xué)截短殼多糖內(nèi)葡糖胺單位上的乙?；拇嬖?，在當(dāng)其暴露于亞硝酸時，有效地保護該糖苷鍵免受切割。通過肼的介導(dǎo)選擇性地除去N-乙?；枪姆椒?Shaklee和Conrad，1986，同上；Shively和Conrad，1976，同上；和Shaklee和Conrad，1984，同上)。
然后通過使用能夠使硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素和硫酸軟骨素中的α糖苷鍵斷裂的亞硝酸來截短葡糖胺多聚體。殼聚糖的糖苷鍵是β糖苷鍵，因此可產(chǎn)生不同于α糖苷鍵的反應(yīng)性和斷裂反應(yīng)。然而，對截短的硫酸化殼聚糖片段已對此進行了描述(Terbojevich等人，1989，同上)。

殼聚糖多糖的硫酸化已詳盡地研究了殼聚糖類型的寡糖主鏈的化學(xué)硫酸化(Hirano等人，1985，同上)。首先通過過硫酸化寡糖，然后以類似于針對硫酸乙酰肝素和K5多糖的方式(Baumann等人，1998，同上)選擇性地使某些位置去硫酸化來獲得一些選擇性。此外，通過使用銅(II)離子獲得2-氨基和3-羥基的保護，從而使得能夠選擇性硫酸化6-OH(Terbojevich等人，1989，同上)。
目標(biāo)在于確定蛋白結(jié)合所需的硫酸化程度的初步研究已顯示，一些非硫酸化區(qū)域可提高結(jié)合的特異性。為了實現(xiàn)對DP12寡糖的硫酸化程度的一些控制，受控肼解產(chǎn)生部分去N-乙?；亩嗵?。在亞硝酸切割期間，N-乙?；拇嬖跒橄噜彽奶擒真I提供了保護作用，并且其不被硫酸化。因此，一些N-乙?；拇嬖趯?dǎo)致在整個寡糖上產(chǎn)生一些非硫酸化區(qū)域。
實施例3GAG寡糖的磷酸化6-O硫酸是最容易水解的O-硫酸，從而提供了獲得游離6-OH的途徑。然后磷酸化游離6-OH以產(chǎn)生6-O磷酸。已顯示硫酸酯和磷酸酯在許多化合物中是等效的。也可能N磷酸化葡糖胺殘基。
使用氨基磷酸酯氧化法(Vieira de Almeida等人，1999，同上；Dubreuil等人，1999，同上，此處引用作為參考)容易地獲得對羥基的選擇性磷酸化。該方法已廣泛地用于形成磷酸肌醇、核苷酸和寡核苷酸?？蛇x擇地，可使用幾種其他更快速的引入磷酸基團的方法，例如在吡啶存在的情況下使用磷酰基氯氧化物，然后再進行水解。也可能通過混雜的己糖激酶的作用酶促地磷酸化這些寡糖。
實施例4肝素和硫酸乙酰肝素寡糖的文庫的制備可通過許多方法部分消化HLGAG，所述方法包括用肝素酶的酶促消化和使用試劑例如亞硝酸的化學(xué)消化、堿性β-消除和氧化聯(lián)合堿性解聚作用[Conrad，1998，同上]。肝素酶I和肝素酶III在肝素/硫酸乙酰肝素鏈上的特定位點進行切割肝素酶I在N-硫酸化g1cN結(jié)構(gòu)域中的IdoA殘基處切割，肝素酶III在非硫酸化的N-乙酰G1cN結(jié)構(gòu)域中的G1cA殘基處切割。
按照Turnbull等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(6)2698-2703，1999)描述的方法解聚硫酸乙酰肝素，按照Chai等人(Anal.Chem.70(10)1998)描述的方法解聚肝素。簡而言之，將肝素(5g)和白蛋白(4mg)溶解在50ml包含3mM CaCl2的30mM CH3CO2Na中并用0.2M NaHCO3將pH調(diào)節(jié)為7。加入肝素酶I，EC 4.2.2.7，(2 IU)，將混合物在30℃下溫育16小時。將該混合物煮沸3分鐘，等分至小體積(5ml)中，然后冷凍。融化等分，在注入(1ml)大小排阻層析系統(tǒng)之前進行離心和過濾。
在兩個串聯(lián)連接的90×1.5cm玻璃柱上進行SEC。用P6 fine裝填第一根柱子，用P10 fine裝填第二根柱子。使用Gilson model 307鈦泵(Middleton，Wisconsin，USA)以0.25ml/分鐘的流速用0.25MNaCl洗脫柱子，用Shimadzu RID-10折光率檢測器(Melbourne，Victoria，Australia)監(jiān)測流出物。使用Gilson Unipoint軟件獲得數(shù)據(jù)。圖1顯示代表性層析圖。收集1ml的級分。匯集臨近峰最大值的級分，進行冷凍干燥并在快速脫鹽柱上脫鹽。凍干已脫鹽的片段，將其重新溶解在水中并在-20℃下貯存。使用5500mol-1cm-1的消光系數(shù)在232nm處在30mM HCl中通過分光光度計確定各片段的濃度。使用MALDI MS(見下文)證實寡糖的大小。
然后將均一糖數(shù)目的肝素和硫酸乙酰肝素片段的文庫用于篩選測定法實施例5篩選測定(1)BIAcore檢測該技術(shù)使用表面等離子共振(surface plasmon resonance)的光學(xué)現(xiàn)象來監(jiān)測分子之間的物理相互作用。使蛋白溶液通過傳感器表面(該表面偶聯(lián)配體)來監(jiān)測蛋白和固定的配體的實時結(jié)合。通過測量非?？拷鼈鞲衅鞅砻娴恼酃饴实母淖儊磉M行檢測。當(dāng)折光率改變時，等離子共振發(fā)生的角度改變，該改變直接和與表面相互作用的蛋白的量關(guān)聯(lián)。BIAcore 2000使用方便。其非常靈敏，其微流控技術(shù)確保只需要少量的材料。
將HLGAG固定在生物傳感芯片上。使用sulfo-NHS-生物素，通過氨基或還原性末端(該末端通過還原性胺化反應(yīng)被氨修飾)來生物素化完整的HLGAG。將生物素化的HLGAG固定在偶聯(lián)鏈霉抗生物素蛋白的傳感芯片上。將包含目的蛋白的溶液注入傳感芯片表面上，實時測量結(jié)合(Fernig，InProteoglycan protocols，Ed.R.V.Iozzo，Humana Press，Totowa，NJ，USA，2001)。本發(fā)明者已證明桿狀病毒和大腸肝菌表達的人IL-4(rhIL-4)、桿狀病毒表達的人IL-5(rhIL-5)、Cos-7細胞表達的人PECAM-1融合蛋白(flag-PECAM-1和PECAM-Fc)以及大腸桿菌表達的親環(huán)蛋白A(CypA)容易地結(jié)合通過本方法固定的肝素(圖2)。此外，有初步的證據(jù)顯示IL-5受體鏈βc結(jié)合肝素。在所有情況下，結(jié)合是特異性的，因為極少有或沒有缺乏肝素的傳感芯片和任何被靶向的蛋白的相互作用，并且結(jié)合被外源肝素抑制。初步分析表明rhIL-5和肝素的結(jié)合具有從50-5×10-9的數(shù)量級的親和常數(shù)。因為來自不同組織的硫酸乙酰肝素中可變地存在未被取代的胺，所以為硫酸乙酰肝素芯片推薦另一備選的生物素標(biāo)記的方法。在該情況下，使用生物素基-LC-肼通過氧化的順式二醇殘基標(biāo)記硫酸乙酰肝素。
(2)濾膜結(jié)合測定法在EDC存在的情況下通過糖醛酸的羧基、通過N-未取代的葡糖胺、或通過還原性末端，用報告分子標(biāo)記HLGAG。將標(biāo)記的HLGAG和目的蛋白混合，讓其在硝酸纖維素96孔濾板中平衡。低速離心該混合物以過濾混合物。濾膜吸附蛋白或蛋白-GAG復(fù)合物，但不吸附單獨的GAG。將標(biāo)記的GAG重新溶解在含有2M NaCl的緩沖液中，使用合適的檢測設(shè)備確定保留在小孔中的報告分子的量。使用肝素-報告分子的標(biāo)準(zhǔn)溶液確定各樣品中的結(jié)合肝素的量。該方法已用于評估rhIL-4的肝素結(jié)合(圖3)和用于其他目的蛋白。
實施例6文庫的篩選使用BIAcore，就其分別抑制靶蛋白和肝素或硫酸乙酰肝素的結(jié)合的能力對均一糖數(shù)目的肝素和硫酸乙酰肝素寡糖的制劑進行檢驗(圖4)。
在用報告分子標(biāo)記之后，可使用濾膜試驗、FRET或FP測定直接的寡糖結(jié)合。也可通過直接的還原性胺化作用將寡糖生物素化并將其固定在鏈霉抗生物素蛋白傳感芯片上，以估量蛋白的結(jié)合(Delehedde，J.Biol.Chem.27712456-12462，2002)。該方法已用于估量結(jié)合rhIL-4、PECAM-1和cypA所需的最短HLGAG長度(圖5)。
該最初的篩選顯示很好地結(jié)合靶蛋白的最小寡糖。通過強陰離子交換(SAX)層析(mini-Q柱和SMART系統(tǒng))基于這些寡糖的硫酸化的模式對其進行分離。SMART HPLC系統(tǒng)對于該用途是理想的，因為其微流控技術(shù)確保非常高的分辨率和非常小的體積增加。再次就其結(jié)合靶蛋白的能力對產(chǎn)生的級分進行篩選。如果糖數(shù)目相同但硫酸化模式不同的片段具有不同的活性，那么得出，靶蛋白結(jié)合肝素/硫酸乙酰肝素鏈中的特定基序。將這些級分貯存在96孔陣列中以在其他篩選中進行檢測。
實施例7活性寡糖的表征通過在用特定靶蛋白偶聯(lián)的基質(zhì)上進行親和層析來富集活性寡糖以用于功能測定和用于進一步的結(jié)構(gòu)分析。通過伯胺直接偶聯(lián)，將大腸桿菌表達的rhIL-4固定到HiTrap NHS-活化的柱子上。在偶聯(lián)前，通過和N-乙?；嗡販赜乐箙⑴c肝素結(jié)合的氨基酸和柱子反應(yīng)。以相似的方式固定CypA。通過對rhIL-5的糖部分上的高碘酸氧化的順式二醇將rhIL-5固定到AffiGel Hz支持物上。可以兩種方式中的任一種方式固定PECAM-1，或可將其固定在載有抗flag標(biāo)簽抗體的柱子上。
將DP10大小的寡糖裝載至磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的rhIL-4柱子上。用PBS洗滌與柱子結(jié)合的寡糖片段，用2M NaCl洗脫。將大小DP12的寡糖裝載至hepes緩沖液(包含100mM NaCl、0.002％v/vTween 20和50M ZnSO4)中的rhIL-5柱子上。用相同的但包含200mMNaCl的緩沖液洗滌與柱子結(jié)合的寡糖片段，用1M NaCl洗脫。匯集洗脫的寡糖以作進一步分析。使用類似的方法分離結(jié)合flag-PECAM-1或親環(huán)蛋白A的寡糖片段。
