專利名稱：姜酚肟及其合成與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物的制取、改性與應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說是利用生姜中提取的粗姜酚或純姜酚，通過肟化反應(yīng)制取姜酚肟，并測定姜酚肟的抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、殺蟲等生物活性。
背景技術(shù)：
20世紀80年代，國外的藥理試驗已經(jīng)證實，自生姜中分離出的、或者是化學(xué)合成的粗姜酚能刺激粘膜，促進胃液分泌，在腸道中能抑制異常發(fā)酵，促進氣體排放，對大腦皮質(zhì)和血管運動中樞有興奮作用，能增進血液循環(huán)。最新的藥理實驗和臨床觀察證實姜酚有強心、降血脂、防治心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、止嘔、止暈、抑制前列腺素合成、防腐殺蟲、驅(qū)蟲、護膚美容等多方面的生物活性。
然而，自生姜中獲得的天然粗姜酚穩(wěn)定性差、難以分離純化，不易獲得，不便保存；另外，目前也沒有工業(yè)化化學(xué)合成姜酚的報道?？傊?，由于沒有可供工業(yè)使用的姜酚，目前無法獲得大量的姜酚用以開發(fā)以姜酚為原料的食品、保健食品、藥品、化妝品、綠色農(nóng)藥等等。因此，為充分利用、開發(fā)姜酚的生物活性，并解決目前無姜酚可供利用的實際困難，開發(fā)出化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性、功能性質(zhì)等與姜酚相似的姜酚衍生物，如姜酚肟等以代替姜酚，可以取得巨大經(jīng)濟效益和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種姜酚衍生物——姜酚肟，可以取代目前天然提取的姜酚，開發(fā)出類似于姜酚生物活性的藥品、食品、農(nóng)藥、試劑標(biāo)樣等產(chǎn)品。
本發(fā)明所述的姜酚肟，是將姜酚粗提物或純姜酚通過肟化反應(yīng)得到的姜酚衍生物，具有如下的通式結(jié)構(gòu)
其中n＝4，為6-姜酚肟；n＝6，為8-姜酚肟；n＝8，為10-姜酚肟；n＝10，為12-姜酚肟。
本發(fā)明提供了姜酚肟的合成方法，以及其應(yīng)用。
本發(fā)明以鮮姜或生姜半成品(如干姜、姜油樹脂等)為原料，獲得粗姜酚，或者利用純姜酚，再通過肟化反應(yīng)、分離純化獲得結(jié)晶狀態(tài)的姜酚肟，并測定其抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、殺蟲等生物活性，從而使姜酚肟應(yīng)用于上述領(lǐng)域。
本發(fā)明所述的姜酚肟的合成方法，其特征在于，包括以下步驟A)肟化反應(yīng)以姜酚粗提物或提純的姜酚為原料，加入摩爾數(shù)1～3倍于姜酚的鹽酸羥胺，在0～100℃、pH為3.5～5.5的條件下，進行肟化反應(yīng)，反應(yīng)時間1～3小時，反應(yīng)使用的溶劑選自10～100％的甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯中的一種；B)制取粗姜酚肟將肟化反應(yīng)液濃縮至原體積的10～50％，用有機溶劑萃取2～3次；所獲有機溶液相先后經(jīng)過酸洗、鹽洗、水洗，重復(fù)該過程1～3次；再回收溶劑，得粗姜酚肟；所述的有機溶劑選自乙醚、乙酸乙酯、正己烷；C)姜酚肟的粗分用吸附劑作為固定相進行色譜分離，洗脫液經(jīng)濃縮回收得粗姜酚肟；步驟C中，所述的吸附劑為硅膠，硅膠色譜分離時，收取正己烷與乙醚體積比為1∶0.5～2的洗脫部分。
