專利名稱：堆肥微生物總dna的提取與純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA的提取與純化，具體涉及堆肥中微生物總DNA的提取與純化。
背景技術(shù)：
堆肥是利用微生物對可生物降解固體廢物進(jìn)行分解從而對其實現(xiàn)最終處理的一種系統(tǒng)，因此，充分認(rèn)識其中的微生物學(xué)原理能為改進(jìn)處理工藝、提高處理效率提供依據(jù)。對堆肥進(jìn)行微生物群落研究的傳統(tǒng)方法主要是微生物培養(yǎng)和純種分離技術(shù)。因為環(huán)境中的絕大多數(shù)微生物是無法通過培養(yǎng)方式進(jìn)行研究的，而且堆肥中的微生物種類繁多、常處于動態(tài)變化狀態(tài)，培養(yǎng)研究無法反映系統(tǒng)中微生物的種群動態(tài)變化過程，因此，這樣的研究方法已經(jīng)無法滿足堆肥微生物學(xué)研究的要求。分子生態(tài)學(xué)技術(shù)正是這樣一種能在不對微生物進(jìn)行培養(yǎng)而對其進(jìn)行研究的新技術(shù)。
1992年Burke等在《Molecular Ecology》發(fā)刊詞中提出分子生態(tài)學(xué)是應(yīng)用分子生物學(xué)方法為生態(tài)學(xué)和種群生物學(xué)各領(lǐng)域提供革新見解的新興學(xué)科，從而確立了分子生物學(xué)技術(shù)在分子生態(tài)學(xué)研究中的主體地位。目前，分子生態(tài)學(xué)研究已經(jīng)涉及到環(huán)境科學(xué)研究的眾多領(lǐng)域，包括在堆肥微生物分子生態(tài)學(xué)方面的研究。
在分子生態(tài)學(xué)研究中，DNA的提取與純化是基礎(chǔ)工作，高質(zhì)量核酸樣品的獲得直接影響到后續(xù)分析的可信度。由于堆肥中微生物種類繁多，而且混雜有大量腐殖酸，因此，如何充分使微生物細(xì)胞裂解并釋放DNA，有效減少腐殖酸等雜質(zhì)的污染從而獲得高產(chǎn)率和高純度的DNA是對堆肥微生物群落進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究的關(guān)鍵。目前，新的適合堆肥微生物總DNA提取與純化的方法體系尚未建成，大多數(shù)研究中還是借用植物或普通微生物DNA的提取與純化方法，存在著速度慢，產(chǎn)量低，設(shè)備要求高，腐殖酸類污染物含量高等缺點。因此，尋找一種有效的DNA提取與純化方法是利用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)研究堆肥微生物所急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在運用生物化學(xué)、分子生物學(xué)和微生物學(xué)的原理，研究一種DNA的提取與純化方法，以解決堆肥中微生物總DNA的提取與純化中存在的速度慢、腐殖酸等雜質(zhì)含量高、DNA產(chǎn)率低與純度不高等問題，從而提高堆肥中DNA的產(chǎn)率和純度，以便更好地應(yīng)用于堆肥微生物的分子生態(tài)學(xué)研究。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述發(fā)明目的的。
堆肥中微生物總DNA的提取與純化方法，包括DNA的提取與純化，本發(fā)明的方法為(1)樣品的洗滌待提取DNA的樣品用0.12M磷酸鹽緩沖液，以4～6ml/g堆肥的用量在25～35℃溫度條件下，以150rpm速率勻速震蕩15～30min，然后以6000×g離心10min，沉淀再次洗滌；(2)DNA的提取樣品洗滌后，用1.2～1.5ml/g堆肥的溶菌酶溶液在37℃恒溫條件下，以200～250rpm振蕩溫浴1～2h，然后均以0.5～0.8ml/g堆肥的用量加入裂解緩沖液、磷酸鹽緩沖液和氯仿—異戊醇溶液，并以2500～3000rpm速率旋渦振蕩10～15min，經(jīng)0.6倍體積的異丙醇沉淀1～2h后，以16000×g速度離心10～20min，沉淀用0.8～1.5的ml冰70％乙醇洗滌兩次后溶解于500～1000μl的TE緩沖液中，得到粗提的DNA溶液；(3)DNA的純化粗提的DNA溶液用0.5～0.6倍體積的聚乙二醇和0.1倍體積的NaCl溶液在4℃溫度條件下沉淀2～24h，然后取0.7ml粗提DNA溶液加入至DNA特異離心吸附柱內(nèi)，在4℃，12000×g離心1min，DNA吸附于柱上，棄去收集管廢液，重復(fù)上述操作直至粗提的DNA溶液全部離心完畢，吸附柱上的DNA經(jīng)0.7ml冰70％乙醇洗滌兩次，再用含RNaseA的TE緩沖液100～500μl洗脫DNA，得到純化的DNA溶液。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明