如果需要，用水稀釋洗脫的級分以將鹽濃度減少至低于0.4M，通過陰離子交換層析法直接對其進行分析。Gilson(Middleton，Wisconsin，USA)色譜儀由2個307型肽泵、805型測壓組件、811型肽動力攪拌器、215型自動取樣機/級分收集器和151型UV檢測儀組成。層析在Gilson Unipoint軟件的控制下。使用250×4.5mmDionex(Sunnyvale，California，USA)Propac PA1柱，并在Eppendorf(Alltech Associates，Sydney，Australia)TC-40柱加熱器中保持在40℃下。用從兩種緩沖液形成的二元梯度以1.0mL/分鐘洗脫柱子。緩沖液A是10mM被調(diào)節(jié)至pH7.0的Na2HPO4。緩沖液B是10mM Na2HPO4加2M NaCl，pH被調(diào)節(jié)至7.0。梯度最初為10％，進行3分鐘，在6分鐘時線性增加至40％，在75分鐘時70％，在76分鐘時100％，在此處保持4分鐘。在注入之間平衡柱子7分鐘。在232nm處監(jiān)測流出物。在圖6中將獲得的和IL-4親和柱結(jié)合的DP10級分的層析圖和總DP10集庫的層析圖比較。在圖7中將獲得的和IL-5親和柱結(jié)合的DP12級分的層析圖和總DP12集庫的層析圖比較。
然后，通過制備型陰離子交換層析制備更多的寡糖。處理后，使用Venkataraman等人(Science 286(5439)537-542，1999)描述的方法通過基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-TOF)分析級分。通過Auspep(Melbourne，Australia)將堿性肽(RG)19R制備為三氟乙酸鹽。向冰冷的50μM肽等分(100μL)中加入大約20mg氫氧化物形式的AG-1 X2陰離子交換樹脂(Biorad，Sydney，Australia)。短暫離心所得的懸浮液并將其保持在冰浴中。將肽的等分(1μL)和50％v/v乙腈(8μL)中的10mg/mL咖啡酸以及5-100μM樣品(1μL)混合，將1μL點在不銹鋼樣品板上并讓其干燥。通過使用配有337nm氮激光的PerSeptive Biosystems(Applied Biosystems，Melbourne，Australia)Voyager reflectron飛行時間質(zhì)譜儀以線性模式獲得MALDI MS質(zhì)譜。使用延遲extraction增加分辨率(22kV，柵極93％，導(dǎo)絲0.15％，脈沖遲延150ns，低質(zhì)量門極2000，平均50shots)。通過用廠商提供的肽校準(zhǔn)混合物進行外校準(zhǔn)來獲得質(zhì)量校準(zhǔn)。通過減去對該樣品觀察到的(RG)19R肽的質(zhì)量推導(dǎo)出寡糖的質(zhì)量。
對層析圖的A-C級分獲得的質(zhì)量表明存在包含9至13個，和可能更多個硫酸基團的寡糖。級分A的質(zhì)譜顯示于圖8中。
實施例8活性寡糖對過敏性鼻炎和哮喘蛋白靶IL-5的功能分析本發(fā)明人已顯示肝素和某些硫酸乙酰肝素抑制IL-5反應(yīng)性細胞系的增殖。該抑制以非常低的劑量發(fā)生并且不是由于HLGAG的毒性效應(yīng)產(chǎn)生的，因為其他結(jié)構(gòu)不同的硫酸乙酰肝素制劑在HLGAG和IL-5的相同濃度下增強IL-5反應(yīng)性細胞系的增殖。此外，以和肝素相同的濃度使用的GAG-硫酸軟骨素C對細胞增殖不具作用(圖9)。使用IL-5反應(yīng)性細胞TF-1.8和Ba/F-IL-5細胞的克隆進行這些實驗。TF-1.8細胞是經(jīng)選擇以在IL-4或IL-5中生長的TF-1細胞的亞克隆。TF-1細胞最初是從患有嚴(yán)重的全血細胞減少癥的男性的骨髓樣品建立的。這些細胞的長期生長依賴于IL-3或GM-CSF，并且這些細胞對多種細胞因子包括IL-4有反應(yīng)(但不對IL-5反應(yīng))。Ba/F-IL-5細胞由Ba/F3細胞系衍生。
通過用pGL3對照載體(Promega，USA)和pEE6hcmv-IL-5Rα共轉(zhuǎn)染細胞使Ba/F3細胞系轉(zhuǎn)化成既具IL-5依賴性又表達螢光素酶。對照載體，pGL3，表達在SV40啟動子和增強子直接控制下的經(jīng)修飾的螢光素酶，但其不包含選擇標(biāo)志物。為制備pEE6hcmv-hIL-5Rα，通過RT PCR從HL60細胞克隆全長人IL-5受體α鏈(hIL-5R-α)。已由Coombe等人(Coombe等人，Journal of Immunological Methods 215145-150，1998)描述了Ba/F-IL-5細胞的制備。可通過用pPGK-嘌呤霉素-螢光素酶(其是包含在SV40啟動子控制之下的螢光素酶、具有選擇標(biāo)志物嘌呤霉素的載體)進行共轉(zhuǎn)染來進一步修飾Ba/F-IL-5細胞(Coombe等人，1998，同上)。
轉(zhuǎn)染后，在3μg/ml嘌呤霉素中選擇陽性轉(zhuǎn)染子。然后克隆陽性轉(zhuǎn)染子以產(chǎn)生具有良好螢光素酶表達的細胞系。在適合于增殖檢測法的96孔微量板(Falcon)中進行該檢測。該孔是平底的，具有白色的側(cè)面和透明的底部。洗滌細胞以除去生長培養(yǎng)基中的任何細胞因子，然后重懸浮于RPMI/5％w/v FCS。用Coulter Multisizer(CoulterElectronics，England)計數(shù)細胞，常規(guī)地將1.6×104細胞加入至不包含IL-5(陰性對照)或包含各種稀釋度的IL-5的微量板小孔。當(dāng)測量HLGAG、硫酸軟骨素C、或特定長度的肝素級分、或特定長度和結(jié)構(gòu)的肝素片段的作用時，小孔也包含各種濃度的這些分子。
在濕潤的空氣中在37℃下所述細胞增殖48小時，之后通過加入50μl螢光素酶底物緩沖液(50mM Tris-HCl、pH7.8、15mM MgSO4、33.3mM DTT、0.1mM EDTA、0.5mM螢光素鈉、0.5mM ATP、0.25mM鋰Co A和0.5％v/v Triton X-100)測量螢光素酶活性。在加入螢光素酶緩沖液后，立即就螢光素酶活性對板進行檢測。在Victor 1420Multilabel計數(shù)器(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上檢測光的發(fā)射。獲得的數(shù)據(jù)類型的示例顯示于圖9。
通過使用這些檢測法，已證明肝素片段的DP12集庫抑制IL-5依賴性Ba/F-IL-5細胞增殖。更小的肝素片段，DP4和DP6，具有很少的或沒有抑制IL-5依賴性Ba/F-IL-5細胞增殖的能力。此外，DP12集庫內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同的抑制IL-5依賴性Ba/F-IL-5細胞增殖的能力(圖10)。
也檢測HLGAG和各種大小的肝素片段阻斷熒光標(biāo)記的IL-5與其受體結(jié)合的能力。就其阻斷熒光標(biāo)記的IL-5與其受體結(jié)合的能力檢測可結(jié)合或不結(jié)合IL-5的特定大小的肝素片段級分。使用IL-5反應(yīng)性細胞TF-1.8和Ba/F-IL-5進行這些實驗。
因為肝素和肝素片段可能不直接阻斷IL-5結(jié)合其受體，但可以干擾IL-5受體復(fù)合物形成和信號傳導(dǎo)，所以檢測肝素和肝素片段對IL-5結(jié)合其高親和受體(IL-5受體α鏈(IL-5Rα))的能力的影響。簡而言之，將IL-5Rα固定在BIAcore芯片上并確定IL-5結(jié)合其的能力。在任何肝素或GAG寡糖或GAG復(fù)合分子不存在的情況下和在各種濃度的肝素、或GAG寡糖和/或GAG復(fù)合分子存在的情況下測定IL-5結(jié)合。
為了全面了解寡糖對IL-5活性的影響，檢查對IL-5起反應(yīng)的原代細胞。通過CD16陰性選擇方案從健康供體分離人外周血嗜酸性粒細胞。評估嗜酸性粒細胞活化的常用方法是監(jiān)測其對固定的IgG的附著。和單獨的IL-5相比，當(dāng)IL-5和選擇的寡糖、或和肝素或硫酸乙酰肝素一起呈現(xiàn)時，通過測量髓過氧化物酶的活性來確定結(jié)合固定的IgG的嗜酸性粒細胞的數(shù)量。在細胞因子不存在的情況下，分離自外周血的嗜酸性粒細胞存活不超過4天。在一系列細胞因子濃度下評估IL-5、IL-5和選擇的寡糖或完整的HLGAG對嗜酸性粒細胞存活的相對能力。在碘化丙啶染色法后通過流式細胞儀確定嗜酸性粒細胞的存活。
實施例9活性寡糖對過敏性鼻炎和哮喘靶蛋白IL-4的功能分析本發(fā)明者已顯示肝素抑制IL-4反應(yīng)性細胞系的增殖。該作用以非常低的劑量發(fā)生并且不是由于HLGAG的毒性作用產(chǎn)生的，因為其他結(jié)構(gòu)不同的GAG，例如硫酸軟骨素C，在IL-4和GAG相同的濃度下不具作用。這些實驗使用TF-1.8細胞。TF-1.8細胞是經(jīng)選擇以在IL-4或IL-5中生長的TF-1細胞的亞克隆。TF-1細胞最早建立自患有嚴(yán)重全血細胞減少癥的男性的骨髓樣品。這些細胞的長期生長依賴于IL-3或GM-CSF并對多種細胞因子包括IL-4但不包括IL-5作出反應(yīng)。