步驟C中，所述的吸附劑為聚酰胺，聚酰胺色譜分離時，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分。
步驟C中，所述的吸附劑為大孔樹脂，大孔樹脂色譜分離時，收取20％～50％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分。
在步驟C后，將姜酚肟濃縮液于0～40℃下靜置結(jié)晶，可獲得粗結(jié)晶姜酚肟。
D)姜酚肟的細分用葡聚糖凝膠作為固定相，以異丙醇∶氯仿＝1～8∶1，為流動相進行連續(xù)洗脫，分別收取異丙醇∶氯仿為1.5∶1到5∶1的洗脫部分，去除流動相后，分別得6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟。
肟化反應(yīng)的原料——姜酚粗提物來自以下兩種制備途徑(一)所述的姜酚粗提物為天然提取的粗姜酚，是通過以下步驟制備的1)原料處理將鮮姜洗凈泥土，切成姜絲或薄姜片，在通風(fēng)干燥處曬干，然后磨成100目姜粉，待用，或直接將自然干燥所獲的干姜片粉碎成100目姜粉，待用；2)獲得姜酚萃取液用40％～100％有機溶劑萃取干姜粉，浸泡期間采用溶劑循環(huán)或滲漉等措施，以提高姜酚的萃取率，浸泡時間不少于12小時；每批干姜粉萃取3～5次；將所用萃取液收集在一起供下一步用；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的一種；所述的步驟2中，可采用滲漉法獲得姜酚萃取液，即將姜粉裝柱，使40％～100％有機溶劑緩慢的通過姜粉柱，獲得姜酚萃取液；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷的一種。
3)回收溶劑在40～70℃下，蒸餾或分餾步驟2所得的姜酚萃取液，回收溶劑，得姜酚粗提物；4)萃取分離姜酚粗提物在姜酚粗提物中加入0.5～1份體積的正己烷，萃取姜酚，連續(xù)萃取2～5次；合并正己烷提取液后，回收75～90％正己烷，殘余物再用等體積的乙醚萃取姜酚，連續(xù)萃取2～3次，回收乙醚后得粗姜酚。
(二)所述的姜酚粗提物為各種類型的姜油樹脂，是通過以下步驟制備的用20～80％的含水有機溶劑進行萃取姜油樹脂，分餾出姜精油，得姜酚粗提物；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙醚。
本發(fā)明的有益效果在于(1)開發(fā)出一種姜酚衍生物——姜酚肟，是一種化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性、功能性質(zhì)等與姜酚相似的姜酚衍生物，可以充分利用、開發(fā)姜酚的生物活性，取代目前天然提取的姜酚，開發(fā)出類似于姜酚生物活性的藥品、食品、農(nóng)藥、試劑標(biāo)樣等產(chǎn)品，解決目前無姜酚可供利用的實際困難，有望取得巨大經(jīng)濟效益和社會效益。
(2)提供了可行的、得率高的姜酚肟合成方法，便于推廣應(yīng)用，使姜酚肟的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景廣闊。
(3)本發(fā)明將目前難以獲得的姜酚制成改性易得、生物活性類似的姜酚肟，為其他難以獲得的天然產(chǎn)物提供了一種可行的解決思路。
本發(fā)明還提供了姜酚肟用于制備抗呼吸道合庖病毒藥物、抗腫瘤藥物的用途，以及用于制備抗氧化劑、殺蟲劑的用途。
本發(fā)明所述的應(yīng)用是基于以下的姜酚肟生物活性測定(一)以溶血作用評價抗氧化活性通過姜酚肟抑制細胞膜物質(zhì)氧化而導(dǎo)致的溶血作用評價其抗氧化能力的大小。
(二)抗脂質(zhì)過氧化作用的評價即通過姜酚肟減少脂肪的過氧化物形成的能力評價其抗氧化作用的大小。
(三)殺蟲能力的測定通過測定棉燈蟲(Spilosoma boiqua)攝入姜酚肟而導(dǎo)致死亡的效果評價其殺蟲作用。
