專利名稱：抑制白斑綜合征病毒(wssv)感染的組合物和方法
抑制白斑綜合征病毒(wssv)感染的組合物和方法相關(guān)申請
本申請要求美國臨時專利申請No. 60/501, 614 ( 2003年 9月9日遞交)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此全部引用作為參考。發(fā)明背景
病毒性疾病是全球蝦水產(chǎn)業(yè)中的主要問題，其導(dǎo)致^艮大的 經(jīng)濟(jì)損失。白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus (WSSV))是 最重要的病毒性病原體之一。由于WSSV導(dǎo)致的產(chǎn)業(yè)損失從1995-2002 年超過了 80億美元。WSSV感染的壞變得昏睡的，顯示食物消耗的降 低，松散的表皮，并且經(jīng)常在外骨骼下呈現(xiàn)白斑。該病毒感染大多數(shù) 的甲殼類動物，但是只對蝦是致死的。
WSSV病毒粒子是具包膜的核殼，其為桿狀，大約275 x 120 認(rèn)的大小，在顆粒的一個末端具有尾巴樣的突出部分 (Wongsteerasupaya Dis. Aqat. Org. 21: 69-77, 1995)。雙鏈環(huán)狀 DNA基因組大約305 kb (參見例如van Hulten等人，Virology 286:7-22,2001; WO 01/09340; WO 02/22664;和WO 03/070258)。根 據(jù)序列和系統(tǒng)發(fā)生分析，WSSV是稱為Nimaviridae的新病毒科的白點 病毒屬(Whispovirus)的成員，指的是病毒顆粒上的線樣的極性延伸。
雙鏈的WSSV基因組包圍于蛋白質(zhì)包膜中，所迷的蛋白質(zhì) 包膜又被雙層脂質(zhì)膜覆蓋。病毒蛋白穿插脂質(zhì)膜并從成熟的病毒的表 面伸出。所述的病毒蛋白質(zhì)與奸的腸內(nèi)層細(xì)胞表面上的受體分子相互 作用，使病毒膜與蝦的細(xì)胞膜非常靠近，因而導(dǎo)致兩個膜的融合，使 病毒DNA進(jìn)入奸細(xì)胞。
WSSV基因組已經(jīng)被測序(van Hulten等人，同上)，并且鑒定了潛在的病毒蛋白。已經(jīng)確定四種病毒蛋白質(zhì)作為核殼的一部分 或在病毒外膜表面上表達(dá)并定位。Vp28和VpW在病毒表面，Vp3S和 Vp26為核殼的一部分。
免疫學(xué)的證據(jù)表明VpM在病毒表面發(fā)揮作用，介導(dǎo)病毒 感染(VanHulten等人，Virology 285: 228-233， 2001)。這些研究 是利用Vp28的抗體進(jìn)行的，其抑制蚱細(xì)胞的病毒感染。但是現(xiàn)有技術(shù) 未確定與受體相互作用的Vp28區(qū)域。
本發(fā)明提供抑制白斑病毒感染的新的Vp28組合物和方法。發(fā)明簡述
本發(fā)明基于以下的發(fā)現(xiàn)，即Vp28是與甲殼類動物(例如 奸)和海洋昆蟲上的WSSV受體相互作用的主要蛋白質(zhì)。本發(fā)明因此提 供了通過施用Vp28與其受體相互作用的阻斷劑來抑制WSSV感染的方 法。本發(fā)明還提供了組合物，例如肽或抗體，其阻斷Vp28與受體的結(jié) 合，從而防止或抑制WSSV進(jìn)入細(xì)胞。附圖筒述


圖1舉例說明了用包含Vp28或Vp35的多肽(濃度為每噸 25克或每噸5克)喂養(yǎng)蝦時對WSSV感染的不同程度的防護(hù)效果。也 包括了對照。
圖2舉例說明了不同飲食的蝦暴露于WSSV之后的存活。 定義
此處使用的"Vp28肽"是指由SEQ ID NO : 2的28-204位 的至少8個連續(xù)的氨基酸組成的肽。優(yōu)選地，"Vp28肽"由SEQIDN0: 2 的28-204位的至少44個連續(xù)的氨基酸的氨基酸序列組成，即，該 氨基酸序列可能具有SEQ ID NO: 2的28-204位的至少8， 9， 10， 11, 12， 13， 14, 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26, 27， 28， 29， 30， 31， 32， 33， 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40， 41， 42或 43，并優(yōu)選至少44， 45， 46， 47， 48, 49, 50， 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57, 58， 59， 60， 61， 62， 63， 64， 65， 66， 67， 68， 69， 70， 71, 72， 73， 74， 75, 76， 77， 78， 79， 80， 81， 82， 83， 84， 85， 86， 87， 88， 89， 90， 91， 92， 93， 94， 95， 96， 97， 98， 99， 100, 101， 102， 103， 104， 105， 106， 107, 108， 109， 110， 111， 112， 113， 114， 115， 116， 117， 118， 119, 120, 121， 122， 123， 124， 125， 126， 127， 128， 129， 130， 131， 132， 133， 134， 135， 136， 137， 138， 139， 140， 141， 142， 143， 144， 145， 146, 147， 148， 149， 150， 151， 152， 153， 154， 155， 156， 157， 158， 159， 160， 161,162， 163， 164， 165， 166， 167， 168， 169， 170， 171， 172， 173， 174， 175， 176或177個連續(xù)的氨 基酸。"Vp28肽"由"Vp28多核苷酸"編碼，本申請所用的這兩個術(shù)語 都包括天然產(chǎn)生的和重組的形式。另外，"Vp28肽"和"Vp28多核苷酸'， 還可能包括包含一個或多個保守性替換的所有變體，其在下面詳述， 只要所迷的變體不改變"包含Vp28肽的多肽"抑制對蝦屬(Penaeus sp.)細(xì)胞的WSSV感染的能力。
此處所用的"包含Vp28肽的多肽"是指包含其一部分氨 基酸序列來自Vp28氨基酸序列，即上述的"Vp28肽"，而其氨基酸 序列的其他部分是與Vp28異源的，即來自非全長Vp28氨基酸序列的 來源。
"全長"Vp28蛋白或核酸是指多肽或多核苷酸序列或其變 體，其包含通常包含于一種或多種天然發(fā)生的野生型Vp28多核苷酸或 多肽序列中的所有元件。"全長"可能在各種翻譯后加工或剪接(包括 可變剪接)階段之前或之后。SEQ ID NO : 2是全長Vp28多肽的代表 性氨基酸序列。
術(shù)語"分離的"、"純化的"或"生物學(xué)純的"是指充分或基本 上不含有其天然狀態(tài)下所見的通常與其一起存在的成分的物質(zhì)。純度和均質(zhì)性通常使用分析化學(xué)技術(shù)如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相層 析進(jìn)行測定。為存在于制劑中的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)或核酸是充分純化 的。特別是，分離的核酸與天然包圍該基因并編碼蛋白的一些開發(fā)閱 讀框架分開，所述的蛋白不是該基因編碼的蛋白。在一些實施方案中