已用表達載體pPGK-嘌呤霉素-熒光酶素中包含的螢火蟲螢光素酶基因轉(zhuǎn)染TF-1.8細胞(Coombe等人，1998，同上)?？寺￡栃赞D(zhuǎn)染子以產(chǎn)生具有良好螢光素酶表達的細胞系。在適合于增殖檢測法的96孔微量培養(yǎng)板(Falcon)中進行該檢測。該孔是平底的，具有白色的側(cè)面和透明的底部。洗滌細胞以除去生長培養(yǎng)基中的任何細胞因子，然后重懸浮于RPMI/5％w/v FCS。用Coulter Multisizer(CoulterElectronics，England)計數(shù)細胞，常規(guī)地將2.5×104細胞加入至沒有包含IL-4(陰性對照)或包含各種稀釋度的IL-4的微量培養(yǎng)板小孔。當(dāng)要測量HLGAG、硫酸軟骨素C、或特定長度的肝素級分、或特定長度和結(jié)構(gòu)的肝素片段的作用時，小孔也包含各種濃度的這些分子。
在濕潤的空氣中在37℃下所述細胞增殖48小時，之后通過加入50μl螢光素酶底物緩沖液(50mM Tris-HCl、pH7.8、15mM MgSO4、33.3mM DTT、0.1mM EDTA、0.5mM螢光素鈉、0.5mM ATP、0.25mM鋰Co A和0.5％v/v Triton X-100)測量螢光素酶活性。在加入螢光素酶緩沖液后，立即就螢光素酶活性對板進行檢測。在Victor 1420Multilabel計數(shù)器(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上檢測光的發(fā)射。獲得的數(shù)據(jù)類型的示例顯示于圖11。
通過使用這一檢測法，本發(fā)明者證明大小DP10的肝素片段產(chǎn)生良好的抑制活性，而小片段，DP4和DP6，顯示具有很少的或沒有抑制TF-1.8細胞的IL-5依賴性增殖的能力。使用該檢測法證明DP10集庫中結(jié)構(gòu)不同的肝素片段具有不同的抑制TF-1.8細胞的IL-4依賴性增殖的能力。
在肝素、特定聚合程度的肝素片段和特定聚合程度及結(jié)構(gòu)的肝素片段存在或不存在的情況下，測定熒光標(biāo)記的IL-4結(jié)合其受體的能力。使用不同濃度的IL-4和肝素或肝素片段進行這些實驗。和顯示在抑制TF-1.8細胞的IL-4依賴性增殖上無活性的其他GAG例如硫酸軟骨素C的比較，證明了廣泛的特異性。聚合程度相同、結(jié)構(gòu)不同的肝素片段例如DP10之間的比較證明，肝素片段的結(jié)構(gòu)決定肝素片段是否能夠抑制IL-4與其受體的相互作用。
實施例10不同大小的肝素片段對IL-4和IL-5依賴性細胞增殖的影響表1顯示由肝素酶I消化產(chǎn)生的不同大小的肝素片段在其抑制IL-5和IL-4依賴性細胞增殖的能力上存在差異。數(shù)據(jù)表示為具有與0.4μM未消化的肝素等同的活性所需的各種肝素片段的濃度。
表1-肝素酶I產(chǎn)生的肝素片段的活性
實施例11活性寡糖對黑色素瘤蛋白靶PECAM-1的功能分析本發(fā)明者已顯示，作為融合蛋白(Flag-PECAM-1)表達的重組的人PECAM-1非常有效地結(jié)合黑色素瘤細胞表面，該結(jié)合通過黑色素瘤細胞表面硫酸乙酰肝素介導(dǎo)。融合蛋白由融合至Flag標(biāo)簽的PECAM-1細胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。如下進行和定量Flag-PECAM-1與黑色素瘤細胞表面的結(jié)合。使用A2058黑色素瘤細胞進行這些實驗。HepSS-1單克隆抗體的結(jié)合的定量顯示，這些細胞在其細胞表面具有大量的硫酸乙酰肝素。HepSS-1單克隆抗體識別硫酸乙酰肝素鏈中包含的硫酸化的表位(Kure和Yoshie，Journal of Immunology 1373900-3908，1986)。為檢測Flag-PECAM-1的結(jié)合，使用2.5mM在PBS中的EDTA收獲A2058細胞，在包含150mM NaCl(Bistris緩沖液)和0.5％w/v BSA的10mMBistris(pH6.3)中洗滌和重懸細胞。用于各結(jié)合反應(yīng)的細胞的數(shù)目是1×105。在適合在流式細胞儀上使用的聚苯乙烯管中沉淀這些細胞，將60μg在Bistris緩沖液中的Flag-PECAM-1和所述細胞混合并在室溫下進行結(jié)合1小時。然后使用Bistris緩沖液洗去過量的Flag-PECAM-1。
使用抗人PECAM-1多克隆抗體和FITC綴合的抗兔二抗檢測結(jié)合的Flag-PECAM-1。使用Coulter EPICS XL流式細胞儀(CoulterElectronics，UK)確定熒光的水平。為進行抑制實驗，在向細胞中加入前，向Flag-PECAM-1中加入250μg肝素溶液或硫酸軟骨素C溶液。可通過滴定測出Flag-PECAM-1和A2058細胞的結(jié)合，肝素能夠阻斷結(jié)合，然而硫酸軟骨素C無效。
肝素阻斷Flag-PECAM-1結(jié)合的能力依賴于所用的肝素的濃度。已發(fā)現(xiàn)，在評估Flag-PECAM-1結(jié)合之前，用1milli國際單位的肝素酶III(Grampian Enzymes)在37℃處理A2058細胞30分鐘顯著地減少了結(jié)合的Flag-PECAM-1的量(圖12)。類似地，用氯酸鹽(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，且因此抑制硫酸乙酰肝素鏈的硫酸化)處理A2058細胞顯著地降低與細胞表面結(jié)合的Flag-PECAM-1的量。使用該檢測法評估肝素寡糖對PECAM-1和黑色素瘤細胞結(jié)合的抑制。
對黑色素瘤細胞結(jié)合PECAM-1的抑制可能影響黑色素瘤細胞穿過毛細血管內(nèi)皮(血細胞滲出)和影響循環(huán)中圍繞黑色瘤細胞的保護性血小板聚集物的形成。內(nèi)皮細胞和血小板都表達PECAM-1。血細胞滲出和血小板聚集對轉(zhuǎn)移性疾病是至關(guān)重要的。已開發(fā)了利用生長在transwell小室的膜上的人臍靜脈內(nèi)皮細胞單層的血細胞滲出模型。將黑色素瘤細胞置于內(nèi)皮單層上的上層室中，使用CyQuant assay試劑盒(Molecular Probes)對其進入低層室的遷移進行定量，在Victor1420 Multilabel計數(shù)器(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上讀出熒光。通過將黑色素瘤細胞置于血小板單層上來檢測黑色素瘤細胞和血小板的相互作用和通過顯微鏡檢查其附著和擴散，在如其他人(Varon等人，Blood 91500-507，1998)描述的細胞外基質(zhì)上或在3-氨丙基三乙氧基硅烷包被的表面(Rainger等人，Thromb.Haemost.791177-1183，1998)上制備所述血小板單層。檢測在流動的條件下黑色素瘤細胞和內(nèi)皮細胞層的相互作用、血小板和內(nèi)皮細胞層的相互作用以及黑色素瘤細胞和血小板的相互作用。設(shè)計流動條件以模擬血流的條件。評估寡糖在血細胞滲出模型中干擾黑色素瘤細胞遷移的能力和干擾黑色素瘤細胞和血小板的相互作用的能力。
實施例12活性寡糖對炎癥蛋白靶PECAM-1的功能分析本發(fā)明者制備了顯示與單核細胞系U937的表面結(jié)合的熒光硫酸乙酰肝素復(fù)合物。使用該熒光硫酸乙酰肝素復(fù)合物和熒光肝素復(fù)合物結(jié)合外周血白細胞的表面。通過使用sulfo-NHS-LC-生物素對HLGAG進行生物素標(biāo)記來制備這些復(fù)合物，所述sulfo-NHS-LC-生物素與沿著糖鏈分布的裸露的胺反應(yīng)。將生物素標(biāo)記的HLGAG以這樣的比例和綴合AlexaFluor 488的鏈霉抗生物素蛋白反應(yīng)，該比例可產(chǎn)生平均每個鏈霉抗生物素蛋白分子4個GAG鏈。通過凝膠過濾步驟從HLGAG-鏈霉抗生物素蛋白-AlexaFluor-488復(fù)合物(HLGAG復(fù)合物)中分離未整合的綴合AlexaFluor 488的鏈霉抗生物素蛋白。然后將所述復(fù)合物在室溫下和2.5×104細胞反應(yīng)1小時，在用1％w/v多聚甲醛固定后，通過流式細胞儀測量熒光的水平。
使用U937細胞的實驗已證明，硫酸乙酰肝素形式的復(fù)合物結(jié)合細胞表面，結(jié)合被游離的未標(biāo)記的硫酸乙酰肝素阻斷，但不被硫酸軟骨素阻斷。
當(dāng)監(jiān)測白細胞表達的PECAM-1對HLGAG復(fù)合物的結(jié)合的貢獻時，在10mM Bistris(pH6.3)(包含150mM NaCl(Bistris緩沖液)和0.5％w/v BSA)中進行該測定法。評估多克隆抗PECAM-1抗體阻斷結(jié)合的能力。類似地，將評估均一聚合程度的肝素片段和均一聚合程度的結(jié)構(gòu)明確的肝素片段阻斷復(fù)合物結(jié)合的能力。
已證明PECAM-1參與白細胞響應(yīng)炎性刺激從而穿過內(nèi)皮的遷移(Muller和Randolph，Journal of Leukocyte Biology 66698-704，1999)。據(jù)信PECAM-PECAM相互作用參與該遷移。此外，已顯示PECAM-1參與白細胞通過內(nèi)皮細胞下面的基板的遷移。還未確定參與的PECAM-1配體。本發(fā)明者提出，基板中的硫酸乙酰肝素參與該PECAM-1依賴性遷移。此外，外源肝素或肝素片段與內(nèi)皮細胞上或白細胞上的PECAM-1的結(jié)合可干擾PECAM-PECAM相互作用。
使用transwell測定法檢測白細胞穿過內(nèi)皮細胞層的遷移。將人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長在transwell的上表面，使用CyQuant assay試劑盒(Molecular Probes)對白細胞穿過該細胞層進入底層室的遷移進行定量，在Victor 1420 Multilabel計數(shù)器(Wallac)上讀出熒光?？捎醚仔约毎蜃永鏣NFα和IL-1β刺激內(nèi)皮細胞，并可將趨化因子如N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)、RANTES(在激活時受調(diào)控的，正常T細胞表達和分泌的)、IL-8和其它加入至底層室以指導(dǎo)白細胞遷移。評估肝素和肝素片段抑制白細胞遷移穿過內(nèi)皮細胞層的能力。也評估肝素和肝素片段阻斷白細胞遷移穿過基板的能力。
