專利名稱：使用可裂解固相分離核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型固相材料在結(jié)合、分離和純化核酸的方法中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分子診斷學(xué)和分子生物學(xué)中的現(xiàn)代技術(shù)(包括反轉(zhuǎn)錄、克隆、限制性分析、擴(kuò)增和序列分析)，要求在這些技術(shù)中使用的核酸基本上不含污染物和干擾物質(zhì)。不期望的污染物包括大分子物質(zhì)例如酶、其它類型的蛋白質(zhì)、多糖、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、脂類、低分子量酶抑制劑、或非目標(biāo)核酸、酶輔因子、鹽、離液劑、染料、金屬鹽、緩沖鹽和有機(jī)溶劑。
獲得用于分子生物學(xué)應(yīng)用的基本上無污染物的目標(biāo)核酸是困難的，原因在于目標(biāo)核酸被發(fā)現(xiàn)于其中的復(fù)雜樣品基質(zhì)。此類樣品包括例如來自組織的細(xì)胞、來自體液的細(xì)胞、血液、培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、或從目標(biāo)核酸擴(kuò)增得到的溶液。樣品基質(zhì)經(jīng)常含有顯著量的污染物，在感興趣的核酸被用于分子生物學(xué)或診斷技術(shù)之前所述污染物必須從所述核酸去除。
從上述細(xì)胞和組織產(chǎn)生的混合物中分離目標(biāo)核酸的常規(guī)技術(shù)，需要使用有害化學(xué)品例如酚、氯仿以及溴化乙錠。酚/氯仿提取被用于此類步驟以從目標(biāo)核酸和多種污染物的混合物中抽提掉污染物。可選地，根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的方法，使用氯化銫-溴化乙錠梯度。參見例如Molecular Cloning，由Sambrook等編著(1989)，Cold Spring Harbor Press，pp.1.42-1.50。通常，在后面的方法之后，通過將乙醇或2-丙醇加入水相以沉淀核酸來沉淀保留在抽提的水相中的核酸物質(zhì)。通常，通過離心從溶液中移出沉淀物，并且在水或緩沖溶液中重懸以作進(jìn)一步使用之前，允許干燥所得到的沉淀物小球。
已經(jīng)開發(fā)出更簡單和更快的方法，其采用各種類型的固相，以從細(xì)胞裂解液或核酸和污染物的其它混合物中分離核酸。此類固相包括層析樹脂、聚合物和各種形狀和形式例如纖維的二氧化硅或玻璃基物質(zhì)、過濾器以及包被的容器。當(dāng)為小顆粒的形式時(shí)，有時(shí)提供磁心，以幫助實(shí)現(xiàn)分離。
在分離核酸中使用的一種類型的固相包括設(shè)計(jì)用于高效液相色譜(HPLC)的多孔硅膠顆粒。用陰離子交換劑對(duì)多孔硅膠顆粒的表面進(jìn)行官能化，以在某一鹽和pH條件下與質(zhì)粒DNA交換。參見，例如美國專利4,699,717和5,057,426。在含有高濃度鹽的水溶液中洗脫結(jié)合到這些固相材料的質(zhì)粒DNA。從那里洗脫的核酸溶液在其被用于下游過程之前必須被進(jìn)一步處理，以除去鹽。
其它硅基固相材料包括可控孔度玻璃(CPG)、包埋有二氧化硅顆粒的濾器、硅膠顆粒、硅藻土、玻璃纖維或上述的混合物。在存在離液劑例如碘化鈉(NaI)、硫氰酸胍或氯化胍的情況下，在含有核酸的樣品中，每一硅基固相材料可逆地結(jié)合核酸。此類固相結(jié)合并保持核酸物質(zhì)，同時(shí)該固相經(jīng)受離心或真空過濾以從殘余樣品成分中分離出基質(zhì)和結(jié)合于其上的核酸物質(zhì)。然后，通過用水或低鹽洗脫緩沖液洗脫，從固相釋放出該核酸物質(zhì)。商業(yè)上可得的用于核酸分離的硅基固相材料包括例如WizardTMDNA純化系統(tǒng)產(chǎn)品(Promega，Madison，WI)、QiaPrepTMDNA分離系統(tǒng)(Qiagen，Santa Clarita，CA)、High Pure(Roche)以及GFXMicro Plasmid Kit(Amersham)。
顆粒形式的聚合樹脂也被廣泛用于核酸的分離和純化。在歐洲專利申請(qǐng)公開第EP 1243694A1中公開了含有季銨首基(head group)的羧酸鹽改性的聚合顆粒(Bangs，Agencourt)聚合物。該聚合物是具有共價(jià)連接的線型非交聯(lián)聚合物的惰性載體顆粒。該類型的聚合固相一般是指觸角樹脂(tentacle resin)。線型聚合物摻入四烷基季銨基團(tuán)。該烷基集團(tuán)被指定為甲基或乙基基團(tuán)(第4欄，第52-55行)。較長的烷基被認(rèn)為是不期望的。
基于陰離子交換原理的其它用于結(jié)合核酸的固相材料目前正在使用中。這些包括具有DEAE首基(Qiagen)和二氧化硅-NucleoBond AX(BD，Roche-Genopure)的硅基材料，這基于在EP0496822B1中描述的層析載體。具有聚合的三烷基銨基團(tuán)的聚合物樹脂被描述于EP 1243649(GeneScan)。用于DNA分離的羧基改性聚合物可以從眾多的供應(yīng)商獲得。在高鹽條件下核酸被吸引，而在低離子強(qiáng)度條件下核酸被釋放。
磁響應(yīng)性顆粒也已經(jīng)被開發(fā)用作核酸分離中的固相。設(shè)計(jì)用于核酸分離的若干種不同類型的磁響應(yīng)性顆粒在本領(lǐng)域中是已知的，并且可以從若干來源商業(yè)獲得。可逆地直接結(jié)合核酸材料的磁性顆粒包括MagneSilTM顆粒(Promega)。也已知，磁性顆粒通過共價(jià)連接的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白可逆地結(jié)合mRNA，其中抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白具有用于與mRNA的聚腺苷酸尾雜交的連接的寡dT尾。
已知多種類型的磁響應(yīng)性硅基顆粒被用作核酸結(jié)合分離法中的固相。一個(gè)這樣的顆粒類型是磁響應(yīng)性玻璃珠，優(yōu)選具有受控孔尺寸的磁響應(yīng)性玻璃珠，其作為Magnetic Porous Glass(MPG)顆?？梢詮腃PG，Inc.(Lincon Park，NJ)獲得；或者在美國專利第4,395,271、4,233,169、或4,297,337號(hào)中描述的多孔磁玻璃顆粒。在核酸的結(jié)合和分離中有用的磁性顆粒的另一類型是通過將磁性材料摻入聚合的二氧化硅化合物基質(zhì)中而產(chǎn)生的。(德國專利DE4307262A1) 具有可誘導(dǎo)磁性性質(zhì)的顆?；蛑榘ㄐ☆w粒的過渡金屬，例如鐵、鎳、銅、鈷和錳，以形成金屬氧化物，在磁體存在下可以使該金屬氧化物具有暫時(shí)的磁性。這些顆粒被稱為順磁性的或超順磁性的。為形成順磁或超順磁珠，已用在水中相對(duì)穩(wěn)定的聚合物包被金屬氧化物。美國專利4,554,088公開了順磁顆粒，其包括被高分子硅烷包被包圍的金屬氧化物芯。美國專利5,356,713公開了可磁化的微球體，其包括被疏水乙烯基芳族單體外殼包圍的可磁化顆粒芯。美國專利5,395,688公開了已經(jīng)用混合的順磁金屬氧化物-聚合物層包被的聚合物芯。另一種方法采用聚合物芯以吸收金屬氧化物，例如諸如在美國專利第4,774,265號(hào)中。包含用順磁金屬氧化物顆粒層包被的聚合芯顆粒的磁性顆粒被公開于美國專利5,091,206中。然后，用另外的聚合層進(jìn)一步包被該顆粒，以保護(hù)金屬氧化物層并提供反應(yīng)性包被。美國專利5,866,099公開了在用于配位金屬鹽并俘獲混合的金屬氧化物顆粒的蛋白存在的情況下，通過兩種金屬鹽的混合物共沉淀制備磁性顆粒。許多示例性金屬鹽對(duì)被描述。美國專利5,411,730描述了相似的方法，其中沉淀的混合的金屬氧化物顆粒被俘獲在葡聚糖——一種寡糖中。
用于不可逆地捕獲DNA和RNA的氧化鋁(氧化鋁(alumina oxide))顆粒被公開于美國專利6,291,166中。用于固相擴(kuò)增法例如PCR的結(jié)合的核酸是可得的。
發(fā)明概述 本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供固相材料，其包括用于結(jié)合核酸的可裂解連接體(cleavable linker)。進(jìn)一步的目標(biāo)是提供包含共價(jià)連接的核酸結(jié)合基團(tuán)的此類可裂解固相材料。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供從固相材料結(jié)合和釋放核酸的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供使用本發(fā)明的固相材料分離和純化核酸的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步的目標(biāo)是提供結(jié)合核酸并在最常使用的洗脫條件下抵抗核酸釋放的固相材料。提供含有共價(jià)連接的三元或四元基(ternary or quaternary oniumgroups)的此類固相材料是進(jìn)一步的目標(biāo)。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供使用本發(fā)明的組合物結(jié)合核酸并釋放該核酸的固相材料。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供用于從固相材料釋放結(jié)合的核酸的此類試劑組合物。
附圖簡述

圖1A描繪了可裂解核酸結(jié)合顆粒的示意圖。圖1B描繪了結(jié)合核酸分子的可裂解固體支持物。
圖2顯示了使用可裂解核酸結(jié)合顆粒結(jié)合和釋放核酸。
圖3是PCR擴(kuò)增的pUC18質(zhì)粒DNA樣品的凝膠圖，其已被吸收在10mg可裂解的聚合物珠上，并在擴(kuò)增前從洗滌過的珠洗脫。
圖4是通過使用實(shí)施例13和19的可裂解的珠從細(xì)胞裂解液分離而獲得的pUC18 DNA的凝膠圖。
圖5是使用本發(fā)明的可裂解固體支持物從人血樣中分離的DNA的凝膠圖。
圖6是結(jié)合至本發(fā)明的具有三丁基-磷(，phosphonium)基團(tuán)的可裂解固體支持物并通過Wittig反應(yīng)釋放的DNA的斑點(diǎn)印跡圖。
發(fā)明詳述 申請(qǐng)人:已開發(fā)出用于從含有核酸的溶液和樣品中捕捉和結(jié)合核酸的新型固相材料。該固相材料可以是顆粒、微粒、纖維、珠、膜和其它支持物的形式，例如試管和微孔。新型材料的一個(gè)限定性特征是存在可裂解的連接體部分。該材料進(jìn)一步包括允許捕捉和緊密結(jié)合不同長度的核酸分子的核酸結(jié)合基團(tuán)。固相材料與切斷可裂解連接體的試劑的反應(yīng)使得結(jié)合的核酸從固相釋放?？煽氐蒯尫沤Y(jié)合的核酸分子的新方法形成本發(fā)明的又一部份，如同用于從該固相材料釋放或洗脫結(jié)合的核酸分子的試劑組合物構(gòu)成本發(fā)明的一部分一樣。
定義 烷基——含有1-20個(gè)碳原子的支鏈、直鏈或環(huán)狀烴基團(tuán)，其可以用除了H以外的1個(gè)或多個(gè)取代基取代。本文中所使用的低級(jí)烷基是指那些含有高達(dá)8個(gè)碳的烷基基團(tuán)。
芳烷基——用芳基取代的烷基基團(tuán)。
芳基——含有1至5個(gè)碳環(huán)芳香環(huán)的含芳香環(huán)的基團(tuán)，其可以用除了H以外的1個(gè)或多個(gè)取代基取代。
磁性顆?！w粒、微?；蛑?，其對(duì)外部的磁場(chǎng)有響應(yīng)。該顆粒本身可以是磁性的、順磁性的或超順磁性的。如當(dāng)使用鐵磁材料時(shí)，其可以被吸引到外部磁體或施用的磁場(chǎng)。顆?？梢跃哂泄腆w芯部分，該固體芯部分是磁響應(yīng)性的，并且被一層或多層非磁響應(yīng)性層包圍。可選地，磁響應(yīng)性部分可以是周圍的層或者可以是分散在非磁響應(yīng)性核芯內(nèi)的顆粒。
寡聚物、寡核苷酸——如本文所使用的，將是指含有磷酸二酯核苷酸間鍵和5′-端單磷酸酯基團(tuán)的化合物。核苷酸可以是正常發(fā)生的核糖核苷酸A、C、G和U或脫氧核糖核苷酸dA、dC、dG和dT。
多核苷酸——多核苷酸可以是DNA、RNA或合成的DNA類似物例如PNA。任何這三種類型的鏈組成的雙鏈雜合子也可以在本術(shù)語的范圍內(nèi)。
引物——指用于定向連接位位點(diǎn)并且為起始連接過程所必需的寡核苷酸。引物的長度足以穩(wěn)定地與模板雜交，并且代表模板中的獨(dú)特序列。引物的長度通常為約15-30個(gè)堿基。含有可檢測(cè)標(biāo)記或允許固相捕獲的標(biāo)記的標(biāo)記的引物在如本文中所使用的術(shù)語的范圍內(nèi)。
模板、試驗(yàn)多核苷酸以及靶被互換使用并且是指其長度將被復(fù)制的核酸。
樣品——含有或疑似含有核酸的流體?？梢杂迷诒景l(fā)明的方法中的典型的樣品包括體液，例如血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細(xì)胞裂解液、組織提取液和類似物。其它類型的樣品包括溶劑、海水、工業(yè)水樣、食物樣品和環(huán)境樣品例如土壤或水、植物材料、原核生物、真核生物來源的細(xì)胞、細(xì)菌、質(zhì)粒和病毒。
固相材料——具有可以將核酸分子吸引至其上的表面的材料。材料可以是微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式。
取代的——是指用非氫原子置換基團(tuán)上的至少一個(gè)氫原子。應(yīng)該注意到的是，關(guān)于取代的基團(tuán)，其意圖是可以存在多點(diǎn)取代，除非明確另外指出。
申請(qǐng)人:已經(jīng)開發(fā)出固相材料，其結(jié)合核酸并具有可以被裂解以釋放結(jié)合的核酸的可裂解連接體部分。該材料可以是微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式，它們具有足夠的表面積以允許進(jìn)行有效結(jié)合。微粒形式的本發(fā)明的固相材料可以進(jìn)一步包括磁芯部分。通常，顆粒以及磁響應(yīng)性微粒在本發(fā)明中是優(yōu)選的。
本發(fā)明的固相核酸結(jié)合材料包括限定其大小、形狀、孔隙率和機(jī)械性能的基質(zhì)，和共價(jià)連接的核酸結(jié)合基團(tuán)。三種最常用類型的基質(zhì)是二氧化硅或玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖。固相可以進(jìn)一步包括磁響應(yīng)性部分。
聚合物是一種或多種烯鍵式不飽和單體單元的均聚物或共聚物，并且可以是交聯(lián)的或非交聯(lián)的。優(yōu)選的聚合物是聚烯烴包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。后者包括多種取代的丙烯酸、酰胺和酯的聚合物，其中丙烯酸單體在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。
包含在本發(fā)明的固相結(jié)合材料中的核酸結(jié)合基團(tuán)吸引并結(jié)合具有各種長度和堿基組成或堿基順序的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。核酸結(jié)合基團(tuán)包括羧基、胺和三元或四元基。胺基團(tuán)可以是NH2、烷基胺以及二烷基胺基團(tuán)。三元或四元基包括三烷基季銨基團(tuán)(-QR3+)，磷基(-QR3+)包括三烷基磷或三芳基磷或混合的烷基芳基磷基、以及三元锍基(ternary sulfonium)(-QR2+)。固相可以含有一種以上類型的核酸結(jié)合基團(tuán)，如本文中所述。含有其中R基團(tuán)是具有至少4個(gè)碳的烷基的三元或四元基-QR2+或-QR3+的固相材料在結(jié)合核酸中特別有效，但少如1個(gè)碳的烷基基團(tuán)也如芳基那樣有用。此類固相材料以高的韌度保持結(jié)合的核酸，并在現(xiàn)有技術(shù)中已知用于洗脫的大多數(shù)條件下抵抗核酸的除去和洗脫。已知的高和低離子強(qiáng)度的洗脫條件對(duì)于除去結(jié)合的核酸是無效的。不同于含有DEAE和PEI基團(tuán)的傳統(tǒng)陰離子交換樹脂，三元或四元固相材料保持正電荷，無論反應(yīng)介質(zhì)的pH如何。
在本發(fā)明的一方面，提供了包括固體支持部分(solid support portion)的固相，所述固體支持部分包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶性多糖的基質(zhì)，在其表面上連接有核酸結(jié)合部分，用于吸引和結(jié)合核酸，所述核酸結(jié)合部分(nucleic acid binding portion，NAB)由可裂解的連接體部分連接到固體支持部分。
或 在一個(gè)實(shí)施方式中，NAB是其中Q為S原子的式QR2+X-的三元基或其中Q為N或P原子的式QR3+X-的四元基，R選自烷基、芳烷基和芳基而X為陰離子。當(dāng)Q是氮原子時(shí)，R基團(tuán)可以每一個(gè)都含有4-20個(gè)碳原子。當(dāng)Q是硫或磷原子時(shí)，R基團(tuán)可以具有1-20個(gè)碳原子。