(四)抗呼吸道合胞病毒(RSV)能力的測定通過姜酚肟抑制感染RSV細胞的活力效果評價其抗RSV的效果。
(五)抗腫瘤活性的測定通過測定抑制腫瘤細胞的生存能力評價其抗腫瘤活性，測定結(jié)果表明其與姜酚相當(dāng)。
以上指標(biāo)的測定結(jié)果見表1。
表1姜酚肟的生物活性-1

注1)樣品的IC50均以6-姜酚肟計(樣品中的6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟含量分別為58％、15％、22％、3％)；2)IC50表示抑制率為50％時的劑量；3)參比物為6-姜酚。
上述測定結(jié)果表明與6-姜酚相比，姜酚肟的生物活性與之相當(dāng)或略小其抗氧化作用、抗腫瘤和殺蟲作用略小于姜酚，但抗RSV作用高于姜酚。


圖1為結(jié)晶姜酚肟的制備工藝流程圖。
圖2為結(jié)晶姜酚肟的紫外可見掃描光譜圖，測定條件甲醇；儀器UnicamUV504，英國Thermo Spectronic公司生產(chǎn)。
圖3為結(jié)晶姜酚肟的紅外光譜圖，德國Bruker公司Equinox 55型傅立葉變換紅外光譜儀，KBr壓片。
圖4為6-姜酚肟的質(zhì)譜圖，F(xiàn)innigan MAT TSQ-70質(zhì)譜儀。
圖5為8-姜酚肟的質(zhì)譜圖，F(xiàn)innigan MAT TSQ-70質(zhì)譜儀。
圖6為10-姜酚肟的質(zhì)譜圖，F(xiàn)innigan MAT TSQ-70質(zhì)譜儀。
圖7為12-姜酚肟的質(zhì)譜圖，F(xiàn)innigan MAT TSQ-70質(zhì)譜儀。
具體實施例方式
實施例一第一步、制取姜酚粗提物按照圖1所示，稱取1公斤鮮姜，用自來水浸泡半小時，取出泥土等雜質(zhì)，淋干水分，晾干，切成2～4毫米的薄片，在陽光下曬干。置粉碎機中粉碎，過100目篩。按照姜粉∶40％酒精＝1∶3～6(體積/體積)的比例，將姜粉加入到酒精中，浸泡24小時，浸泡期間，每隔2小時攪拌一次；重復(fù)浸泡三次，合并酒精浸泡液。在65℃下濃縮回收乙醇。殘余物用等體積的正己烷萃取三次，回收約3/4體積的正己烷后，殘余物再用1∶1乙醚萃取姜酚，連續(xù)萃取三次，回收乙醚后得粗姜酚提取物60克。
第二步、肟化反應(yīng)將粗姜酚提取物10克(含姜酚約14％)，溶于適量10％乙醇溶液中，加入1.5克鹽酸羥胺，調(diào)節(jié)pH值5.5，在100℃下攪拌反應(yīng)1小時。
第三步、肟化反應(yīng)液的處理反應(yīng)完畢后，蒸去90％乙醇，用乙酸乙酯萃取殘余物3次，再用1M鹽酸、1M食鹽水、無離子水洗，重復(fù)該過程三次，回收乙酸乙酯；殘余物用作下一步的硅膠柱分離。
第四步、硅膠柱粗分殘余物上硅膠柱，收取正己烷與乙醚體積比為1∶0.5～2洗脫部分，即可得姜酚肟粗結(jié)晶。姜酚肟粗結(jié)晶產(chǎn)物得率為10％(以粗姜酚提取物計)。
第五步、葡聚糖凝膠柱細分取1克姜酚肟粗結(jié)晶，溶于甲醇，上樣于葡聚糖凝膠柱，用異丙醇∶氯仿混合溶劑洗脫，收集異丙醇∶氯仿＝1.5～5∶1的洗脫部分，室溫靜置，分別獲得6-姜酚肟(如圖4所示，6-姜酚肟的質(zhì)荷比為309，表明6-姜酚的分子量為309)、8-姜酚肟(如圖5所示，8-姜酚肟的質(zhì)荷比為337，表明8-姜酚的分子量為337)、10-姜酚肟(如圖6所示，10-姜酚肟的質(zhì)荷比為365，表明10-姜酚的分子量為365)、12-姜酚肟(如圖7所示，12-姜酚肟的質(zhì)荷比為393，表明12-姜酚的分子量為393)；它們的紫外吸收光譜如圖2所示，227，282吸收峰表明姜酚肟含有苯環(huán)。它們的紅外吸收光譜如圖3所示，3241cm-1羥基(O-H)伸縮振動峰，2934cm-1亞甲基(C-H)伸縮振動峰，1672cm-1羥基(O-H)旋轉(zhuǎn)振動峰，1458cm-1亞甲基(C-H)的剪切振動峰，1606和1515苯環(huán)特征吸收峰。其得率分別為6-姜酚肟53％，8-姜酚肟10％，10-姜酚肟15％，12-姜酚肟3％(以粗姜酚肟計)。
