專利名稱：醋酸奧曲肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的制備方法，特別是涉及醋酸奧曲肽的一種制備方法。
背景技術(shù)：
醋酸奧曲肽(Octreotide acetate)是一個含有7個氨基酸殘基和1個蘇氨醇的多肽，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于臨床，能夠治療的疾病主要有上消化道出血(包括肝硬變食管靜脈曲張出血、消化性潰瘍出血、應(yīng)激性潰瘍出血等)、胰腺疾病(包括重型急性胰腺炎、胰損傷或手術(shù)后胰瘺、預(yù)防胰手術(shù)后并發(fā)癥等)、胃腸道瘺管、消化系統(tǒng)內(nèi)分泌腫瘤、肢端肥大癥、突眼性甲亢癥及艾滋病相關(guān)性腹瀉等。
目前，與醋酸奧曲肽及其類似物的合成相關(guān)的專利有兩篇，其中一篇為“Novelpolypeptides，processes for their production，pharmaceutical compositionscomprising said polypeptides and their use.”，于1983年獲美國專利保護，專利號4395403；另一篇為“醋酸奧曲肽的液相合成方法”，于2002年獲得中國專利保護，公開號CN1355173。
上述兩篇專利文獻中，均采用液相片段縮合法合成醋酸奧曲肽及其類似物。在專利4395403中，將合成片段分為N-端二肽和C-端六肽兩個片段，采用BOC(叔丁氧羰基)/Bzl(芐基)保護策略，其中D-Trp-OH用BOC保護α-氨基，Thr-OH、Thr-ol的羥基沒有保護，接肽方法主要采用疊氮法，化合物的轉(zhuǎn)鹽過程采用凝膠層析法。該制備方法中存在的不足主要表現(xiàn)為1、在用酸脫BOC保護時，D-Trp易發(fā)生氧化、烷基化等副反應(yīng)；2、疊氮化法接肽，反應(yīng)條件苛刻，易發(fā)生爆炸；3、用凝膠層析法轉(zhuǎn)鹽，時間長，耗溶劑，收率低。公開號為CN 1355173的專利在對醋酸奧曲肽的合成研究中，將合成片段分為N-端三肽和C-端五肽兩個片段，采用BOC(叔丁氧羰基)、Bzl(芐基)、Fmoc保護策略，其中二肽的D-Phe用BOC保護，五肽的D-Trp用Fmoc保護，采用DCC-HOBt法進行接肽反應(yīng)，化合物的轉(zhuǎn)鹽過程采用非極性柱轉(zhuǎn)鹽。該專利在合成方法上針對國外方法中的不足的確作出很大改進，但是由于液相合成方法自身具有一些不可避免的缺陷，使得1、后處理過程復(fù)雜；2、需要在兩個容器中進行反應(yīng)，無法避免反應(yīng)中間體轉(zhuǎn)移的手續(xù)和損失；3、難于實現(xiàn)自動化；4、轉(zhuǎn)鹽和純化分步進行，終產(chǎn)物收率始終不理想。因此迫切需要研究開發(fā)出一種更好的醋酸奧曲肽合成方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本較低、純化較容易的醋酸奧曲肽的制備方法。
本發(fā)明所提供的醋酸奧曲肽的制備方法，包括以下步驟1)用固相合成法合成具有D(D型)-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr氨基酸殘基序列的直鏈八肽；2)氧化直鏈八肽，得到氧化型奧曲肽；3)將氧化型奧曲肽在醋酸鹽溶液中經(jīng)轉(zhuǎn)鹽和純化后，得到醋酸奧曲肽。
如圖1所示(R1代表Trt(三苯甲基)；R2代表Boc(叔丁氧羰基)；R3＝But(叔丁基)，R4＝Fmoc(芴甲氧羰基)；I＝二甲基甲酰胺(DMF)，HOBT(1-羥基苯并三氮唑)/HBTU(苯并三唑四甲基脲六氟磷酸酯，“/”是和的含義)，二異丙基乙基胺(DIEA)；II＝DMF，20％六氫吡啶(Pipe)；III＝三氟乙酸(TFA)，1，2-乙二硫醇(EDT)，D.I.H2O)，所述固態(tài)合成法合成直鏈八肽包括以下步驟1)R4-Cys(R1)-OH與H-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin(樹脂)在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；2)將R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-Thr(R3)-OH與R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；3)將R4-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-Lys(R2)-OH與H2N-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；4)將R4-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-D-Trp(R2)-OH與H2N-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；5)將R4-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-Phe-OH與H2N-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；6)將R4-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-Cys(R1)-OH與H2N-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；7)將R4-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-D-Phe-OH與H2N-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；8)將R4-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將H2N-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在TFA，EDT和D.I.H2O中，-20℃至室溫下5反應(yīng)，得到直鏈八肽H2N-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-COOH。