在這些實驗中，可將內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在膠原凝膠上并確定白細胞遷移入凝膠的水平，或可從膠原凝膠上剝離內(nèi)皮細胞，從而暴露下層基板，檢查白細胞的遷移。也可使用transwell測定法，在該測定法中，將內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在transwell的上表面，然后除去內(nèi)皮細胞，從而使得能夠監(jiān)測白細胞直接通過基板的遷移。
實施例13專用試劑(1)寡糖標(biāo)準(zhǔn)使用這些標(biāo)準(zhǔn)確定各寡糖片段中糖單位的數(shù)目。所述標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生自肺乙酰肝素(幾乎均一地IdoA2S-G1cN6S)。該肝素通過HNO2(pH3)切割，硼氫化物還原，并分離成DP2至大約18的寡糖。
(2)IL-5和IL-4使用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備重組人IL-4和IL-5。也在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達重組人IL-4。使用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達攜帶定點突變的重組人IL-4或IL-5。然后在HiTrap活化的NHS柱上通過親和層析純化所得的蛋白，該柱子用肼衍生并偶聯(lián)識別IL-5的單克隆抗體H30或識別IL-4的單克隆抗體11B4。
(3)PECAM-1通過對Cos-7細胞的瞬時轉(zhuǎn)染來制備PECAM-1融合蛋白，flag-PECAM-1并通過在偶聯(lián)抗flag標(biāo)簽的Sepharose柱子上的親和層析純化，其由融合至flag親和標(biāo)簽的PECAM-1的細胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。此外，本發(fā)明人使用攜帶Flag-PECAM-1融合蛋白的截短形式的表達載體，該截短形式使得能夠進行對PECAM-1的單個Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合分析。
(4)親環(huán)蛋白A已通過RT-PCR從細胞克隆了親環(huán)蛋白A，將DNA連接入大腸桿菌表達載體。將CypA表達入內(nèi)含體，用6M尿素溶解，通過對稀釋緩沖液進行充分透析來重折疊CypA。通過硫酸銨分級沉淀、陰離子交換層析和大小排阻層析的組合從其他細菌蛋白中純化重折疊的CypA。
(5)IL-3、IL-5和GM-CSF的共同受體β(βc)通過對Cos-7細胞的瞬時轉(zhuǎn)染來制備IL-3、IL-5和GM-CSF的共同受體β(βc)，并通過在偶聯(lián)抗flag標(biāo)簽的Sepharose柱子上的親和層析純化其由融合至flag親和標(biāo)簽的該受體的細胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。
實施例14ELISA原理使用偶聯(lián)至96孔塑料測定板的孔的肝素或肝素片段選擇性地固定細胞因子或其他肝素結(jié)合蛋白。根據(jù)對于目的細胞因子或蛋白特異性的抗體的結(jié)合來確定被固定的蛋白的身份。發(fā)展了用于將完整肝素，但后來是肝素或乙酰肝素片段偶聯(lián)至板上的方法學(xué)。
檢查許多不同的方法以確定將肝素偶聯(lián)至板上而不(a)減少肝素的蛋白結(jié)合活性、或(b)干擾蛋白特異性的抗體的檢測的最好方法。在國際專利公開號WO03/01476中列出了用于將GAG和GAG樣分子例如肝素偶聯(lián)至固體基質(zhì)的示例性方法，特別參見實施例4、5和6。此處引用該文獻作為參考。用于將肝素偶聯(lián)至固體基質(zhì)上的方法的其他示例包括(1)將肝素和與三(十二烷基)甲基銨(TDMAC)復(fù)合，然后將該復(fù)合物吸附至板上。TDMAC的烴鏈與板形成強疏水性結(jié)合，留下銨部分和肝素形成了離子鍵。
(2)通過肝素的還原性末端將其固定至用甲基乙烯基醚-馬來酸酐共聚物(MMAC)包被的微量滴定板。使用己二酸二酰肼引入MMAC包被板的肼基提供了穩(wěn)定地將肝素偶聯(lián)至板的方法。使用還原性胺化使肼基與糖上的甲?；磻?yīng)。
(3)使用可聚合的陽離子脂質(zhì)，二烯丙基(二油烯基)溴化銨(DADOA)通過離子復(fù)位作用固定肝素。DADOA由長鏈?zhǔn)杷圆糠趾途哂须p鍵的親水頭部構(gòu)成，該雙鍵使其能夠聚合。肝素與DADOA形成離子復(fù)合物，該復(fù)合物通過疏水性結(jié)合保留在塑料表面上。
實施例15口服活性肝素一般說來，未通過口服施用肝素，因為其難以從胃腸道中吸收。然而，最近的數(shù)據(jù)[Money和York，Cardiovascular Surgery9211-218，2001)已表明向肝素中加入有機化合物N-(8-(2-羥基苯甲酰)氨基)辛酸酯(SNAC)顯著地增加了其吸收。NMR數(shù)據(jù)表明肝素在靠近肝素鏈上的OH基團的點上與遞送試劑相當(dāng)非特異性地相互作用。肝素的口服遞送將大大地擴展該藥的用途，對于長期治療尤其如此。
實施例16合成的肝素模擬物/類似物已成功地生產(chǎn)了合成的肝素模擬物/類似物。該分子化學(xué)結(jié)構(gòu)上的輕微變化已改變了和肝素類似物結(jié)合的蛋白。該發(fā)現(xiàn)肯定了本發(fā)明者的想法，即通過調(diào)整肝素類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可能選擇性地結(jié)合特定的蛋白。此外，合成的肝素類似物的活性明顯地超過天然肝素的活性，再次肯定了本發(fā)明者的想法，即通過選擇正確的結(jié)構(gòu)，可能獲得具有和天然肝素一樣或更好的活性，同時具有減少的副作用。進行GAG復(fù)合結(jié)構(gòu)的開發(fā)以促進與配體上的GAG結(jié)合位點的結(jié)合。然而這些復(fù)合結(jié)構(gòu)具有低于天然肝素的副作用，例如和天然肝素相比，減少了對血小板因子IV的結(jié)合。
實施例17IL-4就對IL-4的結(jié)合能力對大小DP10的片段進行篩選。因為片段由肝素酶I消化產(chǎn)生，所以其在非還原末端含有不飽和性。此外，其中一些衍生的結(jié)構(gòu)被特別高度地硫酸化。所述片段在活性上顯示出分等級，在靶中可能存在對于結(jié)合不是嚴(yán)格必需的成分(即，硫酸)。使用三個靶，即靶1該結(jié)構(gòu)(片段10.8.1.5)包含5個三硫酸化二糖的重復(fù)單位，即AUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)4。在圖14中對其進行了示意性說明。
靶2
該結(jié)構(gòu)(片段10.7.2.4)包含4個三硫酸化二糖的重復(fù)單位，在還原性末端具有二硫酸化二糖，即ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)3-UAG1cNS6S。在圖15中對其進行了示意性描述。
靶3該片段(10.9.1.2)包括下列4種可能的包含8O-硫酸和4N-硫酸的結(jié)構(gòu)中的一個(1)ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S；(2)ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS；(3)ΔUA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S；(4)ΔUA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S。
對于上面的靶1-3，“UA2S”是指2-O-硫酸-糖醛酸，“G1cNS6S”是指6-O-硫酸-N-硫酸葡糖胺，“G1cNAc6S”是指6-O-硫酸-N-乙酰葡糖胺。Δ是指“不飽和的”，從而ΔUA是指不飽和糖醛酸，在該情況下是酶促斷裂的結(jié)果。
實施例18IL-5對結(jié)合IL-5的片段的關(guān)注集中在大小DP12的片段上。該片段在非還原性末端具有不飽和性。已在倒數(shù)第2集庫中發(fā)現(xiàn)下列結(jié)構(gòu)?；钚缘呐帕惺?2.8.3＞12.9.1～12.9.2＞12.9.4～12.9.3＞12.8.1～12.10.2＞12.2.3。
靶1級分12.8.3的主要組分是12.8.3.5+6，其是重復(fù)的三硫酸化二糖的序列，即△UA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)5，其中“UA2S”是指2-O-硫酸-糖醛酸，“G1cNS6S”是指6-O-硫酸-N-硫酸葡糖胺，而“G1cNAc6S”是指6-O-硫酸-N-乙酰葡糖胺。Δ表示“不飽和的”，因而ΔUA表示不飽和糖醛酸，在該情況下，其是酶促斷裂的結(jié)果。在圖16中示意性地描述了該結(jié)構(gòu)。
大體上，剩下的序列與靶1相比較少被硫酸化，盡管各情況中的主要組分是三硫酸化二糖(≥50％)。這些序列內(nèi)的共同基序是DP6亞序列UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S。