或 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的固相來源于商業(yè)可得的聚苯乙烯型聚合物例如被稱為Merrifield樹脂(交聯(lián)的)的那些類型。在這些聚合物中，一定百分比的苯乙烯單元含有反應(yīng)性基團(tuán)，通常為氯甲基或羥甲基，作為共價(jià)連接的工具。通過與硫化物(R2S)或三元胺或膦反應(yīng)，置換一些氯，產(chǎn)生本發(fā)明的固相材料。當(dāng)所有的反應(yīng)性氯甲基基團(tuán)已經(jīng)被轉(zhuǎn)化成三元或四元基時(shí)，根據(jù)本定義制備的聚合物可以用下面的式(1)描繪。對(duì)于所有此類基團(tuán)，不必須都被轉(zhuǎn)化，使得本發(fā)明的聚合固相將經(jīng)常含有基和氯甲基基團(tuán)的混合物。
在上式中，m、n和o表示聚合物中每一單體單元的摩爾百分比，并可以取值為m從0.1％至100％、n從0至99％、以及o從0至10％。更優(yōu)選地，m從1％至20％、n從80至99％、以及o從0至10％。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的固相來源于商業(yè)可得的交聯(lián)的Merrifield樹脂，其一定百分比的苯乙烯單元含有反應(yīng)性氯乙?；蚵缺；?，用于共價(jià)連接。從這些起始聚合物制備的本發(fā)明的三元或四元聚合物具有下式 其中Q、R、X、m、n和o如上定義。
許多其它本領(lǐng)域已知的聚合樹脂可以被用作制備本發(fā)明的固相材料中的固體基質(zhì)。聚合樹脂可以從商業(yè)供應(yīng)商例如Advanced ChemTech(Louisville，KY)和NovaBiochem獲得。該樹脂通常基于具有反應(yīng)性官能團(tuán)的交聯(lián)的聚合顆粒。用在如Advanced ChemTech 2002 Catalog，pp.105-140中所述的固體支持的肽合成中的許多合適的聚合樹脂是合適的原材料。具有反應(yīng)性NH2、NH-NH2、OH、SH、CHO、COOH、CO2CH＝CH2、NCO、Cl、Br、SO2CH＝CH2、SO2Cl、SO2NH2、酰基咪唑、肟(C＝N-OH)、琥珀酰亞胺酯基團(tuán)的聚合物每一個(gè)都是商業(yè)可得的，用于制備本發(fā)明的聚合固相。如在下面的多個(gè)例子所示，提供將前體聚合樹脂共價(jià)接合到三元或四元基的方法有時(shí)是必需或期望的。這將通常包括選自亞烷基、亞芳基或亞芳烷基(aralkylene)基團(tuán)的1-20個(gè)原子的鏈或環(huán)基團(tuán)。該鏈或環(huán)還可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、酰胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黃原酸酯、脲、亞胺、肟、亞砜和硫酮形式的羰基基團(tuán)。
具有二氧化硅、玻璃或多糖支持物作為固體基質(zhì)的本發(fā)明的固相材料將通過二價(jià)基團(tuán)的共價(jià)連接來官能化，所述二價(jià)基團(tuán)將核酸結(jié)合基團(tuán)和可裂解連接體部分連接到固相基質(zhì)。該二價(jià)基團(tuán)通常為有機(jī)基團(tuán)，或者為低分子量基團(tuán)或者為聚合基團(tuán)。該二價(jià)基團(tuán)也可以是有機(jī)硅烷。對(duì)包被微粒表面有用的合適的硅烷包括對(duì)-氨丙基-三甲氧基硅烷、N-2-氨基-乙基-3-氨丙基甲氧基-硅烷、(H2NCH2NHCH2CH2NHCH2Si(OCH3)3、三乙氧基硅烷和三甲氧基硅烷。制備這些微粒的方法公開在美國專利第4,628,037、4,554,088、4,672,040、4,695,393和4,698,302號(hào)中，其教導(dǎo)被引入于此作為參考。具有共價(jià)結(jié)合的有機(jī)連接體基團(tuán)的二氧化硅顆粒材料是已知并商業(yè)可得的。描述了許多此類材料的一個(gè)來源是Silicycle(Quebec City，Canada)。通過亞烷基或其它連接體結(jié)合于多種反應(yīng)性官能團(tuán)的二氧化硅顆粒被描述于產(chǎn)品目錄中，該目錄致力于用于固相合成的硅基材料。所描述的代表性官能團(tuán)包括胺、碳二亞胺、碳酸酯、二氯三嗪、異氰酸酯、馬來酰亞胺、酐、羧酸、羧酸酯、硫醇、硫脲、硫氰酸酯、磺酰氯、磺酸以及磺酰肼基團(tuán)。這些物質(zhì)的任何一種可以用來提供用于三元或四元基的連接的固體基質(zhì)，如上所述。
如本文所使用，磁性微粒是可以被磁場(chǎng)吸引和操作的顆粒。用在本發(fā)明的方法中的磁性顆粒包括磁性金屬氧化物芯，其通常被吸附性結(jié)合或共價(jià)結(jié)合的層包圍，核酸結(jié)合層通過選擇的偶聯(lián)化學(xué)術(shù)被共價(jià)結(jié)合到所述層，從而用三元锍、季銨或四元磷官能團(tuán)包被微粒的表面。磁性金屬氧化物芯優(yōu)選是氧化鐵，其中鐵是Fe2+和Fe3+的混合物。無硅烷包被的上述含有氧化鐵芯的磁性微粒也可以被用于本發(fā)明的方法中。如美國4,654,267所述，磁性顆粒也可以通過在多孔聚合物存在下沉淀金屬顆粒以捕獲磁響應(yīng)性金屬顆粒而形成?？芍苽涞拇判越饘傺趸飶亩‵e3O4、MnFe2O4、NiFe2O4和CoFe2O4。其它磁性顆粒也可以如美國5,411,730所述通過在寡糖葡聚糖存在下沉淀金屬氧化物顆粒以捕獲磁響應(yīng)性金屬顆粒而形成。前述的美國專利5,091,206公開了另一種磁性顆粒。該顆粒包括用順磁性金屬氧化物顆粒層包被的聚合芯顆粒，以及另外的聚合層，以保護(hù)金屬氧化物層并提供反應(yīng)性包被層。含有氯甲基化的Merrifield樹脂的磁鐵礦(四氧化三鐵銹層，magnetite)的制備被描述于出版物(Tetrahedron Lett.，40(1999)，8137-8140)中。
商業(yè)可得的磁性二氧化硅或磁性聚合顆?？梢员挥米髦苽涓鶕?jù)本發(fā)明的可裂解磁性顆粒中的原材料。具有表面羧基基團(tuán)的聚合顆粒的合適類型已知為商品名SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences and Bangs Laboratories)。二氧化硅磁性顆粒的合適類型已知為商品名MagneSilTM(Promega)。二氧化硅磁性顆粒也可以從Chemicell GmbH(Berlin)獲得。
其它可裂解固體支持物 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了固相材料，所述固相材料包含選自二氧化硅或玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖的固相基質(zhì)，并具有用于將基連接到固相的可裂解連接體基團(tuán)。基具有其中Q為S原子的式QR2+X-，或者其中Q為N或P原子的式QR3+X-，R選自具有1-20個(gè)碳原子的烷基、芳烷基和芳基，X為陰離子。可裂解連接體起著兩個(gè)功能，1)物理連接基質(zhì)和三元或四元基，和2)提供斷裂固體支持基質(zhì)和吸引核酸的四元基之間的連接的方式，從而從該固相基質(zhì)釋放結(jié)合的核酸。該連接體可以是形成二價(jià)、三價(jià)或多價(jià)基團(tuán)的任何原子集合(grouping)，假如其包含可以被特定化學(xué)試劑、酶試劑或光化學(xué)反應(yīng)裂解的可裂解部分。該裂解劑或反應(yīng)必須在斷裂可裂解連接的過程期間足以保護(hù)核酸，以便核酸對(duì)于下游過程是有用的。
聚合物是一種或多種烯鍵式不飽和單體單元的均聚物或共聚物，并且可以是交聯(lián)的或非交聯(lián)的。優(yōu)選的聚合物是聚烯烴包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。后者包括多種取代的丙烯酸、酰胺和酯的聚合物，其中丙烯酸單體在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。
許多其它本領(lǐng)域已知的聚合樹脂可以被用作制備本發(fā)明的固相材料中的固體基質(zhì)。聚合樹脂可以從商業(yè)供應(yīng)商例如Advanced ChemTech(Louisville，KY)獲得。該樹脂通?；诰哂蟹磻?yīng)性官能團(tuán)的交聯(lián)的聚合顆粒。用在如AdvancedChemTech 2002 Catalog，pp.105-140中所述的固體支持的肽合成中的許多合適的聚合樹脂是合適的原材料。具有反應(yīng)性NH2、NH-NH2、OH、SH、CHO、COOH、CO2CH＝CH2、NCO、Cl、Br、SO2CH＝CH2、SO2Cl、SO2NH2、?；溥?、肟(C＝N-OH)、琥珀酰亞胺酯基團(tuán)的聚合物每一個(gè)都是商業(yè)可得的，用于制備本發(fā)明的聚合固相。
如在下面的多個(gè)例子中所示，提供將前體聚合樹脂共價(jià)結(jié)合到可裂解連接體部分或?qū)⒃摽闪呀膺B接部分結(jié)合到四元基的工具有時(shí)是必需或期望的。在這些情況下，連接體基團(tuán)也可以包括一個(gè)或多個(gè)連接部分。后者將通常包括選自亞烷基、亞芳基或亞芳烷基(aralkylene)基團(tuán)的、1-20個(gè)原子的鏈或環(huán)基團(tuán)。該鏈或環(huán)還可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、酰胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黃原酸酯、脲、亞胺、肟、亞砜和硫酮形式的羰基基團(tuán)。
可裂解連接體部分優(yōu)選選自直鏈、支鏈和環(huán)的有機(jī)基團(tuán)，并包括1至100個(gè)原子并更優(yōu)選1至約50個(gè)原子。該原子優(yōu)選選自C、H、B、N、O、S、Si、P、鹵素和堿金屬。示例性的連接體基團(tuán)是通過水解裂解的水解可裂解基團(tuán)。羧酸酯和羧酸酐、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸乙酯、二酰亞胺、磺酰胺和磺酰亞胺是代表性的，磺酸酯也是代表性。連接體基團(tuán)的另一個(gè)示例性類別是經(jīng)受還原性裂解的那些基團(tuán)。一個(gè)代表性基團(tuán)是含有二硫(S-S)鍵的有機(jī)基團(tuán)，所述二硫鍵通過硫醇例如乙硫醇、巰基乙醇和DTT被裂解。另一個(gè)代表性基團(tuán)是含有過氧化物(O-O)鍵的有機(jī)基團(tuán)。過氧化物鍵可以通過硫醇、胺和膦裂解。
盡管許多特定結(jié)構(gòu)圖為方便起見僅表示四元基，但應(yīng)當(dāng)理解，類似的四元锍基也同樣欲被表示。
示例性的光化學(xué)可裂解連接體基團(tuán)包括下式 的硝基取代的芳族醚和酯，其中Rd為H、烷基或苯基，并且更具體地 鄰硝基芐基酯根據(jù)熟知的反應(yīng)
通過紫外光被裂解。
示例性的可酶切連接體基團(tuán)包括通過酯酶和水解酶裂解的酯、通過蛋白酶和肽酶裂解的酰胺和肽、通過糖苷酶裂解的糖苷基。
具有包含可裂解的1，2-二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)部分的連接體基團(tuán)的固相材料也在發(fā)明的核酸結(jié)合材料的范圍之內(nèi)。此類材料包含可以由化學(xué)劑或酶試劑引發(fā)成片段的二氧雜環(huán)丁烷部分。除去保護(hù)基以產(chǎn)生氧陰離子，促進(jìn)二氧雜環(huán)丁烷環(huán)的分解。根據(jù)熟知的方法，通過裂解過氧化物的O-O鍵以及C-C鍵而發(fā)生斷裂。
可選地，連接的基可以被結(jié)合到芳基Ar，如在
或結(jié)合到可裂解的基團(tuán)Y，如在 進(jìn)一步可選地，與固相和三元或四元基的連接被顛倒。
在前述的從固相裂解三元或四元基的示例性反應(yīng)中，基團(tuán)A表示穩(wěn)定取代基。合適的基團(tuán)選自烷基、環(huán)烷基、聚環(huán)烷基、聚環(huán)烯基、芳基、芳氧基和烷氧基。Ar代表芳環(huán)基團(tuán)。優(yōu)選的芳環(huán)基團(tuán)是苯基和萘基。芳環(huán)可以包含另外的取代基，具體而言，是鹵素、烷氧基和胺基。Y基團(tuán)是通過化學(xué)劑或酶可去除的基團(tuán)或原子。合適的OY基團(tuán)包括OH、其中R3選自烷基和芳基基團(tuán)的OSiR33、羧基、磷酸鹽、硫酸鹽以及糖苷基。許多可引發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域中是熟知的并且已經(jīng)是大量專利的主題。公開于美國5,707,559中的螺金剛烷基(spiroadamantyl)-穩(wěn)定的二氧雜環(huán)丁烷是一個(gè)例子，如美國5,578,253中所公開的含有烷基或環(huán)烷基取代基的其它二氧雜環(huán)丁烷也是合適的。許多其它不同取代的二氧雜環(huán)丁烷被描述于專利文獻(xiàn)中；一旦被連接到固相以及核酸結(jié)合基團(tuán)，這些中的任何一個(gè)也將是適合的。另外的示例性可裂解二氧雜環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)在美國專利6,036,892、66,218,135、6,228,653、5,603,868、6,107,036、4,952,707、6,140,495、6,355,441和6,461,876中找到。
要求來自前述的螺金剛烷基、烷基或環(huán)烷基的連接取代基將二氧雜環(huán)丁烷連接體連接到固相或三元或四元基。具有連接基團(tuán)的二氧雜環(huán)丁烷被公開在美國5,770,743中，并作為用于將二氧雜環(huán)丁烷共價(jià)結(jié)合到固相和基的連接部分，舉例說明了可利用的鍵合化學(xué)類型。示例性的可裂解二氧雜環(huán)丁烷連接體和其裂解被如下描繪。
保護(hù)基Y的去除引發(fā)了二氧雜環(huán)丁烷環(huán)的碎裂，并從而分開固體基質(zhì)和基。在堿性反應(yīng)條件下，所得到的芳基酯經(jīng)受進(jìn)一步水解。
具有包含多電子的C-C雙鍵的連接體基團(tuán)的固相材料也在發(fā)明的核酸結(jié)合材料的范圍內(nèi)，所述多電子的C-C雙鍵可以轉(zhuǎn)化成不穩(wěn)定的1，2-二氧雜環(huán)丁烷部分。在該雙鍵上的至少一個(gè)取代基(A′)通過O、S或N原子被連接到雙鍵上。多電子雙鍵與單態(tài)氧的反應(yīng)產(chǎn)生不穩(wěn)定的1，2-二氧雜環(huán)丁烷基團(tuán)。該二氧雜環(huán)丁烷環(huán)在環(huán)境溫度下自發(fā)斷裂，如上所述，以產(chǎn)生兩個(gè)羰基片段。
具有可裂解連接體基團(tuán)的另一組固相材料具有乙烯酮二硫縮醛(ketenedithioacetal)作為可裂解部分，如在PCT公布WO 03/053934中所公開。乙烯酮二硫縮醛經(jīng)受通過與過氫化物酶和過氧化氫的酶氧化導(dǎo)致的氧化性裂解。
可裂解部分具有所示的結(jié)構(gòu)，包括在9，10-二氫化吖啶(acridan)環(huán)上具有取代基的類似物，其中Ra和Rb每一個(gè)都是有機(jī)基團(tuán)，該有機(jī)基團(tuán)除了滿足基團(tuán)中原子的化合價(jià)所需的必要數(shù)目的H原子之外含有1至約50個(gè)非氫原子，并且其中Ra和Rb可以被接合在一起而形成環(huán)?；鶊F(tuán)Ra和Rb可以包含1至約50個(gè)選自C、N、O、S、P、Si和鹵素原子的非氫原子。Rc是有機(jī)基團(tuán)，除了滿足基團(tuán)中原子的化合價(jià)所需的必要數(shù)目的H原子之外，含有1至50個(gè)選自C、N、O、S、P、Si和鹵素原子的非氫原子。更優(yōu)選地，Rc含有1至20個(gè)非氫原子。有機(jī)基團(tuán)Rc優(yōu)選選自烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基和取代的芳烷基。Rc更優(yōu)選的基團(tuán)包括取代的或未取代的C1-C4烷基基團(tuán)、取代或未取代的苯基或萘基、以及取代或未取代的芐基基團(tuán)。當(dāng)被取代時(shí)，示例性的取代基包括而不限于烷氧基、芳氧基、羥基、鹵素、氨基、取代的氨基、羧基、烷氧羰基、羰酰胺(carboxamide)、氰基、磺酸酯和磷酸酯基團(tuán)。一個(gè)優(yōu)選的Rc基團(tuán)為用至少一個(gè)賦予水溶性的基團(tuán)取代的烷基或雜烷基基團(tuán)。
具有乙烯酮二硫縮醛可裂解連接體基團(tuán)的固相材料具有下式中的任何一個(gè) 或 以及類似的結(jié)構(gòu)，其中固體基質(zhì)和基結(jié)合到可裂解連接體部分的次序被從示出的次序顛倒過來。
具有可裂解連接體基團(tuán)的另一組固相材料具有亞烷基作為可裂解部分，所述亞烷基具有至少一個(gè)結(jié)合到三烷基或三芳基磷基的碳原子。
