專利名稱：分離的苛養(yǎng)木桿菌gum操縱子,分離的其核酸分子及它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa)的操縱子的分離。尤其是其涉及到這樣的一個(gè)操縱子的分離，其包括九個(gè)基因，分別表示為xfgum B，C，D，E，F(xiàn)，H，J，K及M。同樣作為本發(fā)明一部分的是這九個(gè)基因的每一個(gè)的分離的核酸分子。同樣作為本發(fā)明一部分的是含有可操作連接至啟動(dòng)子的該操縱子或一個(gè)或多個(gè)組分(component)基因的表達(dá)載體，含有該操縱子或一個(gè)或多個(gè)所述基因的重組細(xì)胞，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物，及其各自不同的用途。
背景技術(shù)：
黃原膠是一種由致植物病細(xì)菌野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris(Ielpi等，1981，F(xiàn)EBS Lett.130253-256)產(chǎn)生的外多糖(下文稱＂EPS＂)，野油菜黃單胞菌中這種胞外多糖的生物合成由一簇共12個(gè)基因，gumB-gumM(Becker等，1998，Appl Microbiol Biotechnol，50145-152；Vojnov等，1998，Microbiology 144487-493)所控制。其由聚合五糖重復(fù)單元所組成，該五糖單元是在多聚異戊烯醇磷酸酯載體上依次增加葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖，甘露糖，葡萄糖醛酸，及甘露糖而成(Ielpi等，1993，J.Bacteriol.1752490-2500)。五糖重復(fù)單元還有不同程度的O-乙?；氨峄?Ielpi等，1993，J.Bacteriol.1752490-2500)。
使用一簇?cái)y帶gumB及gumC的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在缺陷型突變體中恢復(fù)了黃原膠的產(chǎn)生，這表明gumB及gumC都涉及到黃原膠跨細(xì)菌細(xì)胞膜的遷移(Vojnov等，1998，Microbiology 144487-493)。
有兩組基因涉及到黃原膠的生物合成一組是基因xpsIII，xps IV及xpsVI，它們分別負(fù)責(zé)合成UDP-葡萄糖，UDP-葡萄糖醛酸及GDP-甘露糖(Harding等，J.Bacteriol 1692854-2861(1987)；Harding等，J.Gen Micobiol139447-457(1993)；Hotte等，1999；Poplin等J.Bacteriol 174191-199(1992)，1992)，另一組是基因gum或xpsI，其編碼的酶參與了連接至多聚異戊烯醇磷酸酯的五糖的聚合及EPS向胞外介質(zhì)中的分泌(Ielpi等，1992；出處同上Ielpi等，1993出處同上)。
野油菜黃單胞菌的gum基因集中在一個(gè)大約長16Kb的操縱子(GUM操縱子)中，含有12個(gè)基因，它們是gumB，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J，K，L及M。gumD基因編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶I，其負(fù)責(zé)使UDP-葡萄糖的葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移至polyprenol磷酸鹽載體上，以形成脂-單糖。GumM基因編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶II，其催化增加第二個(gè)葡萄糖殘基以形成脂-二糖。GumH基因編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶III，其催化增加第一個(gè)甘露糖殘基以形成脂-三糖。GumK基因編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶IV，其催化增加一個(gè)葡萄糖醛酸殘基以形成脂-四糖。GumI基因編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶V，其催化增加另一個(gè)甘露糖殘基以形成脂-五糖。GumF基因編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶I，其催化內(nèi)部甘露糖殘基的乙酰化。GumG編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶II，其催化外部甘露糖殘基的乙?；Ｗ詈?，gumL編碼丙酮酸縮酮轉(zhuǎn)移酶(pyruvate ketal transferase)，其催化外部甘露糖殘基的丙酮酸化。GumB，C及E涉及到EPS通過細(xì)菌細(xì)胞膜的聚合及分泌，而gumJ被認(rèn)為參與了與EPS聚合及分泌平行的一個(gè)階段(Ielpi等，1992出處同上；Ielpi等，1993出處同上)。
黃原膠因?yàn)槠渥鳛楹芤旱脑稣硠┒哂袕V泛的商業(yè)用途。其應(yīng)用于食品及非食品工業(yè)，還可作為懸浮液，乳液及泡沫的穩(wěn)定劑。在黃原膠生物合成途徑中有缺陷的黃單胞菌(Xanthomonas)突變株已經(jīng)表明可以合成并聚合具有不同結(jié)構(gòu)，類似的流變學(xué)特性及不同的粘性的黃原膠(Hassler和Doherty，1990，Biotechnical Prog 6182-187)。乙酰化及丙酮酸化可影響黃原膠的粘性特征。丙酮酸的存在增加粘性而乙酸降低粘性(Hassler和Doherty，出處同上)。從黃原膠側(cè)鏈中減少糖殘基同樣可以影響粘性。與野生型黃原膠相比，缺乏末端甘露糖的聚合物(聚四體)是很弱的增粘劑。相比較來說，同時(shí)缺乏末端甘露糖及葡萄糖醛酸的聚合物(聚三體)是很好的增粘劑(Hassler和Doherty，出處同上)。一種非乙?；捏w和一種乙酰化四體，它們都缺乏側(cè)鏈末端甘露糖殘基，前一種在內(nèi)部甘露糖殘基上還缺乏乙酸基團(tuán)，它們與野生型相比，前一種表現(xiàn)出較高粘性而后一種表現(xiàn)出較低粘性(Levy等，1996，Biopolymers 38251-272)。較高粘性與較低粘性的主要構(gòu)象差別是開放螺旋骨架數(shù)量的增加及側(cè)鏈可塑性高粘度的增加(Levy等，1996，Biopolymers 38251-272)。
黃原膠也可作為藥物穩(wěn)定劑使用，以提高藥物的吸收，延緩藥物的釋放，還可用于控釋制劑中(Talukdar等，1996，J Pharm Sci 185537-540)。與黃原膠混合的α-環(huán)糊精減少了直腸粘膜中以及肝臟的嗎啡的一過性代謝(first-pass metabolism)，且表現(xiàn)出阿片樣物質(zhì)的表觀直腸生物可利用性提高了大約4倍(Kondo等，1996，Biol Pharm Bull 19280-286)。黃原膠藻酸鹽已被用于對酶的膠囊化。黃原膠藻酸鹽球體在最佳條件下重復(fù)使用20次后仍顯示出最大尿素酶活性的75％(Elcin，1995，Biomaterials 161157-1161)的活性。
使用水溶性食用纖維，黃原膠及刺槐豆多糖(locust bean gum)制備的持續(xù)釋放型水凝膠栓劑已顯示出比商品栓劑更長時(shí)間的持續(xù)的藥物釋放。平均滯留時(shí)間較長，在血漿濃度對時(shí)間的曲線下的面積未減少。組織病理學(xué)研究顯示出水凝膠栓劑對直腸粘膜的良好的生物安全性。這些結(jié)果表明，使用黃原膠和刺槐豆多糖制備的IMC水凝膠栓劑是一種實(shí)用的直腸試劑，它具有延長的效果且副作用減小(Watanabe等，1993，Bio Pharm Bull 16391-394)。
用黃原膠制備的水凝膠中，強(qiáng)地松龍(prednisolone)的表觀釋放速率隨著黃原膠濃度的增加而減少，表明藥物分子的擴(kuò)散主要受控于基質(zhì)中三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的密度。這些結(jié)果顯示，藥物釋放不僅受控于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的密度，同時(shí)也受控于水凝膠的顯微粘性(Watanabe等，1992，Chem Pharm Bull 40459-462)。新霉素-呋喃唑酮-黃原膠復(fù)合體已被顯示可以增加藥物抗微生物的活性(Dumitriu等，1993，J.Biomater 7256-276)。
黃原膠還顯示可以緩解糖尿病。黃原膠給藥糖尿病患者后降低了空腹和進(jìn)食后的血清葡萄糖，也降低了空腹時(shí)的血漿總膽固醇水平。黃原膠還傾向于降低空腹和進(jìn)食后胃泌素及胃抑制多肽(GIP)的水平，總甘油三酯和VLDL甘油三酯的空腹水平，以及VLDL及LDL中的膽固醇空腹水平?；颊咴诔粤它S原膠松餅后有一種很飽的感覺而沒有嚴(yán)重的消化癥狀(Osilesi等，1985，Am J Clin Nutr 42597-603)。