所述將直鏈八肽經(jīng)氧化使自N端第2位的Cys與自N端第7位的Cys之間形成雙硫鍵，得到氧化型奧曲肽的方法為將直鏈八肽直接溶于水經(jīng)稀釋得到濃度為0.1-1.0mg/mL的稀溶液，優(yōu)選為1.0mg/mL，并調(diào)節(jié)pH值至8-9，優(yōu)選的pH值為8.5，在室溫下反應(yīng)至用HPLC監(jiān)測無直鏈多肽存在即可，然后凍干后可進行下一步的純化。氧化過程中，濃度越低的溶液氧化反應(yīng)效率較高，產(chǎn)物純度較好，但隨著溶液濃度的降低，溶液體積也會相應(yīng)增加，不利于后續(xù)的凍干，因此在生產(chǎn)過程中一般采用濃度相對較高的溶液進行氧化。
所述將氧化型奧曲肽在醋酸鹽溶液中進行轉(zhuǎn)鹽和純化的方法為將氧化型奧曲肽溶于水經(jīng)稀釋得到濃度為10-100mg/mL的溶液，然后用醋酸鹽溶液作為純化緩沖液用HPLC法進行梯度洗脫，同時使溶液中的氧化型奧曲肽與醋酸根結(jié)合得到醋酸奧曲肽，將收集的組分液合并，凍干后得到醋酸奧曲肽干粉。所述醋酸鹽緩沖液的濃度為10-50mM；所述醋酸鹽為醋酸銨。
本發(fā)明醋酸奧曲肽的制備方法中，全部采用DMF，HOBT/HBTU和DIEA進行接肽反應(yīng)，具有操作簡便，副反應(yīng)少的優(yōu)點，用此方法可達到最小保護策略，并可進行大量的合成?，F(xiàn)有技術(shù)中制備醋酸鹽多肽樣品一般包括用TFA緩沖液純化樣品和用離子交換柱進行換鹽處理兩個步驟。在該制備方法中，采用離子交換柱換鹽將會有較大量的損失。本發(fā)明在奧曲肽的轉(zhuǎn)鹽過程中將醋酸鹽的制備以及樣品的純化同時進行，大大減少了由于多步純化造成的溶劑浪費。本發(fā)明具有成本低，收率高的優(yōu)點，在醋酸奧曲肽的工業(yè)化生產(chǎn)中將具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為用固相合成法合成直鏈八肽的流程2A為0.1mg/mL奧曲肽粗品的S-S環(huán)化反應(yīng)時間為0小時的HPLC檢測色譜2B為0.1mg/mL奧曲肽粗品的S-S環(huán)化反應(yīng)時間為48小時的HPLC檢測色譜3A為0.2mg/mL奧曲肽粗品的S-S環(huán)化反應(yīng)時間為0小時的HPLC檢測色譜3B為0.2mg/mL奧曲肽粗品的S-S環(huán)化反應(yīng)時間為60小時的HPLC檢測色譜4A為0.4mg/mL奧曲肽粗品的S-S環(huán)化反應(yīng)時間為0小時的HPLC檢測色譜4B為0.4mg/mL奧曲肽粗品的S-S環(huán)化反應(yīng)時間為72小時的HPLC檢測色譜5A為1.0mg/mL奧曲肽粗品的S-S環(huán)化反應(yīng)時間為0小時的HPLC檢測色譜5B為1.0mg/mL奧曲肽粗品的S-S環(huán)化反應(yīng)時間為96小時的HPLC檢測色譜6為醋酸奧曲肽的HPLC純化圖譜圖7為醋酸奧曲肽的HPLC純化圖譜圖8為醋酸奧曲肽的HPLC純化圖譜具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、醋酸奧曲肽的制備具體的制備過程，包括以下步驟一、用固相合成法合成直鏈八肽1、Fmoc-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備將Fmoc-Cys(Trt)-OH 10.54克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克混合后，溶于DMF100毫升，加入DIEA 19毫升，將上述混合溶液倒入ACT90合成反應(yīng)器中，室溫條件下反應(yīng)。反應(yīng)1小時后，抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及二氯甲烷100毫升(DCM)各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到Fmoc-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2、Fmoc-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備1)H2N-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備向ACT90合成反應(yīng)器中加入20％Pipe 100毫升，反應(yīng)20分鐘后經(jīng)抽濾除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，再經(jīng)抽濾后除去溶劑，得到H2N-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備將Fmoc-Thr(But)-OH 7.15克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，將上述混合溶液倒入ACT90合成反應(yīng)器中，室溫條件下反應(yīng)。反應(yīng)1.5小時后，抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到Fmoc-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
