專利名稱：固相多肽合成奧曲肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種奧曲肽的制備方法，具體涉及固相多肽合成奧曲肽的制備方法。
背景技術(shù)：
奧曲肽，中文名醋酸奧曲肽；英文名Octreotide Acetate結(jié)構(gòu)式 分子式C49H66N10O10S2·XC2H4O2奧曲肽是人工合成的生長(zhǎng)抑素8肽，是90年代臨床應(yīng)用最具成效的激素類藥物之一。與天然生長(zhǎng)抑素的藥理作用相同，但半衰期延長(zhǎng)了30倍，因此具有應(yīng)用價(jià)值。奧曲肽能抑制多種胃腸道激素的分泌及其它多種內(nèi)分泌功能，目前已廣泛用于臨床治療各型胰腺炎、胰腺瘺管、腸瘺、肝硬化食道-胃底曲張靜脈出血、消化道潰瘍出血、嚴(yán)重腹瀉及肢端肥大癥，并有望用于消化系統(tǒng)內(nèi)分泌腫瘤的治療。
奧曲肽是一種安全有效的治療上消化道出血、急性胰腺炎的首選藥物。但目前本品尚無(wú)國(guó)產(chǎn)品，全部依賴進(jìn)口，進(jìn)口品(商品名善得定、善寧，生產(chǎn)商為瑞士山道士公司)在國(guó)內(nèi)的零售價(jià)為801元/盒(5支)，規(guī)格為2ml:0.1mg。
在國(guó)內(nèi)，肝硬化發(fā)病率超過1％，每年發(fā)生食管曲張靜脈破裂引起的大出血的患者，加上消化性潰瘍引起的上消化道大出血患者，總數(shù)超過300萬(wàn)，因此奧曲肽的市場(chǎng)巨大。我們研制的生長(zhǎng)抑素八肽(醋酸奧曲肽)成本將大大低于進(jìn)口品，將大大降低患者的治療成本。
目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的制備方法均存在著一定的缺陷，每一輪脫帽須用三氟醋酸，故接肽收率低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高；三廢污染多，并使用氟化氫切肽、三氟醋酸進(jìn)行純化，污染環(huán)境，收率較低。因此目前的方法限制了奧曲肽的大規(guī)模生產(chǎn)和使用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種固相多肽合成奧曲肽的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟以2-氯-三苯甲基樹脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)、三苯甲基樹脂作樹脂(TritylChloride Resin)、4-甲基三苯甲基樹脂(4-Methyltrityl Chloride Resin)或4-甲氧基三苯甲基樹脂(4-Methoxytrityl Chloride Resin)為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用TBTU或HBTU及HOBT為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的還原型八肽樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得還原型奧曲肽，并在pH7-11的條件下用空氣氧化，獲得奧曲肽粗品，再經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，冷凍干燥后，制得奧曲肽精品。
按照本發(fā)明，依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Thr(tBu)-樹脂將2-氯-三苯甲基樹脂、三苯甲基樹脂、4-甲基三苯甲基樹脂或4-甲氧基三苯甲基樹脂，用DMF浸泡10～60分鐘，使樹脂充分溶脹，加DIPEA或DMPA和Fmoc-Thr(tBu)-ol10～50℃反應(yīng)1～24小時(shí)；再加甲醇10～50℃反應(yīng)1～20小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，樹脂用DMF洗滌，獲得Fmoc-Thr(tBu)-樹脂；所說(shuō)的樹脂取代量為0.3-1.5mmol/g；粒徑為100-400目；Fmoc-Thr(tBu)-ol的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；DIPEA或DMPA的摩爾數(shù)為樹脂的2～20倍；脫帽試劑的加入量以樹脂的重量為基準(zhǔn)為5～20ml/g，下同；甲醇的摩爾數(shù)為樹脂的2～20倍；(2)制備Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(1)的Fmoc-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10～50℃反應(yīng)1～5小時(shí)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；所說(shuō)的脫帽試劑為PIP∶DMF＝1∶2～5，體積比，下同；脫帽試劑的加入量以樹脂的重量為基準(zhǔn)為5～20ml/g，下同；混合物中Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；
TBTU/HBTU和HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；所說(shuō)的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比，下同；接肽試劑中，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；“TBTU/HBTU和HOBT”指的是TBTU與HOBT的混合物，或者是HBTU與HOBT的混合物，下同；(3)制備Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(2)的Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍。
其余操作以及工藝條件同上；(4)制備Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(2)的Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍。
其余操作以及工藝條件同上；(5)制備Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(3)的Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-D-Trp-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-D-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；其余操作以及工藝條件同上；(6)制備Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂
在步驟(5)的Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-Phe-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；其余操作以及工藝條件同上；(7)制備Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(6)的Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍。
其余操作以及工藝條件同上；(8)制備Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)樹脂在步驟(7)的Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Boc-D-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)樹脂；混合物中Boc-D-Phe-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；其余操作以及工藝條件同上；(9)制備D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(SH)-Thr-ol在步驟(8)Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)樹脂中，加入預(yù)冷至-10℃～20℃的切肽試劑，10℃～50℃反應(yīng)1～5小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，獲得切肽后的還原型奧曲肽；所說(shuō)的切肽試劑的組分為TFA/EDT/H2O/TIS＝90-95/2-5/2-5/1-5，體積比；
(10)制備
在步驟(9)的D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(SH)-Thr-ol中，用氫氧化鈉或氨水調(diào)節(jié)pH至7-12，在10℃～50℃下，通入空氣或氧氣氧化反應(yīng)8～30小時(shí)，獲得奧曲肽粗品。