這組的材料通過與酮或醛的Wittig反應(yīng)是可裂解的。在有機(jī)溶劑中季磷化合物(季化合物)與強(qiáng)堿的反應(yīng)使結(jié)合到磷的碳原子脫質(zhì)子化，產(chǎn)生磷葉立德(phosphorus ylide)。該葉立德與含羰基化合物例如酮或醛的反應(yīng)形成雙鍵和氧化膦。在該過程中磷基和固相之間的連接斷裂。優(yōu)選地，將固相結(jié)合到磷原子的碳原子(α碳)以這樣的方式被取代任何結(jié)合的質(zhì)子比磷原子上的R基團(tuán)上的任何質(zhì)子更具有酸性。然后，葉立德形成和鏈碎裂被指引至正確的部位。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在經(jīng)歷葉立德形成的碳原子上的其它取代基中的一個(gè)是苯基或取代的苯基。當(dāng)季磷基為三芳基磷基例如三苯基磷基時(shí)，對(duì)α質(zhì)子增強(qiáng)的酸度的要求不再重要(moot)。
本發(fā)明進(jìn)一步的方面包括使用可裂解固相結(jié)合材料分離和純化核酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了從樣品分離核酸的方法，包括a)提供固相，所述固相包括包含基質(zhì)的固體支持部分，所述基質(zhì)選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，用于吸引和結(jié)合核酸的核酸結(jié)合部分，和可裂解連接體部分；b)混合固相和含有核酸的樣品，以將核酸結(jié)合到固相上；c)從所述固相分離所述樣品；d)裂解所述可裂解連接體；和e)從固相釋放所述核酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸結(jié)合部分是連接于基質(zhì)表面的式QR2+X-或QR3+X-的四元基，其中四元基選自三元锍基、季銨和磷基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，而X是陰離子。
從固相分離樣品的步驟可以通過下列方法完成，例如過濾、重力沉降、傾析、磁力分離、離心、真空吸氣、當(dāng)例如使液體通過多孔膜或過濾氈片(filter mat)時(shí)過壓空氣或其它氣體。該樣品中除了核酸之外的組分在該步驟被除去。就其它組分的除去不完全而言，可以進(jìn)行另外的洗滌，以幫助它們完全被去除。
裂解可裂解連接體的步驟，包括用裂解劑處理在其上結(jié)合有核酸的固相一段時(shí)間，該時(shí)間足以斷裂可裂解連接體部分中的共價(jià)鍵但不破壞核酸。裂解劑的選擇由可裂解連接體的性質(zhì)決定。當(dāng)可裂解連接體是水解可裂解的基團(tuán)時(shí)，裂解劑是水或低級(jí)醇或它們的混合物。裂解劑優(yōu)選包含當(dāng)加入到水中提高pH的堿。優(yōu)選的堿選自氫氧化物鹽和醇鹽或者包含無機(jī)酸或過氧化氫。示例性的堿包括LiOH、NaOH、KOH、NH4OH、NaOCH3、KOCH3和KOt-Bu。當(dāng)可裂解連接體是還原性可裂解基團(tuán)例如二硫化物或過氧化物基團(tuán)時(shí)，裂解劑是選自硫醇、胺和膦的還原劑。示例性的還原劑包括乙硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、三烷基胺和三苯基膦。光化學(xué)可裂解連接體基團(tuán)要求使用光作為裂解劑，典型為紫外區(qū)或可見區(qū)的光。如上所述的酶促可裂解連接體基團(tuán)通過選自酯酶、水解酶、蛋白酶、肽酶、過氧化物酶和糖苷酶的酶裂解。
當(dāng)可裂解連接體基團(tuán)是可引發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷時(shí)，裂解劑起作用，以裂解如上所解釋的引發(fā)OY基團(tuán)中的O-Y鍵。裂解O-Y鍵使二氧雜環(huán)丁烷環(huán)基團(tuán)不穩(wěn)定，并通過C-C和O-O鍵的斷裂導(dǎo)致二氧雜環(huán)丁烷碎裂成兩部分。當(dāng)OY基團(tuán)是OH時(shí)，裂解劑是有機(jī)或無機(jī)堿。當(dāng)OY基團(tuán)是OSiR33時(shí)——其中R3選自烷基或芳基，裂解劑是氟化物離子。當(dāng)OY基團(tuán)被結(jié)合到羰基基團(tuán)上時(shí)，如酯中的羰基，裂解劑是酯酶或者是水解該酯的化學(xué)水解劑。此類化學(xué)水解劑選自水或低級(jí)醇或它們的混合物。裂解劑優(yōu)選包含選自氫氧化物鹽和醇鹽的堿，或者包含無機(jī)酸或過氧化氫。當(dāng)OY基團(tuán)是磷酸鹽時(shí)，裂解劑是磷酸酯酶。當(dāng)OY基團(tuán)是硫酸鹽時(shí)，裂解劑是硫酸酯酶。當(dāng)OY基團(tuán)是糖苷基例如糖苷或半乳糖苷的部分時(shí)，裂解劑是相應(yīng)的糖苷酶。
當(dāng)可裂解連接體是用至少一個(gè)O、S或N原子取代的多電子C-C雙鍵時(shí)，裂解劑是單態(tài)氧。該雙鍵基團(tuán)與單態(tài)氧的反應(yīng)產(chǎn)生不穩(wěn)定的1，2-二氧雜環(huán)丁烷基團(tuán)，其在環(huán)境溫度或以上溫度下自發(fā)碎裂。根據(jù)單態(tài)氧化領(lǐng)域中已知的方法，單態(tài)氧可以通過染料增感作用或通過熱分解亞磷酸三苯酯臭氧化物或蒽內(nèi)過氧化物(anthracene endoperoxide)而產(chǎn)生。
當(dāng)可裂解連接體是如上所述的乙烯酮二硫縮醛時(shí)，裂解劑是過氧化物酶和過氧化氫。
當(dāng)可裂解連接體是至少一個(gè)碳原子結(jié)合到三烷基或三芳基磷基的亞烷基基團(tuán)時(shí)，通過與酮或醛的Wittig反應(yīng)進(jìn)行裂解。Wittig反應(yīng)是熟知的反應(yīng)，通過該反應(yīng)，在有機(jī)溶劑中用強(qiáng)堿對(duì)季化合物脫質(zhì)子化而產(chǎn)生磷葉立德。該葉立德與羰基化合物例如酮或醛的反應(yīng)形成雙鍵和氧化膦。在磷基和α碳之間的連接如下所示被斷裂。優(yōu)選地，α碳用基團(tuán)取代，該基團(tuán)使得結(jié)合的質(zhì)子比磷原子上的R基團(tuán)上的任何質(zhì)子都更具有酸性。然后，葉立德形成和C-P鍵碎裂被指引至正確的部位。α碳上優(yōu)選的取代基是苯基或取代的苯基、亞烷基、炔基或羰基。當(dāng)季磷基為三芳基磷基例如三苯基磷基時(shí)，對(duì)α質(zhì)子增強(qiáng)的酸度的要求不再重要。
優(yōu)選的形成葉立德的堿是醇鹽和氫化物鹽，尤其是堿金屬鹽。優(yōu)選的用于與葉立德反應(yīng)的羰基化合物是脂族和芳族醛和脂族和芳族酮。更優(yōu)選地，羰基化合物不具有降低反應(yīng)速率的大基團(tuán)。丙酮是最優(yōu)選的。優(yōu)選的溶劑是非質(zhì)子有機(jī)溶劑，其可以溶解反應(yīng)物而不消耗堿，包括THF、二乙醚、對(duì)二烷、DMF和DMSO。
裂解后從固相釋放核酸的步驟包括，用溶解和充分保護(hù)釋放的核酸的溶液洗脫。該溶液可以是試劑組合物，其包括含水緩沖液，具有7-9的pH、0.1-3M金屬鹵化物或醋酸鹽以及1-50％的親水有機(jī)助溶劑。更優(yōu)選地，該親水有機(jī)溶劑占約1-20％。金屬鹵化物鹽包括堿金屬鹽、堿土金屬鹽。優(yōu)選的鹽是乙酸鈉、NaCl、KCl和MgCl2。親水有機(jī)助溶劑是水溶性有機(jī)溶劑，并包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和對(duì)二烷。釋放捕獲的核酸的步驟可以是在裂解步驟之后或者與其同時(shí)發(fā)生。在后一種情況中，裂解劑也可以作為洗脫溶液起作用。
用于裂解后從固相釋放核酸的試劑可以可選地是強(qiáng)堿水溶液。濃度為至少10-4M的堿金屬氫氧化物或氫氧化鋁的溶液對(duì)于從裂解的固相洗脫核酸是有效的。
用于裂解后從固相釋放核酸的試劑可以可選地是純水或pH在約8至10之間的堿性緩沖液。此類堿性緩沖液的使用可以在可達(dá)100℃的溫度下進(jìn)行，以提高裂解的速率。中度堿性pH的緩沖液是有用的，尤其是當(dāng)核酸是RNA時(shí)。在非常高的pH，尤其在高溫下，RNA的延長的接觸導(dǎo)致其降解。
裂解反應(yīng)和釋放(洗脫)步驟每一個(gè)都可以在室溫下進(jìn)行，但水的凝固點(diǎn)以上和水的沸點(diǎn)以下的任何溫度都可以被使用。洗脫溫度對(duì)于本分離核酸的方法的成功似乎并不是關(guān)鍵的。優(yōu)選環(huán)境溫度，但水的凝固點(diǎn)以上和水的沸點(diǎn)以下的任何溫度都可以被使用。在一些情況下，升高的溫度可以增加洗脫速率。釋放或洗脫步驟可以進(jìn)行一次，或者如果必要的話可以被重復(fù)1次或多次，以提高所釋放核酸的量。
通過使用單獨(dú)且不同的溶液來完成每一步驟，裂解反應(yīng)和洗脫步驟可以作為連續(xù)的步驟實(shí)施?？蛇x地，裂解和洗脫步驟可以在同一步驟中一起進(jìn)行。當(dāng)裂解反應(yīng)條件采用了與洗脫的核酸的下游用途相容的試劑時(shí)，后者——同時(shí)發(fā)生的方法是優(yōu)選的。例子是使用中度堿性的反應(yīng)緩沖液以及甚至更強(qiáng)的氫氧化鈉堿性溶液的裂解反應(yīng)。前者——連續(xù)的方法在這樣的情況下可以是期望的其中裂解反應(yīng)的試劑或溶劑的存在與核酸是不相容或是不期望的。該情況的例子是Wittig釋放化學(xué)術(shù)。當(dāng)裂解反應(yīng)條件基本上不釋放DNA到溶液中時(shí)，使用單獨(dú)的裂解和洗脫溶液是可能的。
該方法可以進(jìn)一步包括這樣的步驟用洗滌液洗滌具有結(jié)合到其上的、捕獲的核酸的固相，以從固相中除去樣品的其它組分。這些不期望的物質(zhì)包括酶、其它類型的蛋白質(zhì)、多糖、較低分子量的物質(zhì)例如脂和酶抑制劑。通過上述的方法捕獲在本發(fā)明的固相上的核酸，可以以捕獲的形式用在雜交反應(yīng)中，以雜交到標(biāo)記或未標(biāo)記的互補(bǔ)核酸。雜交反應(yīng)在診斷測(cè)試中是有用的，用于檢測(cè)捕獲的核酸的存在或數(shù)量。雜交反應(yīng)在固相核酸擴(kuò)增過程中也是有用的。
對(duì)于結(jié)合和儲(chǔ)存結(jié)合的核酸，固相核酸結(jié)合載體也是有用的。因此，提供了從樣品捕獲核酸的方法，包括從樣品分離核酸的方法，包括a)提供固相，該固相包括包括基質(zhì)的固體支持部分，所述基質(zhì)選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖，用于吸引和結(jié)合核酸的核酸結(jié)合部分，和可裂解連接體部分；和b)混合所述固相和含有所述核酸的樣品，以將所述核酸結(jié)合至固相上。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸結(jié)合部分或者是式QR2+X-的三元基——其中Q為S且R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，或者是連接于基質(zhì)表面上的式QR3+X-的季基，其中所述季基選自其中R選自C4-C20烷基、芳烷基和芳基的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季磷基，并且其中X是陰離子。
無裂解釋放 已發(fā)現(xiàn)，結(jié)合至本發(fā)明的固體支持物上的核酸可以被制備，以通過與某些試劑組合物接觸而釋放所述核酸，其中，所述固體支持物具有作為可裂解連接體的亞烷基，所述亞烷基的至少一個(gè)碳原子或者結(jié)合到三烷基或三芳基磷基(即，借助這些固體支持物，通過與酮或醛的Wittig反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)裂解)，或者結(jié)合到三烷基銨基團(tuán)。由于通過與現(xiàn)有技術(shù)中已知的、用于洗脫結(jié)合的核酸的許多其它試劑和組合物接觸，并未從這些固相結(jié)合材料除去結(jié)合的核酸，該結(jié)果是意料之外的。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，然后，提供了從樣品分離核酸的方法，包括a)提供固相，該固相包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基質(zhì)，和結(jié)合至所述基質(zhì)表面上的基，所述基選自其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2+X-的三元锍基，其中R選自C4-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3+X-的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季基PR3+X-，并且其中X是陰離子；b)混合所述固相和含有所述核酸的樣品，以將所述核酸結(jié)合到所述固相上；c)從所述固相分離所述樣品；和d)通過接觸所述固相和試劑組合物從所述固相釋放所述核酸，所述試劑組合物包括水溶液，具有7-9的pH、0.1-3M金屬鹵化物鹽或醋酸鹽以及1-50％的親水性有機(jī)助溶劑。
從固相分離樣品的步驟可以通過下列方法完成例如過濾、重力沉降、傾析、磁力分離、離心、真空吸氣、對(duì)空氣或其它氣體過壓處理以使液體通過多孔膜或過濾氈片。該樣品中除了核酸之外的組分在該步驟被除去。如果其它組分的除去是不完全的，可以進(jìn)行另外的洗滌，以幫助它們的完全去除。
通過用試劑組合物洗脫，從固體支持物釋放出結(jié)合至固體支持物的、捕獲的核酸。該試劑組合物包括水溶液，具有7-9的pH、0.1-3M金屬鹵化物鹽或醋酸鹽以及1-50％的親水性有機(jī)助溶劑。更優(yōu)選地，該親水性有機(jī)溶劑占約1-20％。金屬鹵化物鹽包括堿金屬鹽和堿土金屬鹽。優(yōu)選的鹽是乙酸鈉、NaCl、KCl和MgCl2。親水性有機(jī)助溶劑包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和對(duì)二烷。
洗脫組合物有利地允許在隨后的下游過程中直接使用洗脫的核酸，而不需要在使用前蒸發(fā)溶劑或沉淀核酸。
通過用現(xiàn)有技術(shù)中已知的許多試劑和組合物進(jìn)行洗滌以洗脫結(jié)合的核酸，令人驚奇地，結(jié)合的核酸并未從上面本發(fā)明的固相結(jié)合材料除去。固相材料對(duì)其有抗性的洗脫液包括下面的列表。該列表包括高pH、高離子強(qiáng)度和低離子強(qiáng)度條件。
去離子水H2O1M磷酸鹽緩沖液，pH 6.70.1％十二烷基硫酸鈉0.1％十二烷基磷酸鈉3M乙酸鉀，pH 5.5TE(三羥甲基氨基甲烷(Tris)EDTA)緩沖液50mM Tris，pH 8.5+1.25M NaCl
0.3M NaOH+1M NaCl1M NaOH或1M NaOH+1M H2O2 當(dāng)使用如上所述的試劑組合物洗脫核酸時(shí)，洗脫溫度對(duì)于本分離核酸的方法的成功似乎不是關(guān)鍵的。優(yōu)選環(huán)境溫度，但水的凝固點(diǎn)以上和水的沸點(diǎn)以下的任何溫度都可以使用。在一些情況下，升高的溫度可以增加洗脫的速率。
在本發(fā)明的另一方面，提供了從固相材料釋放或洗脫結(jié)合的核酸分子的新的試劑組合物。本發(fā)明的組合物包括水溶液，具有7-9的pH、0.1-3M金屬鹵化物鹽或醋酸鹽以及1-50％的親水性有機(jī)助溶劑。更優(yōu)選地，有機(jī)溶劑占約1-20％。親水性有機(jī)助溶劑包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和對(duì)二烷。
這些試劑組合物的重要優(yōu)勢(shì)是它們與許多下游的分子生物學(xué)過程相容。在很多情況下，洗脫入如上所述的試劑組合物的核酸可以在進(jìn)一步的過程中被直接使用。擴(kuò)增反應(yīng)例如PCR、美國專利5,998,175中描述的多寡聚體連接(Ligation of Multiple Oligomers，LMO)、以及LCR可以采用此類核酸洗脫液。通過常規(guī)技術(shù)、尤其是從細(xì)菌培養(yǎng)物或從血樣中分離的核酸，采用沉淀步驟。加入高體積百分比的低分子量醇，以從水溶液中沉淀核酸。然后，在使用前，沉淀的物質(zhì)必須被分離、收集并重溶于合適的介質(zhì)中。通過使用上述的試劑組合物，從本發(fā)明的固相結(jié)合材料洗脫核酸，這些步驟可以被免除。
樣品——通過本發(fā)明的方法可以從其中分離核酸——包括含有一種或更多的核酸以及任選地含有其它物質(zhì)的水溶液。代表性的例子包括核酸、擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物以及測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物的水溶液。從細(xì)菌培養(yǎng)物、體液、血液和血液組分、組織提取物、植物材料以及環(huán)境樣品得到的材料在使用前同樣地被置于含水的溶液——優(yōu)選緩沖的溶液中。
固相核酸捕獲的方法可以被用于許多用途。如下面的具體例子所示，可以捕獲和釋放單鏈和雙鏈核酸?？梢圆东@和釋放DNA、RNA和PNA。第一用途是從細(xì)菌培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA被用作克隆載體，以將含有具體基因或基因片段的重組DNA片段導(dǎo)入宿主，用于克隆。