實施例19由3-O-磺基轉(zhuǎn)移晦-3產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)對于IL-5結(jié)合具有高度活性硫酸乙酰肝素3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶為硫酸乙酰肝素中的葡糖胺殘基的3-O位加上了硫酸。硫酸乙酰肝素的3-O硫酸化在自然狀態(tài)下是稀有的修飾，其組成硫酸乙酰肝素的生物合成途徑的最后步驟。硫酸乙酰肝素生物合成酶，包括3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶，以許多不同的同種型存在，各同種型具有稍微不同的底物特異性并識別不同的單糖序列。稱為3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶-3(3-OST-3)的同種型將硫酸轉(zhuǎn)移至四糖UA2S-G1cNS-IdoA2S-G1cNH26S或UA2S-G1cNS-IdoA2S-G1cNH2中N-未取代葡糖胺的3-O位置(Liu等人，J.Biol.Chem.27438155-38162，1999)。鑒定了人3-OST-3和3’-磷酸腺苷5′-磷酸(PAP)以及四糖ΔUA2S-G1cNS6S-IdoA2S-G1cNS6S的三元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。由于3-OST-3活性的結(jié)果，該四糖的中心G1cNS6S被修飾成3-O-硫酸化(Moon等人，J.Biol.Chem.27945185-45193，2002)，表明寡糖中的G1cNS單位也可被3-OST-3取代。扭船型構(gòu)型中葡糖胺任一側(cè)面連接IdoA2S似乎對3-OST-3的識別至關(guān)重要。
由3-OST-3修飾的硫酸乙酰肝素在抑制IL-5與固定在生物傳感芯片上的肝素和硫酸乙酰肝素的結(jié)合極其有效。通過對硫酸乙酰肝素的肝素酶III斷裂獲得的和用該酶修飾的DP12片段具有相似的活性(圖27和28)。這些圖顯示當(dāng)IL-5(在含有20μM ZnSO4的HEPES緩沖鹽水中)在3-OST-3修飾的硫酸乙酰肝素或3-OST-3修飾的DP12存在或不存在的情況下通過固定的肝素時，使用BIAcore 2000獲得的感應(yīng)圖。這些數(shù)據(jù)表明含有作為3-OST-3活性的結(jié)果產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)的寡糖遠比不含有該修飾的硫酸乙酰肝素更容易結(jié)合IL-5，從而非常有效地抑制IL-5與肝素結(jié)合。根據(jù)公開的方法(Liu等人，1999同上)用3-OST-3修飾硫酸乙酰肝素和DP12硫酸乙酰肝素寡糖。簡而言之，將由硫酸乙酰肝素(或硫酸乙酰肝素寡糖)、[35S]PAPS、50mM MES pH7.0、2mM MnCl2、1mM MgCl2、牛血清白蛋白和1％v/v Triton X-100(v/v)組成的反應(yīng)混合物在37℃溫育1.5小時。通過加入2倍所得體積的終止緩沖液(50mM醋酸鈉pH5.0、150mM NaCl、0.1％v/v Triton X-100、6M尿素和1mM EDTA)終止反應(yīng)。通過DEAE層析，使用1M NaCl洗脫，分離[35S]硫酸乙酰肝素或[35S]硫酸乙酰肝素寡糖。將洗脫的材料對20mM碳酸氫銨進行透析，然后冷凍干燥。
實施例20IL-5上肝素結(jié)合位點的確定使用以截短的形式表達的、或攜帶點突變的蛋白確定對于與肝素相互作用重要的氨基酸。按照所描述的方法純化改變的蛋白和在所描述的HLGAG結(jié)合檢測法中篩選。匯集合有影響肝素結(jié)合水平的氨基酸改變的蛋白，并在三維蛋白模型上進行作圖。使用該方法，已顯示rhIL-5上的幾個氨基酸對于HLGAG結(jié)合非常重要。即，當(dāng)將1μM溶液注射在肝素表面上時，組氨酸38、賴氨酸39、組氨酸41、賴氨酸84或賴氨酸85的突變都減少rhIL-5結(jié)合超過50％。在IL-5表面上，這些氨基酸相互之間全都定位十分靠近。然而，組氨酸38和組氨酸41可能是IL-5上鋅結(jié)合位點的組分。鋅是肝素結(jié)合IL-5所必需的，因此鋅結(jié)合能力的喪失降低于肝素結(jié)合能力。這些氨基酸以間接的方式對肝素結(jié)合IL-5起作用，而氨基酸賴氨酸84和賴氨酸85是肝素結(jié)合位點的關(guān)鍵組分并直接與GAG鏈相互作用。對IL-5上的GAG結(jié)合位點有貢獻的其他氨基酸包括K77、K70、R67、R90和R91。這些氨基酸在C螺旋和相鄰的β折疊片的暴露表面上，該表面由一個IL-5單體的C-D環(huán)和另一個單體的A-B環(huán)組成(Milbum等人，Nature 363172-176，1993)。因為IL-5是同型二聚體蛋白，所以在蛋白表面有兩個相同的能潛在地與HLGAG相互作用的區(qū)域(圖13)。
已顯示CD環(huán)中帶電荷的殘基E88、E89、R90、R91和R92參與IL-5受體α鏈(IL-5Rα)的結(jié)合(Tavernier等人，Proc Natl Acad SciU SA 925194-8，1995；Wu等人，J Biol Chem 27420479-88，1999)。有趣的是，R90似乎是IL-5Rα結(jié)合的關(guān)鍵性殘基，暗示著其他帶電荷的氨基酸起著提供一個凈正電荷的靜電平衡的作用(Wu等人，J BiolChem 27420479-88，1999)。使用實施例8中描述的測定法確定肝素阻礙IL-5結(jié)合其受體的能力。肝素抑制IL-5依賴性細胞增殖(圖9)的事實支持IL-5上的肝素結(jié)合位點與IL-5Rα的結(jié)合位點重疊的結(jié)論。異二聚體IL-5受體由IL-5Rα和βc(IL-3、IL-5和GM-CSF的受體共同的β鏈)組成。該受體不在細胞表面上預(yù)先形成，而是IL-5結(jié)合IL-5Rα并且該復(fù)合物與βc相互作用(Scibek等人，AnalBiochem 307258-65，2002)。因此，干擾IL-5結(jié)合IL-5Rα也就干擾了功能性IL-5受體的形成，干擾了受體的信號傳導(dǎo)。
實施例21PECAM-1上的肝素結(jié)合位點的確定已使用以截短的形式表達的PECAM-1定位肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
圖18顯示結(jié)合固定在生物傳感芯片上的肝素的PECAM-1細胞外結(jié)構(gòu)域的BIAcore曲線。陰性對照是PECAM-1結(jié)合葡聚糖芯片(無固定的肝素)。2.5μM肝素的加入顯著地阻斷了結(jié)合。在這些實驗中，使用1μM純化的PECAM-1。在FLAG表達系統(tǒng)中表達PECAM-1的細胞外結(jié)構(gòu)域(1-6)，其中Flag-標(biāo)簽附著至蛋白的氨基末端，并且蛋白在結(jié)構(gòu)域6的末端被截短。
為了確定PECAM-1的GAG結(jié)合區(qū)域，制備使用Flag表達系統(tǒng)和融合蛋白表達系統(tǒng)的各種PECAM-1構(gòu)建體(參見圖19)。在融合蛋白表達中，用人IgG1的Fc區(qū)域(即CH3和CD2結(jié)構(gòu)域以及鉸鏈區(qū))融合PECAMl的細胞外結(jié)構(gòu)域。已選擇性地缺失各種細胞外結(jié)構(gòu)域，表達和純化所示的構(gòu)建體。
使用這些蛋白的結(jié)合實驗已顯示肝素結(jié)合的PECAM-1結(jié)構(gòu)域。使用兩種檢測法其中將PECAM-1和已固定肝素的BIAcore生物傳感芯片反應(yīng)的檢測法，第二種檢測法是PECAM-1和細胞表面上的硫酸乙酰肝素的結(jié)合。
融合蛋白的BIAcore分析圖20顯示PECAM-Fc融合蛋白和固定在生物傳感芯片上的肝素的結(jié)合。在銀染凝膠上顯示蛋白的純度。這些數(shù)據(jù)表明在結(jié)構(gòu)域3中存在肝素結(jié)合區(qū)域，因為D1-Fc、D1-2-Fc不結(jié)合但D1-3-Fc確實結(jié)合。更長的構(gòu)建體的結(jié)合動力學(xué)上的差異暗示著在結(jié)構(gòu)域5-6中可能存在第二個肝素結(jié)合區(qū)域。
Flag表達系統(tǒng)蛋白的BIAcore分析將各種Flag-PECAM-1結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體和固定在BIAcore芯片上的肝素結(jié)合。BIAcore分析的結(jié)果顯示于圖21中。如圖21的小圖A中所示，盡管使用不同的肝素芯片，但很清楚的是Flag-D1-3很好地結(jié)合芯片，但Flag-F1-2不結(jié)合。比較圖21中的小圖A中顯示的D1-D3的反應(yīng)單位(RU)評分和小圖B中的數(shù)據(jù)提示，盡管結(jié)構(gòu)域3以其自身的能力結(jié)合，但當(dāng)結(jié)構(gòu)域2存在時會產(chǎn)生更好的結(jié)合。具體而言，小圖A中顯示的FlagD1-D3具有大約2000的RU評分，而小圖B中顯示的D1+D3具有大約425的RU評分。也存在包括結(jié)構(gòu)域5和6的更弱的結(jié)合區(qū)域的證據(jù)。
調(diào)查外源加入的肝素對PECAM-1和肝素生物傳感芯片的結(jié)合的影響。如圖22中所示，2.5μM肝素的加入幾乎完全抑制了Flag-構(gòu)建體，D1+5-6、D1+4-6和D1-D3與肝素生物傳感芯片的結(jié)合。