3、Fmoc-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備1)H2N-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備向ACT90合成反應(yīng)器中加入20％Pipe 100毫升，反應(yīng)20分鐘后抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到H2N-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備將Fmoc-Lys(Boc)-OH 8.43克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，將上述混合溶液倒入ACT90合成反應(yīng)器中，室溫條件下反應(yīng)2小時后，抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到Fmoc-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
4、Fmoc-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備1)H2N-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備向ACT90合成反應(yīng)器中加入20％Pipe 100毫升，反應(yīng)20分鐘后抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到H2N-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備將Fmoc-D-Trp(Boc)-OH 9.48克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，將上述混合溶液倒入ACT90合成反應(yīng)器中，室溫條件下反應(yīng)3小時后，抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到Fmoc-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
5、Fmoc-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備1)H2N-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備向ACT90合成反應(yīng)器中加入20％Pipe 100毫升，反應(yīng)20分鐘后抽濾除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到H2N-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備將Fmoc-Phe-OH 6.97克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，將上述混合溶液倒入ACT90合成反應(yīng)器中，室溫條件下反應(yīng)2小時后，抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到Fmoc-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
6、Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備1)H2N-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備向ACT90合成反應(yīng)器中加入20％Pipe 100毫升，反應(yīng)20分鐘后抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，抽濾除去溶劑，得到H2N-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備將Fmoc-Cys(Trt)-OH 10.54克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，將上述混合溶液倒入ACT90合成反應(yīng)器中，室溫條件下反應(yīng)5小時后，抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
7、Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備1)H2N-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備向ACT90合成反應(yīng)器中加入20％Pipe 100毫升，反應(yīng)20分鐘后抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到H2N-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
2)Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備將Fmoc-D-Phe-OH 6.97克、HBTU 9.10克和HOBT 3.24克溶于DMF 100毫升，加入DIEA 19毫升，將上述混合溶液倒入ACT90合成反應(yīng)器中，室溫條件下反應(yīng)2.5小時后，抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到Fmoc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
8、H2N-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin的制備向ACT90合成反應(yīng)器中加入20％Pipe 100毫升，反應(yīng)20分鐘后抽濾以除去溶劑，然后用DMF 100毫升、CH3OH 100毫升及DCM 100毫升各洗樹脂3次，經(jīng)抽濾除去溶劑，得到H2N-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin。