第二用途是純化PCR或其它擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。這些反應(yīng)可以是在交替的高溫和低溫之間進(jìn)行熱循環(huán)，例如LMO或PCR，或者它們可以在單一的溫度下進(jìn)行，例如核酸序列基擴(kuò)增法(nucleic acid sequence-based amplication，NASBA)。所述反應(yīng)可以使用各種擴(kuò)增試劑和酶，包括DNA連接酶、RNA聚合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶?？梢允褂帽景l(fā)明的方法純化的多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物包括多寡聚體連接(LMO)、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、“支鏈”DNA擴(kuò)增(“branched chain”DNA amplication)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、QB復(fù)制酶擴(kuò)增(QBreplicase amplication，QBR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(ligation activated transcription，LAT)、核酸序列基擴(kuò)增(NASBA)、修復(fù)鏈反應(yīng)(repair chain reaction，RCR)、循環(huán)探針反應(yīng)(CRP)和滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。
第三用途是測(cè)序反應(yīng)凈化(sequencing reaction cleanup)。雙脫氧終止測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生多核苷酸序列梯度，所述序列梯度由用dNTPs和四種反應(yīng)混合物的每一種中的一種ddNTP的混合物延伸引物而產(chǎn)生。標(biāo)記每一種中的ddNTP，通常用不同的熒光染料標(biāo)記。反應(yīng)混合物包含過量的dNTPs和標(biāo)記的ddNTP、聚合酶和輔因子例如ATP。序列分析之前除去在后的物質(zhì)是有利的。
第四用途是從全血中分離DNA。用通常使用的技術(shù)從白細(xì)胞提取DNA。通常，處理血液，以選擇性溶解紅細(xì)胞，并且在沉淀或離心步驟之后，單獨(dú)溶解完整的白細(xì)胞以暴露核酸內(nèi)容物。消化蛋白質(zhì)，并且得到的DNA用固相分離，隨后用于序列多態(tài)性的測(cè)定、序列分析、RFLP分析、突變檢測(cè)或其它類型的診斷試驗(yàn)。
第五用途是從DNA和RNA的混合物中分離DNA。涉及強(qiáng)堿性洗脫條件的本發(fā)明的方法，尤其是使用高溫的那些方法，可以降解或破壞存在的RNA同時(shí)保持DNA的完整性。涉及強(qiáng)堿性裂解反應(yīng)的方法將類似地起作用。
另外的用途包括從其它樣品——土壤、植物、細(xì)菌和廢水中提取核酸物質(zhì)，以及為了存檔的目的對(duì)核酸材料進(jìn)行長期保存。
本發(fā)明的可裂解固體支持物的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是從支持物釋放的核酸被包含于溶液中，所述溶液與許多下游的分子生物學(xué)方法相容。在許多情況下，或者被洗脫到包含裂解劑的溶液——當(dāng)固相包含可裂解連接體時(shí)——中，或者被洗脫到上述的試劑組合物中的核酸，可以被直接用于進(jìn)一步的過程中。這些過程包括使用聚合酶和連接酶的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。典型的擴(kuò)增反應(yīng)是PCR、美國專利5,998,175中描述的多寡聚體連接(LMO)、以及LCR。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用含有釋放的核酸的溶液與酶促反應(yīng)或其它反應(yīng)相容，并基本上不干擾酶促反應(yīng)和其它反應(yīng)。其它的下游過程被如上描述，并包括核酸雜交試驗(yàn)、突變檢測(cè)和序列分析。
因此，本發(fā)明的又一方面包括使用可裂解固相結(jié)合材料分離和純化核酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了從樣品分離核酸的方法，包括a)提供固相，其包括包含基質(zhì)的固體支持部分，所述基質(zhì)選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，用于吸引和結(jié)合核酸的核酸結(jié)合部分，和可裂解連接體部分；b)混合所述固相和含有核酸的樣品，以將核酸結(jié)合到固相上；c)從所述固相分離所述樣品；d)裂解所述可裂解連接體；e)從所述固相釋放所述核酸，進(jìn)入溶液；和
f)進(jìn)一步包括在下游過程中直接使用含有所述釋放的核酸的溶液。
在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中直接使用含有所釋放的核酸的溶液是優(yōu)選的實(shí)踐，由此，使用聚合酶或連接酶介導(dǎo)的反應(yīng)，核酸或它們的片段的數(shù)量得以擴(kuò)增。
下面的實(shí)施例被呈現(xiàn)，目的在于更充分地描述本發(fā)明的各個(gè)方面，這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例 當(dāng)存在于下面的實(shí)施例中時(shí)，結(jié)構(gòu)圖旨在僅僅說明固相材料的可裂解部分。所述圖不代表固相材料的完整定義。
實(shí)施例1.含三丁基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞(argon pad)下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，攪拌Merrifield肽樹脂(Merrifield peptide resin)(Sigma，1.1meq/g，20.0g)，其為交聯(lián)的氯甲基化聚苯乙烯。加入過量的三丁基膦(48.1g，10當(dāng)量)，并在室溫下攪拌漿液7天。過濾該漿液，并用200mL CH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下干燥樹脂(21.5g)。元素分析觀察到的(Found)P 2.52％，Cl 3.08％；期望的(Expected)P2.79％，Cl 3.19％P/Cl比率為0.94。
實(shí)施例2.含三辛基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，攪拌Merrifield肽樹脂(Sigma，1.1meq/g，20.0g)。加入過量的三辛基膦(92.4g，10當(dāng)量)，并在室溫下攪拌漿液7天。過濾該漿液并用200mL CH2Cl2洗滌所得到的固體3次。在真空下干燥樹脂(21.3g)。元素分析觀察到的P 2.28％，Cl 2.77％；期望的P 2.77％，Cl2.42％P/Cl比率為0.94。
實(shí)施例3.含三甲基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在50mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入1.0M在THF中的三甲基膦(Aldrich，12mL)溶液，并在室溫下攪拌漿液7天。加入另外的100mL CH2Cl2和1.2mL在THF中的1.0M三甲基膦溶液，并攪拌該漿液3天。過濾該漿液，并用125mL CH2Cl2洗滌所得到的固體，隨后用375mL甲醇洗滌。在真空下干燥樹脂(5g)。在使用前將該樹脂研磨成細(xì)粉。
實(shí)施例4.含三苯基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成 在氬填塞下，在40mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入三苯基膦(Aldrich，3.2g)，并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并依次用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2洗滌所得到的固體。在真空下干燥樹脂(5.4g)。
實(shí)施例5.含三丁基銨基團(tuán)的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在150mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(Aldrich，1.43meq/g，25.1g)。加入過量的三丁基胺(25.6g，4當(dāng)量)，并在室溫下攪拌漿液8天。過濾該漿液，并用250mLCH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下干燥樹脂(28.9g)。元素分析觀察到的N 1.18％，Cl 3.40％；期望的N 1.58％，Cl 4.01％N/Cl比率為0.88。
實(shí)施例6.含2-(三丁基磷)乙酰基基團(tuán)的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，將氯乙?；郾揭蚁┲?Advanced Chemtech，3.0g，3.4meq/g)加入到50mL CH2Cl2中的三丁基膦(4.lg，2當(dāng)量)的溶液中。攪拌漿液1周。過濾該漿液，并依次用CH2Cl2(4×25mL)、MeOH(2×25mL)和丙酮(4×25mL)洗滌所得到的固體。然后，風(fēng)干該樹脂。
實(shí)施例7.具有含聚乙烯基苯基三丁基磷基團(tuán)的聚合物層的磁性顆粒的合成 在玻璃瓶中，將磁性Merrifield肽樹脂(Chemicell，SiMag Chloromethyl，100mg)加至2mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(80μL)，并在室溫下?lián)u動(dòng)漿液3天。在該瓶下放置磁體，并用移液管除去上清液。用2mL CH2Cl2洗滌固體4次(洗滌液也通過磁體/移液管步驟除去)。風(fēng)干該樹脂(93mg)。
實(shí)施例8-Br.含三丁基磷基團(tuán)和溴化物陰離子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
用35mL SOCl2回流聚甲基丙烯酸樹脂4小時(shí)，以形成?；取Ｔ跉逑?，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(4.8g)和三乙胺(11.1g)。加入3-溴丙醇(9.0g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用40mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風(fēng)干該樹脂(8.7g)。
在氬下，于100mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(8.5g)。加入三丁基膦(16.2g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。然后，風(fēng)干該樹脂(5.0g)。
實(shí)施例8-Cl.含三丁基磷基團(tuán)和氯化物陰離子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(12.2g)和三乙胺(23.2g)。加入3-氯丙醇(12.8g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風(fēng)干該樹脂(12.8g)。
在氬下，于100mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(12.8g)。加入三丁基膦(27.8g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用2×100mL CH2Cl2和2×100mLMeOH洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(9.8g)。
實(shí)施例8-S.含三丁基磷基團(tuán)和烷基硫酯(alkylthioester)鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于20mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(3.6g)和三乙胺(8.9g)。加入稀釋于20mL CH2Cl2的3-巰基-1-丙醇(5.8g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用CH2Cl2、水和甲醇洗滌該樹脂。風(fēng)干該樹脂(3.5g)。
在氬下，于100mL干燥的乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(4.3g)。加入四溴化碳(14.9g)和三苯基膦(11.8g)?；亓髟摶旌衔?小時(shí)。過濾該漿液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(4.2g)。
在氬下，于40mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(4.2g)。加入三丁基膦(6.7g)并攪拌該漿液8天。過濾該漿液，并用90mL CH2Cl2以及隨后用50mLMeOH洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(4.0g)。
實(shí)施例9.含三丁基磷基團(tuán)和酯鍵的聚乙烯基苯基聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于50mL乙腈中，攪拌聚苯乙烯丙烯酸羥甲酯樹脂(polystyrene hydroxymethyl acrylate resin)(5.0g)。在氬下攪拌三丁基膦(2.1g)和4.0M HCl(2.5mL)15分鐘。在1小時(shí)內(nèi)，以4等份將此溶液加入到該樹脂漿液中。除去冰水浴并在室溫下攪拌漿液3小時(shí)。過濾漿液，并用50mL乙腈隨后用2個(gè)50mL份的CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(6.24g)。
實(shí)施例10.含三丁基磷基團(tuán)和酯鍵的聚乙烯基苯基聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中攪拌羥甲基化聚苯乙烯(Aldrich，2.0meq/g，5.0g)和三乙胺(2.3g)。加入氯乙酰氯(1.9g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾漿液，并用40mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風(fēng)干該樹脂(5.8g)。
在氬下于100mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(5.8g)。加入三丁基膦(3.2g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂2次。然后，風(fēng)干該樹脂(5.9g)。
實(shí)施例11.含三丁基磷基團(tuán)和2個(gè)酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于50mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂和吡啶。加入四氟氫醌(2.7g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液43小時(shí)。過濾漿液，并依次用CH2Cl2、水、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。風(fēng)干該樹脂(1.3g)。
在氬下，在冰水浴中，于30mL CH2Cl2中攪拌該樹脂和三乙胺(662mg)。加入4-溴丁酰氯(1.12g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌該漿液2天。過濾該漿液，并依次用CH2Cl2、水、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。風(fēng)干該樹脂(1.3g)。
在氬下于18mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂。加入三丁基膦(4.7g)并攪拌該漿液10天。過濾該漿液并依次用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風(fēng)干該樹脂(1.3g)。
實(shí)施例12.含三丁基磷基團(tuán)和酯鍵的可光裂解的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴甲，于25mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酯氯樹脂(2.0g)和三乙胺(4.2g)。在100mL CH2Cl2中稀釋[4，5-雙(4-溴-1-丁氧基)-2-硝基苯基]-苯基甲醇(16.7g)并將其加入。除去冰水浴，并在室溫下過夜攪拌漿液。過濾漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂2次。風(fēng)干該樹脂(2.5g)。