幾種因素與致植物病細(xì)菌的致病性相關(guān)，包括胞外酶的生產(chǎn)，外多糖的生產(chǎn)，毒素和植物生長素以及介導(dǎo)特定植物病原體相互作用的因子的生產(chǎn)(Agrios，1988，Plant Pathology，3rd edition，Academic Press；Alippi，1992，Agronomie 12115-122)。幾種細(xì)菌的致病性中，EPS的作用均為已知。其與以下相關(guān)(i)因?yàn)槟举|(zhì)管閉塞導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，(ii)粘液損害以及(iii)輔助植物/病原體相互作用以及植物組織中細(xì)菌的生長。
幾個(gè)研究組已經(jīng)調(diào)查了黃單胞菌的致病性中黃原膠的作用。盡管很長一段時(shí)間以來人們認(rèn)為黃原膠對于致病性是很關(guān)鍵的，許多人并未成功證明該EPS與致病性之間有一個(gè)直接的聯(lián)系(Kamoun and Kado，1990，J.Bacteriol1725165-5172)。最近以來，已經(jīng)證明了黃原膠生物合成后期階段gum D的刪除(Chou等，1997，Biochem Biophys Res.Commun 233265-269)或改變(Katzen等，1998，J.Bacteriol 1801607-1617)減少了花椰菜中導(dǎo)致黑腐病的毒力及降低了黃單胞菌對植物體的進(jìn)攻性。盡管苛養(yǎng)木桿菌感染柑橘樹的癥狀已為公知，例如，葉子clorosis，營養(yǎng)缺陷的癥狀，果實(shí)體積的減小，等(DeNegri，1990，Com.Tec.No.82，Ext.Rural，Cats，Compinas；Malavolta等，1990，Cordeiropolis，v.11，n.1，p.15-18)，細(xì)菌致病的機(jī)理尚不清楚。細(xì)菌感染有賴于昆蟲載體例如Oncometopia facialis，Acrogonia terminalis及Dilobopterus costalimai(Gravena等，1997，＂Os vetores de X lellafastidiosa InClorose Variegada do Citros＂)。這些昆蟲，當(dāng)以木質(zhì)養(yǎng)料為食時(shí)，將細(xì)菌引入其容易滋長的木質(zhì)管(Lopes等，1996，＂Xvlella fastidiosa＂，F(xiàn)itopathologinBrasileira，Brasilia v.2 1，Suplemento p.343；Roberto等，1996，F(xiàn)itopatologiaBrasileira，Brasilia v.21，n.4，p.517-18)。由XfGUM操縱子合成的EPS，為本發(fā)明的一個(gè)特征，可能直接涉及到在柑橘樹中導(dǎo)致柑桔屬斑駁Clorosis的致病性及其他植物例如咖啡及葡萄植物中的其他疾病。
發(fā)明簡述本發(fā)明部分涉及大約12710個(gè)核苷酸的核酸分子，其編碼XfGUM操縱子的成員，包括xfgumB，xfgumC，xfgumD，xfgumE，xfgumF，xfgumH，xfgumJ，xfgumK及xfgumM的基因，本發(fā)明涉及該操縱子以及由此編碼的蛋白的用途。上述物質(zhì)可被用于例如控制柑橘樹疾病如柑桔斑駁Clorosis(CVC)及其它植物中的細(xì)菌導(dǎo)致的疾病。由XfGUM操縱子編碼的酶所產(chǎn)生的EPS可以導(dǎo)致由木質(zhì)管閉塞所引起的疾病或者通過細(xì)菌感染，粘附及擴(kuò)散機(jī)制所導(dǎo)致的疾病；然而申請人并不局限于上述任一理論。本發(fā)明也涉及到XfGUM操縱子的組分在生產(chǎn)外多糖方面的應(yīng)用，這種新多糖和該多糖的結(jié)構(gòu)變體的工業(yè)應(yīng)用和/或藥物用途，所用宿主為苛養(yǎng)木桿菌或其他細(xì)菌。
本發(fā)明的基礎(chǔ)是許多不曾預(yù)料及令人驚奇的發(fā)現(xiàn)。一個(gè)發(fā)現(xiàn)是一種長為12710個(gè)核苷酸的DNA序列存在于致植物病細(xì)菌苛養(yǎng)木桿菌的基因組中。而此前黃原膠操縱子僅在野油菜黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)。另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是XfGUM操縱子缺少基因gumI，gumG及gumL，它們分別編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶V，乙酰轉(zhuǎn)移酶II及丙酮酸縮酮轉(zhuǎn)移酶。這些基因的缺乏表明XfGUM操縱子編碼的酶對由四聚體單位所組成的外多糖的合成是必需的，所述四聚體單位含有葡萄糖，葡萄糖，甘露糖及葡萄糖醛酸。因?yàn)榫幋a乙酰轉(zhuǎn)移酶II及丙酮酸縮酮轉(zhuǎn)移酶的基因缺乏，所以產(chǎn)生的四糖并沒有丙酮酸化，且正如黃單胞菌中所證明的，其甘露糖是部分乙酰化的。這些結(jié)果表明XfGUM編碼的酶可以產(chǎn)生具有新的流變學(xué)及化學(xué)特性的新多糖。
本發(fā)明包括但并不限于，(a)含有編碼糖基轉(zhuǎn)移酶I，糖基轉(zhuǎn)移酶II，糖基轉(zhuǎn)移酶III，糖基轉(zhuǎn)移酶IV及乙酰轉(zhuǎn)移酶I的XfGUM操縱子的結(jié)構(gòu)區(qū)及調(diào)控區(qū)的核苷酸序列，以及下文稱GUMB，GUMC，GUME和GUMJ的蛋白；(b)上述核苷酸序列在細(xì)胞中的表達(dá)；(c)分離的酶，蛋白及其活性形式，以及其突變體，片段及融合蛋白；(d)由GUM樣操縱子編碼的酶和/或蛋白在篩選方法中的用途，所述方法用以鑒定控制苛養(yǎng)木桿菌和/或相關(guān)的生物所致的疾病的化合物；(e)改造細(xì)菌宿主以表達(dá)由XfGUM所編碼的酶和/或蛋白；及(f)表達(dá)由XfGUM編碼的酶和/或蛋白的改造宿主在制備用于工業(yè)和/或醫(yī)療目的以及用于動(dòng)物包括人的外多糖方面的應(yīng)用。
附圖的簡要說明

圖1A-1I顯示了本發(fā)明蛋白的推導(dǎo)的氨基酸序列與野油菜黃單胞菌的同源蛋白的氨基酸序列的比較；圖2提出了一種使用本發(fā)明組分的生物合成途徑。
優(yōu)選技術(shù)方案的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及苛養(yǎng)木桿菌基因組的大約12710個(gè)核苷酸的核酸分子，其編碼的XfGUM操縱子包括基因xfgumB，xfgumC，xfgumD，xfgumE，xfgumF，xfgumH，xfgumJ，xfgumK及xfgumM，本發(fā)明還涉及該操縱子作為DNA和其編碼的蛋白在控制柑橘樹疾病柑桔斑駁Clorosis(CVC)或由其它植物如櫟樹及葡萄中的細(xì)菌導(dǎo)致的相關(guān)疾病方面的作用。
下列定義以消除任何可能于說明書及權(quán)利要求書中產(chǎn)生的概念不清楚。
本發(fā)明所使用的“相似性”是指核苷酸序列的同一性，假如經(jīng)過總體對比后，較小序列的70％的核苷酸與其他序列的相應(yīng)核苷酸是同一的，那么可以說該序列與所述序列具有70％的同一性?？傮w對比可以通過動(dòng)態(tài)程序的方式來完成(Thompson JD等(1997)，Nucleic Acids Res.25，4876-4882引用本文作為參考)。這就保證了算數(shù)上的最佳對比，其為所有核苷酸之間的匹配與不匹配確定了數(shù)值，也為不同長度的插入或缺失的罰分確定了數(shù)值。常用的數(shù)值為1.9是匹配，0是不匹配，15是出現(xiàn)了缺口，6.66是該缺口的延伸。
實(shí)施例1使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括使用限制性酶BamHI消化DNA從來自總苛養(yǎng)木桿菌的DNA制備粘粒文庫。大約為35-45千堿基對的片段被選為最相關(guān)片段。制備雜交圖譜以選擇不重疊的粘粒，挑選以后，使用識別的鳥槍法對其進(jìn)行測序。選定與黃單胞菌(Xanthomonas spp)序列類似的一個(gè)粘粒。大約12710個(gè)核苷酸的片段被分離且作進(jìn)一步研究。
實(shí)施例2對實(shí)施例1中的分離的核苷酸作進(jìn)一步的研究包括將12710個(gè)核苷酸的片段與已知的野油菜黃單胞菌的GUM操縱子進(jìn)行比較。該已知操縱子已被描述含有12個(gè)基因；然而本發(fā)明所揭示的操縱子卻顯示只含有9個(gè)基因，也就是說，其含有的基因與gumB，C，D，E，F(xiàn)，H，J，K及M具有一定的同源性，然而并未發(fā)現(xiàn)與gumG，I或L同源的序列。
為了區(qū)別這兩組基因，做為本發(fā)明一部分的那些基因本文以下稱“xfgum”基因，該操縱子稱為“XfGUM”。
xfgumB，C，D，E，F(xiàn)，H，J，K及M的核苷酸序列分別列于SEQ ID NO1-9。完整的XfGUM操縱子列于SEQ ID NO10。
xfgum基因所編碼的推導(dǎo)的氨基酸序列由序列SEQ ID NO11-19所述。已將其與野油菜黃單胞菌的相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行了比較。圖1A-1I顯示同源性分析，其中使用的縮寫“GUMBXf，GUMCXf”等對應(yīng)于本發(fā)明所述的蛋白，而“GUMBXc，GUMCXc”等對應(yīng)于野油菜黃單胞菌的蛋白。