實施例二稱取300g姜粉，過100目篩。按照姜粉∶丙酮＝1∶1～3(體積/體積)的比例，將姜粉加入到丙酮中，浸泡12～24小時，浸泡期間，每隔2小時攪拌一次；重復(fù)浸泡五次，合并丙酮浸泡液。在70℃下真空濃縮回收丙酮。殘余物用1/2體積的正己烷萃取五次，回收約80％體積的正己烷后，殘余物再用1∶1乙醚萃取姜酚，連續(xù)萃取兩次，回收乙醚后得粗姜酚提取物80克。
將粗姜酚提取物10克，溶于適量10％甲醇溶液中，加入20克鹽酸羥胺，調(diào)節(jié)pH值3.5，在50℃下攪拌反應(yīng)2小時。反應(yīng)完畢后，蒸去適量甲醇，將肟化反應(yīng)液濃縮至原體積的50％，用乙醚萃取殘余物2次，再用1M鹽酸、1M食鹽水、無離子水洗，重復(fù)該過程三次，再進行真空濃縮干燥，回收乙醚后，用10克聚酰胺粉吸附殘余物。
姜酚肟的粗分將吸附姜酚肟的聚酰胺粉上樣于聚酰胺色譜柱，用0～100％甲醇(或乙醇、丙酮)洗脫液經(jīng)濃縮回收，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分，得粗姜酚肟。將姜酚肟濃縮液放置在40℃下，靜置結(jié)晶，可獲得粗結(jié)晶姜酚肟。姜酚肟粗結(jié)晶產(chǎn)物得率為15％(以粗姜酚提取物計)。
姜酚肟的細分取1克姜酚肟粗結(jié)晶，溶于甲醇，上樣于葡聚糖凝膠柱，用異丙醇∶氯仿＝4∶1體積比的混合溶劑為流動相進行色譜分離，收集異丙醇∶氯仿＝1.5～5∶1的洗脫部分，室溫靜置，分別獲得6-姜酚肟(如圖4)，8-姜酚肟(如圖5)，10-姜酚肟(如圖6)，12-姜酚肟(如圖7)；它們的紫外與紅外吸收光譜分別如圖2和圖3所示。其得率分別為6-姜酚肟54％，8-姜酚肟9％，10-姜酚肟14％，12-姜酚肟5％(以粗姜酚肟計)。
實施例三稱取干姜200克，置粉碎機中粉碎，過100目篩。按照姜粉∶甲醇＝1∶1～3(體積/體積)的比例，將姜粉加入到甲醇中，浸泡24小時，待浸透后，裝入柱子，再用甲醇慢慢滲漉，收集滲漉液約400毫升。在40℃下真空濃縮回收甲醇，殘余物用等體積的正己烷萃取三次，回收約90％體積的正己烷后，殘余物再用1∶1乙醚萃取姜酚，連續(xù)萃取三次，40℃下回收乙醚后得粗姜酚提取物。
本實施例采用滲漉法獲得姜酚萃取液，可用乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷替代甲醇進行滲漉，其濃度范圍可在40％～100％。
將粗姜酚提取物10克，溶于適量乙醚溶液中，加入3克鹽酸羥胺，調(diào)節(jié)pH值4.5，在70℃下攪拌反應(yīng)2小時。反應(yīng)完畢后，蒸去70％乙醚，用正己烷萃取殘余物3次，水洗滌脫鹽后，回收正己烷，即可得粗姜酚肟結(jié)晶。產(chǎn)物得率為94％(以姜酚計)。
姜酚肟的粗分將吸附姜酚肟的聚酰胺粉上樣于大孔樹脂色譜柱，用0～100％甲醇(或乙醇、丙酮)洗脫液經(jīng)濃縮回收，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分，得粗姜酚肟。將姜酚肟濃縮液放置在0℃下，靜置結(jié)晶，可獲得粗結(jié)晶姜酚肟。姜酚肟粗結(jié)晶產(chǎn)物得率為18％(以粗姜酚提取物計)。
姜酚肟的細分取1克姜酚肟粗結(jié)晶，溶于10～50％甲醇，上樣于聚酰胺柱，用0～95％乙醇連續(xù)洗脫，收集20～60％的乙醇洗脫部分，室溫靜置，分別獲得6-姜酚肟(如圖4)，8-姜酚肟(如圖5)，10-姜酚肟(如圖6)，12-姜酚肟(如圖7)；它們的紫外與紅外吸收光譜分別如圖2和圖3所示。其得率分別為6-姜酚肟50％，8-姜酚肟8％，10-姜酚肟15％，12-姜酚肟3％(以粗姜酚肟計)。