這些實驗已顯示在PECAM-1上似乎有兩個肝素結(jié)合區(qū)域。一個結(jié)合區(qū)域需要PECAM-1 Ig樣結(jié)構(gòu)域3，而另一個區(qū)域位于近膜結(jié)構(gòu)域，最可能在PECAM-1 Ig樣結(jié)構(gòu)域5和/或6中。
PECAM-1蛋白與細胞表面的結(jié)合
Flag表達系統(tǒng)中表達的PECAM-1細胞外結(jié)構(gòu)域(1-6)結(jié)合A2058黑素瘤細胞的表面。如通過HepSS-1抗體所證明的，A2058黑素瘤細胞表達顯著水平的硫酸乙酰肝素。通過抗PECAM-1多克隆抗體和FITC標(biāo)記的二抗檢測PECAM-1，通過流式細胞儀對其進行定量。
圖12中提供的數(shù)據(jù)表明PECAM-1是通過細胞表面硫酸乙酰肝素結(jié)合這些細胞的，因為在加入PECAM-1之前用肝素酶III處理所述細胞將減少結(jié)合(小圖B)。對細胞的氯酸鹽處理也消除PECAM-1結(jié)合(小圖A)。氯酸鹽是ATP硫酸化酶的抑制劑，從而抑制了PAPS的產(chǎn)生，PAPS是磺基轉(zhuǎn)移酶的活性供體。因此，用氯酸鹽處理細胞使得在其表面上不具有正確硫酸化的硫酸乙酰肝素。這表明PECAM-1識別由細胞表面上表達的硫酸乙酰肝素展示的硫酸。
圖23顯示Flag-PECAM-1細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合A2058細胞。圖24中顯示的數(shù)據(jù)表明D1-D6和D1-D3可結(jié)合肝素芯片，而D1-D2不結(jié)合。此外，已證明外源肝素可抑制D1-D6以及D1-D3蛋白的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)進一步支持了觀點，即用于肝素結(jié)合的PECAM-1的至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)域是結(jié)構(gòu)域3。
實施例22IL-4上的肝素結(jié)合位點的確定圖24顯示野生型IL-4結(jié)合固定在生物傳感芯片上的肝素的BIAcore結(jié)合曲線。顯示了許多不同濃度的IL-4。親和常數(shù)的計算顯示了5-10nM范圍內(nèi)的估計KD。
對IL-4進行定點誘變。將提出的肝素結(jié)合位點中的堿性殘基改變成丙氨酸和使用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達該蛋白。一個例外是R88，其被改變?yōu)槔i氨酸。在抗IL-4親和柱上純化昆蟲細胞表達的蛋白，并通過SDS-PAGE和銀染檢查其純度。就其結(jié)合固定在生物傳感芯片上的肝素的能力檢查突變的IL-4蛋白，使用BIAcore 2000評估結(jié)合。這些結(jié)果，表示為和以相同濃度的野生型IL-4相比相對結(jié)合的百分比，顯示于圖25。這些數(shù)據(jù)表明R75、K77、R81、R84、R85和R88是IL-4上的肝素結(jié)合位點的部分-該數(shù)據(jù)符合我們的分子建模預(yù)測。
也值得注意的是E60A突變體顯示了增加的結(jié)合肝素的能力。這可能是因為除去了靠近或存在于結(jié)合區(qū)域中的酸性殘基，由此產(chǎn)生更有利于肝素結(jié)合的帶電區(qū)域而造成的。相同的解釋也適用于D87A突變體。
圖26顯示肝素五糖(其由三硫酸化二糖(Ido2SG1cNS6S)的重復(fù)構(gòu)成)結(jié)合IL-4的分子模型。顯示了20個最佳結(jié)合位置。已展現(xiàn)了蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)，以空間結(jié)構(gòu)模型標(biāo)示據(jù)認為對肝素結(jié)合位點有貢獻的氨基酸。結(jié)合位點的建模非常符合從定點誘變研究獲得的數(shù)據(jù)。
在IL-4中，具有兩個長末端對末端環(huán)的螺旋(A、B、C、D)是反向平行和并列的，環(huán)AB和CD通過位于和螺旋B和D相對的短β折疊連接。高親和受體鏈IL-4Rα的結(jié)合位點位于螺旋A和C上，主要的結(jié)合決定子是E9和R88(Wang等人，Proc Natl Acad Sci USA 941657-62，1997)。然而低親和受體鏈γc和IL-13Rα1的結(jié)合位點位于螺旋A和D上。E9和R88對IL-4與IL-4Rα的結(jié)合的非常大的貢獻是因為E9和R88的相互作用側(cè)鏈都被較小的決定子的殼包圍。圍繞E9的疏水性殼由IL-4殘基I5、K12、T13和N89以及IL-4Rα上的一組殘基構(gòu)成，而圍繞R88的殼由IL-4上的R53、Y56和W91與IL-4Rα上的對應(yīng)的一組殘基構(gòu)成(Mueller等人，Biochim Biophys Acta 1592237-50，2002)。人IL-4的螺旋AC面由于幾個堿性殘基即K12、R53、R75、K77、R81、K84、R85和R88的原因而具有大正電荷。相反地，IL-4Rα上的結(jié)合區(qū)域包含系列酸性殘基。據(jù)認為該電荷互補性操控著IL-4至IL-4Rα上的締合，結(jié)果締合速度常數(shù)非常高(Mueller等人，同上)。我們的來自定點誘變研究的數(shù)據(jù)(圖25和26)表明IL-4上的肝素結(jié)合位點確實與參與結(jié)合IL-4Rα的位點重疊。該結(jié)論受到證明肝素抑制IL-4依賴性細胞增殖(圖11)的生物學(xué)數(shù)據(jù)支持。
實施例23
IL-4-肝素結(jié)合的動力學(xué)IL-4-肝素結(jié)合的動力學(xué)表明K77和R88的關(guān)鍵作用(表2)。R85A產(chǎn)生比野生型(WT)更強的結(jié)合，表明體積大的精氨酸可能抑制結(jié)合。R81和R84對于結(jié)合似乎也是重要的，有來自K61和R53作出的貢獻。除去酸性殘基D87和E60增加結(jié)合。對于E9也是如此，但程度相對較低。R75不朝向這一面-R75A的增加的KD可能歸因于其他至關(guān)重要的氨基酸的改變的朝向。
包含C螺旋和相鄰的B螺旋的部分的淺溝描繪了IL-4上的肝素結(jié)合位點。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到除了明確描述的以外，此處描述的發(fā)明容易進行改變或修改。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明包括所有這些變化和修改。本發(fā)明也包括在本說明書中個別或一起提到或說明的所有步驟、特征、組合物和化合物，和所述步驟或特征的任何兩個或多個的任何和所有組合。
表2IL-4結(jié)合的動力學(xué)
就其支持TF1.8細胞的增殖的能力將IL-4突變體與WT進行比較。繪制各突變體的滴定曲線，確定支持50％的細胞生長所需的濃度。
在受試的突變體中，E9A和R88V具有顯著降低的增殖活性。少數(shù)其他的突變體也具有輕微減少的增殖活性，特別是R53A和R81A以及可能地K84A。盡管所有突變體既結(jié)合多克隆又結(jié)合單克隆抗IL-4抗體，但仍可能有一些構(gòu)象差異。E60A可能屬于該范疇。
除了E60A外，已知顯示減少的活性的所有突變體都對IL-4受體α(IL-4Rα)結(jié)合位點具有貢獻。IL-4Rα結(jié)合的關(guān)鍵性殘基是E9和R88，但這些殘基被也作出貢獻的較小決定子的殼包圍(Mueller等人Biochim.Biophys.Acta 1592237-250，2002)。
在本專利的第87頁第15-20行描述了IL-4Rα結(jié)合位點，我們的數(shù)據(jù)(表3)符合已公開的數(shù)據(jù)。
表3
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權(quán)利要求
1.具有下式的GAG寡糖1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B](I)或GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或式(I)的GAG寡糖的化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；其中A是寡糖、二糖或單糖單體單位，包含糖，例如但不限于，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式；B可以與A相同或是包含葡糖胺殘基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙?；男问交虬谆?、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的單體單位；其中單體單位A和B通過糖苷鍵連接；i[A-B]是相同或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，i表示從一端開始測量的沿著鏈排列的二糖的位置，其中i是整數(shù)，1≤i≤n；n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，n表示在i[A-B]的相反末端的構(gòu)建部件；和n是從大約2至大約10，其表示重復(fù)A-B單位的鏈的長度；條件是1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B]不是全長HLGAG分子；其中所述GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或其類似物、同源物或直向同源物結(jié)合配體，所述配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1、-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體。