圖1純化后的堆肥微生物總DNA的瓊脂糖凝膠電泳照片；其中Marker為從生物公司購買的DNA分子量標(biāo)記，1，2，3分別代表三個平行樣品，數(shù)字表示DNA的大小，單位是bp。
圖2PCR擴(kuò)增純化DNA得到的16SrDNA產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳照片；其中MarkerV為從生物公司購買的DNA分子量標(biāo)記MarkerV，1，2，3分別代表三個平行樣品，數(shù)字表示DNA的大小，單位是bp；目前，分子生態(tài)學(xué)在環(huán)境科學(xué)中的研究主要依賴于對生物的DNA進(jìn)行分析研究。堆肥中的微生物種類是非常豐富的，因此，要對其中的微生物開展分子生態(tài)學(xué)研究，就必須獲取高質(zhì)、高量的DNA，然后利用PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切和梯度凝膠電泳以及建立克隆文庫和DNA測序?qū)ξ⑸锏腄NA序列進(jìn)行分析，從而獲取微生物的遺傳信息。
本發(fā)明首先對堆肥中的一部分腐殖酸類物質(zhì)和微生物細(xì)胞外的DNA洗脫，既減少了腐殖酸類物質(zhì)的污染，也消除了胞外DNA對實驗結(jié)果的影響；因此本發(fā)明首先將磷酸鹽緩沖液(0.12M，pH8.0，)與堆肥樣品混合，使用時磷酸鹽緩沖液用量為4～6ml/g堆肥，堆肥樣品量增加時適量增加溶液用量，然后在振蕩器上在25～35℃溫度條件下勻速震蕩(150rpm以上)15～3min，樣品量較多時可提高振蕩速度或延長振蕩時間然后以6000×g離心10min，沉淀再次洗滌；樣品洗滌后使用溶菌酶溶液37℃振蕩(200～250rpm)溫浴1h，堆肥樣品量較多時可延長溫浴時間，一般保持在2h以內(nèi)；然后再加入裂解緩沖液(0.5～0.8ml/g堆肥)和磷酸鹽緩沖液(0.5～0.8ml/g堆肥)以及氯仿—異戊醇溶液(0.5～0.8ml/g堆肥)旋渦振蕩(2500～3000rpm以上)10～15min，樣品量較多時可提高振蕩速度或延長振蕩時間將微生物細(xì)胞裂解，經(jīng)0.6×體積異丙醇沉淀1～2h后，離心(16,000×g)10min，樣品量較大時離心時間可延長至20min；沉淀用1.0ml冰70％乙醇洗滌兩次后溶解于TE緩沖液(500～1,000μl)中，得到粗提的DNA溶液，提取過程使用的溶液和儀器為恒溫振蕩器旋渦混合儀冷凍離心機(jī)磷酸鹽緩沖液0.12M，pH8.0(NaH2PO4配制成0.12M，用1.0M NaOH溶液將pH調(diào)至8.0)溶菌酶溶液 0.15M NaCl，0.1M Na2EDTA，10mg/ml溶菌酶，pH8.0裂解緩沖液 10％SDS(w/v)，0.1M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH8.0磷酸鹽緩沖液0.1M，pH8.0(NaH2PO4配制成0.1M，用1.0M NaOH溶液將pH調(diào)至8.0)氯仿—異戊醇溶液24∶1(v/v)TE緩沖液10mM Tris·Cl，pH8.0，1mMEDTA冰70％乙醇(v/v)；本發(fā)明采用溶菌酶、SDS以及高速旋渦振蕩的方法，利用生物、化學(xué)以及物理相結(jié)合的原理，盡可能地將堆肥中的微生物細(xì)胞裂解，從而使細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)釋放出來，實現(xiàn)了DNA產(chǎn)量的最大化，而且為了使溶菌酶的作用更好地發(fā)揮，又將溶菌酶溶液與堆肥樣品在37℃下振蕩溫浴1～2h，這樣既保證了其處于酶催化的最適溫度，又可以與樣品充分接觸；加入的氯仿—異戊醇溶液能夠抽提掉大部分細(xì)胞裂解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