實(shí)施例3根據(jù)苛養(yǎng)木桿菌序列與野油菜黃單胞菌序列的同源性，得出有關(guān)編碼蛋白的功能的結(jié)論，并推測出苛養(yǎng)木桿菌合成黃原膠樣產(chǎn)物的機(jī)理，見圖2。具體地講，xfgumD編碼糖基轉(zhuǎn)移酶I類似物，其涉及到通過UDP-葡萄糖上的葡萄糖-I-磷酸轉(zhuǎn)移至異戊二烯醇載體上加入第一個(gè)葡萄糖殘基，結(jié)果產(chǎn)生脂質(zhì)單糖。該合成第二步涉及通過由xfgumM編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶II類似物添加另一個(gè)葡萄糖殘基，結(jié)果產(chǎn)生脂質(zhì)二糖。隨后，認(rèn)為由xfgumH所編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶III類似物添加一個(gè)甘露糖殘基以形成三糖，通過由xfgumK所編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶IV類似物添加一個(gè)葡萄糖醛酸殘基以形成四糖。xfgumF基因編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶I類似物，其如上所述催化甘露糖殘基的乙?；?。由xfgumB，C及E所編碼的蛋白顯示涉及通過細(xì)菌細(xì)胞膜的黃原膠樣EPS的分泌，而由xfgumJ所編碼的蛋白表現(xiàn)出涉及黃原膠樣EPS的聚合及分泌。
正如上所述，XfGUM操縱子缺乏對應(yīng)于黃單胞菌基因GUMG，I及L的組分，它們編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶II，葡糖基轉(zhuǎn)移酶V，及丙酮酸轉(zhuǎn)移酶。這表明由苛養(yǎng)木桿菌所產(chǎn)生的EPS由葡萄糖-葡萄糖-甘露糖-葡萄糖醛酸四聚體單位組成，其中這些四聚體并未丙酮酸化但已全部或部分乙?；?br> Hassler等，Biotechnol Proj.6182-187(1990)，及Levy等，Biopolymers38251-272(1996)，都表明了黃單胞菌突變株黃原膠生物合成途徑(一步或多個(gè)步驟缺陷)可合成黃原膠的結(jié)構(gòu)變體，該變體具有的化學(xué)特性與其他的黃原膠結(jié)構(gòu)變體及標(biāo)準(zhǔn)的黃原膠不同。乙?；氨峄家阎梢杂绊扅S原膠的粘性特征。丙酮酸基增加了粘度而乙?；档土苏扯取８M(jìn)一步，末端甘露糖缺失時(shí)，粘度降低。缺乏側(cè)鏈末端甘露糖的非乙酰化的四聚體具有較高的粘度。上述發(fā)現(xiàn)表明本文所述的EPS具有與先前鑒定的黃原膠不同的特性。
上述說明，包括實(shí)施例，描述了本發(fā)明的特征。這些包括編碼本文所述任一及所有xfgum蛋白(包括GUMxfB，C，D，E，F(xiàn)，H，J，K及M)的分離的核酸分子，以及所述蛋白本身。尤其優(yōu)選，包括SEQ ID NO1-9所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO1-9所示的核苷酸序列組成的分離的核酸分子，以及與這些核酸分子不同、但從遺傳密碼的簡并性角度來看、仍編碼具有SEQ ID NO11-19所示氨基酸序列的蛋白的核酸分子。
本發(fā)明分離的核酸分子包含在表達(dá)載體中，所述核酸分子可操作地連接至啟動(dòng)子上。根據(jù)本發(fā)明這一特征，本文所描述及要求保護(hù)的多個(gè)核酸分子可以包括在表達(dá)載體中。本文描述了9個(gè)核酸分子家族，這些家族核酸分子的任意及全部組合都可以成為該表達(dá)載體的一部分。換句話講，2，3，4，5，6，7，及8種該核酸分子的組合可以是這些載體的一部分，這些表達(dá)載體也可以包括所述9種核酸分子，或僅包括一種核酸分子。
同樣作為本發(fā)明一部分的是重組細(xì)胞，例如重組原核細(xì)胞株及重組真核細(xì)胞系，其已被一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的分離的核酸分子或重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
如本文所述，同樣作為本發(fā)明一部分的是分離的XfGUM操縱子。優(yōu)選的實(shí)施方案是SEQ ID NO10所示的序列；然而，可以理解上述遺傳密碼的簡并性同樣也適用于此。更進(jìn)一步，有關(guān)操縱子以及本文所述的所有核酸分子，優(yōu)選密碼子使用原則適用于應(yīng)用這些核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
如前所述，同樣作為本發(fā)明的特征的是由分離的核酸分子編碼的蛋白。該蛋白如前所述具有酶的活性。更進(jìn)一步，其可以用作免疫原以產(chǎn)生抗體，不管是單克隆抗體還是多克隆抗體，其都可如以下所述進(jìn)行應(yīng)用。更進(jìn)一步，這些蛋白可以以不同的重組形式產(chǎn)生(包括融合蛋白)，以活性形式產(chǎn)生，該活性形式的蛋白包含的氨基酸序列小于所述蛋白全部的氨基酸序列。例如，已知酶含有不同的結(jié)構(gòu)功能域，包括一個(gè)或多個(gè)活性位點(diǎn)，所述活性位點(diǎn)是本發(fā)明的一部分，其含有本發(fā)明蛋白的小于全部的氨基酸序列。
如前所述，本發(fā)明的蛋白可用于制備黃原膠類似分子，例如圖2所示的，即[葡萄糖-葡萄糖-甘露糖-葡萄糖醛酸]n。其中n是一個(gè)從1至約5000的整數(shù)，優(yōu)選從約300至大約5000，最優(yōu)選是大約1500-3000。
上述結(jié)構(gòu)可被乙?；?；然而，正如前所述，當(dāng)使用做為本發(fā)明一部分的酶制備所述結(jié)構(gòu)時(shí)，所產(chǎn)生的四糖結(jié)構(gòu)不同于已知的黃原膠，區(qū)別在于其并未完全乙酰化或丙酮酸化，該化合物可以經(jīng)過胞內(nèi)或胞外途徑進(jìn)行聚合。
對XfGUM操縱子的分離和鑒定可使本領(lǐng)域技術(shù)人員確定何種物質(zhì)可用作該操縱子的全部或其各組分的抑制劑或激活劑。如前所述，本發(fā)明所述的黃原膠類似產(chǎn)品具有不同的工業(yè)用途，找到其激活劑和/或拮抗劑可使本領(lǐng)域技術(shù)人員能在適當(dāng)?shù)臈l件下(例如在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)苛養(yǎng)木桿菌時(shí)或在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染產(chǎn)生黃原膠類似化合物的細(xì)胞時(shí))提高該物質(zhì)的產(chǎn)量?！霸诒绢I(lǐng)域中”期望抑制或拮抗苛養(yǎng)木桿菌，本發(fā)明的操縱子和分離的核酸分子可使技術(shù)人員找到用于抑制該種生物的物質(zhì)。
本發(fā)明的其它方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是清楚的且不需要詳細(xì)描述。本發(fā)明所用術(shù)語和表達(dá)并不構(gòu)成對本說明書的限制，且這些術(shù)語和表達(dá)的應(yīng)用并不意味著排除本文所示和所描述的所有特征的任何等同物或其部分，可以認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)的各種修改都是可能的。
序列表序列表<110>保羅，阿魯達(dá)(Arruda，Paulo)菲利普R，達(dá)西爾瓦(daSilva，F(xiàn)elipe Rodrigues)埃德森L，肯伯(Kemper，Edson Luis)安德烈，維托雷(Vettore，Andre)阿迪爾森，萊特(Leite，Adilson)馬西奧J，達(dá)西爾瓦(daSilva，Marcio Jose)<120>分離的苛養(yǎng)木桿菌GUM操縱子，分離的其核酸分子及它們的用途<130>FAPESP 201-P<140>PCT/IB01/01004<141>2000-05-09<160>19<210>1<211>654<212>DNA<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>1atgtgtacgg ttattctgat ggcttgcaat actgcaccgc attctctggc ctcttctctc 60ccggtacctg atgcactgct gtttccacaa gtgcagcctg aatacaaagt ttctcctggt120gacttattgt tgatcaaggt attccaagtc gatgatctgg agcgtcaggt ccgtgtggac180aacactgggc gtattaccct gccattgtta ggaagcattg atgtatccaa taaaggtgcg240gctgagttgg aaactctgat agccaatcgt taccgcagtg gctatctgca aaatcctcaa300gtttctgttt ttatccaaga agcgaatgca cgccgtgtta ccgtgactgg tgcagtgacc360gagccgggga gctatccatt gatcggtagc aacctgacat tgcagcaagt gattgctcag420gctaaaggta taaacacgct ggcgagtctt caaaacgtgg ttgtattccg tactgtcaaa480ggacagaaga tgttggcgcg ctttgatttg gcacgtatcg agcgtggtaa ggatcctgat540cctgagatct atcctggtga tctcgttgtt gtttaccgtt ccgacatgcg cttgtttttg600cgcactcttg ttgaaattac ccccttcgtt atggtctggc gcgcgtatcg ataa 654<210>2<211>1404<212>DNA<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>2atggattatc ccaatcaaac ttcttccgct ttgtttcact cctcagaacc attgggtctg 60aatcttcttg attatttacg tgtgttggtc agtcaatatt ggctgattat tggtgttgcc120