術(shù)語"純化的"是指核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中基本上產(chǎn)生一條帶。優(yōu)選地，其意味著所迷的核酸或蛋白質(zhì)是至少85%純，更優(yōu)選至少95 %純，并最優(yōu)選至少99%純。在其他實施方案中"純度"或"純化"是指 從欲被純化的組合物中除去至少一種污染物。在這種意義上，純化不 要求被純化的化合物是均一的，即100%純。
術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在這里互換使用，是指氨基 酸殘基的多聚物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是對應(yīng)的 天然發(fā)生的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸多聚物，也適用于天然 發(fā)生的氨基酸多聚物，那些包含修飾的殘基的多聚物和非天然發(fā)生的 氨基酸多聚物。
術(shù)語"氨基酸"是指天然發(fā)生的和合成的氨基酸，以及與天 然發(fā)生的氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然 發(fā)生的氨基酸是那些由遺傳密碼子編碼的氨基酸，以及那些后來修飾 的氨基酸，例如羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基 酸類似物是指與天然發(fā)生的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如與 氫結(jié)合的a碳，羧基，氨基和R基團(tuán))的化合物，例如，高絲氨酸、 正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜(methionine sulfoxide)、甲硫氨酸甲基 銳(methionine methyl suifonium)。這樣的類似物可能具有修飾 的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或修飾的主鏈，但是保持與天然發(fā)生的氨 基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的 一般化 學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)的化合物，但是其發(fā)揮與天然發(fā)生的氨基酸相似的 功能。
這里通過氨基酸通常已知的三字母符號或通過IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission建議的單字母符號來引用氨 基酸。同樣地，核苷酸通過其普遍認(rèn)可的單字母密碼來引用。
"保守性修飾的變體"對氨基酸和核酸序列都適用。對于特 定的核酸序列，保守性修飾的變體是指那些編碼相同或基本相同的氨 基酸序列的核酸，或者如果所述的核酸不編碼氨基酸序列時，是指基 本相同或相關(guān)(例如天然鄰接的序列)。由于遺傳密碼子的簡并性， 大量功能上相同的核酸編碼大多數(shù)的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、 GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每個由某一密碼子確定的 丙氨酸位置處，該密碼子可以被改變?yōu)樗龅钠渌鄳?yīng)的密碼子，而 不改變編碼的多肽。這種核酸變異為"沉默變異"，其是一種保守性 修飾的變異。此處所迷的每一編碼多肽的核酸序列還包括該核酸的沉 默變異。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到在一定的上下文中，核酸中的每 個密碼子(除了 AUG，其通常是甲疏氨酸的唯一密碼子，還有TGG，其 通常是色氨酸的唯一密碼子)都能被修飾產(chǎn)生功能上相同的分子。因 此，通常對于表達(dá)產(chǎn)物而非實際的探針序列而言，在所述的序列中包 含了編碼多肽的核酸中的沉默變異。
至于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到對核酸、肽、 多肽或蛋白質(zhì)序列的個別的替換、缺失或插入改變、添加或缺失編碼 序列中的單個氨基酸或少量氨基酸，如果所述的改變導(dǎo)致用化學(xué)類似 的氨基酸替換氨基酸，其是"保守性修飾的變體"。提供功能上類似 的氨基酸的保守性替換表本領(lǐng)域眾所周知。除了但是并不排除本發(fā)明 的多態(tài)性變體、種間同源物以及等位基因，該保守性修飾的變體通常 為如下的互相的保守性替換1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ; 2)天 門冬氛酸(D)，谷氨酸(E) ， 3)天門冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q); 4)精氨酸(R)，賴氨酸(K) ; 5)異亮氨酸U),亮氨酸(L)， 甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V) ; 6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y),色 氨酸(W) ; 7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)， 甲石克氨酸(M)(參見例如Creighton， proteins (1984))。
可以通過不同組織水平描述大分子結(jié)構(gòu)例如多肽結(jié)構(gòu)。 對于這種組織的一般描述，參見例如Albert等人，Molecular Biology of the Cell (3rd, 1994)和Cantor&Schimmel， Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)。 "一級結(jié)構(gòu)，，是指具體肽的氨基酸序列。"二級結(jié)構(gòu)"是指多肽內(nèi)局 部有序的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)被稱為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是通常形成該多 肽的緊密單元的多肽部分，并通常"至大約500個氨基酸長。典型的
結(jié)構(gòu)域由較弱組織部分例如P-折疊和a-螺旋片段組成。"三級結(jié)構(gòu)" 是指多肽單體的完整的三維結(jié)構(gòu)。"四級結(jié)構(gòu)，，是指通常由獨立的三 級單元通過非共價鍵締合形成的三維結(jié)構(gòu)。