)；粗提的DNA用0.5～0.6×體積聚乙二醇(PEG8000)和0.1×體積NaCl溶液在4℃沉淀2h以上，如果時間充裕，可以將其保存過夜；然后將0.7ml粗提DNA溶液加入DNA特異離心吸附柱離心(4℃，12,000×g，1min)，使DNA特異吸附于柱上，棄去收集管廢液；重復(fù)上述操作至粗提DNA溶液全部離心完畢；離心吸附柱上的DNA經(jīng)0.7ml冰70％乙醇洗滌兩次后，使用含核糖核酸酶A(RNaseA)的TE緩沖液(100～500μl，根據(jù)堆肥樣品量具體確定)將DNA洗脫下來，得到純化的DNA溶液，純化過程使用的溶液和儀器材料為恒溫箱冷凍離心機(jī)PEG8000 50％(w/v)NaCl溶液 5MDNA特異離心吸附柱 型號CB2(北京天為時代科技有限公司)TE緩沖液 10mM Tris·Cl，pH8.0，1mM EDTA，0.5mg/ml RNaseA冰70％乙醇(v/v)。
本發(fā)明在DNA純化中加入的PEG8000是一種對腐殖酸類物質(zhì)具有良好的去除效果的物質(zhì)，而隨后使用的特異離心吸附柱，則能特異性地將DNA吸附在離心柱上，當(dāng)用70％乙醇洗滌時不能將DNA洗脫，因此不能很好地去除與DNA混雜在一起的其他有機(jī)物質(zhì)，本發(fā)明即在溶解吸附柱上的DNA的TE緩沖液中還加入了RNaseA，能夠去除DNA中的核糖核酸(RNA)。
本發(fā)明針對堆肥的特點，使用了對不同對象有特定作用的處理方法，從而獲得了片段長度比較單一的23kb的DNA；經(jīng)過純化以后，DNA的產(chǎn)量達(dá)到了53±1.5μgDNA/g堆肥，而腐殖酸類物質(zhì)的產(chǎn)量僅為1.5±0.2μg/g堆肥，使用細(xì)菌16S rDNA通用擴(kuò)增引物從純化后的DNA中成功地擴(kuò)增出了特異性很高的長度約為1.5kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體實施例方式1、堆肥取樣堆肥取自一個20L的實驗室規(guī)模的堆肥裝置，堆肥材料主要為10kg菜市場剩余，并添加了5kg菜園土壤，采樣點為堆肥表面以下3cm，一共取三個樣品(設(shè)為1，2，3)，每個樣品1g，取樣時間為堆肥處理16d后，溫度為22℃(已達(dá)到了最高溫度46℃)，pH為6.8，含水率為43.4±0.5％，有機(jī)質(zhì)含量為1.62±0.3％。其中，pH用玻璃電極法測定，含水率在105℃下重復(fù)烘烤至恒重測定，有機(jī)質(zhì)含量根據(jù)重鉻酸鉀法測定。
2、樣品的洗滌每1g樣品加入到4ml 0.12M的磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中并與溶液混勻，然后室溫下在振蕩器上150rpm勻速震蕩15min，然后以6,000×g離心10min；沉淀再次洗滌后用于后續(xù)處理。
3、DNA的提取洗滌過的堆肥樣品1g與1.5ml的溶菌酶溶液混勻，然后在37℃恒溫振蕩器上以225rpm振蕩1h；然后加入0.5ml裂解緩沖液，0.5ml磷酸鹽緩沖液，0.5ml氯仿-異戊醇；將裝有樣品的離心管置于漩渦混合器上以2,800rpm振蕩10min；裂解液以6,000×g離心3min，上清轉(zhuǎn)入新離心管；原管加入0.5ml去離子水重新離心5～10s；兩次離心的上清混合，12,000×g離心5min，收集水相留用；加0.6×異丙醇沉淀1h，然后16,000×g離心10min；沉淀以冰預(yù)冷的70％乙醇洗滌兩次后風(fēng)干，加入600μl TE緩沖液將DNA溶解。
其中，溶菌酶溶液0.15M NaCl，0.1M Na2EDTA，10mg/ml溶菌酶，pH8.0；裂解緩沖液10％SDS、0.1M NaCl、0.5M Tris-HCl，pH8.0；磷酸鹽緩沖液0.1M，pH8.0；氯仿-異戊醇體積比為24∶1；TE緩沖液10mM Tris·Cl，pH8.0，1mM EDTA。