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<400>5gtgattcatg aaaaaaagta tgtgccagta cgaggaggga cattagcaca ctctccggga 60tctttatcag ttgggcgtga tgcacgtatt gatgcggcga agggactagg tatttttctg 120gtagtacttg gtcatgctaa agggcttcca gaatggtggg ttgtgctgat ttacagtttc 180cacgtgccgt tgttttttct gttatctggt tgggctgctg gcacgaatat gcgtcagtct 240ggattctgcg aatgtttgtt gcatttgatg cgtaccttac tggttccata tgtattcttt 300tttttcgttg gttatatcta ttggttgctt acccgtcata ttggtgcgaa ggatttgcgt 360tgggggatgc acccttggtg ggagccgttg aatggtttgt tgatgggggg aggaactgct 420ttgtatgttc atccgtcgtt gtggtttctt ccagcattgt ttgtgacgaa attaacctat 480caaatgttgt ctaagtatgt ttctttagaa cgattggtgt tgtttggtgg gatattttct 540tgggtatggg tagggttttt tncctgggtt tggtgtgcgt ttcccatttg ctttagatga 600attgcctatt gcatttttat ttttcgtttt tggagtgatg ggacgcagaa cgtcttggtt 660acggttgctc ccgaaaacaa gaaaagcgaa tatgatttta cttgccgtgt tgttgtttcc 720ttggtttctg ttggcgttgt gcaatgaaaa agttgatatg aatatgctta tttttggcaa 780ttcaccattt gtttttcatg tttccgcatt gttaggtgtg gcgatagtgt tatgtgcggc 840ggctcttgtt gagcaatggt cattggtaca atgggctggg cgtaatacgc tgttgatttt 900gtgcacgcat acgctagttt tttttgtgtt attcggagta ttgtctttgc tcggagggac 960atctggattg atcttggcat tgcttttttc agcaattacg ttgtgtttta ttccaatttt 1020tagatggata ttgatgaggt ggataccttg gtcactgggt gcatgttcat atatgcgatc 1080gcgttcatca tga1093<210>6<211>1143<212>DNA<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>6atgaaagtgg tgcatgttgt tcgtcaattt catccgtcaa ttggtgggat ggaggatgtg 60gtcttcaata ttgcgatgca gctgcatttg catgctggaa tcgatgttga tgtcgtgacg 120ttgaaccgag tatttactca gtctgatgtt ctacttccat gtactgataa gtatcagggt 180gtgtcgatcc agcgcattgg ttatcgtggt tcttcgcgtt atccattggc accatgggta 240ttgcgtatgt tggataaagc cgatgtgatt catgtgcacg gtattgattt tttttatgac 300tttctggcat tgactcgggt gttacatgga aagccaatgg tcgtttcaac gcacggtggt 360ttcttccata cggattatgc atcaagactt aaattacttt ggttcaatac gttgactagg 420ttatcagcgt tggcttatgc aaggattatt gcgagtagtg agagtgatgg tgcgttgttt 480tcaaagatcg tggcaccgag tcgattgcga gtcattgaaa atggcgtaga tgtggagaag 540tatgcaaggt gtggtgcttc ggaagctgga cgcactcttt tgtatttcgg gcgctggtcg 600atgaacaagg gattgttgga gacgttgcaa ttactcgctg tattgtatgt gttagatcca 660cgctggcgat taattattgc tggacgtgaa tatgattatg atcaggctgc gttggcgtat 720gaggtggata ggcttgggtt gtctgagcag gtgcattttc attgtagtcc gtcacagtcg 780cagttgcgct ttttaatgga gcaagcacag ttttttattt cactgtcgcg gcatgagggt 840tttggtatcg ctgcagttga ggcgatgagt gctggattaa ttcctgtctt gagtgatatt 900ccaccatttg cgcgtctaca tcgtgagtcc ggtttaggtg ttttggtcga tccattacaa 960
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Ala Ser Ser Leu Pro Val Pro Asp Ala Leu Leu Phe Pro Gln Val Gln20 25 30Pro Glu Tyr Lys Val Ser Pro Gly Asp Leu Leu Leu Ile Lys Val Phe35 40 45Gln Val Asp Asp Leu Glu Arg Gln Val Arg Val Asp Asn Thr Gly Arg50 55 60 65Ile Thr Leu Pro Leu Leu Gly Ser Ile Asp Val Ser Asn Lys Gly Ala70 75 80Ala Glu Leu Glu Thr Leu Ile Ala Asn Arg Tyr Arg Ser Gly Tyr Leu85 90 95Gln Asn Pro Gln Val Ser Val Phe Ile Gln Glu Ala Asn Ala Arg Arg100 105 110Val Thr Val Thr Gly Ala Val Thr Glu Pro Gly Ser Tyr Pro Leu Ile115 120 125Gly Ser Asn Leu Thr Leu Gln Gln Val Ile Ala Gln Ala Lys Gly Ile130 135 140 145Asn Thr Leu Ala Ser Leu Gln Asn Val Val Val Phe Arg Thr Val Lys150 155 160Gly Gln Lys Met Leu Ala Arg Phe Asp Leu Ala Arg Ile Glu Arg Gly165 170 175Lys Asp Pro Asp Pro Glu Ile Tyr Pro Gly Asp Leu Val Val Val Tyr180 185 190Arg Ser Asp Met Arg Leu Phe Leu Arg Thr Leu Val Glu Ile Thr Pro195 200 205Phe Val Met Val Trp Arg Ala Tyr Arg210 215<210>12<211>467<212>PRT<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>12Met Asp Tyr Pro Asn Gln Thr Ser Ser Ala Leu Phe His Ser Ser Glu1 5 10 15Pro Leu Gly Leu Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Val Leu Val Ser Gln20 25 30Tyr Trp Leu Ile Ile Gly Val Ala Ile Gly Ala Thr Ser Leu Ala Leu35 40 45Gly Val Ser Leu Leu Leu Pro Gln Lys Phe Arg Ala Thr Ala Thr Leu50 55 60Gln Ile Glu Arg Asp Val Pro Lys Val Met Asn Val Asp Asn Leu Ile65 70 75 80Pro Val Glu Ser Pro Leu Asp Arg Asp Phe Tyr Gln Thr Gln Tyr Gln