"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"此處所用的語法上的 等價物是指至少兩個共價連接在一起的核苷酸。寡核苷酸通常大約5, 6， 7， 8， 9， 10， 12, 15， 25， 30， 40， 50或更多個核苷酸長或多 達(dá)大約100個核苷酸長。核酸和多核苷酸是任意長度的多聚物，包括 更長的長度，例如200、 300、 500、 1000、 2000、 3000、 5000、 7000、 10000等。本發(fā)明的核酸通常含有砩酸二酯鍵，但是在某些情況，包 括可能具有可變的主鏈以及肽核酸主鏈和鍵的核酸類似物，包含例如 氨基磷酸酯、硫代砩酸酯(phosphorothioate ) 、 二疏代磷酸酯(phosphorodithioate )或 O-methylphophoroamidite鍵(參見 Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)。其他類似物核酸包括那些具有正主鏈(positive backbone);非離子主鏈以及非核糖主鏈的核酸類似物， 包括那些描述于以下文獻(xiàn)中的核酸類似物美國專利Nos. 5235033和 5034506 , 以及 ASC Symposium Series 580 , Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui&Cook， Eds的第6 章和第7章。包含一個或多個碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸定義中?？?以為多種原因?qū)颂橇姿嶂麈溸M(jìn)行修飾，例如，為了增加該分子在生 理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期或作為生物芯片上的探針?？梢灾苽涮烊?發(fā)生的核酸和類似物的混合物；或可以制備不同核酸類似物的混合物 以及天然發(fā)生的核酸和類似物的混合物。
多種參考文獻(xiàn)公開了此類核酸類似物，包括例如氨基磷酸 酯鍵(Beaucage等人，Tetrahedron 49 (10) ) : 1925 ( 1993 )以及其 中的參考文獻(xiàn)；Letsinger， J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl 等人，Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Utsinger等人，Nucl. Acids Res. 14: 3487( 1986 );Sawai等人，Chem. Lett. 805 (1984)， Letsinger 等人，J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988);以及Pauwels等人，ChemicaScripta 26: 141 91986))，硫代磷酸酯鍵(Mag等人，Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991);以及美國專利No. 5644048)， 二硫代磷酸酯鍵 (Briu等人，J. Am.Chem.Soc. 111: 2321 (1989))， O-methylphophoroamidite鍵(參見Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)， 和 肽核酸主鏈和鍵(參見Egholm， J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier等人，Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson等人，Nature 380: 207 (1996)，所有這 些被引入以供參考)。其他類似物核酸包括具有正主鏈(Denpcy等人， Pro" Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995);非離子主鏈(U.S. Patent Nos. 5, 386, 023， 5, 637, 684， 5, 602, 240， 5,216,141和 4, 469, 863; Kiedrowshi等人，Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsinger等人，J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger等人，Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); ASC Symposium Series 580， "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y, S. Sanghui和P. Dan Cook, 第2章 和第3章；Mes歸eker等人，Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994); Jeffs等人，J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996))和非核糖主鏈的核酸，包括描 述于下列文獻(xiàn)中的那些U.S.專利Nos. 5， 235， 033和5， 034， 506， 以及ASC Symposium Series 580， "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook, 第 6 章和第7章。包含一個或多個碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義中 (參見Jenkins等人，Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176)。 Rawls， C & E News June 2， 1997笫35頁中也描述了幾種核酸類似物。所 有這些參考文獻(xiàn)在此引用以供參考。
其他類似物包括肽核酸(PM)，其為肽核酸類似物。與天 然發(fā)生的核酸的高電荷磷酸二酯鍵主鏈不同，這些主鏈在中性條件下 基本是非離子性的。這產(chǎn)生兩個優(yōu)點。首先該PNA主鏈表現(xiàn)改善的雜
交動力學(xué)。由于錯配的與完全匹配的堿基對，PNA在熔點溫度(TJ上具 有較大的變化。由于內(nèi)部錯配DNA和RNA通常在Tm上表現(xiàn)2-4X:的 下降。對于非離子型PNA主鏈，所述的下降接近7-9"C。類似的，由 于他們的非離子性質(zhì)，連接在這些主鏈上的堿基的雜交對于鹽濃度相 對不敏感。另外，PNA不被細(xì)胞酶降解，因此能更穩(wěn)定。
核酸可能是所述的單鏈的或雙鏈的，或含有雙鏈或單鏈序 列都有的部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，單鏈的描述也限定了互補 鏈的序列；因此，此處描述的序列也提供了該序列的互補序列。核酸 可能是DNA (基因組的和cDNA) 、 RM或雜合子，其中核酸可能包含 脫氧核糖核酸和核糖核酸的組合，以及堿基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸 腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤核苷、黃嘌呤、次黃嚟呤、異胞 嘧咬(isocytosine)、異鳥噤呤(isog磁ine)等的組合。"轉(zhuǎn)錄本" 通常是指天然產(chǎn)生的RNA，例如pre-mRNA、 hnMA或mRNA。此處所用 的術(shù)語"核苷"包括核苷酸和核苷以及核苷酸類似物和修飾的核苷，如 氨基修飾的核苷。另外，"核苷"包括非天然產(chǎn)生的類似物結(jié)構(gòu)。因此 例如肽核酸的單一單元，每個都包含堿基，在此稱為核苷。