在氬下于50mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(2.5g)。加入三丁基膦(4.0g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用50mL CH2Cl2洗滌該樹脂2次。然后，風(fēng)干該樹脂(2.4g)。
實(shí)施例13.含三丁基磷基團(tuán)和芳基硫酯(arylthioester)鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于25mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(2.7g)和三乙胺(8.6g)。加入稀釋于20mL CH2Cl2中的2-巰基芐醇(5.0g)，并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液2天。用50mL CH2Cl2稀釋漿液，并在6000rpm下離心10分鐘。丟棄上清。用100mL MeOH洗滌該樹脂3次(在6000rpm下離心每一洗滌液10分鐘)。在最后一次洗滌后，過濾該樹脂并風(fēng)干(4.2g)。
在氬下于100mL干乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(3.4g)。加入四溴化碳(10.2g)和三苯基膦(8.0g)?；亓髟摶旌衔?小時(shí)。過濾該漿液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風(fēng)干該樹脂(2.8g)。
在氬下于40mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(2.8g)。加入三丁基膦(4.0g)并攪拌漿液8天。過濾該漿液，并用50mL CH2Cl2隨后用125mL MeOH洗滌該樹脂。然后風(fēng)干該樹脂(2.7g)。
實(shí)施例14.含三甲基磷基團(tuán)和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巰基芐醇(9.3g)并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并用300mL CH2Cl2、500mL水和200mL MeOH洗滌該樹脂。風(fēng)干該樹脂(5.8g)。
在氬下于100mL干燥的乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)?；亓髟摶旌衔?小時(shí)。過濾該漿液，并用100mL乙腈、200mL CH2Cl2、200mL MeOH和200mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(4.8g)。
在氬下于30mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(1.04g)。加入于THF中的1.0M三甲基膦溶液(7.3mL)，并攪拌漿液10天。過濾該漿液，并用100mLCH2Cl2、100mL THF、50mL MeOH和100mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風(fēng)干該樹脂(1.10g)。
實(shí)施例15.含三辛基磷基團(tuán)和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巰基芐醇(9.3g)并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并用300mL CH2Cl2、500mL水和200mL MeOH洗滌該樹脂。風(fēng)干該樹脂(5.8g)。
在氬下于100mL干燥的乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)?；亓髟摶旌衔?小時(shí)。過濾該漿液，并用100mL乙腈、200mL CH2Cl2、200mL MeOH和200mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(4.8g)。
在氬下于30mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(1.68g)。加入三辛基膦(4.4g)并攪拌漿液10天。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2、100mL THF、50mLMeOH和100mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風(fēng)干該樹脂(1.67g)。
實(shí)施例16.用聚甲基丙烯酸酯連接體官能化的、并含有三丁基磷基團(tuán)和芳基硫酯鍵的磁性二氧化硅顆粒的合成 將磁性的羧酸官能化的二氧化硅顆粒(Chemicell，SiMag-TCL，1.0meq/g，0.6g)置于6mL亞硫酰氯中并回流3小時(shí)。減壓下除去過量的亞硫酰氯。在氬下，在冰水浴中，將樹脂重懸于40mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。加入2-巰基芐醇(0.7g)并除去冰水浴。在室溫下過夜搖動(dòng)該漿液。過濾該漿液，并用35mL MeOH以5000rpm離心樹脂10分鐘。棄上清液。橙黃色的樹脂被風(fēng)干(335mg)。
在氬下于45mL干燥的乙腈中重懸該樹脂(335mg)。加入四溴化碳(2.0g)和三苯基膦(1.6g)。回流混合物3小時(shí)。以5000rpm離心該樹脂10分鐘，并丟棄上清。用50mL乙腈以5000rpm離心該樹脂10分鐘，2次，并丟棄上清。然后，風(fēng)干該樹脂(328mg)。
在氬下于40mL CH2Cl2中重懸該樹脂(328mg)。加入三丁基膦(280mg)并搖動(dòng)漿液10天。通過在瓶的外部放置磁體沉降磁性樹脂，并傾析上清。用30mLCH2Cl2洗滌該樹脂3次，隨后用25mL MeOH洗滌3次。然后，風(fēng)干該樹脂(328mg)。
實(shí)施例17.含有三丁基磷基團(tuán)和芳基硫酯鍵的磁性聚合甲基丙烯酸酯顆粒的合成。
Sera-MagTM磁性羧酸酯微粒(Seradyn)被用于形成可裂解磁性顆粒。Sera-Mag顆粒包括聚苯乙烯-丙烯酸聚合物芯，其被用專用聚合物包封的磁鐵礦包覆層包圍。羧酸酯基團(tuán)在表面上是可及的。顆粒(0.52meq/g，0.50g)被懸浮于15mL水和25mL 0.1M MES緩沖液中(pH 4.0)。在加入126mg EDC(1-[3-二甲氨基]丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物)和110mg 2-巰基芐醇之前，對(duì)該反應(yīng)混合物超聲處理5分鐘。搖動(dòng)該反應(yīng)混合物7天。過濾該反應(yīng)混合物。用50mL水和100mLMeOH洗滌該樹脂。風(fēng)干該樹脂(0.53g)。
在氬下于20mL干燥的乙腈中重懸該樹脂(0.53g)。加入四溴化碳(174mg)和三苯基膦(138mg)。在65℃下超聲處理該混合物5小時(shí)。將反應(yīng)混合物置于大磁體上并傾析上清。用乙腈洗滌該樹脂4次，用磁體沉淀該樹脂，并丟棄洗滌液。將該樹脂重懸于MeOH中并搖動(dòng)過夜。用MeOH洗滌該樹脂4次，用磁體沉淀該樹脂，并丟棄洗滌液。然后，風(fēng)干該樹脂(0.52g)。
將該樹脂(0.52g)重懸于10mL乙腈中。加入三丁基膦(106mg)并搖動(dòng)該反應(yīng)7天。用磁體沉淀該磁性樹脂并傾析上清。用乙腈洗滌該樹脂4次并用MeOH洗滌4次。然后，風(fēng)干該樹脂(0.51g)。
實(shí)施例18.含三丁基磷基團(tuán)和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于30mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(0.6g)和三乙胺(1.5g)。加入稀釋于20mL CH2Cl2中的4-巰基芐醇(1.0g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液2天。過濾該漿液，并用50mL CH2Cl2、100mL水、50mLMeOH和25mL CH2Cl2洗滌該樹脂。風(fēng)干該樹脂(0.7g)。
在氬下于20mL干燥的乙腈中重懸該樹脂(0.6g)。加入四溴化碳(1.8g)和三苯基膦(1.4g)?；亓髟摶旌衔?小時(shí)。過濾該漿液，并用乙腈、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(0.6g)。
在氬下于15mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(0.6g)。加入三丁基膦(0.85g)并攪拌漿液6天。過濾該漿液，并用75mL CH2Cl2隨后用150mL MeOH洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(0.6g)。
實(shí)施例19.含三丁基磷基團(tuán)和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，于100mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(0.71g)和三乙胺(2.2g)。加入4-羥基苯基4-溴硫代丁酸酯(2.55g)并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并用CH2Cl2和己烷洗滌。風(fēng)干該樹脂(0.85g)。
在氬下于20mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(0.85g)。加入三丁基膦(2.7g)并攪拌漿液3天。過濾該漿液，并用CH2Cl2和己烷洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂。
實(shí)施例20.含三丁基磷基團(tuán)和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，于20mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(1.0g)和吡啶(1.9mL)。加入1，4-苯二硫醇(1.85g)并在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用CH2Cl2和己烷洗滌。風(fēng)干該樹脂(1.08g)。
在氬下于20mL CH2Cl2中攪拌該樹脂(1.08g)和三乙胺(3.0mL)。加入4-溴丁酰氯(1.8mL)并攪拌反應(yīng)混合物2天。過濾該漿液并用CH2Cl2洗滌。風(fēng)干該樹脂(1.10g)。
在氬下于30mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(1.10g)。加入三丁基膦(4.0g)并攪拌漿液5天。過濾該漿液并用CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(1.0g)。
實(shí)施例21.含三丁基磷基團(tuán)的交聯(lián)的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物的合成。
在30mL亞硫酰氯中回流TentaGel S COOH珠(Advanced Chemtech，3.0g)——交聯(lián)的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物90分鐘。在減壓下除去殘余的亞硫酰氯。該樹脂重懸于30mL氯仿中并再濃縮。
在氬下，在冰水浴中，于60mL CH2Cl2中攪拌該樹脂和三乙胺(0.14g)。加入2-巰基芐醇(0.11g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液2天。過濾該漿液，并用CH2Cl2、水、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。過濾并風(fēng)干該樹脂(2.9g)。
在氬下于60mL干燥的乙腈中重懸并攪拌該樹脂(2.8g)。加入四溴化碳(0.36g)和三苯基膦(0.29g)?；亓髟摶旌衔?小時(shí)。過濾該漿液，并用乙腈、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(2.8g)。
在氬下于50mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(2.7g)。加入三丁基膦(0.21g)并攪拌漿液6天。過濾該漿液，并用50mLCH2Cl2隨后用175mL MeOH洗滌該樹脂。然后，風(fēng)干該樹脂(2.8g)。
實(shí)施例22.含有琥珀酸酯連接的三丁基磷基團(tuán)和硫酯鍵的可控多孔玻璃珠的合成。
將Millipore LCAA玻璃(1.0g，38.5微摩爾/克)懸浮于10mL干燥的吡啶中。加入琥珀酸酐(40mg)并在室溫下?lián)u動(dòng)反應(yīng)混合物4天。用20mL MeOH稀釋該反應(yīng)混合物，并過濾該混合物。用20mL MeOH洗滌固體5次，并用20mLCH2Cl2洗滌5次。風(fēng)干該固體(1.0g)。
將該固體(0.50g)懸浮于10mL干燥的CH2Cl2中。加入二環(huán)己基碳二亞胺(10mg)和2-巰基芐醇，并在室溫下?lián)u動(dòng)反應(yīng)混合物6天。用CH2Cl2稀釋該反應(yīng)混合物并過濾該混合物。用MeOH洗滌固體3次并用CH2Cl2洗滌3次。風(fēng)干該固體(0.50g)。
在氬下于10mL干燥的乙腈中重懸該固體(400mg)。加入4-溴化碳(14mg)和三苯基膦(11mg)?；亓髟摶旌衔?小時(shí)。過濾該混合物，并用50mL MeOH洗滌固體5次，以及用50mL CH2Cl2洗滌5次。風(fēng)干該固體(360mg)。
在氬下于10mL CH2Cl2中重懸該固體(300mg)。加入三丁基膦(5滴)并搖動(dòng)反應(yīng)混合物5天。用CH2Cl2稀釋該反應(yīng)混合物并過濾。用50mL CH2Cl2洗滌該固體5次并風(fēng)干(300mg)。
實(shí)施例23.含吖啶酯(acridinium ester)基團(tuán)的聚乙烯基芐基聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于40mL CH2Cl2中攪拌吖啶9-羧酸氯化物(Acridine 9-carboxylic acid chloride)(1.25g)和三乙胺(1.3g)。加入羥基苯硫酚樹脂(Polymer Laboratories，1.67meq/g，3.0g)，并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用200mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風(fēng)干該樹脂(4.4g)。
在氬下于40mL CH2Cl2中攪拌該樹脂(4.3g)。加入三氟甲基磺酸甲酯(methyl triflate)(6.1g)并攪拌反應(yīng)混合物2天。過濾該漿液并用200mL CH2Cl2和1LMeOH洗滌該樹脂。真空干燥該樹脂(4.7g)。
實(shí)施例24.含9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛(acridan ketene dithioacetal)基團(tuán)的聚乙烯基芐基聚合物的合成。
在氬下，在-78℃下，于20mL無水THF中攪拌N-苯基9，10-二氫化吖啶(0.62g)。加入丁基鋰(2.5M，在己烷中，0.93mL)并于-78℃攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)。加入二硫化碳(0.16mL)并于-78℃攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)。將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。加入Merrifield’s肽樹脂(1.6meq/g，1.0g)并在室溫下過夜攪拌該混合物。過濾該混合物。用10mL丙酮洗滌樹脂5次，用10mL水洗滌3次以及用10mL丙酮洗滌2次。風(fēng)干該樹脂(1.21g)。
在氬下于20mL無水DMF中攪拌該樹脂(1.21g)和NaH(60％，在油中，0.003g)4小時(shí)。加入1，3-二溴丙烷(0.07mL)并攪拌混合物3天。過濾該混合物。用10mL丙酮洗滌樹脂3次，用10mL水洗滌5次以及用10mL丙酮洗滌5次。風(fēng)干該樹脂(1.22g)。
在氬下于20mL DMF中重懸并攪拌該樹脂(1.22g)。加入三丁基膦(1.18g)并攪拌漿液7天。過濾該漿液并用20mL CH2Cl2洗滌該樹脂4次以及用20mL丙酮洗滌4次。然后，風(fēng)干該樹脂(1.07g)。
實(shí)施例25.從可水解裂解顆粒結(jié)合并洗脫DNA的一般步驟 在管中用500μLTHF漂洗10mg珠樣品。離心內(nèi)容物并除去液體。用200μL水重復(fù)漂洗過程。將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并輕輕搖動(dòng)該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL含水NaOH于37℃溫育5分鐘洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于分析。