85 90 95Leu Leu Gln Ser Arg Ser Leu Ala Arg Ala Val Ile Arg Lys Met Asn100 105 110Leu Asp Arg Glu Pro Met Leu Lys Pro Leu Val Asp Lys Val Leu Ser115 120 125Lys Val Gln Asn Leu Pro Val Asn Thr Arg Asn Thr Ala Ile Glu Ser130 135 140Ala Leu Ile Glu Met Met Leu Asn Ser Leu Lys Ile Glu Pro Ile Leu145 150 155 160Asn Ser Arg Leu Val Tyr Val His Phe Asp Ser His Asp Pro Thr Leu165 170 175Ser Ala Lys Val Ala Asn Ala Tyr Ala Lys Met Phe Ile Glu Asn Asn180 185 190Gln Gln Arg Arg Ser Asn Ala Phe Ser Phe Ala Met Lys Tyr Leu Ala195 200 205Gly Arg Leu Glu Gln Leu Arg Ile Lys Val Asp Lys Ser Glu Arg Asn210 215 220Val Val Ala Tyr Ser Thr Asp Glu Lys Ile Val Ser Val Gly Asp Glu225 230 235 240Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Asn Leu Ser Asp Leu Asn Ala Leu Leu245 250 255Ala Ser Ala Gln Asn Glu Arg Ile Arg Ala Glu Ala Ser Trp Arg Gln260 265 270Ala Ser Ile Gly Asp Gly Leu Ser Ile Pro Gln Val Leu Ser Asn Leu275 280 285Leu Val Gln Ser Leu Arg Thr Glu Gln Ala Asn Met Val Asn Glu Tyr290 295 300Gln Gln Lys Leu Ser Met Phe Lys Pro Glu Tyr Pro Glu Met Gln Arg305 310 315 320Leu Lys Ala Arg Ile Lys Glu Asn Thr Lys Gln Ile Asn Ala Glu Val325 330 335Leu Asn Ile Arg Gln Ser Leu Lys Ser Gln Tyr Glu Ala Thr Leu Arg340 345 350Gln Glu Asn Leu Leu Asn Asp Arg Ile Ala Val Leu Glu Lys Asp Glu355 360 365Leu Asp Leu Lys Thr Arg Leu Ile Arg Tyr Asn Leu Leu Glu Arg Glu370 375 380Ala Glu Thr Asp Arg Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Leu Gln Arg Tyr Lys385 390 395 400Glu Ile Ser Val Leu Gly Asp Val Gly Ser Asn Asn Val Thr Val Val405 410 415Asp Ala Ala Asp Ile Pro Ser Arg Pro Ile Ser Pro Asn Leu Leu Met420 425 430Asn Thr Ile Leu Gly Gly Ile Phe Gly Val Phe Leu Gly Leu Thr Val
435 440 445Ala Met Val Arg Tyr Ser Met His Gly Ala Lys Arg Ile Asn Val Met450 455 460Ser Val Glu465<210>13<211>482 494<212>PRT<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>13Met Leu Leu Ala Asp Leu Asn Ser Val Thr Asp Ile Ala Ser Ser Pro15 10 15Arg Leu Leu Ser Lys Tyr Ser Ala Ala Ala Asp Leu Ile Leu Arg Val20 25 30Phe Asp Leu Thr Met Val Val Leu Ser Gly Val Met Ile Tyr Arg Leu35 40 45Leu Phe Gly Thr Trp Met Leu Met Val Pro Tyr Arg Ile Ala Ile Gly50 55 60Asn Thr Leu Leu Tyr Ser Val Ile Cys Phe Ser Phe Phe Pro Leu Tyr65 70 75 80Arg Ser Trp Arg Gly Arg Ala Leu Ala Arg Glu Leu Leu Val Leu Ser85 90 95Ser Ala Phe Cys Gly Val Phe Ile Leu Phe Ser Leu His Thr Leu Ile100 105 110Val Gln Leu Gly His Pro Val Ser Trp Leu Trp Ile Thr Phe Trp Phe115 120 125Leu Gly Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Ala Arg Val Ala Leu Arg Ser130 135 140Leu Leu Asn Trp Leu His Met Arg Gly Val Asp Val Gln Arg Ile Val145 150 155 160Val Val Gly Leu Arg His Pro Val Met Lys Ile His His Tyr Leu Asn165 170 175Arg Asn Thr Trp Thr Gly Met Gln Leu Ile Gly Tyr Phe Ser Thr Ser180 185 190Tyr Asp Val Ser Val Ser Glu Tyr Val Arg Arg Leu Pro Ser Leu Gly195 200 205Thr Pro Asp Arg Leu Phe Asp Phe Leu Glu Lys Asn His Val Glu Gln210 215 220Val Trp Ile Ser Met Pro Leu Gly Glu Arg Asp Tyr Ile Lys Thr Leu225 230 235 240Leu Lys Lys Leu Glu Arg Tyr Pro Ile Asn Val Lys Leu Ile Pro Asp245 250 255
Leu Phe Asp Phe Gly Thr Leu Asn Gln Ser Gly Glu Gln Ile Gly His260 265 270Val Pro Val Ile Asn Leu Arg Gln Gly Gly Val Asp Arg Asp Asn Tyr275 280 285Phe Phe Val Ala Lys Thr Ile Gln Asp Lys Val Leu Ala Met Ile Ala290 295 300Leu Leu Leu Leu Trp Pro Leu Leu Ile Ile Ile Gly Ile Gly Ile Lys305 310 315 320Phe Ser Ser Pro Gly Pro Val Leu Phe Arg Gln Arg Arg His Gly Leu325 330 335Asn Gly Arg Glu Phe Tyr Val Leu Lys Phe Arg Ser Met Arg Val His340 345 350Asp Asp Gln Ser Gln His Leu Lys Gln Ala Ser Arg Asn Asp Ser Arg355 360 375Ile Thr Ala Phe Gly Ala Phe Leu Arg Arg Thr Ser Leu Asp Glu Leu380 385 390Pro Gln Ile Phe Asn Val Leu Gly Gly Ser Met Ser Ile Val Gly Pro395 400 405 410Arg Pro His Ala Ala Gln His Asn Ser Tyr Tyr Glu Lys Leu Ile Gln415 420 425His Tyr Met Gln Arg His Tyr Val Lys Pro Gly Ile Thr Gly Trp Ala430 435 440Gln Val Asn Gly Phe Arg Gly Glu Thr Gln Glu Leu Arg Thr Met Lys445 450 455Lys Arg Ile Gln Tyr Asp Leu Asp Tyr Ile Arg Arg Trp Ser Leu Trp460 465 470Phe Asp Phe Arg Ile Ile Val Leu Thr Leu Val Arg Val Leu Gly Gln475 480 485 490Lys Asn Ala Tyr<210>14<211>424<212>PRT<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>14Met Leu Met Arg Met Arg Lys Ile Thr Lys Glu His Ser Arg Asn Leu1 5 10 15Leu Val Gly Ile Val Leu Phe Phe Gly Val Ala Tyr Asn Phe Pro Leu20 25 30Ala Met Ile Asn Ala Lys Val Phe Thr Val Thr Pro Val Met Thr Tyr35 40 45Ala Val Glu Leu Val Ile Tyr Phe Ala Cys Phe Ile Leu Gly Leu Ser50 55 60