9、直鏈八肽H2N-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OL的獲得將盛有步驟8獲得的H2N-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(But)-Cys(Trt)-Thr-OL-2-Cl-Trt-Resin 27.494克的500毫升圓底燒瓶(放有一合適的磁子)中加入100毫升TFA/EDT/D.I.H2O混合液(混合比例為38∶1∶1)，調(diào)節(jié)磁子攪拌速度，在緩慢攪拌條件下反應(yīng)5小時后，將切割混合物倒入抽濾瓶內(nèi)抽干，然后用35毫升50％TFA/DCM清洗樹脂2次，抽干；將抽濾液倒入預(yù)先冷凍好的2.5L冰凍乙醚中，置于-20℃冰箱放置30分鐘后，從冰箱中取出沉淀乙醚液，離心(轉(zhuǎn)速為3500rpm)棄上清液，再用200毫升冰凍乙醚將沉淀洗滌4次，分別離心(轉(zhuǎn)速3500rpm)，最后用150毫升5％HAc溶解沉淀，冷凍抽干，得到粗肽10.8克。
二、奧曲肽的制備根據(jù)雙硫鍵在空氣中氧化的通用方法，取0.102g、0.202g、0.409g、1.009g步驟一制備的粗肽干粉(直鏈八肽)分別溶解于1000mL水中(容器選用2000mL燒杯)，并用1M氨水調(diào)節(jié)pH值至8.5，得到濃度分別為0.1mg/mL(其摩爾濃度約為1×10-4M)、0.2mg/mL(其摩爾濃度約為2×10-4M)、0.4mg/mL(其摩爾濃度約為4×10-4M)、1.0mg/mL(其摩爾濃度約為1×10-3M)的粗肽溶液，室溫下(約25℃)敞口放置，緩慢攪拌，用HPLC監(jiān)測二硫鍵的形成，其中濃度為0.1mg/mL(其摩爾濃度約為1×10-4M)粗肽溶液的反應(yīng)監(jiān)測圖譜如圖2A-圖2B所示，反應(yīng)進行48小時后直鏈八肽的主峰面積占總峰面積的7.65％，-70℃冷凍停止反應(yīng)，冷凍干燥后得到氧化型奧曲肽粗品干粉85mg，多肽的氧化率為92.4％，在該濃度下步驟反應(yīng)產(chǎn)率為83.0％；濃度為0.2mg/mL(其摩爾濃度約為2×10-4M)粗肽溶液的反應(yīng)監(jiān)測圖譜如圖3A-圖3B所示，反應(yīng)進行60小時后直鏈八肽的主峰面積占總峰面積的3.1％，-70℃冷凍停止反應(yīng)，冷凍干燥后得到氧化型奧曲肽粗品干粉0.176g，多肽的氧化率為96.9％，該步驟反應(yīng)的產(chǎn)率為87.0％；濃度為0.4mg/mL(其摩爾濃度約為4×10-4M)粗肽溶液的反應(yīng)監(jiān)測圖譜如圖4A-圖4B所示，反應(yīng)進行72小時后直鏈八肽基本完全被氧化，-70℃冷凍停止反應(yīng)，冷凍干燥后得到氧化型奧曲肽粗品干粉0.343g，多肽的氧化率為100％，該步驟反應(yīng)的產(chǎn)率為84.0％；濃度為1.0mg/mL(其摩爾濃度約為1×10-3M)粗肽溶液的反應(yīng)監(jiān)測圖譜如圖5A-圖5B所示，反應(yīng)進行96小時后直鏈八肽基本完全被氧化，-70℃冷凍停止反應(yīng)，冷凍干燥后得到氧化型的奧曲肽粗品干粉0.862g，多肽的氧化率為100％，該步驟反應(yīng)的產(chǎn)率為86.2％。
對于濃度較小的直鏈八肽溶液，形成雙硫鍵的時間相對于濃度較高的溶液要要快得多。雖然高濃度的樣品在氧化過程中所需要的時間相對較長，但在隨后的冷凍干燥過程中，獲得相同的量的氧化八肽的時間要短的多，甚至可以不進行冷凍干燥直接進行純化過程。
三、醋酸奧曲肽的獲得采用下述三種方法對步驟二制備的氧化型奧曲肽粗品進行鹽化及純化，得到醋酸奧曲肽1、稱取步驟二制備的氧化型奧曲肽粗品200mg溶于水得到濃度約為20mg/mL的氧化型奧曲肽粗肽溶液，采用HPLC進行純化，純化條件為色譜柱Varian(21.4×250mm)C18柱流動相A5mM NH4Ac in 10％乙腈(AcN)，pH4.5流動相B5mM NH4Ac in 90％AcN，pH4.5洗脫程序20mL/min，線性梯度

全部過程采用紫外檢測儀(275nm)監(jiān)測，純化圖譜如圖6所示，保留時間約為17分鐘。
將HPLC純化過程中收集得到的含主峰的流動相凍干，得到所需要的醋酸奧曲肽52mg，采用該方法進行純化的收率為26.0％，該工藝可進行放大操作。
2、稱取步驟二制備的氧化型奧曲肽粗品200mg溶于水得到濃度約為20mg/mL的氧化型奧曲肽粗肽溶液，采用HPLC進行純化，純化條件為色譜柱Varian(21.4×250mm)C18柱流動相A20mM NH4Ac in 5％AcN，pH4.5流動相B20mM NH4Ac in 90％AcN，pH4.5洗脫程序20mL/min，線性梯度

全部過程采用紫外檢測儀(275nm)監(jiān)測，純化圖譜如圖7所示，保留時間為14分鐘左右。
將HPLC純化過程中收集得到的含主峰的流動相凍干，得到所需要的醋酸奧曲肽47mg，采用該方法進行純化的收率為23.5％，該工藝可進行放大操作。
3、稱取步驟二制備的氧化型奧曲肽粗品200mg溶于水得到濃度約為20mg/mL的氧化型奧曲肽粗肽溶液，采用HPLC進行純化，純化條件為色譜柱Varian(21.4×250mm)C18柱流動相A20mM NH4Ac in 5％AcN，pH6.0流動相B20mM NH4Ac in 90％AcN，pH6.0洗脫程序20mL/min，線性梯度

全部過程采用紫外檢測儀(275nm)監(jiān)測，純化圖譜如圖8所示，保留時間為17分鐘左右。
將HPLC純化過程中收集得到的含主峰的流動相凍干，得到所需要的醋酸奧曲肽59mg，采用該方法進行純化的收率為29.5％，該工藝可進行放大操作。
采用不同濃度，不同pH的醋酸胺溶液作為純化的緩沖液，均可得到色譜純度大于95.0％且其它各項都能符合質(zhì)量標準要求的藥用醋酸奧曲肽，經(jīng)鑒定用本發(fā)明所述方法制備的醋酸奧曲肽HPLC純度可達99.05％，Maldi-TOF MS為1019.62(理論分子量為1019.3)，比旋度為-61.2°(標準[α]D20-57°～-63°(c 0.2，100％CH3COOH))，乙酸含量9.3％(標準5.0-12％)。