實施例四稱取20克姜油樹脂，用80％甲醇萃取姜酚，連續(xù)萃取三次，合并萃取液，回收甲醇后得粗姜酚提取物。
將粗姜酚提取物50克，溶于適量90％乙醇溶液中，加入5克鹽酸羥胺，調(diào)節(jié)pH值5，在0℃下攪拌反應(yīng)3小時。反應(yīng)完畢后，蒸去乙醇，用乙酸乙酯萃取殘余物3次，回收乙酸乙酯后，將殘余物上葡聚糖凝膠色譜柱，以異丙醇、氯仿(1～8∶1，V/V)為流動相，收取異丙醇、氯仿(3～5∶1)洗脫部分，去除流動相后，于室溫下靜置洗脫液，分別得到結(jié)晶的6-姜酚肟，8-姜酚肟，10-姜酚肟，12-姜酚肟。6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟的得率分別為11％、5％、9％和1％(以姜油樹脂計)。
實施例五稱取10克姜油樹脂，用20％的乙醚連續(xù)萃取五次，合并乙醚萃取液，回收乙醚后得粗姜酚提取物。
將粗姜酚提取物50克，溶于適量50％乙酸乙酯溶液中，加入5克鹽酸羥胺，調(diào)節(jié)pH值5，在室溫下攪拌反應(yīng)2小時。反應(yīng)完畢后，蒸去乙酸乙酯，用乙酸乙酯萃取殘余物3次，回收乙酸乙酯后，將殘余物上大孔吸附樹脂色譜柱，用0～95％乙醇連續(xù)洗脫，收集20～50％的乙醇洗脫部分，置0℃冰箱中靜置，分別獲得6-姜酚肟(如圖4)，8-姜酚肟(如圖5)，10-姜酚肟(如圖6)，12-姜酚肟(如圖7)；它們的紫外與紅外吸收光譜分別如圖2和圖3所示。其得率分別為6-姜酚肟56％，8-姜酚肟10％，10-姜酚肟15％，12-姜酚肟3％(以粗姜酚肟計)。
實施例六稱取15克姜油樹脂，用50％丙酮或乙醇萃取姜酚，連續(xù)萃取三次，合并萃取液，回收丙酮或乙醇后得粗姜酚提取物。
將粗姜酚提取物50克，溶于適量50％乙醚溶液中，加入5克鹽酸羥胺，調(diào)節(jié)pH值5，在室溫下攪拌反應(yīng)2小時。反應(yīng)完畢后，蒸去乙醇，用正己烷萃取殘余物3次，回收正己烷后，將殘余物上葡聚糖凝膠色譜柱，以異丙醇、氯仿(1～8∶1，V/V)為流動相，收取異丙醇、氯仿(3～5∶1)洗脫部分，去除流動相后，于室溫下靜置洗脫液，分別得到結(jié)晶的6-姜酚肟，8-姜酚肟，10-姜酚肟，12-姜酚肟。6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟的得率分別為11％、5％、9％和1％(以姜油樹脂計)。
實施例七取購買的純度為95％的6-姜酚30mg，溶于2ml乙醚，加入0.2ml正己烷羥胺(羥胺含量為50％)溶液，混勻，于室溫下反應(yīng)2小時，分別加2ml1M鹽酸洗滌三次，2ml1M食鹽水洗滌三次，2ml無離子水洗滌三次，無水硫酸鈉脫水后，靜置，待乙醚揮發(fā)后即可獲得結(jié)晶狀態(tài)的6-姜酚肟25mg。
上述實施例所得的姜酚肟的生物活性測定主要指標(biāo)的測定方法如下(一)以溶血作用評價抗氧化活性取200克BALB/c雄性鼠，處死，迅速取后靜脈管血液放入肝素鈉處理過的玻璃管中，離心得紅細胞，用磷酸緩沖液(PBS)清洗三次，每次用吸管吸去血漿和棕黃色血沉，然后于1000g離心10分鐘，棄去上層液體，用PBS重新懸浮，并配制成20％紅細胞懸浮液。
溶血評價分別取0.1ml20％紅細胞懸浮液，分別加入0.1mlPBS或含有不同濃度姜酚肟樣品的PBS和0.2ml AAPH[2，2′-Azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride]混勻于37℃水浴保溫3小時后，再加入8ml PBS(A)，另一支管加入8ml蒸餾水(B)以使紅細胞破裂溶血，兩種反應(yīng)物均在1000g下離心10分鐘，分別測定其在540nm的吸光度。吸光度越高，說明溶血作用越嚴重，所用姜酚肟的抗氧化作用越弱。以維生素C作為陽性對照。按照下式計算抑制率％抑制率＝[(1-A)/B]×100％以50％抑制率時的姜酚肟濃度作為半有效劑量(IC50)。