按照本發(fā)明，粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化分離純化的方法包括如下步驟將奧曲肽粗品溶于乙酸中，過濾，濾液經(jīng)C18或C8柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為100-650ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得成品，總收率為30-40％(以樹脂的mmol計(jì))。
乙酸的重量濃度為0.5～10％，乙酸中奧曲肽粗品的重量濃度為1～50％。
本發(fā)明的奧曲肽工藝路線有下列特點(diǎn)，具備規(guī)?；a(chǎn)能力，工藝穩(wěn)定，原輔材料來(lái)源方便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，三廢少，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，接肽收率高(每步接肽收率為≥99％)，降低了成本，采用切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS)進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢污染少，且提高收率，采用C18(或C8)柱進(jìn)行分離純化，避免使用TFA(三氟醋酸)進(jìn)行純化，減少三廢，每步接肽收率均在98％以上；總收率為30-40％。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1實(shí)施例和前述過程中所采用的原料列表如下
一、合成肽鏈(1)制備Fmoc-Thr(tBu)-樹脂取2-氯-三苯甲基樹脂50克(100-200目，1.0mmol/g，50mmol)，用DMF浸泡30分鐘，使樹脂充分溶脹，加44ml DIPEA，39.7g Fmoc-Thr(tBu)-ol，反應(yīng)3小時(shí)，再加50ml甲醇繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，樹脂用DMF洗三次。獲得Fmoc-Thr(tBu)-樹脂；(2)Fmoc-Cys(Trt)-Thr-樹脂的制備加入800毫升體積濃度為20％的六氫吡啶的DMF溶液，25℃反應(yīng)30分鐘。氮?dú)獯禐V去六氫吡啶，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW585.7，200mmol)117.1g、TBTU(MW321，200mmol)64.2g，HOBT(MW153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
加入500毫升20％的六氫吡啶的DMF溶液，25℃反應(yīng)30分鐘。氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(3)Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-樹脂的制備在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加79.5g(397.5，200mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU(MW321，200mmol)64.2g，HOBT(MW153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
加入500毫升20％的六氫吡啶的DMF溶液，25℃反應(yīng)30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(4)Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-樹脂的制備在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加93.7g(468.5，200mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU(MW321，200mmol)64.2g，HOBT(MW153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑珼MF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
加入500毫升20％的六氫吡啶的DMF溶液，25℃反應(yīng)30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(5)Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-樹脂的制備在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加85.3g(426.5，200mmol)Fmoc-D-Trp-OH、TBTU(MW321，200mmol)64.2g，HOBT(MW153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
加入500毫升20％的六氫吡啶的DMF溶液，25℃反應(yīng)30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(6)Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-脂的制備在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加77.5g(FW387.4，200mmol)Fmoc-Phe-OH、TBTU(MW321，200mmol)64.2g，HOBT(MW153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
加入500毫升20％的六氫吡啶的DMF溶液，25℃反應(yīng)30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(7)Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-樹脂的制備在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加117.1g(585.7，200mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU(MW321，200mmol)64.2g，HOBT(MW153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
加入500毫升20％的六氫吡啶的DMF溶液，25℃反應(yīng)30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(8)Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-樹脂的制備在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加53g(FW265.3，200mmol)Boc-D-Phe-OH、TBTU(MW321，200mmol)64.2g，HOBT(MW153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
加入500毫升20％的六氫吡啶的DMF溶液，25℃反應(yīng)30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br>
再用無(wú)水甲醇洗滌三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得八肽樹脂約90g(MW＝931，43mmol)，接肽總收率約為86％。
二、切肽取90.2g八肽樹脂轉(zhuǎn)移到茄形瓶中，冷卻下加入切肽試劑(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚＝650ml/17ml/17ml/34ml)，25℃攪拌2小時(shí)。過濾，抽干，濾液加無(wú)水乙醚沉淀，過濾收集沉淀得約30g還原型奧曲肽粗品。
三、氧化(二硫鍵的形成)將30g還原型奧曲肽粗品溶于30L水，在攪拌下慢慢滴加2M NH4OH至pH7.8，室溫通空氣氧化約24小時(shí)，用冰醋酸調(diào)至pH5.5，加活性碳攪拌30分鐘，過濾。
四、純化濾液分批經(jīng)C18柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為380ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；樣品峰合并后凍干，約得15.6g白色疏松塊狀物成品(MW1019，15.3mmol)；收率30.6％(以Fmoc-Thr-樹脂的mmol計(jì))。用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液。