在提到細(xì)胞或核酸、蛋白質(zhì)或載體時使用的術(shù)語"重組的" 是指所述的細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或栽體已經(jīng)通過引入異源核酸或蛋白 質(zhì)或天然核酸或蛋白質(zhì)的改變而被修飾，或者所述的細(xì)胞衍生自如此 修飾的細(xì)胞。因此，例如重組的細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的天然形式(非重 組的)內(nèi)不存在的基因，或者表達(dá)異常表達(dá)、低表達(dá)或根本不表達(dá)的 天然基因。此處的術(shù)語"重組核酸"是指未在天然情況通常發(fā)現(xiàn)的形式 的、 一般通過例如使用聚合酶和核酸內(nèi)切酶的核酸操作最初在體外形 成的核酸。以這種方式獲得了可操作連接的不同的核酸。因此，通過 連接通常不相連的DNA分子而體外形成的線性的分離的核酸或表達(dá)載 體都被認(rèn)為是本發(fā)明目的的重組的。應(yīng)當(dāng)理解一旦制備了重組的核酸 并重新引入宿主細(xì)胞或生物體，其將非重組地復(fù)制，即使用宿主細(xì)胞 的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)制而不是體外操作；但是，該核酸一旦被重組制備，盡管 其后是非重組復(fù)制的，但是其仍然被認(rèn)為是本發(fā)明目的的重組的。類 似地，"重組蛋白質(zhì)"是使用重組技術(shù)制備的蛋白質(zhì)，即通過上述的重 組核酸的表達(dá)制備的蛋白質(zhì)。
當(dāng)用于核酸部分時術(shù)語"異源的"是指該核酸包含兩個或 多個亞序列，所述的亞序列在自然中通常不以相同的相互關(guān)系存在。 例如，所述的核酸通常是重組產(chǎn)生的，具有兩個或多個序列，例如來 自安排用于制備新的功能性核酸的不相關(guān)基因，例如來自 一個來源的 啟動子和來自另一來源的編碼區(qū)。類似地，異源蛋白質(zhì)通常指兩個或 多個亞序列，它們在自然中不以相同的相互關(guān)系存在(例如融合蛋白 質(zhì))。
"啟動子"是指指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的一系列核酸控制序列。此處 所用的啟動子包括在轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必要核酸序列，例如在聚合 酶II型啟動子的情況下的TATA元件。啟動子可選地還包括遠(yuǎn)側(cè)增強 子或抑制子元件，其可以位于遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點多達(dá)幾千堿基對處。
"組成型"啟動子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的 啟動子。"誘導(dǎo)型"啟動子是環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動子。術(shù)語 "可操作連接，，是指核酸表達(dá)控制序列(如啟動子或系列轉(zhuǎn)錄因子結(jié) 合位點)與另一核酸序列之間的功能性連接，其中所述的表達(dá)控制序 列指導(dǎo)相應(yīng)于另一序列的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。
"表達(dá)載體"是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，具有一系列 的特定的核酸元件，所述的元件能使特定的核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。 所述的表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒的一部分或核酸片段。通常所迷的 表達(dá)載體包括與啟動子可操作性連接的欲被轉(zhuǎn)錄的核酸。
短語"與…選擇性(或特異性)雜交"是指如果在復(fù)雜 混合物(例如總細(xì)胞或文庫DM或RM)中存在特定的核苷酸序列，在嚴(yán)緊雜交條件下某一分子只與所述的特定的核苷酸序列結(jié)合、形成雙 鏈(duplexing)或雜交。
短語"嚴(yán)緊雜交條件"是指這樣一種條件，在該條件下，探針將與通常在核酸的復(fù)雜混合物中的其靶亞序列雜交，但是不與其 他序列雜交。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，在不同的情況會不同。較長
的序列在較高的溫度下特異性雜交。有關(guān)核酸雜交的廣泛的指南參見
Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)。對于特定的序列，在限定的離子強度pH下，通常選 擇嚴(yán)緊條件為低于熱熔解溫度(Tm) 5-IOC。 L是一定的離子強度、 pH和核酸濃度下的溫度，在該溫度平衡時50%的與靼物質(zhì)互補的探 針與靶序列雜交(當(dāng)靶序列過剩時，在L，在平衡時50%的探針被占 用)。嚴(yán)緊條件是如下的條件鹽濃度低于大約1. 0 M鈉離子，通常 大約O. 01 -l.OM鈉離子濃度(或其他鹽)，pH7.0 — 8.3， 對 于短探針(例如10-50個核苷酸)溫度為至少大約30°C，對于長探針 (例如大于50個核苷酸)是至少大約60t:。也可以通過加入去穩(wěn)定劑 如甲酰胺獲得嚴(yán)緊條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號至少是 背景的兩倍，優(yōu)選10倍于背景雜交。示例性的嚴(yán)緊雜交條件可以如下 50%甲酰胺，5x SSC，和1% SDS， 42"€溫育，或，5x SSC， 1% SDS， 65 n溫育，在65。C用0. 2x SSC和0.1°/。 SDS洗滌。對于PCR，通常大 約36t:的溫度用于低嚴(yán)緊性擴(kuò)增，但退火溫度可能根據(jù)引物的長度在 大約-48X:變化。對于高嚴(yán)緊性PCR擴(kuò)增，典型的溫度是大約62 C，但高嚴(yán)緊性退火溫度可以根據(jù)引物長度和特異性為大約50'C至 大約65X:。對于高和低嚴(yán)緊性擴(kuò)增的典型循環(huán)條件包括90'C - 95*C 30sec-2min.的變性階段，持續(xù)30 sec. - 2 min.的退火階段，和 大約72X: 1 - 2 min的延伸階段。在例如Innis等(1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications， Academic Press, Inc. N.Y.中提供了用于低和高嚴(yán)緊性擴(kuò)增反應(yīng)的方案和指南。在嚴(yán)緊條件下彼此不雜交的核酸如果他們編碼的多肽實質(zhì) 上相同，那么他們?nèi)允菍嵸|(zhì)上相同的。這種情況發(fā)生在例如當(dāng)使用遺
傳密碼子所允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝時。在這種情況下， 所述的核酸通常在中度嚴(yán)緊雜交條件下雜交。示例性的"中度嚴(yán)緊雜 交條件"包括在40%的甲酰胺、1MNaCl、 1。/。SDS的緩沖液中37C雜
交，在1XSSC中45n的洗滌。陽性雜交是背景的至少兩倍。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)該容易地認(rèn)識到可以使用替代的雜交和洗滌條件來提供類 似的嚴(yán)緊性條件。在許多參考文獻(xiàn)中提供了確定雜交參數(shù)的另外的指 南，例如Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001) 和 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人，eds. ， 1994).