權(quán)利要求
1.一種醋酸奧曲肽的制備方法，包括以下步驟1)用固相合成法合成具有D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr氨基酸殘基序列的直鏈八肽；2)氧化直鏈八肽，得到氧化型奧曲肽；3)將氧化型奧曲肽在醋酸鹽溶液中經(jīng)轉(zhuǎn)鹽和純化后，得到醋酸奧曲肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中用固相合成法合成直鏈八肽包括以下步驟1)R4-Cys(R1)-OH與H-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；2)將R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-Thr(R3)-OH與R4-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；3)將R4-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-Lys(R2)-OH與H2N-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；4)將R4-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-D-Trp(R2)-OH與H2N-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；5)將R4-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys-(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-Phe-OH與H2N-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；6)將R4-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-Cys(R1)-OH與H2N-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；7)將R4-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將R4-D-Phe-OH與H2N-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF，HOBT/HBTU和DIEA中反應(yīng)，得到R4-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin；8)將R4-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在DMF和20％Pipe中反應(yīng)，得到H2N-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin，再將H2N-D-Phe-Cys(R1)-Phe-D-Trp(R2)-Lys(R2)-Thr(R3)-Cys(R1)-Thr-OL-2-Cl-R1-Resin在TFA，EDT和D.I.H2O中，-20℃至室溫下反應(yīng)，得到直鏈八肽H2N-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-COOH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中將直鏈八肽氧化的方法為將直鏈八肽直接溶于水得到濃度為0.1-1.0mg/mL的溶液，并調(diào)節(jié)溶液pH值至8-9，在室溫下進行氧化反應(yīng)，得到氧化型奧曲肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述溶液濃度為1.0mg/mL；所述溶液pH值為8.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中將氧化型奧曲肽在醋酸鹽溶液中進行轉(zhuǎn)鹽和純化的方法為將氧化型奧曲肽溶于水得到濃度為10-100mg/mL的溶液，然后用醋酸鹽溶液作為純化緩沖液用HPLC法進行梯度洗脫，將收集的組分液合并，凍干后得到醋酸奧曲肽干粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述醋酸鹽緩沖液的濃度為10-50mM；所述醋酸鹽為醋酸銨。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種醋酸奧曲肽的制備方法，該方法，包括以下步驟1)用固相合成法合成具有D－Phe－Cys－Phe－D－Trp－Lys－Thr－Cys－Thr氨基酸殘基序列的直鏈八肽；2)氧化直鏈八肽，得到氧化型奧曲肽；3)將氧化型奧曲肽在醋酸鹽溶液中經(jīng)轉(zhuǎn)鹽和純化后，得到醋酸奧曲肽。本發(fā)明的醋酸奧曲肽的制備方法中，全部采用DMF，HOBT/HBTU和DIEA進行接肽反應(yīng)，具有操作簡便，副反應(yīng)少的優(yōu)點，用此方法可達到最小保護策略，并可進行大量的合成。本發(fā)明具有成本低，收率高的優(yōu)點，在醋酸奧曲肽的工業(yè)化生產(chǎn)中將具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K7/00GK1810829SQ20051000287
公開日2006年8月2日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日
發(fā)明者嚴俐, 宋江莉 申請人:北京中科亞光生物科技有限公司