實(shí)施例26.熒光測(cè)定步驟 通過熒光測(cè)定，使用PicoGreen對(duì)DNA進(jìn)行染色而分析上清液和洗脫劑中DNA含量。簡要地，將10μL含有或疑似含有DNA的溶液等分試樣與190μL熒光DNA“染色”液溫育。熒光染色劑為在0.1M tris，pH 7.5，1mM EDTA中以1∶400稀釋的PicoGreen(Molecular Probes)。在溫育樣品至少15分鐘后，在微量板熒光分析儀(microplate fluorometer)(Fluoroskan，LabSystems)中測(cè)量熒光。濾片組為480nm和535nm。含有已知量的相同DNA的陽性對(duì)照以及陰性對(duì)照被同時(shí)進(jìn)行。
實(shí)施例27.從可裂解珠結(jié)合和釋放DNA 通過熒光測(cè)定，使用PicoGreen(Molecular Probes)對(duì)DNA進(jìn)行染色而分析上清液和洗脫劑中DNA含量。結(jié)果通過與用原始的2μgDNA溶液的等分試樣獲得的值相比較來表示。對(duì)結(jié)合步驟的洗滌液和上清液的分析確定了被珠捕獲的DNA的百分比。
實(shí)施例#的珠[NaOH](M)結(jié)合％釋放％11 0.005 36 3313 1 100 10014 1 36 10015 1 100 10018 1 100 7819 0.1100 10020 0.05 100 7921 1 100 7722 1 100 72實(shí)施例28.洗脫時(shí)間和溫度對(duì)于從可裂解顆粒洗脫DNA的效應(yīng) 根據(jù)實(shí)施例25的方案處理實(shí)施例13的珠。在室溫下或者37℃，將DNA結(jié)合珠與1M NaOH溫育1、5或10分鐘的時(shí)間期間，并通過熒光測(cè)定釋放的DNA分?jǐn)?shù)。
洗脫時(shí)間室溫37℃1分鐘 80％ 100％590 9010 90 120實(shí)施例29.使用離心柱從可裂解珠結(jié)合和釋放DNA 將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL離心柱(Costar)中的20mg珠。在溫育2分鐘后，離心該柱30秒并收集上清。用2×200μL水洗滌珠并丟棄洗滌液。通過下述步驟洗脫DNA用200μL 0.5M NaOH于37℃洗滌珠1分鐘、離心30秒并收集洗脫液，用于熒光和凝膠電泳分析。直接使用洗脫液而不需要沉淀DNA，通過PCR擴(kuò)增洗脫的DNA。
實(shí)施例30.從實(shí)施例13的可裂解珠結(jié)合并釋放的質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增 在0.5M NaOH中的前一實(shí)施例的洗脫的DNA(1μL)經(jīng)受用1對(duì)引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)生285bp的擴(kuò)增子。PCR反應(yīng)混合物含有下表中所列出的組分。
細(xì)分體積(μL)10×PCR緩沖液10引物18引物282.5mM dNTPs 850mM MgCl25Taq DNA聚合酶 0.5模板1或2去離子水59.5或58.5 陰性對(duì)照用1或2μL 0.5M NaOH或1μL水替換反應(yīng)混合物中的模板。進(jìn)一步的反應(yīng)使用1μL以1∶10稀釋于水中的模板。反應(yīng)混合物經(jīng)受22個(gè)循環(huán)94℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，1分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上跑膠。
圖3說明了從珠洗脫的DNA是完整的。
實(shí)施例31.用實(shí)施例13的三丁基磷珠結(jié)合不同長度的寡核苷酸并用1M NaOH釋放。
對(duì)從20個(gè)堿基至2.7kb的不同大小的寡核苷酸進(jìn)行實(shí)施例25的結(jié)合和釋放方案。用200μL 1M NaOH于37℃裂解該珠5分鐘。使用ssDNA的熒光染色劑——OliGreen熒光測(cè)定DNA的量。
寡核苷酸大小(nt)洗脫％2061306550 6468 48181 47424 52753 702.7kb51 在室溫下，使用30分鐘的珠反應(yīng)，重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)以裂解聚合物，產(chǎn)生了如下結(jié)果。
寡核苷酸大小(nt)洗脫％207330113509768109實(shí)施例32.從實(shí)施例16的磁性可裂解珠結(jié)合和釋放DNA 將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg可裂解磁珠，并輕輕搖動(dòng)該混合物20分鐘。磁分離該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠與2×200μL 0.5M NaOH于37℃溫育5分鐘來洗脫DNA。離心該混合物并移出洗滌液，用于熒光分析。所有的DNA都結(jié)合于該珠。第一洗脫液含有92％的結(jié)合DNA；第二洗脫液含有13％。
實(shí)施例33.從實(shí)施例17的磁性可裂解珠結(jié)合和釋放DNA 按照相同的步驟，實(shí)施例17的可裂解磁珠被用于結(jié)合和釋放2μg的線性化pUC18 DNA。對(duì)結(jié)合步驟中的上清液的分析揭示了DNA被完全結(jié)合。在從珠釋放后對(duì)洗脫液的分析表明完整的DNA被洗脫。
實(shí)施例34.實(shí)施例16的磁珠的結(jié)合容量 下表中列出的各種量的DNA被結(jié)合于實(shí)施例16的可裂解磁珠，并如上所述用0.5M NaOH洗脫。熒光測(cè)定上清液和洗脫液，以評(píng)價(jià)結(jié)合容量和釋放不同量的DNA的能力。
輸入DNA的量結(jié)合％洗脫％2 100 834 100 836 100 8410 100 9014 100 100實(shí)施例35.用較小的洗脫體積釋放結(jié)合于實(shí)施例13的可裂解珠上的DNA 將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL離心柱(Costar)中的10mg珠。在溫育5分鐘后，離心該柱1分鐘并收集上清。用2×200μL水洗滌珠并丟棄洗滌液。如下洗脫DNA 3次通過每次用40μL 0.5M NaOH于37℃洗滌珠5分鐘、離心30秒、并在每一次洗脫后收集洗脫液用于熒光和凝膠電泳分析。所有起始DNA都被結(jié)合。發(fā)現(xiàn)洗脫液分別含有65％、22％和9％。
實(shí)施例36.將大體積中的DNA結(jié)合至實(shí)施例16的可裂解磁珠上并用小洗脫體積釋放。
將2μg線性化pUC18 DNA在1mL、2mL或10mL水中的溶液加至10mg實(shí)施例16的可裂解磁珠，并如上所述用200μL 0.5M NaOH于37℃洗脫5分鐘。將來自1mL和2mL結(jié)合反應(yīng)的上清液濃縮至大約(ca.)100μL，用于分析。所有三個(gè)操作的洗脫液同樣被熒光測(cè)定。上清液不含DNA。所有洗脫液含有＞80％的起始DNA。
實(shí)施例37.用實(shí)施例13的聚合物珠公離細(xì)菌供養(yǎng)物的DNA 使大腸桿菌(E.coli)培養(yǎng)物過夜生長。在4℃下以6000×g離心50mL的部分15分鐘，以沉淀細(xì)胞。該沉淀被重懸于4mL 50mM tris，pH 8.0，10mMEDTA中，其含有100μg/mLRNaseA。然后，將4mL含有1％SDS的0.2M NaOH溶液加至該混合物，其被輕輕混合并在室溫下保持4分鐘。接下來，加入4mL冷卻至4℃、pH 5.5的3M KOAc，混合該溶液并使其保持10分鐘，以沉淀SDS。過濾出沉淀物并收集濾液。
混合以1∶10稀釋于水(200μL)中的裂解物和10mg實(shí)施例13的珠，并溫育20分鐘。純化的pUC18溶液——在細(xì)胞裂解液中為0.33μg/μL——也被制備，并結(jié)合于10mg相同的珠上。結(jié)合后，離心該珠并除去上清。用2×200μL水洗滌珠樣品，然后用200μL 5mM NaOH于37℃洗脫5分鐘。凝膠電泳顯示出質(zhì)粒DNA從裂解物回收，其與結(jié)合于磁珠并釋放的質(zhì)粒對(duì)照或在游離的溶液中的質(zhì)粒對(duì)照匹配。結(jié)果示于圖4中。
實(shí)施例38.用實(shí)施例19的聚合物珠公離細(xì)菌培養(yǎng)物的DNA 根據(jù)上述實(shí)施例37中的相同方案，使用實(shí)施例19的珠，分離前一實(shí)施例的細(xì)胞裂解物中的DNA。結(jié)果示于圖4中。
實(shí)施例39.從不同的pH溶液將DNA結(jié)合至實(shí)施例13的珠上，顯示出在寬范圍的pH內(nèi)的有效捕獲。
制備pH跨度為4.5至9.0的緩沖液。具有pH 4.5至6.5的緩沖液為10mM乙酸鹽緩沖液。具有pH 7.0至9.0的緩沖液為10mM tris乙酸鹽緩沖液。在室溫下，將2μg線性化pUC18 DNA在200μL每一緩沖液中的溶液加至10mg實(shí)施例13的可裂解珠30-45秒。在每一緩沖液中，平行運(yùn)行陰性對(duì)照溶液，其不含DNA。在將珠樣品離心后除去上清，并用UV和熒光分析。
緩沖液pH結(jié)合％ (通過UV)結(jié)合％(通過熒光)4.5 56735.0 64685.5 58646.0 61716.5 5774
7.0 49 617.5 44 608.0 45 558.5 37 399.0 31 33單獨(dú)地，發(fā)現(xiàn)在pH 8.0下使用20mg珠結(jié)合5分鐘導(dǎo)致100％的DNA捕獲。
實(shí)施例40.通過使用不同堿性溶液進(jìn)行水解，從可裂解珠釋放DNA 將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg實(shí)施例13、18、19和20的可裂解珠，并用200μL下面列出的不同濃度的NaOH溶液于37℃洗脫5分鐘。實(shí)施例13的珠也被用KOH和NH4OH溶液裂解。通過凝膠測(cè)定所有試驗(yàn)的洗脫液。所測(cè)試的所有水解條件都導(dǎo)致裂解和DNA的釋放。
堿 濃度(M)NaOH0.005`` 0.01`` 0.05`` 0.1`` 0.5`` 1.0KOH 0.5NH4OH 0.5`` 1.0實(shí)施例41.從實(shí)施例8-Br和8-S的可裂解珠結(jié)合和釋放DNA 在管中用500μL THF漂洗兩種珠中的每一種的25mg樣品。離心內(nèi)容物并除去液體。用500μL水重復(fù)該漂洗過程。將16μg線性化pUC18 DNA在500μL水中的溶液加至所述珠，并輕輕搖動(dòng)該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×500μL水漂洗所述珠并丟棄水。通過將所述珠與500μL 1M NaOH于37℃溫育16小時(shí)而洗脫DNA。離心該混合物并除去洗脫液，用于進(jìn)行熒光分析。上清不含有DNA，所有DNA都被結(jié)合。發(fā)現(xiàn)洗脫液含有18％(8-Br)和12％(8-S)。
實(shí)施例42.從實(shí)施例13的可裂解珠洗脫的DNA在LMO擴(kuò)增中的使用 將在200μL水中的、含有0.1或1μg pUC18 DNA的溶液加至先前用400μL THF洗滌、然后用水洗滌2次的10mg珠。在溫育30分鐘之后，離心樣品管30秒并收集上清。用2×400μL水洗滌所述珠并丟棄洗滌液。通過在室溫下用100μL 1M NaOH洗滌所述珠15分鐘、離心30秒并收集洗脫液而洗脫DNA。用40μL 1M乙酸中和每一洗脫液的80μL的部分。
如美國專利5,998,175所述，使用本發(fā)明的聚合珠分離的質(zhì)粒DNA通過LMO進(jìn)行擴(kuò)增，其直接使用洗脫液而未沉淀DNA。簡要地，通過熱循環(huán)方案，使用一對(duì)引物和一組跨越68個(gè)堿基區(qū)域的八聚體，擴(kuò)增68bp的區(qū)域。將一組12個(gè)八聚體-5′-磷酸鹽(每條鏈6個(gè))、引物和模板(1μL)溶解在Ampligase緩沖液中。用50μL礦物油覆蓋反應(yīng)管并加熱至94℃5分鐘。在約2分鐘之后，將100UAmpligase加入每一管中。樣品被循環(huán)35次94℃，30秒；55℃，30秒；35℃，30秒。擴(kuò)增反應(yīng)物的凝膠電泳揭示了具有期望分子量的條帶。
實(shí)施例43.使用實(shí)施例13的可裂解珠從全血分離人基因組DNA 通過標(biāo)準(zhǔn)方案制備的來自16個(gè)人血樣(1-3mL)的沉淀的白細(xì)胞被懸浮于100μL的裂解緩沖液中，該裂解緩沖液含有pH 8.0的0.2M tris、0.1M EDTA、1％SDS。將蛋白酶K(10μg)加入每一管并將管于55℃溫育4小時(shí)。將3M KOAc(100μL)加至每一管中并通過輕輕翻轉(zhuǎn)混合管。在13,000rpm下離心所述管。除去上清并用水以1∶2稀釋。在室溫下使溶液中的DNA結(jié)合至10mg珠20分鐘。在結(jié)合后，離心所述珠并除去上清。用2×200μL水洗滌所述珠樣品，然后用200μL5mM NaOH于37℃洗脫5分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分析每一洗脫液樣品。圖5顯示了高分子量DNA從所有樣品的回收。
實(shí)施例44.通過酶促反應(yīng)在實(shí)施例24的9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛聚合物上結(jié)合和釋放DNA。
在管中用500μLTHF漂洗60mg珠樣品。離心內(nèi)容物并除去液體。用400μL水重復(fù)漂洗過程。將2μg線性化pUC18 DNA在250μL水中的溶液加至珠并輕輕搖動(dòng)該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。
通過用HRP和過氧化物酶促氧化9，10-二氫化吖啶連接體部分來洗脫DNA。組合物含有14飛摩爾(fmol)的HRP，在pH 8.0的0.025 M tris、4mM對(duì)羥基肉桂酸、2.5mM過氧化脲、0.1％Tween-20、0.5mM EDTA中。平行運(yùn)行缺乏HRP的對(duì)照組合物。所述珠與組合物的反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。通過熒光測(cè)定和通過凝膠電泳分析溶液的DNA含量。對(duì)上清液的分析顯示了DNA的100％結(jié)合。對(duì)洗脫液的分析顯示了在酶促反應(yīng)中結(jié)合的DNA的52％被洗脫；在對(duì)照中無DNA被洗脫。
實(shí)施例45.實(shí)施例23的吖啶酯聚合物上的DNA的結(jié)合和釋放。
在管中用1mL THF漂洗100mg珠樣品。離心內(nèi)容物并除去液體。用2×1mL水重復(fù)漂洗過程。將75μg pUC18 DNA在586μL水中的溶液加至珠，并在室溫下輕輕搖動(dòng)該混合物2小時(shí)。平行進(jìn)行不含DNA的陰性對(duì)照珠樣品。離心該混合物并收集上清。用2×1mL水漂洗該珠并丟棄水。對(duì)上清液的紫外分析顯示了所述珠已結(jié)合了10％的DNA。通過與200μL含有1M過氧化脲的1M NaOH在室溫下反應(yīng)30分鐘而洗脫DNA。從洗脫液分離珠并用1M乙酸中和洗脫液。通過斑點(diǎn)印跡對(duì)中和的洗脫液的分析，顯示了小量的DNA被釋放。陰性對(duì)照顯示無信號(hào)。
實(shí)施例46.DNA結(jié)合至實(shí)施例9的聚合物珠 在管中用1mL THF漂洗100mg珠樣品。離心內(nèi)容物并除去液體。用1mL水重復(fù)漂洗過程兩次。將80μg pUC18 DNA在1mL水中的溶液加至珠，并輕輕搖動(dòng)該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清，用于UV分析。該上清液含有66μgDNA。因此結(jié)合容量被測(cè)定為0.14μg/mg。
實(shí)施例47.從實(shí)施例13的可裂解珠結(jié)合和釋放RNA 在2個(gè)管中，使2μg熒光素酶(Luciferase)RNA結(jié)合至10mg珠。1×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(50mM tris-HCl，pH 8.5，8mM MgCl2，30mM KCl，1mM DTT)被用于洗脫。將一個(gè)管在94℃下加熱5分鐘，而另一個(gè)管在94℃下加熱30分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上對(duì)洗脫液和對(duì)照跑膠，并用SYBR GreenTM染色。5分鐘的加熱顯示了～50％的RNA從所述珠洗脫，但30分鐘的加熱似乎使RNA變性。
實(shí)施例48.用不同的裂解/洗脫緩沖液從實(shí)施例13的可裂解珠結(jié)合和釋放RNA。