"抗體"是指免疫球蛋白家族的糖蛋白或包含免疫球蛋白 片段的多肽，能夠非共價、可逆地并以特異方式結(jié)合相應(yīng)的抗原。典 型的抗體結(jié)構(gòu)單位是四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成， 每對具有一條"輕鏈"(大約25 kD)和一條"重鏈"(大約50-70 kD)， 通過二硫鍵連接。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括K 、入、a、 y、 5、 s和u恒定區(qū)基因以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。將輕鏈分為K 或入類。重鏈分為y、 u、 a、 5或s類，其依次分別限定了免疫球 蛋白種類IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。每條鏈的N-末端限定了可變區(qū)， 其大約100-H0或更多個氨基酸，主要負(fù)責(zé)抗原識別。術(shù)語可變輕鏈 (Vl)和可變重鏈(VJ分別是指輕鏈和重鏈的這些區(qū)。
此處所用的術(shù)語抗體包括單克隆和多克隆抗體，以及包括 體內(nèi)產(chǎn)生的抗體，例如用抗原免疫的動物產(chǎn)生的抗體，以及體外產(chǎn)生 的抗體，例如雜交瘤產(chǎn)生的抗體。該術(shù)語還包括單鏈抗體(ScFv)。
可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備單克隆或多克隆抗 體(參見例如Kohler & Milstein， Nature 256: 495-497, 1975 ; Kozbor等人，Immunology Today 4: 72,1983 ; Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan IL Uss， Inc.， 1985)?？梢孕薷闹苽鋯捂溈贵w的技術(shù)(U. S.專利No. 4,946， 778) 用于制備本發(fā)明的多肽的抗體。還可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠或其他生物如 其他哺乳動物來表達(dá)人源化抗體?；蛘呖梢允褂檬删w展示技術(shù)來鑒 定特異性結(jié)合選擇的抗原的抗體和異聚的Fab片段(參見例如， McCafferty等人，同上；Marks等人，Biotechnology, 10: 779-783,1992)。此處所用的用來描述抗原(例如Vp28多肽)和抗體之間 的相互作用的術(shù)語"特異性結(jié)合"是指結(jié)合于特定抗原上的抗體的檢測 是抗所述抗原的抗體的存在所決定的，所述的抗體通常存在于其他抗 體和蛋白質(zhì)的不均一群體中。在指定的免疫測定條件下，指定可檢測 的信號至少是背景信號的兩倍。因此，特異性的抗原抗體結(jié)合應(yīng)該產(chǎn) 生至少兩倍于背景的信號，更通常是高于背景IO倍至IOO倍的信號。此處所用的術(shù)語"白斑綜合征病毒(WSSV)感染的抑制"是 指在易感種動物中WSSV感染的發(fā)生率和嚴(yán)重程度的降低，如暴露于 WSSV后顯示疾病癥狀(包括死亡)的動物數(shù)量的降低所顯示的。如果 相對于對照群體，某一肽降低感染性至少10%,通常至少20%，典型 地至少50%或更高時就實現(xiàn)了 WSSV感染的抑制。此處所用的術(shù)語"甲殼類動物"包括任何和所有的甲殼類物 種，包括通常稱為"蝦"、"螃蟹"和"龍蝦"，如雙蝦屬(Penaeus )、 Litopenaeus、 Marsupenaeus、 Fenneropenaeus和Farfantepenaeus
的那些甲殼類動物。 發(fā)明詳述
I. 介紹本發(fā)明是基于以下的發(fā)現(xiàn)，即病毒蛋白質(zhì)Vp28介導(dǎo)WSSV和 細(xì)胞表面受體的結(jié)合，所述的結(jié)合是WSSV感染過程中的必要步驟。因 此，本發(fā)明提供了抑制WSSV感染的有效的手段，即通過給予易受WSSV 感染的物種無病毒的Vp28蛋白，由此細(xì)胞表面受體將不能被WSSV利 用。在本發(fā)明中已經(jīng)對Vp28片段(以及其相應(yīng)的編碼多核苷酸序列) 的阻斷WSSV結(jié)合、并因此抑制WSSV感染的能力進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。 因此，包含至少一個該Vp28的此類功能性片段的多肽可以被用于抑制 蝦、龍蝦、螃蟹、喇蛄(crawfish)和其他甲殼類動物的WSSV感染。
II. Vp28多肽 Vp28多肽是具有抑制WSSV感染能力的Vp28的片段。此 類片段包含SEQ ID NO: 2中28-204位的至少8個連續(xù)的氨基酸殘基。 所述的多肽可以是任何長度，但是優(yōu)選大小是150或更少的氨基酸。
示例性的片段如SEQ ID N0s : 3-8所示。Vp28多肽包括保持WSSV抑 制活性的包含保守性替換(例如Val替換Leu， Asp替換Glu， Lys替 換Arg或His,以及Gly替換Ser或Thr )的變體。
WSSV-抑制活性可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)容易地確定。 例如，可以使用實施例2舉例說明的方法評價一個肽的抑制壞或其他 甲殼類動物群體的WSSV感染的能力。通常通過測定感染后動物的存活 確定感染。如果相對于對照群體， 一個肽降低了至少10%，通常至少 20%,通常至少50%或更多的感染性，則實現(xiàn)了WSSV抑制。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，也可以使用終點法 (endpoint)而非存活來測定WSSV感染的水平。例如，可以使用WSSV 蛋白的抗體，包括本發(fā)明Vp28多肽的抗體確定感染性來確定感染水 平。A.原核和真核生物中重組體產(chǎn)量
可以使用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，根據(jù)編碼此處所述 多肽的多核苷酸序列制備本發(fā)明的Vp28多肽。教導(dǎo)本發(fā)明中使用的 一般重組技術(shù)方法的基礎(chǔ)教材包括Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler， Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 以及 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人，eds., 1994))。
核酸的大小以千堿基(kb)或堿基對(bp)表示。這是根據(jù)瓊脂糖或丙稀酰胺凝膠電泳，根據(jù)測序的核酸或根據(jù)公開的DM序列的估計。蛋白質(zhì)的大小以千道爾頓UDa)或辱基酸殘基數(shù)表示。蛋白質(zhì)大小是從凝膠電泳、測序的蛋白質(zhì)或從衍生的氨基酸序列或從公開的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行估計的。