2.權(quán)利要求1的GAG寡糖，其中寡糖[A-B]n附加選自A和B的單個糖以產(chǎn)生選自[A-B]n-A和B-[A-B]n的寡糖。
3.權(quán)利要求1的GAG寡糖，其中B具有一個或多個附著至6位的羥基的單糖、二糖或三糖單位，從而產(chǎn)生分枝的結(jié)構(gòu)，其中所述糖單位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。
4.權(quán)利要求1的GAG寡糖，其中A是葡糖胺，一個或多個A具有附著至羥基的單糖、二糖或三糖單位，從而產(chǎn)生分枝的結(jié)構(gòu)；且其中所述糖單位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。
5.權(quán)利要求1的GAG寡糖，其中寡糖具有這樣的末端糖，該末端糖是4-脫氧-L-蘇型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸或通過用亞硝酸處理產(chǎn)生的葡糖胺的衍生物。
6.權(quán)利要求5的GAG寡糖，其中所述末端糖選自2，5-脫水-D-甘露醇、2，5-脫水-D-甘露糖和其衍生物。
7.權(quán)利要求1或5或6的GAG寡糖，其中任一個或兩個末端糖或其衍生物可以是中性的、帶電荷的、親水性的或疏水性的。
8.權(quán)利要求7的GAG寡糖，其中電荷是正的、負的或兩性離子的。
9.權(quán)利要求1的GAG寡糖，其中配體選自IL-4、IL-5、PECAM-1、gp120、親環(huán)蛋白A、βc和IL-4。
10.具有選自以下的通式的GAG樣復(fù)合分子(lP-mX)q-q+1P(II)和(lX-mP)q-q+1X(III)或式(II)或式(III)的分子的化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；其中X是由以下通式定義的分子1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B](I)或式(I)的GAG寡糖的GAG樣寡糖、GAG樣化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；其中A是寡糖或單糖單體單位，包含糖，例如但不限于，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式；B可以與A相同或是包含葡糖胺殘基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙?；男问交虬谆?、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的單體單位；其中單體單位A和B通過糖苷鍵連接；i[A-B]是相同或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，i表示從一端開始測量的沿著鏈排列的二糖的位置，其中i是整數(shù)，1≤i≤n；n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，n表示在1[A-B]的相反末端的構(gòu)建部件；和n是從大約2至大約10，其表示重復(fù)A-B單位的鏈的長度；或GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或其化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；條件是1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B]不是全長HLGAG分子；P是肽、多肽或蛋白、化學(xué)部分、飽和或不飽和脂肪酸、脂、樹狀分子、糖、多元醇、葡聚糖、聚乙二醇或分枝或不分枝的、飽和的或不飽和的烴鏈或柔性接頭；l和m是整數(shù)，如l，m=1…q；q是整數(shù)，1≤q≤9；其中所述GAG寡糖、GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或類似物、同源物或直向同源物結(jié)合配體，該配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1，-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體。
11.權(quán)利要求10的GAG樣復(fù)合分子，其中復(fù)合分子附加單個mX或lP部分以產(chǎn)生選自(lP-mX)q+1或(lX-mP)q+1的復(fù)合分子，其中l(wèi)和m是整數(shù)，例如l，m＝1…q+1。
12.權(quán)利要求10的GAG樣復(fù)合分子，其中X中的B具有一個或多個附著至羥基的單糖、二糖或三糖單位，從而產(chǎn)生分枝的結(jié)構(gòu)；其中所述糖單位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。
13.權(quán)利要求10的GAG樣復(fù)合分子，其中X中的A是葡糖胺，A具有一個或多個附著至羥基的單糖、二糖或三糖單位，從而產(chǎn)生分枝結(jié)構(gòu)；其中所述糖單位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。
14.權(quán)利要求10的GAG樣復(fù)合分子，其中X中的i[A-B]具有這樣的末端糖，該末端糖是4-脫氧-L-蘇型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸或通過用亞硝酸處理產(chǎn)生的葡糖胺的衍生物。
15.權(quán)利要求14的GAG樣復(fù)合分子，其中所述末端糖選自2，5-脫水-D-甘露醇、2，5-脫水-D-甘露糖和其衍生物。
16.權(quán)利要求10的GAG樣復(fù)合分子，其中配體是IL-4、IL-5、βc、親環(huán)蛋白A或PECAM-1。
17.用于產(chǎn)生和鑒定與配體相互作用的GAG寡糖的方法，該配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1，-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體，所述方法包括對GAG多糖或者GAG多糖或具有非GAG主鏈的GAG多糖的群體的水解作用以及下列步驟中至少一個步驟(i)去乙?；?；(ii) 硫酸化；(iii) 去硫酸化；(iv) 磷酸化；(v)側(cè)鏈的附著；然后就其與所述配體相互作用的能力對產(chǎn)生的各GAG寡糖進行篩選。
18.權(quán)利要求17的方法，其中多糖是大腸桿菌K5多糖。
19.權(quán)利要求17的方法，其中多糖是殼多糖。
20.權(quán)利要求17的方法，其中多糖是殼聚糖。
21.用于產(chǎn)生和鑒定與配體相互作用的GAG復(fù)合分子的方法，所述配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1，-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體，所述方法包括合成或構(gòu)建包含由接頭結(jié)構(gòu)或接頭連接的兩個或更多個高度帶電荷的二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖或八糖或其組合的復(fù)合結(jié)構(gòu)，然后就其與所述配體相互作用的能力篩選所產(chǎn)生的各GAG復(fù)合分子。
22.權(quán)利要求21的方法，其中一個或多個所述高度帶電荷的二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖或八糖是硫酸化的。
23.權(quán)利要求22的方法，其中一個或多個所述高度帶電荷的二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖或八糖是磷酸化的。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述接頭結(jié)構(gòu)是烷基鏈。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述接頭結(jié)構(gòu)是多元醇。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述接頭結(jié)構(gòu)是葡聚糖鏈。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述接頭結(jié)構(gòu)是肽。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述接頭結(jié)構(gòu)是聚乙二醇。
29.權(quán)利要求21的方法，其中配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1，-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體。
30.產(chǎn)生和鑒定與配體相互作用的GAG寡糖的方法，所述配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1，-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體，所述方法包括對HLGAG或HLGAG的群體的大小分級分離，然后就與所述配體相互作用的能力對各級分進行篩選。