Ala Leu Asp Arg Lys Arg Val Val Leu Val Met Ser Gly Leu Gly Phe65 70 75 80Leu Val Ala Leu Thr Leu Leu Arg Phe Leu Met Ser Leu Asp Phe Asp85 90 95Pro Lys Phe Phe Arg Asp Ala Leu Ile Pro Phe Ala Phe Leu Ile Leu100 105 110Gly Ala Ala Tyr Arg Gly Ser Leu Leu Arg Leu Phe Met Gly Met Ser115 120 125Ile Phe Ile Thr Phe Val Ala Val Phe Glu Leu Met Met Pro Asp Val130 135 140Tyr Gly Asp Ile Ala Asn Pro Lys Ser Tyr Phe Val Asn Ser Arg Gly145 150 155 160Ala Ser Ala Asp Gly Phe Trp Asn Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Leu Ser165 170 175Ala Thr Arg Pro Asp Glu Arg Asn Phe Phe Ala Gly Ser Asn Leu Pro180 185 190Arg Ala Ser Ser Val Phe Ile Glu Pro Val Thr Met Gly Asn Tyr Ile195 200 205Ile Phe Phe Ala Ala Ile Val Leu Val Phe Trp Arg Trp Met Ser Val210 215 220Ser Glu Leu Ile Leu Ser Ile Ala Met Ile Leu Phe Leu Ile Val Ala225 230 235 240Ser Asp Gly Arg Leu Ala Thr Gly Thr Cys Ile Leu Met Val Leu Leu245 250 255Ala Pro Phe Leu Lys Arg Phe Asp Gln Arg Phe Ala Phe Leu Leu Phe260 265 270Phe Ser Val Leu Leu Gly Gly Trp Phe Ile Val Gln Val Asn Gly Ile275 280 285His Ala Tyr Asp Lys Asp Thr Ile Leu Ser Arg Thr Phe Phe Ser Val290 295 300Tyr Ser Leu Ala His Leu Pro Leu Asp Ser Trp Phe Gly Leu Asp Val305 310 315 320Gln Ser Ser Tyr Arg Tyr Phe Asp Ser Gly Ile Ala Tyr Phe Ile Ala325 330 335Ser Gln Ser Val Ile Thr Val Leu Val Phe Leu Leu Ala Tyr Ser Phe340 345 350Leu Phe Asp Met Gln Ser His Glu Gly Arg Gly Phe Lys Asn Met Ala355 360 365Ile Phe Ala Phe Ala Leu Ser Leu Leu Val Ser Asn Ser Tyr Phe Ser370 375 380Ile Lys Thr Ser Ala Leu Trp Trp Phe Thr Cys Gly Cys Leu Trp Asn385 390 395 400Cys Ser Pro Lys Val Leu Ala Ala Lys Lys Asn Leu Val Glu Ala Arg405 410 415
Val Ile Ala Gln Gly Gly Val Ser420<210>15<211>372 363<212>PRT<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>15Met Ile His Glu Lys Lys Tyr Val Pro Val Arg Gly Gly Thr Leu Ala1 5 10 15His Ser Pro Gly Ser Leu Ser Val Gly Arg Asp Ala Arg Ile Asp Ala20 25 30Ala Lys Gly Leu Gly Ile Phe Leu Val Val Leu Gly His Ala Lys Gly35 40 45Leu Pro Glu Trp Trp Val Val Leu Ile Tyr Ser Phe His Val Pro Leu50 55 60Phe Phe Leu Leu Ser Gly Trp Ala Ala Gly Thr Asn Met Arg Gln Ser65 70 75 80Gly Phe Cys Glu Cys Leu Leu His Leu Met Arg Thr Leu Leu Val Pro85 90 95Tyr Val Phe Phe Phe Phe Val Gly Tyr Ile Tyr Trp Leu Leu Thr Arg100 105 110His Ile Gly Ala Lys Asp Leu Arg Trp Gly Met His Pro Trp Trp Glu115 120 125Pro Leu Asn Gly Leu Leu Met Gly Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Val His130 135 140Pro Ser Leu Trp Phe Leu Pro Ala Leu Phe Val Thr Lys Leu Thr Tyr145 150 155 160Gln Met Leu Ser Lys Tyr Val Ser Leu Glu Arg Leu Val Leu Phe Gly165 170 175Gly Ile Phe Ser Trp Val Trp Val Gly Phe Phe Pro Gly Phe Gly Val180 185 190Arg Phe Pro Phe Ala Leu Asp Glu Leu Pro Ile Ala Phe Leu Phe Phe195 200 205Val Phe Gly Val Met Gly Arg Arg Thr Ser Trp Leu Arg Leu Leu Pro210 215 220Lys Thr Arg Lys Ala Asn Met Ile Leu Leu Ala Val Leu Leu Phe Pro225 230 235 240Trp Phe Leu Leu Ala Leu Cys Asn Glu Lys Val Asp Met Asn Met Leu245 250 255Ile Phe Gly Asn Ser Pro Phe Val Phe His Val Ser Ala Leu Leu Gly260 265 270Val Ala Ile Val Leu Cys Ala Ala Ala Leu Val Glu Gln Trp Ser Leu
275 280 285Val Gln Trp Ala Gly Arg Asn Thr Leu Leu Ile Leu Cys Thr His Thr290 295 300Leu Val Phe Phe Val Leu Phe Gly Val Leu Ser Leu Leu Gly Gly Thr305 310 315 320Ser Gly Leu Ile Leu Ala Leu Leu Phe Ser Ala Ile Thr Leu Cys Phe325 330 335Ile Pro Ile Phe Arg Trp Ile Leu Met Arg Trp Ile Pro Trp Ser Leu340 345 350Gly Ala Cys Ser Tyr Met Arg Ser Arg Ser Ser355 360<210>16<211>380<212>PRT<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>16Met Lys Val Val His Val Val Arg Gln Phe His Pro Ser Ile Gly Gly15 10 15Met Glu Asp Val Val Phe Asn Ile Ala Met Gln Leu His Leu His Ala20 25 30Gly Ile Asp Val Asp Val Val Thr Leu Asn Arg Val Phe Thr Gln Ser35 40 45Asp Val Leu Leu Pro Cys Thr Asp Lys Tyr Gln Gly Val Ser Ile Gln50 55 60Arg Ile Gly Tyr Arg Gly Ser Ser Arg Tyr Pro Leu Ala Pro Trp Val65 70 75 80Leu Arg Met Leu Asp Lys Ala Asp Val Ile His Val His Gly Ile Asp85 90 95Phe Phe Tyr Asp Phe Leu Ala Leu Thr Arg Val Leu His Gly Lys Pro100 105 110Met Val Val Ser Thr His Gly Gly Phe Phe His Thr Asp Tyr Ala Ser115 120 125Arg Leu Lys Leu Leu Trp Phe Asn Thr Leu Thr Arg Leu Ser Ala Leu130 135 140Ala Tyr Ala Arg Ile Ile Ala Ser Ser Glu Ser Asp Gly Ala Leu Phe145 150 155 160Ser Lys Ile Val Ala Pro Ser Arg Leu Arg Val Ile Glu Asn Gly Val165 170 175Asp Val Glu Lys Tyr Ala Arg Cys Gly Ala Ser Glu Ala Gly Arg Thr180 185 190Leu Leu Tyr Phe Gly Arg Trp Ser Met Asn Lys Gly Leu Leu Glu Thr195 200 205