不可商業(yè)獲得的寡核苷酸可以根據(jù)Beaucage &Caruthers，Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981)首次描述的固相氨基磷酸三酯法，使用自動化合成儀，按照Van Devanter等人，NucleicAcids Res. 12: 6159-6168 (1984)所述化學(xué)合成。通過天然丙稀酰
胺凝膠電泳或通過如Pearson & Reanier， J. Chrom. 255: 137-149 (1983)所述的陰離子交換HPLC純化寡核苷酸?？梢栽诳寺『笫褂美鏦allace等人，Gene 16: 21-26 (1981)的用于測序雙鏈模板的鏈終止法驗證克隆的基因和合成的寡核 苷酸的序列。
表達(dá)系統(tǒng)為獲得編碼Vp28多肽的核酸的高水平表達(dá)，通?？梢詫?編碼Vp28多肽的多核苷酸亞克隆入含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強啟動子、轉(zhuǎn)錄/ 翻譯終止子以及如果對于編碼蛋白質(zhì)的核酸時的用于翻譯起始的核糖 體結(jié)合位點的表達(dá)載體中。合適的細(xì)菌啟動子本領(lǐng)域公知，并在例如 Sambrook等人(同上)以及Ausubel等人(同上)中描述。用于表達(dá) Vp28多肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可在例如大腸桿菌(E. coli)、芽孢桿菌 屬(Bacillus sp.)、沙門氏菌屬(Salmonella)和柄桿菌屬 (Caulobacter)中獲得。用于此類表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒可以商業(yè)獲得。 用于哺乳動物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)為本領(lǐng)域公知， 并且可商業(yè)獲得。在一個實施方案中，所迷的真核表達(dá)載體是腺病毒 載體、腺伴隨載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。用于指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的啟動子取決于具體的應(yīng)用。所述 的啟動子可選地位于離該異源轉(zhuǎn)錄起點的距離與其在天然環(huán)境下離轉(zhuǎn) 錄起點的距離相同。但是正如本領(lǐng)域已知，該距離可以發(fā)生一些變異 而不影響啟動子功能。除了所述的啟動子，所述的表達(dá)載體通常含有轉(zhuǎn)錄單元或 表達(dá)盒，其含有Vp28多肽編碼核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的另外的元 件。因此典型的表達(dá)盒含有可操作連接于編碼Vp28多肽的核酸序列的 啟動子以及轉(zhuǎn)錄本有效多腺苷酸化所需的信號、核糖體結(jié)合位點以及 翻譯終止。編碼Vp28的核酸序列可能通常與可切割的信號肽序列連 接，以促進(jìn)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的編碼的蛋白質(zhì)的分泌。該信號肽可包括來自 組織纖溶酶原激活劑、胰島素和神經(jīng)元生長因子以及煙芽夜蛾
(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信號肽。如果基因組DM 被用作結(jié)構(gòu)基因，則表達(dá)盒的其他元件可以包括增強子，帶有功能性 剪接供體和受體位點的內(nèi)含子。除了啟動子序列外，表達(dá)盒還應(yīng)該包含結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn) 錄終止區(qū)以提供有效的終止。所述的終止區(qū)可從與啟動子序列相同的 基因獲得或可從不同的基因獲得。用于將遺傳信息轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的特別的表達(dá)載體不是非常 關(guān)鍵的?？梢允褂糜糜谠谡婧嘶蛟思?xì)胞中表達(dá)的任何常規(guī)載體。標(biāo) 準(zhǔn)的細(xì)菌表達(dá)載體包括質(zhì)粒，例如基于pBR322的質(zhì)粒，pSKF,pET23D， 以及融合表達(dá)系統(tǒng)，如GST和LacZ。也可以將表位標(biāo)簽添加到重組蛋 白上以提供方便的分離方法，例如c-myc。含有來自真核病毒的調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體通常用于真核 表達(dá)載體，例如SV40載體，乳頭瘤病毒載體以及衍生自EB (Epstein-Barr )病毒的載體。其他示例性真核載體包括pMSG， pAV009/A+， pMT010/A+， pMAMneo-5，桿狀病毒pDSVE，以及其他允許 在下列啟動子的指導(dǎo)下表達(dá)蛋白質(zhì)的載體SV40早期啟動子、SV40 晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、Rous肉瘤 病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或其他顯示對真核細(xì)胞中表達(dá)有效的 啟動子。 —些表達(dá)系統(tǒng)具有提供基因擴(kuò)增的標(biāo)志，如胸苷激酶、潮 霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶以及二氫葉酸還原酶?；蛘撸话ɑ驍U(kuò)增的高 產(chǎn)量表達(dá)系統(tǒng)也是合適的，如在昆蟲細(xì)胞中使用桿狀病毒載體，其中 Vp28多肽編碼核酸在多角體蛋白啟動子或其他強桿狀病毒啟動子的 指導(dǎo)下。通常包含于表達(dá)載體中的元件也包括在大腸桿菌中起作 用的復(fù)制子，能篩選帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌的編碼抗生素抗性的基因， 以及在質(zhì)粒非必須區(qū)域的唯一限制性位點以插入真核序列。所選擇的 特定的抗生素抗性基因不是關(guān)鍵的，本領(lǐng)域已知的許多抗性基因中的 任一種都適合。如果必要，可以任選原核序列，只要其不干擾真核細(xì)
胞中DM的復(fù)制。如上所迷，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到可以對任何Vp28多 肽或其編碼序列產(chǎn)生多種保守性替換而仍然保持其WSSV阻斷活性。另 外，也可以對多核苷酸編碼序列產(chǎn)生修飾以在特定表達(dá)宿主中提供偏 愛密碼子使用而不改變Vp28多肽的氨基酸序列。