4、DNA的純化在粗提DNA溶液中加入0.5×體積的PEG8000溶液和0.1×體積NaCl溶液，輕微顛倒將液體混合，在4℃恒溫箱中保存2h；使用北京天為時代科技有限公司的CB2離心吸附柱將混合液離心，每次在吸附柱中加入0.7ml混合液，冷凍離心機(jī)中4℃下12,000×g離心1min，棄去收集管中液體，重復(fù)多次直至粗提DNA溶液全部離心完畢；然后吸附柱以冰預(yù)冷的70％乙醇0.7ml洗滌，在4℃下12,000×g離心1min；棄去收集管中廢液，70％乙醇重復(fù)洗滌；吸附柱自然風(fēng)干后，更換新收集管，用200μl加入了核糖核酸酶A(RNaseA)的TE緩沖液將吸附柱上的DNA洗脫至收集管，37℃恒溫消化2h后于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 其中，PEG8000溶液50％(質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù))；NaCl溶液5M；含RNaseA的TE緩沖液10mM Tris·CL，pH8.0，1mM EDTA，0.5mg/ml RNaseA。
5、純化的DNA片段大小的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小的檢測按照常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，所用瓊脂糖凝膠濃度為1％(質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù))，所用的DNA分子量標(biāo)記(Marker)為北京天為時代科技有限公司的λDNA/HindIII，所用電泳緩沖液為1×TAE電泳緩沖液，以10V/cm的電壓降在水平電泳槽上電泳，電泳結(jié)束后凝膠使用溴化乙錠(EB)染色液染色10min，然后在美國BIoRad公司的Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)上拍照檢測，結(jié)果見圖1，從圖1可以看出，純化后的DNA條帶單一，沒有拖尾現(xiàn)象，DNA片段長度約為23kb。
其中，1×TAE電泳緩沖液40mM Tris堿，20mM乙酸，2mM EDTA；1％瓊脂糖凝膠1g瓊脂糖，加入100ml 1×TAE電泳緩沖液加熱溶解，然后冷卻；EB染色液10μg/ml 1×TAE電泳緩沖液。
6、DNA和腐殖酸類物質(zhì)濃度的測定DNA濃度使用美國Beckman公司生產(chǎn)的DU640核酸和蛋白質(zhì)分析儀進(jìn)行測定，實驗步驟根據(jù)儀器操作手冊進(jìn)行，儀器根據(jù)測量結(jié)果自動給出所檢測DNA溶液的濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算得到原始DNA濃度，從而根據(jù)DNA溶液濃度和體積計算得到純化后的DNA產(chǎn)量為53±1.5μgDNA/g堆肥。
腐殖酸的吸收波長為340nm，使用一系列濃度(0.1-100ng/μl)的腐殖酸混合物(Aldrich Chemical，USA)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過加入10ng/μl DNA(Molecular Probes，USA)和2μg/μl牛血清白蛋白(Amresco，USA)以檢查DNA和蛋白質(zhì)對腐殖酸濃度測定的影響，使用紫外下分光光度計在340nm波長處測定各個樣品的吸光度。根據(jù)測量結(jié)果計算得出腐殖酸類物質(zhì)的產(chǎn)量為1.5±0.2μg/g堆肥。
7、16S rDNA的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測選擇細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物對27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1495R(5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3′)作為PCR擴(kuò)增的引物，該引物對分別對應(yīng)于大腸桿菌(E.coli)16S rDNA的8-27位堿基和1495-1514位堿基，從而可以擴(kuò)增出近乎全長的16S rDNA序列，約為1507bp。