在3個(gè)管中，使1μg Luciferase RNA結(jié)合至10mg珠。在一個(gè)管中，3M乙酸鉀被用于在室溫下洗脫RNA30分鐘。在另一個(gè)管中，1×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(RT)被用于在94℃下洗脫1分鐘。第三管具有RNA提取緩沖液并被加熱至94℃1分鐘。RNA提取緩沖液由pH 8.8的10mM tris-HCl、0.14M NaCl、1.5M MgCl2、0.5％NP-40、1mM DTT組成。在1％瓊脂糖凝膠上對(duì)所有洗脫液和對(duì)照跑膠，并用SYBR GreenTM染色。3M乙酸鉀未產(chǎn)生可識(shí)別的RNA。1×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液和RNA提取緩沖液都顯示出條帶，該條帶被估計(jì)包含相應(yīng)于大約50％洗脫的RNA。
實(shí)施例49.從實(shí)施例13的可裂解珠結(jié)合和釋放RNA，并通過化學(xué)發(fā)光印跡試驗(yàn)檢測(cè)。
在4個(gè)管中，使1μg Luciferase RNA結(jié)合至10mg珠。2個(gè)管使用1×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液進(jìn)行洗脫，而另2個(gè)管使用RNA提取緩沖液。將每一種類的緩沖液的一個(gè)管加熱至94℃1分鐘。其它兩個(gè)管被加熱至94℃5分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上對(duì)所有洗脫液和對(duì)照跑膠，并用SYBR Green染色。使用任一種緩沖液，加熱1分鐘的洗脫液比加熱5分鐘的洗脫液都含有更多的RNA。RNA提取緩沖液比1×RT緩沖液洗脫出更多的RNA。采用過夜的毛細(xì)轉(zhuǎn)移，將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜。然后，用HF-1生物素標(biāo)記的引物過夜雜交RNA。用抗生物素HRP以及作為化學(xué)發(fā)光底物的Lumigen PS-3進(jìn)行檢測(cè)。5分鐘的暴露驗(yàn)證了凝膠結(jié)果。
實(shí)施例50.在不同溫度下從實(shí)施例13的可裂解珠結(jié)合和釋放RNA。
在6個(gè)管中，使1μg Luciferase RNA結(jié)合至10mg珠。RNA提取緩沖液被用于在若干個(gè)不同的溫度下洗脫RNA 5分鐘40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。在1％瓊脂糖凝膠上對(duì)所有洗脫液和對(duì)照進(jìn)行跑膠，并用SYBR Green染色。所有的溫度似乎都100％洗脫。
實(shí)施例51.用實(shí)施例1的三丁基磷珠結(jié)合線性化的pUC18 DNA，并用不同的洗脫組合物釋放。
在管中用500μL THF漂洗10mg珠樣品。離心內(nèi)容物并除去液體。用200μL水重復(fù)漂洗過程。將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并輕輕搖動(dòng)該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL下表所述的各種試劑組合物在室溫下溫育20分鐘而洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于如實(shí)施例26所述的熒光分析。
緩沖液鹽有機(jī)溶劑洗脫％50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％糠醇 5850mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％聚蔗糖 1950mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％HOCH2CH2SH 5250mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％DTT5250mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％丙三醇 1550mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％2-丙醇 5050mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％乙醇 3750mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％CF3CH2OH 3850mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％丙酮 4250mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％THF4150mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％對(duì)二烷 33實(shí)施例52. 用下表描述的試劑組合物重復(fù)實(shí)施例51的結(jié)合和釋放方案。檢測(cè)改變DTT或2-巰基乙醇的濃度的效應(yīng)。
緩沖液鹽有機(jī)溶劑洗脫％50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl0.1％DTT 050mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl1％DTT050mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl3％DTT3650mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl4％DTT4150mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl0.1％HOCH2CH2SH 050mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl1％HOCH2CH2SH 050mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl3％HOCH2CH2SH 3950mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl4％HOCH2CH2SH 38實(shí)施例53. 用下表描述的試劑組合物重復(fù)實(shí)施例51的結(jié)合和釋放方案。檢測(cè)改變鹽NaCl和KCl的濃度的效應(yīng)。
緩沖液鹽有機(jī)溶劑洗脫％50mM tris，pH 8.50.1M NaCl5％DTT 150mM tris，pH 8.50.25M NaCl 5％DTT 050mM tris，pH 8.50.5M NaCl5％DTT 2750mM tris，pH 8.50.75M NaCl 5％DTT 2950mM tris，pH 8.51.0M NaCl5％DTT 2950mM tris，pH 8.51.25M NaCl 5％DTT 2650mM tris，pH 8.50.75M KCl5％DTT 6450mM tris，pH 8.51.25M KCl5％DTT 60實(shí)施例54. 用下表描述的試劑組合物重復(fù)實(shí)施例51的結(jié)合和釋放方案。洗脫珠60分鐘。
緩沖液鹽有機(jī)溶劑洗脫％50mM tris，pH 8.5 0.1M NaCl0％2-丙醇350mM tris，pH 8.5 0.1M NaCl15％2-丙醇 6850mM tris，pH 8.5 0.25M NaCl 30％2-丙醇 6450mM tris，pH 8.5 0.5M NaCl50％2-丙醇 4實(shí)施例55. 用下表描述的試劑組合物重復(fù)實(shí)施例51的結(jié)合和釋放方案。評(píng)價(jià)相對(duì)效應(yīng)。
緩沖液鹽有機(jī)溶劑50mM tris，pH 8.5 1.0M乙酸鈉15％2-丙醇 ++50mM tris，pH 8.5 1.5M乙酸鈉15％2-丙醇 ++50mM tris，pH 8.5 1.25M乙酸鈉 15％2-丙醇 ++50mM tris，pH 8.5 0.75M乙酸鈉 15％2-丙醇 +50mM tris，pH 8.5 0.5M乙酸鈉15％2-丙醇 +50mM tris，pH 8.5 0.1M乙酸鈉15％2-丙醇 +實(shí)施例56. 用實(shí)施例1的三丁基磷珠結(jié)合不同長度的寡核苷酸并用試劑組合物釋放。
對(duì)范圍為20堿基至2.7kb的不同大小的寡核苷酸進(jìn)行實(shí)施例51的結(jié)合和釋放方案。洗脫組合物是pH 8.5的50mM tris、0.75M NaCl、5％DTT。使用ssDNA的熒光染色劑——OliGreen，熒光測(cè)定DNA的量。
寡核苷酸大小(nt)洗脫％20 39
30 4350 3668 34181 33424 33753 322.7kb 20實(shí)施例57.用實(shí)施例1的三丁基磷珠結(jié)合線件化pUC18 DNA并用不同洗脫體積釋放。
將2μg線性化的pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL離心柱(Costar)中的10mg珠。在溫育20分鐘后，離心該柱并收集上清。用2×200μL水洗滌所述珠并丟棄洗液。如下洗脫DNA通過用5×200μL的50mM tris，pH 8.5、0.75M NaCl、5％DTT在室溫下洗滌所述珠5分鐘，離心并收集洗脫液，用于在每次洗脫后進(jìn)行熒光和凝膠電泳分析。
以類似的方式，用5×40μL相同的緩沖液洗脫含有結(jié)合DNA的珠。
洗脫百分比200μL洗脫液 40μL洗脫液洗脫1 6347洗脫2 1011洗脫3 5.5 10洗脫4 3.5 5洗脫5 2.1 4總量 8477實(shí)施例58.用實(shí)施例5的三丁基銨珠結(jié)合和釋放核酸。
將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg的珠中，并輕輕搖動(dòng)該混合物30分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL的50mM tris，pH 8.5、0.75M NaCl、5％DTT于室溫下溫育30分鐘洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析，如實(shí)施例26中所述。DNA結(jié)合為50％，洗脫為結(jié)合部分的69％。
實(shí)施例59.用實(shí)施例7的磁性三丁基磷珠結(jié)合和釋放核酸。
在管中用500μL THF漂洗10mg珠樣品。磁法分離內(nèi)容物并除去液體。用200μL水重復(fù)漂洗過程。將在200μL水中的2μg線性化pUC18 DNA的溶液加至所述珠中，并輕輕搖動(dòng)該混合物20分鐘。磁分離該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL的50mM tris，pH 8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇于室溫下溫育30分鐘而洗脫DNA。磁分離該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析，如實(shí)施例26中所述。DNA結(jié)合為100％，洗脫為18％。
實(shí)施例60.用實(shí)施例1的三丁基磷珠結(jié)合線性化的pUC18 DNA，并用不同的洗脫溫度釋放。
將在200μL水中的2μg線性化pUC18 DNA的溶液加至10mg的珠中，并輕輕搖動(dòng)該混合物30分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL的50mM tris，pH 8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇在不同溫度下溫育5分鐘而洗脫DNA37℃、46℃、65℃和94℃。離心該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析，如實(shí)施例26中所述。在所有溫度下，DNA結(jié)合為100％，洗脫為結(jié)合部分的約65-70％。
實(shí)施例61.對(duì)從實(shí)施例1的珠結(jié)合并釋放的質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增。
在實(shí)施例51的步驟之后，在0.5M NaOH中1μL洗脫的質(zhì)粒DNA，用跨度為285堿基區(qū)的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)混合物含有下表所列的組分。
組分體積(μL)10×PCR緩沖液 10引物1(1.5pmol/μL) 8引物2(1.5pmol/μL) 82.5mM dNTPs850mM MgCl25Taq DNA聚合酶 0.5模板 1或2去離子水 59.5或58.5陰性對(duì)照用1或2μL 0.5M NaOH或1μL水替換反應(yīng)混合物中的模板。進(jìn)一步的反應(yīng)使用1μL以1∶10稀釋于水中的模板。反應(yīng)混合物經(jīng)受22個(gè)循環(huán)94℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，1分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上跑膠，其證明了從所述珠洗脫的DNA是完整的。
實(shí)施例62.用實(shí)施例1的三丁基磷珠結(jié)合核酸并用Wittig反應(yīng)釋放。
將在200μL水中的2μg pUC18 DNA的溶液加至10mg實(shí)施例1的珠中，并輕輕搖動(dòng)該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。將珠用5×400μl DMF洗滌。將DMF(300μL)中的NaOt-Bu飽和溶液和20μL丙酮與所述珠一起搖動(dòng)20分鐘。離心該混合物并除去液體。用3×400μL DMF洗滌所述珠，在最后一次洗滌后除去液體。通過將該珠和200μL 10mMtris，pH 8.5一起搖動(dòng)5分鐘并收集溶液而洗脫DNA。用新鮮的幾份緩沖液重復(fù)該過程2次。
實(shí)施例63.對(duì)Wittig釋放的DNA的斑點(diǎn)印跡分析。
在Wittig反應(yīng)后，在尼龍膜上通過斑點(diǎn)印跡分析實(shí)施例62的三種洗脫液的部分(1μL)。UV交聯(lián)施用于膜上的DNA，并用2×SSC緩沖液漂洗。用5mL DigEasy HybTM緩沖液(Roche)于37℃預(yù)雜交該膜1.5小時(shí)。在Dig Easy Hyb緩沖液中，于37℃下，過夜雜交地高辛標(biāo)記的30mer探針。在2％BM封團(tuán)液(Boehringer-Mannheim)中，用抗-地高辛HRP偶聯(lián)物(1∶10,000稀釋)捕獲雜交的探針1小時(shí)。通過用Lumigen PS-3潤濕該膜并暴露于X線膠片，來檢測(cè)HRP標(biāo)記。用從結(jié)合步驟獲得的洗脫的樣品和上清液平行分析含有10、5和2.5ng DNA的標(biāo)準(zhǔn)物。圖6證明，在第一次洗脫中大部分結(jié)合的DNA被除去，在第二次和第三次洗脫中越來越少的量被除去。對(duì)上清液的分析(未示出)證明了，所有的DNA都被結(jié)合到所述珠上。其中釋放的DNA在100℃被洗脫的類似實(shí)驗(yàn)得到類似的結(jié)果。
實(shí)施例64.反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)施例62的方案中釋放的DNA的除去的影響。
通過改變與丙酮的Wittig反應(yīng)中的反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)行實(shí)施例62的方案。在單獨(dú)的試驗(yàn)中，使用10分鐘、20分鐘、30分鐘和60分鐘的反應(yīng)時(shí)間。如實(shí)施例W2所描述的斑點(diǎn)印跡分析證明了，不論反應(yīng)時(shí)間如何，都得到相同的結(jié)果。
實(shí)施例65.用實(shí)施例3的三苯基磷珠結(jié)合核酸并通過Wittig反應(yīng)釋放。
根據(jù)實(shí)施例62所描述的一般性方法，實(shí)施例3的珠被用于結(jié)合DNA并通過Wittig釋放。通過UV對(duì)結(jié)合步驟的上清進(jìn)行的分析顯示，78％的DNA被捕獲。相比于三丁基磷珠的＞0.2μg/mg，結(jié)合容量為0.156μg/mg。類似于三丁基磷珠，大部分DNA在第一次洗脫中被從珠除去。
實(shí)施例66.用實(shí)施例4的三苯基磷珠結(jié)合核酸并通過Wittig反應(yīng)釋放。
根據(jù)實(shí)施例62所描述的一般性方法，實(shí)施例4的珠被用于結(jié)合25mg珠上的17μg DNA并通過Wittig反應(yīng)釋放。通過UV對(duì)結(jié)合步驟的上清進(jìn)行的分析顯示，14％的DNA被捕獲。結(jié)合容量為0.095μg/mg。類似于三丁基磷珠，大部分DNA在第一次洗脫中被從珠除去。
實(shí)施例67.用實(shí)施例7的磁性三丁基磷珠結(jié)合核酸并通過Wittig反應(yīng)釋放。