(二)脂質(zhì)過氧化作用的評價腦勻漿的制作取150g雄性BALB/c鼠腦，迅速用20mM 0℃Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)充分洗滌，置Polytron PT 3000勻漿機上均質(zhì)，再于3000g下離心10分鐘，取上清液進行脂質(zhì)過氧化評價。
脂質(zhì)過氧化的測定以丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化評價的指標(biāo)，用FeSO4-Vit.C系統(tǒng)誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化。取0.1ml鼠腦勻漿上清液，0.1ml 10uMFeSO4，0.1ml 0.1mM Vit.C，0.2ml不同濃度姜酚肟樣品溶液，混勻，37℃水浴保溫1小時后，加入0.5ml 28％三氯乙酸(TCA)停止反應(yīng)，加0.38ml 2％硫代巴比妥酸(TBA)與鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化脂質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生的MDA于80℃反應(yīng)20分鐘，冷卻后，離心10分鐘，于532nm下測定上清液中的MDA-TBA反應(yīng)物的吸光度。用BHA作為陽性對照。按下式計算抑制率％抑制率＝[(1-A)/B]×100％式中A為樣品的吸光度；B為對照的吸光度。以50％抑制率時的姜酚肟濃度作為半有效劑量(IC50)。
(三)殺蟲能力的測定配制0.2％(WN)結(jié)晶姜酚肟乙醇母液將0.2g姜酚肟結(jié)晶溶于10ml20％乙醇中。用時分別用0.01％分子蒸餾單甘酯溶液稀釋成10、7、5、3、2、1g/L溶液。將配制好的溶液用等面積的干燥蓖麻葉浸透，以此作為棉燈蟲的飼料。對照棉燈蟲的飼料用0.01％分子蒸餾單甘酯溶液浸泡等面積的干蓖麻葉。
將三齡幼蟲(6～8天)和浸透姜酚肟溶液的蓖麻葉一塊放入瓶中，喂養(yǎng)24小時后，再飼喂正常的蓖麻葉。飼喂過程中，每24小時更換飼料，清除糞便等渣滓。統(tǒng)計幼蟲的死亡率、異常幼蟲率、蛹死亡率等，并按照下式計算出校正抑制率％校正生長抑制率＝[(T-C)/100-C]×100式中T——處理棉燈蛾總生長抑制量；C——對照棉燈蛾總生長抑制量。
以50％抑制率時的姜酚肟濃度作為半有效劑量(IC50)。
(四)抗呼吸道合胞病毒(RSV)能力的測定病毒和細胞RSV，猴腎皮樣癌細胞(Hep-2)和狗腎細胞(MDCK)細胞均購自ATCC(American Type Culture Collection)。
細胞生長培養(yǎng)基和維持液生長培養(yǎng)基DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle’s Medium)。配制生長培養(yǎng)基時，每升添加10％牛血清蛋白，10000U青霉素，2mM慶大霉素，2mM谷酰胺。配制細胞的生長維持液時，只添加1％牛血清蛋白，其它同生長培養(yǎng)基配制。其它試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。
抗RSV活性的測定將姜酚肟樣品均用適量的二甲基亞砜(控制其在培養(yǎng)基母液中的含量低于1％)溶解，再用配制好的維持培養(yǎng)基稀釋成含樣品4-8mg/ml的母液備用。