實(shí)施例2～3采用與實(shí)施例1相同的方法和工藝條件，其中分別以4-甲基三苯甲基樹脂或4-甲氧基三苯甲基樹脂作起始原料，同前法接上Fmoc-Thr-ol后，再加入脫帽試劑，25℃反應(yīng)0.5小時(shí)，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-氨基酸、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，25℃反應(yīng)2小時(shí)，再經(jīng)切肽、氧化等反應(yīng)，得到16.3g和14.9g白色疏松塊狀物成品，收率分別為32.0％和29.2％(以Fmoc-Thr-樹脂的mmol計(jì))。
權(quán)利要求
1.一種固相多肽合成奧曲肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟以2-氯-三苯甲基樹脂、三苯甲基樹脂作樹脂、4-甲基三苯甲基樹脂或4-甲氧基三苯甲基樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用TBTU或HBTU及HOBT為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的還原型八肽樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得還原型奧曲肽，并在pH7-11的條件下用空氣氧化，獲得奧曲肽粗品，再經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，冷凍干燥后，制得奧曲肽精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Thr(tBu)-樹脂將2-氯-三苯甲基樹脂、三苯甲基樹脂、4-甲基三苯甲基樹脂或4-甲氧基三苯甲基樹脂(100-400目，0.3-1.5mmol/g)，用DMF浸泡5～60分鐘，加入DIPEA或DMPA和Fmoc-Thr(tBu)-ol或Fmoc-Thr-ol，10～50℃反應(yīng)1～24小時(shí)；再加甲醇10～50℃反應(yīng)1～24小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，樹脂用DMF洗滌，獲得Fmoc-Thr(tBu)-樹脂；Fmoc-Thr(tBu)-ol的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；DIPEA的摩爾數(shù)為樹脂的2～20倍；甲醇的摩爾數(shù)為樹脂的2～20倍；(2)制備Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(1)的Fmoc-Cys(Trt)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；所說(shuō)的脫帽試劑為PIP∶DMF＝1∶2～5，體積比，下同；脫帽試劑的加入量以樹脂的重量為基準(zhǔn)為5～20ml/g，下同；混合物中Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；TBTU/HBTU和HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；所說(shuō)的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比，下同；接肽試劑中，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；(3)制備Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(2)的Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；其余操作以及工藝條件同上；(4)制備Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(2)的Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；其余操作以及工藝條件同上；(5)制備Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(3)的Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-D-Trp-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-D-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；其余操作以及工藝條件同上；(6)制備Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(5)的Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-Phe-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；其余操作以及工藝條件同上；(7)制備Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(6)的Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍。其余操作以及工藝條件同上；(8)制備Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂在步驟(7)的Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Boc-D-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)樹脂；混合物中Boc-D-Phe-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；其余操作以及工藝條件同上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，加入脫帽試劑，10～50℃反應(yīng)10～60分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10～50℃反應(yīng)1～5小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得還原型奧曲肽的方法包括如下步驟在步驟(8)Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)樹脂中，加入預(yù)冷至-10℃～20℃的切肽試劑，10℃～50℃反應(yīng)1～5小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，獲得切肽后的還原型奧曲肽；所說(shuō)的切肽試劑的組分為TFA/EDT/H2O/TIS＝90-95/2-5/2-5/1-5，體積比。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，氧化過程包括如下步驟在步驟(9)的D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(SH)-Thr-ol中，用氫氧化鈉或氨水調(diào)節(jié)pH至7-12，在10℃～50℃下，通入空氣或氧氣氧化反應(yīng)8～30小時(shí)，獲得奧曲肽粗品。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化分離純化的方法包括如下步驟將奧曲肽粗品溶于乙酸中，過濾，濾液經(jīng)C18或C8柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為100-650ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得成品；乙酸的重量濃度為0.5～10％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固相多肽合成奧曲肽的制備方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟以2－氯－三苯甲基樹脂、4－甲基三苯甲基樹脂或4－甲氧基三苯甲基樹脂作起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc－保護(hù)基團(tuán)，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得還原型奧曲肽，并在pH7－11的條件下用空氣氧化，獲得奧曲肽粗品，再經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，制得奧曲肽精品。本發(fā)明的方法，具備規(guī)模化生產(chǎn)能力，工藝穩(wěn)定，原輔材料來(lái)源方便，生產(chǎn)周期短，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，接肽收率高，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢污染少，采用C18(或C8)柱進(jìn)行分離純化。
文檔編號(hào)C07K7/06GK1923849SQ20051002922
公開日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者周逸明 申請(qǐng)人:上海子能制藥有限公司, 周逸明