按照實(shí)施例62的方案，其具有下面的改變。所有的分離步驟被磁性進(jìn)行。有機(jī)溶劑和洗滌液用THF代替DMF。THF/NaOt-Bu溶液的體積為250μL。在tris緩沖液中，用3個(gè)15分鐘洗滌來洗脫釋放的DNA。用PicoGreen通過熒光試驗(yàn)來分析洗脫液和上清液。對(duì)上清液的分析顯示100％結(jié)合到顆粒。熒光分析發(fā)現(xiàn)，在第一次洗脫中32％被洗脫。隨后的洗脫液包含太少的DNA，以至于用該方法無法檢測(cè)。為了比較，實(shí)施例1的非磁性珠顯示在第一次洗脫中的31％DNA，并且在隨后的洗脫中DNA太少而無法檢測(cè)。
實(shí)施例68.從實(shí)施例16的可裂解珠洗脫的DNA直接用于LMO和PCR擴(kuò)增。
將在200μL10mM pH 8.5的tris中的、包含分離自人全血的4μg基因組DNA的溶液加到20mg珠中。在溫育5分鐘后，離心該樣品管30秒并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄洗液。通過如下洗脫DNA用100μL的0.5MNH4OH在37℃下洗滌所述珠5分鐘，離心30秒并收集洗脫液。
如美國專利5,998,175中所述，使用本發(fā)明的聚合物珠分離的DNA通過LMO進(jìn)行擴(kuò)增，而無需中和或進(jìn)一步的樣品預(yù)處理。簡而言之，使用一對(duì)引物以及一組2種八聚體和2種十聚體，通過熱循環(huán)步驟，制備對(duì)應(yīng)于Factor V基因的片段的擴(kuò)增子，其具有51個(gè)堿基的鏈和48個(gè)堿基互補(bǔ)，所述引物之一用6-FAM進(jìn)行5′-標(biāo)記。在Taq連接酶緩沖液中溶解引物和模板(1μL)。用40μL礦物油覆蓋反應(yīng)管，并加熱至94℃ 5分鐘。然后，將20U Taq DNA連接酶加至每一管。對(duì)樣品循環(huán)40次94℃30秒；55℃30秒；38℃30秒。
對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光雜交測(cè)定。野生型擴(kuò)增子的捕獲探針被固定于微量培養(yǎng)板孔中，并被用于雜交含有FAM標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。抗FITC-堿性磷酸酶偶聯(lián)物被結(jié)合，并用Lumi-Phos Plus檢測(cè)。通過LMO、雜交和檢測(cè)步驟，對(duì)每一基因型的血樣DNA以及水空白進(jìn)行平行運(yùn)行。選擇已知對(duì)照中DNA的量，以與50％回收的珠處理樣品中的量相等。該樣品以前被分型為純合子野生型。
樣本信號(hào)(RLU)樣品24.7純合子野生型87.3雜合子 47.1純合子突變體0.20空白0.30實(shí)施例69.含有二甲基锍基和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在室溫下，于100mL CH2Cl2中，攪拌如上所述制備的聚甲基丙烯酰氯樹脂(2.96g)、5.07g 4-(甲硫基)苯硫酚和三乙胺(8.8mL)5天。過濾出該固體，并用100mL CH2Cl2和100mL水洗滌，然后在125mL甲醇中攪拌若干天。過濾并干燥所產(chǎn)生的3.76g硫酯產(chǎn)物。
將100mL CH2Cl2中的2.89g部分的固體與4.1mL三氟甲基磺酸甲酯一起攪拌7天。過濾該固體，并依次用200mL CH2Cl2、300mL甲醇和300mLCH2Cl2洗滌，然后風(fēng)干。
實(shí)施例70.使用具有二甲基锍基的可裂解珠結(jié)合和釋放DNA。
將在200μL 10mM pH為8的tris中的2μg線性化pUC18 DNA的溶液加至實(shí)施例69的10mg珠樣品中，并輕輕搖動(dòng)該混合物5分鐘。離心該混合物并收集上清液。用2×200μL水漂洗所述珠并丟棄水。通過與200μL 0.5M NaOH于37℃溫育所述珠5分鐘而洗脫DNA。離心該混合物并除去洗脫液，用于熒光分析。該上清液不含有DNA。洗脫液含有100％初始結(jié)合的DNA。
實(shí)施例71.使用具有二甲基锍基的可裂解珠結(jié)合和釋放DNA。
通過與200μL 50mM pH 8.5的tris、0.75 NaCl、5％DTT于37℃溫育5分鐘，洗脫如實(shí)施例70所述的結(jié)合至珠的DNA。離心該混合物并除去洗脫液，用于熒光分析。該上清液不含有DNA。洗脫液含有初始結(jié)合的DNA的37％。
前述的說明書和實(shí)施例僅僅是說明性的并且不被理解為限制性的。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)未具體公開的具體化合物和方法作出改變，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求的限定。
權(quán)利要求
1.從樣品中分離核酸的方法，包括a)提供固相，所述固相包括包含基質(zhì)的固體支持部分，所述基質(zhì)選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，用于吸引和結(jié)合核酸的核酸結(jié)合部分，和可裂解連接體部分；b)混合所述固相和含有所述核酸的所述樣品，以將所述核酸結(jié)合到所述固相上；c)從所述固相分離所述樣品；d)裂解所述可裂解連接體；和e)從所述固相釋放所述核酸。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述核酸結(jié)合部分選自其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2+X-的三元锍基，其中R選自C4-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3+X-的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季磷基PR3+X-，并且其中X是陰離子。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸結(jié)合部分是季銨基并且所述每一個(gè)R基團(tuán)都包含4-20個(gè)碳原子。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸結(jié)合部分是季磷基并且所述每一個(gè)R基團(tuán)都包含1-20個(gè)碳原子。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述固相的每一個(gè)R基團(tuán)為丁基。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固體支持部分選自顆粒、微粒和珠。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固體支持部分包括不溶的合成聚合物。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述聚合物選自聚苯乙烯和聚丙烯酸聚合物。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述固體支持部分包括玻璃基質(zhì)。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述固體支持部分包括二氧化硅基質(zhì)。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分進(jìn)一步包括一個(gè)或更多個(gè)連接部分。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相進(jìn)一步包括磁響應(yīng)性部分。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分被水解性裂解。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中用含有選自氫氧化物鹽和醇鹽的堿的溶液進(jìn)行所述水解性裂解。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述堿選自LiOH、NaOH、KOH、NH4OH、NaOCH3、KOCH3和KOt-Bu。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中用還含有過氧化氫的溶液進(jìn)行所述水解性裂解。
17.權(quán)利要求13所述的方法，其中用含有無機(jī)酸的溶液進(jìn)行所述水解性裂解。
18.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述固相的所述可水解性裂解的連接體部分是酯或硫酯基團(tuán)。
19.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分被還原性裂解。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述可裂解連接體包括二硫化物或過氧化物基團(tuán)。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中用選自硫醇、胺和膦的還原劑進(jìn)行所述還原性裂解。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述還原劑選自乙硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、三烷基胺和三苯基膦。
23.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分包括可以被引發(fā)劑裂解的可引發(fā)二氧雜環(huán)丁烷環(huán)。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述可引發(fā)二氧雜環(huán)丁烷具有式 其中基團(tuán)A表示穩(wěn)定取代基，其選自烷基、環(huán)烷基、聚環(huán)烷基、聚環(huán)烯基、芳基、芳氧基和烷氧基，Ar代表芳環(huán)基團(tuán)，其可以包含選自鹵素、烷氧基和胺基的另外的取代基，Y是通過選自化學(xué)劑和酶的引發(fā)劑可去除、以便使所述二氧雜環(huán)丁烷環(huán)碎裂的基團(tuán)或原子。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述OY基團(tuán)選自O(shè)H、其中R3選自烷基和芳基基團(tuán)的OSiR33、羧基、磷酸鹽、硫酸鹽以及糖苷基。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中在所述可引發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷中的Ar是取代的或未取代的苯基或萘基。
27.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述引發(fā)劑選自堿、氟化物離子、酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶和糖苷酶。
28.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分包括多電子烯烴，所述多電子烯烴通過轉(zhuǎn)化至熱不穩(wěn)定性二氧雜環(huán)丁烷而被裂解。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述烯烴通過與單態(tài)氧反應(yīng)而被轉(zhuǎn)化成所述不穩(wěn)定二氧雜環(huán)丁烷。
30.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分被酶促裂解。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分包括9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛，所述9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛通過與過氧化物酶和過氧化物反應(yīng)而被裂解。
32.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分包括酯，所述酯通過水解酶或酯酶而被裂解。
33.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分包括酰胺，所述酰胺通過蛋白酶而被裂解。
34.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分包括肽，所述肽通過肽酶而被裂解。
35.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分包括糖苷，所述糖苷通過糖苷酶而被裂解。
36.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分包括具有式 的硫酯，其中Q為P或N，R為1-20個(gè)碳的烷基。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分包括具有式 的硫酯。
38.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分是至少一個(gè)碳原子結(jié)合至三烷基磷或三芳基磷核酸結(jié)合部分的亞烷基，并且利用與酮或醛的Wittig反應(yīng)可被裂解。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述Wittig反應(yīng)通過在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中用醇鹽或氫化物鹽堿進(jìn)行去質(zhì)子化而形成葉立德，并且所述葉立德與選自脂族和芳族醛以及脂族和芳族酮的羰基化合物反應(yīng)。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述溶劑選自THF、二乙醚、對(duì)二烷、DMF和DMSO，并且用于與所述葉立德反應(yīng)的所述羰基化合物是丙酮。
41.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述固相的所述可裂解連接體部分具有式
42.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裂解反應(yīng)和洗脫步驟是采用單獨(dú)和不同的溶液完成每一步驟、以連續(xù)的步驟被進(jìn)行的。
43.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裂解和洗脫步驟可以在相同的步驟中一起進(jìn)行。
44.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括，在步驟(b)后，用洗滌溶液洗滌其上結(jié)合有被捕獲的核酸的所述固相，以從所述固相除去所述樣品的其它組分。
45.權(quán)利要求1所述的方法，其中從所述固相分離所述樣品的所述步驟通過磁分離被完成。
46.權(quán)利要求1所述的方法，其中從所述固相分離所述樣品的所述步驟通過選自過濾、重力沉降、傾析、離心、真空吸氣和空氣過壓的方法被進(jìn)行。
47.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述固相的所述核酸結(jié)合部分是式SR2+X-的三元锍基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且其中X是陰離子。
48.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括在步驟(e)中將所述核酸從所述固相釋放入溶液中；和f)在下游過程中直接使用含有所述釋放的核酸的所述溶液。
49.權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括在步驟(e)中將所述核酸從所述固相釋放入溶液中；和f)在下游過程中直接使用含有所述釋放的核酸的所述溶液。
50.權(quán)利要求49所述的方法，其中含有所述釋放的核酸的所述溶液被直接用在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，由此，通過使用聚合酶或連接酶介導(dǎo)的反應(yīng)，所述核酸或其片段的數(shù)量被擴(kuò)增。
全文摘要
公開了結(jié)合核酸的固相材料和它們的使用方法。所述材料特征在于可裂解連接體部分，其可以被裂解以釋放結(jié)合的核酸。該固相材料包括固體支持部分，所述固體支持部分包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶性多糖的基質(zhì)，用于吸引和結(jié)合核酸的核酸結(jié)合部分連接至所述固體支持部分，所述核酸結(jié)合部分(NAB)通過可裂解連接體部分被連接至固體支持部分。優(yōu)選的核酸結(jié)合部分包括三元或四元基。所述材料可以是微粒、纖維、珠、膜、試管或微孔的形式，并可以進(jìn)一步包括磁芯部分。使用該可裂解固體支持物結(jié)合核酸的方法以及它們?cè)诜蛛x或純化核酸的方法中的用途被公開。
文檔編號(hào)C07H21/02GK101018870SQ200480043906
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月15日
發(fā)明者H·阿哈萬－塔夫帝, R·德西瓦, N·M·奇利, W·G·克里普斯, R·S·漢德利, E·A·奧康納, L·V·雷迪, S·西利普拉普 申請(qǐng)人:魯米根公司