將含有生長良好Hep-2細胞的生長培養(yǎng)基分裝于96孔塑料培養(yǎng)板上，在37℃，含5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，等細胞生長形成單細胞層后，除去生長培養(yǎng)基，添加0.1毫升含100 TCID50(半數(shù)感染病毒量)的RSV懸浮液和0.1毫升含適當(dāng)濃度樣品的維持液。每個樣品測定三個濃度，以樣品對培養(yǎng)細胞的最大無毒劑量作為最大測試濃度，其他兩個濃度為倍比稀釋濃度。每個樣品濃度重復(fù)三次。對照中不添加樣品。以病毒唑為陽性對照。將96孔板置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天后，鏡檢細胞病變情況，以細胞病變率(CPE)反映樣品的活性。利用不同樣品濃度下的CPE值求出樣品的半有效劑量(IC50)，以比較不同樣品的抗RSV效果。
細胞毒測定為避免高濃度樣品毒害培養(yǎng)細胞而導(dǎo)致的正誤差，測定樣品活性前先測定樣品的最大無毒劑量。具體測定操作同前述樣品的活性測定。只是利用純的生長培養(yǎng)基代替病毒懸浮液。測定結(jié)果以50％培養(yǎng)細胞出現(xiàn)異常(如細胞變圓、收縮、原生質(zhì)體形成氣泡等)時的樣品濃度表示為該樣品的最大無毒劑量。
(五)抗腫瘤活性的測定細胞血癌細胞(K562)猴腎細胞(Vero)，白血病腫瘤細胞(HL-60)。
抗病毒活力的測定取培養(yǎng)好的HL-60和K-562腫瘤細胞，分別接種在96孔板上，每孔接種1×10-4個細胞，再分別加入姜酚肟溶液，使其終濃度為2.5、5、10、20ug/L，再于37℃、5％CO2、95％相對濕度下培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)結(jié)束后，加入與適量的0.4％Tryphan blue溶液，鏡檢死細胞與活細胞的數(shù)量，據(jù)下式計算腫瘤細胞抑制率。
％抑制率＝(1-樣品處理活細胞數(shù)/對照活細胞數(shù))×100姜酚肟對細胞毒力的測定同抗RSV活性的測定。
以上指標(biāo)的測定結(jié)果見表1。
表1姜酚肟的生物活性-1

注1)樣品的IC50均以6-姜酚肟計(樣品中的6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟含量分別為58％、15％、22％、3％)；2)IC50表示抑制率為50％時的劑量；3)參比物為6-姜酚。
上述測定結(jié)果表明與6-姜酚相比，姜酚肟的生物活性與之相當(dāng)或略小其抗氧化作用、抗腫瘤和殺蟲作用略小于姜酚，但抗RSV作用高于姜酚。
權(quán)利要求
1.姜酚肟，其特征在于，是將姜酚粗提物或純姜酚通過肟化反應(yīng)得到的姜酚衍生物，具有如下的通式結(jié)構(gòu) 其中n＝4，為6-姜酚肟；n＝6，為8-姜酚肟；n＝8，為10-姜酚肟；n＝10，為12-姜酚肟。
2.如權(quán)利要求1所述的姜酚肟的合成方法，其特征在于，包括以下步驟A)肟化反應(yīng)以姜酚粗提物或提純的姜酚為原料，加入摩爾數(shù)1～3倍于姜酚的鹽酸羥胺，在0～100℃、pH為3.5～5.5的條件下，進行肟化反應(yīng)，反應(yīng)時間1～3小時，反應(yīng)使用的溶劑選自10～100％的甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯中的一種；B)制取粗姜酚肟將肟化反應(yīng)液濃縮至原體積的10～50％，用有機溶劑萃取2～3次；所獲有機溶液相先后經(jīng)過酸洗、鹽洗、水洗，重復(fù)該過程1～3次；再回收溶劑，得粗姜酚肟；所述的有機溶劑選自乙醚、乙酸乙酯、正己烷；C)姜酚肟的粗分用吸附劑作為固定相進行色譜分離，洗脫液經(jīng)濃縮回收得粗姜酚肟；D)姜酚肟的細分用葡聚糖凝膠作為固定相，以異丙醇∶氯仿＝1～8∶1，為流動相進行連續(xù)洗脫，分別收取異丙醇∶氯仿為1.5∶1到5∶1的洗脫部分，去除流動相后，分別得6