Leu Gln Leu Leu Ala Val Leu Tyr Val Leu Asp Pro Arg Trp Arg Leu210 215 220Ile Ile Ala Gly Arg Glu Tyr Asp Tyr Asp Gln Ala Ala Leu Ala Tyr225 230 235 240Glu Val Asp Arg Leu Gly Leu Ser Glu Gln Val His Phe His Cys Ser245 250 255Pro Ser Gln Ser Gln Leu Arg Phe Leu Met Glu Gln Ala Gln Phe Phe260 265 270Ile Ser Leu Ser Arg His Glu Gly Phe Gly Ile Ala Ala Val Glu Ala275 280 285Met Ser Ala Gly Leu Ile Pro Val Leu Ser Asp Ile Pro Pro Phe Ala290 295 300Arg Leu His Arg Glu Ser Gly Leu Gly Val Leu Val Asp Pro Leu Gln305 310 315 320Pro Gln Gln Ala Ala Val Ala Val Gln Gly Leu Ala Val Gln Val Asp325 330 335Thr His Phe Ile Asp Trp Arg Ser Gln Ala Met Ala Phe Ser Asp Arg340 345 350Tyr His Trp Arg Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gln Asp Glu Tyr Cys Arg355 360 365Ala Leu Gly Leu Gly Gly Glu Gln Glu Phe Leu Arg370 375 380<210>17<211>510<212>PRT<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>17Met Ser Asp Ser Val Val Ser Val Ser Ala Val Ser Glu Arg Ser Leu1 5 10 15Ala Ser Arg Ala Leu Gly Gly Ala Val Val Thr Met Leu Gly Gln Gly20 25 30Ala Arg Val Val Ile Gln Phe Ser Ile Ile Val Leu Leu Ala Arg Leu35 40 45Leu Asn Pro His Asp Tyr Gly Leu Met Ala Met Val Thr Ala Ile Val50 55 60Gly Val Ala Asp Ile Leu Arg Asp Phe Gly Leu Ser Ser Ala Ala Ile65 70 75 80Gln Ala Lys Gln Ile Thr Asn Ala Gln Arg Asp Asn Leu Phe Trp Ile85 90 95Asn Ser Val Ile Gly Leu Ala Leu Ser Leu Val Val Phe Val Ala Ala100 105 110Gln Leu Ile Ala Asp Phe Tyr Arg Glu Pro Ala Leu Val Thr Ile Thr
115 120 125Gln Val Leu Ala Ile Asn Phe Leu Leu Asn Gly Met Ala Thr Gln Tyr130 135 140Arg Ala Asn Leu Ser Arg Glu Met Arg Phe Gly Gln Leu Ala Leu Ser145 150 155 160Asp Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Leu Val Gly Val Ser Val Ala165 170 175Leu Val Gly Trp Gly Val Trp Ala Leu Val Leu Gln Gln Val Val Gln180 185 190Ala Val Ala Asn Leu Val Ile Ala Met Val Cys Ala Arg Trp Leu Pro195 200 205Gly Gly Tyr Arg Arg Gly Val Pro Met Gly Ser Phe Leu Ser Phe Gly210 215 220Trp Asn Leu Met Val Ala Gln Leu Leu Ser Tyr Ala Asn Arg Ser Val225 230 235 240Gly Gln Val Ile Ile Gly Tyr Arg Leu Gly Pro Asn Val Leu Gly Leu245 250 255Tyr Asn Arg Ala Phe Gln Leu Leu Met Met Pro Leu Asn Gln Val Ile260 265 270Ala Pro Ala Ser Ser Val Ala Leu Pro Val Leu Ser Gln Leu Gln Asp275 280 285Asp Arg Ala Arg Phe Asp Ser Phe Leu Leu Arg Gly Gln Thr Met Met290 295 300Leu His Val Ile Val Ala Leu Phe Ala Phe Ser Cys Ala Gln Ala Thr305 310 315 320Pro Leu Ile Val Leu Val Leu Gly Glu Lys Trp Arg Ser Ala Val Leu325 330 335Leu Phe Gln Ile Leu Thr Leu Ala Gly Met Thr Gln Ser Ala Ser Tyr340 345 350Ala Ser Tyr Trp Leu Phe Leu Ala Arg Gly Leu Ile Arg Asp His Leu355 360 365Leu Phe Ser Ile Val Ser His Val Phe Leu Val Leu Cys Val Cys Ile370 375 380Gly Ala Tyr Trp Gly Val Phe Gly Val Ala Ile Gly Tyr Ser Ile Ser385 390 395 400Leu Ala Leu Ile Trp Pro Leu Ser Ile Ile Trp Ala Ala Arg Ile Thr405 410 415Pro Val Pro Gly Trp Glu Met Phe Phe Asn Gly Met Arg Ala Ile Val420 425 430Gly Tyr Gly Val Cys Ala Phe Ala Ser Met Tyr Ala Ser Gln Trp Cys435 440 445Asp Glu Ser Asn Leu Trp Lys Gln Leu Ile Val Gly Ala Leu Ala Met450 455 460Leu Val Ala Phe Ala Val Leu Ser Leu Leu Trp Ser Ala Phe Arg Arg