轉(zhuǎn)染方法使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法來產(chǎn)生表達(dá)大量Vp28多肽的細(xì)菌、 哺乳動物、酵母或昆蟲細(xì)胞系，然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法純化所述多肽(參 見例如Colley等人，J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology， vol. 182 (Deutscher， ed. ， 1990))。通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行真核和原核細(xì)胞的轉(zhuǎn) 化(參見例如，Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss&Curtiss， Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu 等人，eds， 1983).可使用任何眾所周知的方法將外原核苷酸序列引入宿主 細(xì)胞中。這些方法包括使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、polybrene、原生質(zhì)體融合、 電穿孔、脂質(zhì)體、顯微注射、plasma載體、病毒載體以及任何其他 已知的用于將克隆的基因組DNA、 cDNA、合成DNA或其他外源遺傳物 質(zhì)引入宿主細(xì)胞的方法(參見例如Sambrook等人，同上)。只要所使 用的特定遺傳工程方法能成功地將至少一種基因引入能表達(dá)Vp28多 肽的宿主細(xì)胞。
重組多肽的純化將表達(dá)載體引入到所述的細(xì)胞之后，在有助于所述的Vp28 多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)方法從所述的培 養(yǎng)物中回收所述的多肽(參見例如，Scopes, Protein Purification : Principles and Practice (1982); U. S.專利No. 4, 673， 641; Ausubel等人，同上；以及Sambrook等人，同上)。
1.來自重組細(xì)菌的蛋白質(zhì)的純化當(dāng)本發(fā)明的Vp28多肽在轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中大量重組產(chǎn)生時
(通常在啟動子誘導(dǎo)之后，但表達(dá)可能是組成性的)，蛋白質(zhì)可能形 成不溶性的聚集體。有幾種方案可以適于蛋白質(zhì)包含體的純化。例如， 聚集體蛋白(以下稱為包含體)的純化通常涉及通過通常但不限于在
大約100-150|ug/ml的溶菌酶和非離子去污劑0.1 % Nonidet P40的 緩沖液中溫育來破壞細(xì)菌細(xì)胞而提取、分離和/或純化包含體?？梢允?用Polytron grinder(Brinkman Instruments, Westbury， NY)研磨細(xì) 胞懸液。或者，可以在水上超聲細(xì)胞。另外的裂解細(xì)菌的方法描述 Ausubel等人(同上)和Sambrook等人(同上)中，并且為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所已知。 —般離心所述的細(xì)胞懸液，將含有包含體的沉淀重懸于不 溶解包含體但洗滌所述的包含體的緩沖液中，例如20mMTris-HCl (pH 7.2)， 1 mM EDTA， 150 mM NaCl和2% Triton-X 100 (—種非離子 去污劑)?？赡苄枰貜?fù)洗滌步驟以盡可能多地除去細(xì)胞碎屑。保留 的包含體沉淀可重懸于合適的緩沖液中(例如20mM磷酸鈉，pH6. 8， 150 niM NaCl)。其他合適的緩沖液對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見 的。洗滌步驟后，加入既是強的氫受體又是強的氫供體的溶劑 (或者各具有所述特性之一的溶劑的組合)溶解包含體。然后形成包 含體的蛋白質(zhì)可能通過用相容性的緩沖液稀釋或透析復(fù)性。合適的溶 劑包括但不限于尿素(大約4 M-大約8 M)、甲酰胺(至少大約80%， 體積/體積)，和鹽酸胍(大約4M至大約8M)。 一些能增加形成聚集體 蛋白質(zhì)溶解的溶劑如SDS (十二烷基硫酸鈉)和70%的曱酸不適于用于 該方法中，因為可能引起蛋白質(zhì)的不可逆的變性，從而缺乏免疫原性和 /或活性。盡管鹽酸胍和類似的試劑是變性劑，但是其變性不是不可逆 的，除去(例如通過透析)或稀釋所述的變性劑，可以產(chǎn)生復(fù)性，使 得重新形成免疫學(xué)和/或生物學(xué)活性的目的蛋白質(zhì)。溶解后，所述的蛋 白質(zhì)可以與其他細(xì)菌蛋白質(zhì)通過標(biāo)準(zhǔn)的分離技術(shù)分離?；蛘?，可以從細(xì)菌周質(zhì)中純化蛋白質(zhì)，例如重組的Vp28 多肽。如果重組蛋白被運到細(xì)菌周質(zhì)中，則可以通過冷的滲透壓休克
(cold osmotic shock)以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分離細(xì) 菌周質(zhì)部分(參見Ausubel等人，同上)。為了從周質(zhì)中分離重組蛋白， 將所述的細(xì)菌細(xì)胞離心形成沉淀。將該沉淀重懸于含有20%蔗糖的緩 沖液中。為裂解細(xì)胞，將細(xì)菌離心并將沉淀重懸于冰冷的5 mM MgS04 中，并在水浴中保持大約IO分鐘。離心細(xì)胞懸液，傾析上清并保存。 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)的分離技術(shù)可以將存在于上清中的重 組蛋白與宿主蛋白分離。
2.用于純化的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分離技術(shù)
(a) 溶解度分級分離(Solubility Fractionation)經(jīng)常作為初始步驟，并且如果蛋白混合物復(fù)雜時，初始的 鹽分級分離可以從目的重組蛋白(例如重組Vp28多肽)分離許多不需 要的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(或來自細(xì)胞培養(yǎng)基的蛋白質(zhì))。優(yōu)選的鹽是硫 酸銨。硫酸銨通過有效降低蛋白混合物中的水量而沉淀蛋白。然后蛋 白質(zhì)基于其溶解度發(fā)生沉淀。越加疏水的蛋白越容易在較低的硫酸銨 濃度下沉淀。典型的方案是向蛋白溶液中加入飽合的硫酸銨使所得的 硫酸銨濃度為20 - 30%。這將沉淀大多數(shù)疏水性蛋白質(zhì)。棄掉沉淀(除 非目的蛋白是疏水性的)，并向上清中加入硫酸銨至已知沉的蛋 白的濃度。然后在緩沖液中溶解沉淀，并且如果必要通過透析或滲濾 除去過量的鹽。其他根據(jù)蛋白溶解度的方法(例如冷乙醇沉淀)為本 ^域技術(shù)人員所公知，且也可以用于分級分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物。
(b) 大小差異過濾基于計算分子量，可以使用不同孔徑(pore size)的膜 (例如Amicon或Millipore膜)的超濾將較大和較小的蛋白質(zhì)分離。 第一步，用具有比目的蛋白(例如Vp28多肽)分子量低的分子量截留 值的孔徑的膜超濾蛋白質(zhì)混合物。然后用具有大于目的蛋白質(zhì)的分子
量的分子截留值的膜對超濾的保留物進(jìn)行超濾。重組的蛋白質(zhì)將通過 膜進(jìn)入濾液中。然后可以如下所述對濾液進(jìn)行層析。
(c) 柱層析可以基于目的蛋白(如Vp28多肽)的大小、表面靜電荷、
疏水性和對配體的親和性將其與其他蛋白質(zhì)分開。另外，可以將針對