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的步驟C中，所述的吸附劑為硅膠，硅膠色譜分離時，收取正己烷與乙醚體積比為1∶0.5～2的洗脫部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于所述步驟C中，所述的吸附劑為聚酰胺，聚酰胺色譜分離時，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的步驟C中，所述的吸附劑為大孔樹脂，大孔樹脂色譜分離時，收取20％～50％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于在步驟C后，將姜酚肟濃縮液于0～40℃下靜置結(jié)晶，可獲得粗結(jié)晶姜酚肟。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述的姜酚粗提物為天然提取的粗姜酚，是通過以下步驟制備的1)原料處理將鮮姜洗凈泥土，切成姜絲或薄姜片，在通風(fēng)干燥處曬干，然后磨成100目姜粉，待用，或直接將自然干燥所獲的干姜片粉碎成100目姜粉，待用；2)獲得姜酚萃取液用40％～100％有機溶劑萃取干姜粉，浸泡期間采用溶劑循環(huán)或滲漉措施，以提高姜酚的萃取率，浸泡時間不少于12小時；每批干姜粉萃取3～5次；將所用萃取液收集在一起供下一步用；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的一種；3)回收溶劑在40～70℃下，蒸餾或分餾步驟2所得的姜酚萃取液，回收溶劑，得姜酚粗提物；4)萃取分離姜酚粗提物在姜酚粗提物中加入0.5～1份體積的正己烷，萃取姜酚，連續(xù)萃取2～5次；合并正己烷提取液后，回收75～90％正己烷，殘余物再用等體積的乙醚萃取姜酚，連續(xù)萃取2～3次，回收乙醚后得粗姜酚。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的合成方法，其特征在于所述的步驟2中，采用滲漉法獲得姜酚萃取液，即將姜粉裝柱，使40％～100％有機溶劑緩慢的通過姜粉柱，獲得姜酚萃取液；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述的姜酚粗提物為各種類型的姜油樹脂，是通過以下步驟制備的用20～80％的含水有機溶劑進行萃取姜油樹脂，分餾出姜精油，得姜酚粗提物；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙醚。
10.如權(quán)利要求1所述的姜酚肟用于制備抗呼吸道合庖病毒藥物、抗腫瘤藥物的用途，以及用于制備抗氧化劑、殺蟲劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物的制取、改性與應(yīng)用領(lǐng)域，具體地涉及一種姜酚衍生物——姜酚肟，以及其合成方法與應(yīng)用。所述的姜酚肟，是將姜酚粗提物或提純的姜酚通過肟化反應(yīng)得到的姜酚衍生物。本發(fā)明以鮮姜或生姜半成品(如干姜、姜油樹脂等)為原料，獲得粗姜酚，或者利用純姜酚，再通過肟化反應(yīng)、分離純化獲得結(jié)晶狀態(tài)的姜酚肟，并測定其抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、殺蟲等生物活性，從而使姜酚肟應(yīng)用于上述領(lǐng)域。姜酚肟可以替代姜酚使用，并可用于新型藥品、食品添加劑、綠色農(nóng)藥等新產(chǎn)品的開發(fā)。
文檔編號C07C251/54GK1680290SQ20051003297
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月31日
發(fā)明者黃雪松 申請人:暨南大學(xué)