465 470 475 480Asp Val Leu Ser Ile Ile Lys Ile Gly Met Ser Ser Ser Val Val Ser485 490 495Ser Phe Leu Leu Arg Ile Met Arg Arg Val Arg Lys Gly Ser500 505 510<210>18<211>281<212>PRT<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>18Met Leu Phe Arg Trp Tyr Val Gln His Pro Pro Glu Ile Leu Leu Gln15 10 15Trp Ile Arg Glu Ala Asp Ile Ile Leu Phe Glu Ser Gly Thr Ala Val20 25 30Ala Phe Ile Asp Met Ala Lys Arg Ile Asn Pro Ser Ala Arg Leu Ile35 40 45Tyr Asn Ala Ser Asp Ser Leu Ser Ala Ile Asn Val Ala Cys Tyr Ile50 55 60Glu Arg Glu Phe Gln Arg Val Ala Ala Ser Leu Asp Val Ile Ala Val65 70 75 80Val Ser Pro Ala Met Thr Lys Glu Ile Pro Ser His Gly Asn Val Phe85 90 95Tyr Ile Gly His Gly Val Leu Gln Asn Leu Ser Glu Leu Gly Gly Pro100 105 110Ser Pro Tyr Glu Gly Gly Ile His Ala Val Ser Val Gly Ser Met Leu115 120 125Phe Asp Pro Leu Phe Phe Val Val Ala Gly Lys Glu Phe Pro His Ile130 135 140Thr Phe His Val Ile Gly Ser Gly Met Gly Arg His Pro Asp Tyr Pro145 150 155 160Asp Asn Val Val Val Tyr Gly Glu Met Lys Tyr Val Glu Thr Ile Arg165 170 175Tyr Ile Arg His Ala Ser Phe Gly Ile Ala Pro Tyr Val Ser Gln Gln180 185 190Val Pro Glu Tyr Leu Ala Asp Ser Ser Met Lys Leu Leu Gln Tyr Asp195 200 205Phe Phe Gly Leu Pro Ala Val Cys Pro His Ala Val Val Gly Ser Tyr210 215 220Pro Thr Arg Phe Gly Tyr Thr Pro Gly Asn Ala Ile Glu Leu Val Ala225 230 235 240Ala Ile Lys Arg Ala Leu Gln Ala Pro His Gln Gln Ser Arg Gln Tyr245 250 255
Leu Ser Trp Glu Glu Val Val Ala Arg Val Leu Asp Pro Thr Ala Tyr260 265 270Glu Gly Thr Arg Ile Leu Pro Ala Val275 280<210>19<211>264<212>PRT<213>苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa〕<400>19Met Trp Ala Phe Gly Asp Phe Val Val Thr Ile Ser Gly Ile Ser Ser15 10 15Asp Pro Pro Phe Ile Glu Thr Ile Asp Thr Leu Leu Leu Gly Gly Phe20 25 30Pro Val Leu Ser Thr Thr Pro Ser Ala Phe Val Ala Ser Leu Tyr Arg35 40 45Ser Leu Thr Glu Glu Arg Pro Gln Arg Val Phe Phe Ala Asn Thr Asn50 55 60Phe Ile Val Gln Cys Gln Ser Leu Arg Gly Arg Met Tyr Ser Glu Arg65 70 75 80Val Cys Ile Leu Asn Asp Gly Ile Gly Met Asp Leu Ala Ala Leu Phe85 90 95Ile His Gly Arg Arg Phe Val Ser Asn Leu Asn Gly Thr Asp Leu Ile100 105 110Pro Tyr Leu Cys Gln His Ala Pro Arg Pro Leu Arg Phe Phe Leu Leu115 120 125Gly Ala Lys Pro Gly Val Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Leu Cys Gln130 135 140Leu Gly Gln Leu Val Val Gly Thr Cys Asp Gly Tyr Ala Gln Phe Ile145 150 155 160Ala Ala Gly Glu Asp Leu Val Glu Ser Ile Asn Ala Ser Gly Ala Asp165 170 175Val Leu Leu Val Ala Leu Gly Asn Pro Val Gln Glu Arg Trp Ile Leu180 185 190Asp His Asp Val Gln Leu His Thr Pro Leu Val Phe Gly Val Gly Ala195 200 205Leu Phe Asp Phe Met Ser Gly Asn Val Arg Arg Ala Pro Leu Trp Val210 215 220Arg Arg Val Arg Gly Glu Trp Leu Tyr Arg Leu Leu Leu Glu Pro Arg225 230 235 240Arg Leu Phe Lys Arg Tyr Ser Trp Asp Leu Arg Phe Phe Gly Val Cys245 250 255Leu Leu Arg Arg Arg Gly Val Asn260
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其含有編碼至少一種蛋白的核苷酸序列，或與其至少有70％相似性的核苷酸序列，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO11，12，13，14，15，16，17，18，19或20所示。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子或與其具有至少70％相似性的核苷酸序列，其編碼具有如SEQ ID NO11，12，13，14，15，16，17，18及19所示氨基酸序列的所有蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子或與其具有至少70％相似性的核苷酸序列，其含有至少一種如SEQ ID NO1，2，3，4，5，6，7，8或9所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子或與其具有至少70％相似性的核苷酸序列，其含有如SEQ ID NO10所示的核苷酸序列。
5.含有如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子的表達(dá)載體，其可操作地連接至啟動(dòng)子上。
6.含有如權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子的表達(dá)載體，其可操作地連接至啟動(dòng)子上。
7.含有如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子的重組細(xì)胞。
8.含有如權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子的重組細(xì)胞。
9.含有如權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的重組細(xì)胞。
10.含有如權(quán)利要求6所述表達(dá)載體的重組細(xì)胞。
11.含有如SEQ ID NO11，12，13，14，15，16，17，18或19所示氨基酸序列的分離的蛋白。
12.特異性結(jié)合權(quán)利要求11所述分離蛋白的抗體。
13.一種化合物，其通式為[葡萄糖-葡萄糖-甘露糖-葡萄糖醛酸]n，其中n是一個(gè)從1至大約5000的整數(shù)。
14.制備具有通式[葡萄糖-葡萄糖-甘露糖-葡萄糖醛酸]n的化合物的方法，其包括培養(yǎng)含有如權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子的細(xì)胞，待所述細(xì)胞產(chǎn)生所述化合物后，分離該化合物，其中在所述通式中，n是一個(gè)從1至大約5000的整數(shù)。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞是苛養(yǎng)木桿菌。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞是重組細(xì)胞。
17.一種確定物質(zhì)對XfGUM操縱子成員的影響的方法，其包括將含有如權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子的細(xì)胞與所述物質(zhì)接觸，確定所述物質(zhì)對于具有通式[葡萄糖-葡萄糖-甘露糖-葡萄糖醛酸]n的化合物的產(chǎn)生的影響，其中所述通式中的n是一個(gè)從1至大約5000的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及對來自生物體苛養(yǎng)木桿菌的操縱子的分離及鑒定。該操縱子被稱為XfGUM操縱子，其含有9個(gè)基因，參與具有黃原膠類似特性的化合物的產(chǎn)生，該操縱子的表達(dá)產(chǎn)物和基因以及它們的各種用途同樣是本發(fā)明的一部分。
文檔編號C12R1/01GK1496370SQ01813620
公開日2004年5月12日 申請日期2001年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月9日
發(fā)明者保羅·阿魯達(dá), 菲利普·R·達(dá)西爾瓦, 埃德森·L·肯珀, 安德烈·維托雷, 阿迪爾森·萊特, 馬西奧·J·達(dá)西爾瓦, J 達(dá)西爾瓦, L 肯珀, R 達(dá)西爾瓦, 維托雷, 保羅 阿魯達(dá), 森 萊特 申請人:圣保羅州研究獎(jiǎng)勵(lì)基金會(huì)