31.一種HLGAG級分，其包含下式1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]-....-n[A-B](I)或GAG樣寡糖、GAG樣復(fù)合物或式(I)的化學(xué)類似物、同源物或直向同源物；其中A是寡糖、二糖或單糖單體單位，包含糖，例如但不限于，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式；B可以與A相同或是包含葡糖胺殘基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙酰化的形式或包含甲基、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的單體單位；其中單體單位A和B通過糖苷鍵連接；i[A-B]是相同或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，i表示從一端開始測量的沿著鏈排列的二糖的位置，其中i是整數(shù)，1≤i≤n；n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖構(gòu)建部件，n表示在1[A-B]的相反末端的構(gòu)建部件；和n是從大約2至大約10，其表示重復(fù)A-B單位的鏈的長度；條件是1[A-B]-2[A-B]-....-i[A-B]....-n[A-B]不是全長HLGAG分子。
32.權(quán)利要求31的方法，其中B包含附著至羥基的單糖、二糖或三糖單位，從而產(chǎn)生分枝的結(jié)構(gòu)；其中所述糖單位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。
33.權(quán)利要求31的方法，其中A是葡糖胺，A包含附著至羥基的單糖、二糖或三糖單位，從而產(chǎn)生分枝的結(jié)構(gòu)；其中所述糖單位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。
34.權(quán)利要求31的方法，其中A和B相同。
35.權(quán)利要求31的方法，其中i[A-B]具有4-脫氧-L-蘇型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸作為末端糖。
36.權(quán)利要求31的方法，其中n[A-B]具有選自2，5-脫水-D-甘露醇、2，5-脫水-D-甘露糖和其衍生物的末端糖。
37.權(quán)利要求31的方法，其中通過凝膠過濾柱進行大小分級分離。
38.權(quán)利要求31的方法，其中，通過將所述GAG寡糖與配體混合并就對該配體與固定化的HLGAG結(jié)合的抑制進行篩選來鑒定與該配體相互作用的GAG寡糖。
39.權(quán)利要求31的方法，其中通過濾膜結(jié)合試驗鑒定與配體相互作用的GAG寡糖或GAG復(fù)合分子，該試驗包括將用報告分子標(biāo)記的GAG寡糖或GAG復(fù)合分子與配體混合，將混合物通過能夠保留配體的濾膜，就保留在濾膜上的報告分子的存在進行篩選，報告分子存在表示配體和GAG寡糖或GAG復(fù)合分子之間形成復(fù)合物。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述報告分子是熒光染料。
41.權(quán)利要求30或31的方法，其還包括將經(jīng)鑒定為與配體相互作用的GAG寡糖經(jīng)陰離子交換柱通過，以確定該級分中不同結(jié)構(gòu)實體的數(shù)目。
42.與配體相互作用的GAG寡糖，其通過權(quán)利要求31的方法產(chǎn)生。
43.在受治療者中治療疾病狀況的方法，所述疾病狀況由所述宿主中細胞表面上的HLGAG與配體之間的相互作用造成，所述配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1，-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體，所述方法包括給所述受治療者施用有效量的藥物，所述藥物包含權(quán)利要求1的GAG寡糖或權(quán)利要求10的GAG復(fù)合物。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述GAG寡糖或GAG復(fù)合物分子具有抗炎活性。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述GAG寡糖或GAG復(fù)合物分子具有抗轉(zhuǎn)移活性。
46.權(quán)利要求1至16中任一項的GAG寡糖或GAG復(fù)合物分子，所述GAG寡糖或GAG復(fù)合物分子具有抗病毒活性。
47.權(quán)利要求43的方法，其中所述GAG寡糖或GAG復(fù)合物分子具有抗哮喘活性。
48.權(quán)利要求43的方法，其中所述GAG寡糖或GAG復(fù)合物分子具有抗過敏性鼻炎活性。
49.鑒定配體上的GAG結(jié)合區(qū)域的方法，該配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1，-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體，所述方法包括獲得一種或多種該配體的變體形式，以及將該配體的所述變體形式和GAG分子的結(jié)合與該配體的非變體形式和相同的GAG分子的結(jié)合進行比較，其中與非變體配體和GAG分子的結(jié)合相比，變體配體和相同的GAG分子之間的結(jié)合親和力的降低表示配體的該變體形式包含該配體的GAG結(jié)合位點的改變。
50.權(quán)利要求48的方法，其中配體選自βc、親環(huán)蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子(嗜酸細胞活化趨化因子-1，-2或-3)；或可溶性受體或細胞結(jié)合或病毒結(jié)合的受體，gp120。
51.權(quán)利要求48或49的方法，其中配體的所述變體形式包含一個或多個氨基酸插入、缺失或置換。
52.權(quán)利要求48至49中任一項的方法，其中使用表面等離子共振生物傳感器測量GAG與配體的結(jié)合。
53.權(quán)利要求1的GAG寡糖或權(quán)利要求10的GAG樣復(fù)合分子，其結(jié)合IL-5上的一個或多個殘基，所述殘基選自R32、R67、K70、K76、K77、K83、K84、K85、E88、E89、R90、R91和R92。
54.權(quán)利要求53的GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子，其中所述GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子包含糖結(jié)構(gòu)ΔUA2SGlcNS6S-(UA2SGlcNS6S)5或和ΔUA2SGlcNS6S-(UA2SGlcNS6S)5一樣結(jié)合IL-5上的相同位點的其類似物、同源物或直向同源物。
55.權(quán)利要求1的GAG寡糖或權(quán)利要求10的GAG樣復(fù)合分子，其中所述GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子與IL-4上的一個或多個殘基相互作用，所述殘基選自E9、K12、R53、E60、K61、H74、R75、K77、Q78、R81、R84、R85、D87和/或R88。
56.權(quán)利要求54的GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子，其中所述GAG寡糖或GAG樣復(fù)合分子包含糖結(jié)構(gòu)，所述糖結(jié)構(gòu)選自ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)4、ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)3-UAG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS、ΔUA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、和與上述糖結(jié)構(gòu)一樣結(jié)合IL-4上的相同位點的其類似物、同源物或直向同源物。
57.組合物，其包含以下物質(zhì)中的一種或多種(i) 權(quán)利要求1的GAG寡糖；(ii) 權(quán)利要求10的GAG樣復(fù)合分子，和一種或多種藥物可接受載體或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明總地涉及用于預(yù)防和/或治療疾病狀況的化學(xué)試劑，特別是慢性疾病狀況例如炎癥包括過敏性疾病、轉(zhuǎn)移癌和由病原體包括細菌、病毒或寄生蟲導(dǎo)致的感染。更明確地，本發(fā)明提供的化學(xué)試劑選自衍生自更大的糖胺聚糖(GAG)的糖胺聚糖分子、GAG樣分子和具有GAG樣復(fù)合結(jié)構(gòu)的分子以及和GAG、GAG樣分子或GAG樣復(fù)合分子一樣結(jié)合相同位點的試劑，所述GAG樣分子在其一些特征上類似GAG，但其可衍生自更大的非GAG多糖。本發(fā)明也提供了鑒定GAG和GAG樣治療劑(包括GAG樣復(fù)合結(jié)構(gòu))以及其類似物、同源物和直向同源物的測定法。
文檔編號C07K14/74GK1997657SQ200580020143
公開日2007年7月11日 申請日期2005年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者D·R·庫慕比, W·C·凱特, B·姆雷 申請人:海普密姆生物科學(xué)控股公司