50μl的PCR擴(kuò)增體系為1μl已純化DNA，5μl dNTP混合溶液(終濃度為1pmol/μl)，引物各1μl，10×Buffer 5μl，Taq DNA聚合酶(Promege，USA)0.5μl，加無菌去離子水補(bǔ)足50μl。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，接下來是94℃30s，50℃30s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，停止于4℃。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測同樣使用1％瓊脂糖凝膠電泳，除所用的DNA分子量標(biāo)記為北京天為時代科技有限公司的Marker V外，其余與第5點方法相同，結(jié)果見圖2，從圖2可以看出，使用細(xì)菌通用引物對(27F和1495R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了長度為1,500bp的PCR產(chǎn)物，條帶單一，表明擴(kuò)增的特異性很好，本方法提取、純化的DNA可以用于分子生態(tài)學(xué)研究。
從上述測定結(jié)果可以清楚地看出，本方法不僅可以得到較高產(chǎn)量的長片段DNA，而且其中的腐殖酸類物質(zhì)含量極低，純化的DNA用于16S rDNA的PCR擴(kuò)增，得到了特異性良好的產(chǎn)物，此外，本方法不需要額外的儀器設(shè)備，因此本方法可以成為堆肥微生物分子生態(tài)學(xué)研究中的一種方便、高質(zhì)、高量、低成本的堆肥微生物總DNA提取與純化技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種堆肥中微生物總DNA的提取與純化方法，包括DNA的提取與純化，本發(fā)明的特征在于(1)樣品的洗滌待提取DNA的樣品用0.12M磷酸鹽緩沖液，以4～6ml/g堆肥的用量在25～35℃溫度條件下，以150rpm速率勻速震蕩15～30min，然后以6000×g離心10min，沉淀再次洗滌；(2)DNA的提取樣品洗滌后，用1.2～1.5ml/g堆肥的溶菌酶溶液在37℃恒溫條件下，以200～250rpm振蕩溫浴1～2h，然后均以0.5～0.8ml/g堆肥的用量加入裂解緩沖液、磷酸鹽緩沖液和氯仿—異戊醇溶液，并以2500～3000rpm速率旋渦振蕩10～15min，經(jīng)0.6倍體積的異丙醇沉淀1～2h后，以16000×g速度離心10～20min，沉淀用0.8～1.5ml的冰70％乙醇洗滌兩次后溶解于500～1000μl的TE緩沖液中，得到粗提的DNA溶液；(3)DNA的純化粗提的DNA溶液用0.5～0.6倍體積的聚乙二醇和0.1倍體積的NaCl溶液在4℃溫度條件下沉淀2～24小時，然后取0.7ml粗提DNA溶液加入至DNA特異離心吸附柱內(nèi)，在4℃，12000×g離心1min，DNA吸附于柱上，棄去收集管廢液，重復(fù)上述操作直至粗提DNA溶液全部離心完畢，吸附柱上的DNA經(jīng)0.7ml冰70％乙醇洗滌兩次，再用含RNaseA的TE緩沖液100～500μl洗脫DNA，得到純化的DNA溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及堆肥中微生物總DNA的提取和純化。本發(fā)明用磷酸鹽緩沖液洗滌樣品，用溶菌酶溶液和SDS溶液裂解堆肥微生物細(xì)胞，粗提的DNA經(jīng)異丙醇離心沉淀和70％冰乙醇洗滌，用聚乙二醇和DNA特異離心吸附柱純化粗提的DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，提取的DNA片段長度約為23kb；純化后的DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，腐殖酸類的產(chǎn)量為1.5μg/g堆肥，去除了大部分的腐殖酸類物質(zhì)；用核酸蛋白質(zhì)分析儀對純化的DNA進(jìn)行檢測，DNA的產(chǎn)量為53μg/g堆肥。本發(fā)明堆肥微生物總DNA的提取與純化，能去除DNA中的腐殖酸類物質(zhì)的干擾，得到的高質(zhì)量DNA可直接用于PCR擴(kuò)增及其他分子生物學(xué)分析，從而建立一套可用于城市生活垃圾堆肥微生物分子生態(tài)學(xué)研究的快速、高質(zhì)、高量的DNA提取與純化技術(shù)。
文檔編號C07H1/00GK1733791SQ20051003211
公開日2006年2月15日 申請日期2005年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月6日
發(fā)明者肖勇, 楊朝暉, 曾光明, 陳耀寧, 陶然 申請人:湖南大學(xué)