Vp28多肽產(chǎn)生的抗體綴合到柱基質(zhì)上，免疫純化Vp28多肽。所有這 些方法為本領(lǐng)域所公知。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，很顯然層析技術(shù)可以以任何規(guī)模 并使用來自許多不同的制造商(例如Pharmacia Biotech)的設(shè)備進(jìn) 行。
B. Vp28多肽的化學(xué)合成另外，本發(fā)明的Vp28多肽可使用常規(guī)的肽合成或其他本 領(lǐng)域公知的方案化學(xué)合成?？梢允褂妙愃朴贛errifield等人，J.Am. Chem. Soc. ， 85: 2149-2156 (1963); Barany和Merrifield， Solid-Phase Peptide Synthesis, The Peptides : Analysis, Synthesis, Biology Gross and Meienhofer (eds.)， Academic Press, N. Y. ， vol. 2， pp. 3-284 (1980);和Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis 2nd ed.， Pierce Chem. Co. ， Rockford， 111. (1984)中所描述的方法的方法 通過固相肽合成方法合成多肽。合成過程中，逐步加入具有保護(hù)的側(cè) 鏈的N-a-保護(hù)的氨基酸逐漸生成通過其C-末端連接至固相支持物 即聚苯乙烯珠子的多肽鏈。通過將N- a-去保護(hù)的氨基酸的氨基基 團(tuán)與N- a-保護(hù)的氨基酸的a羧基連接合成所述的肽，其中所述的N -a-保護(hù)的氨基酸已經(jīng)通過使其與如二環(huán)己基碳二亞胺的試劑反應(yīng) 而被活化。游離的氨基基團(tuán)與活化的羧基的連接導(dǎo)致肽鍵的形成。最 常用的N - cc-保護(hù)基團(tuán)包括酸不穩(wěn)定的Boc和堿不穩(wěn)定的Fmoc。適用于用作固體支持物的材料本領(lǐng)域技術(shù)人員公知并且 包括但不限于下列囟代曱基樹脂，如氯代甲基樹脂或溴代甲基樹脂； 羥甲基樹脂；酚樹脂，如4- (a- [2， 4- 二曱氧基苯基]-Fmoc-氨基 曱基)苯氧基樹脂；叔烷氧基羰基-酰肼化樹脂等。此類樹脂可商業(yè)獲 得，并且他們的制備方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知。簡言之，首先將C-末端N-oc-保護(hù)的氨基酸附著于固相 支持物。然后除去N-a-保護(hù)基團(tuán)。去保護(hù)的a-氨基連接到下一個N-
a-保護(hù)的氨基酸的活化的a羧基。重復(fù)該過程直至合成所需的肽。 然后將得到的肽從不溶性多聚物支持物上切割下來，并將氨基酸側(cè)鏈 去保護(hù)?？梢酝ㄟ^縮合保護(hù)的肽片段衍生較長的肽。關(guān)于合適的化學(xué)、 樹脂、保護(hù)基團(tuán)、被保護(hù)的氨基酸和試劑的細(xì)節(jié)都是本領(lǐng)域所公知的， 因此不在此詳細(xì)討論(參見Atherton等人，Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, I壯Press (1989)， 和Bodanszky， Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed. ， Springer-Verlag (1993))。III.本發(fā)明的Vp28多肽抗體的制備
可以通過多種來源獲得本發(fā)明的Vp28多肽的抗體。這些 抗體可能是天然產(chǎn)生的抗體，其需要分離、純化和優(yōu)選地定量。這些 抗體也可能是人工的它們可能是嵌合抗體或重組產(chǎn)生的抗體，包括 單鏈抗體(ScFv)。A.天然產(chǎn)生的抗體 1.產(chǎn)生具有所需的特異性的抗體
產(chǎn)生與目的免疫原特異性反應(yīng)的單克隆和多克隆抗體的 方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(例如參見Coligan， Current Protocols in I咖unology Wiley/Greene， NY，1991 ; Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY， 1989; StUes等人(eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos， CA，及其中引用的參考 文獻(xiàn)；Goding， Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice (2d ed. ) Academic Press, New York, NY, 1986; 和Kohler and Milstein Nature 256: 495-497, 1975)。這些技術(shù)包括通過選擇噬菌 體或類似栽體中的重組抗體文庫的抗體的抗體制備(參見Huse等人， Science 246:1275-1281， 1989; 和 Ward等人，Nature 341: 544-546，1989)。
為了制備具有對本發(fā)明的Vp28多肽的所需特異性的抗 體，可以從WSSV感染的細(xì)胞分離天然產(chǎn)生的多肽(例如包含SEQ ID NO :3或4的多肽)用于免疫合適的動物，例如小鼠，兔子或靈長類。標(biāo) 準(zhǔn)的佐劑如弗氏佐劑(Freund's adjuvant)可以用于標(biāo)準(zhǔn)的免疫程序 中。或者可以將來自Vp28多肽的合成的肽綴合栽體蛋白并隨后用作免 疫原。
通過取測試血樣并測定對目的抗原的反應(yīng)性滴度來監(jiān)測 動物對免疫原制劑的免疫應(yīng)答。當(dāng)獲得合適高滴度的該抗原的抗體時， 可以從所述的動物收集血液并制備抗血清。進(jìn)一步分級分離所述的抗 血清以富集與抗原特異性反應(yīng)的抗體，并隨后進(jìn)行抗體的純化，參見 Harlow和Lane (同上)，下文提供了抗體純化的一般描述。
可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的多種技術(shù)獲得單克隆抗體。 典型地，將用目的抗原免疫的動物的脾細(xì)胞一般通過與骨髓瘤細(xì)胞融 合而永生化(參見Kohler和Milstein， Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976)。其他的永生化方法包括例如用EB病毒、致癌基因或 逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化，或其他本領(lǐng)域已知的方法。針對具有所需特異性 和對抗原的親和性的抗體的產(chǎn)生對單一永生化細(xì)胞產(chǎn)生的集落進(jìn)行篩 選，并且可通過多種方法增加該細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量，包括 注射入脊推動物宿主的腹腔。
另外，本發(fā)明的Vp28多肽的抗體可由從已經(jīng)被通過施用 Vp28多肽免疫的動物取出的卵產(chǎn)生。優(yōu)選的動物包括禽類，如雞(特 別是產(chǎn)蛋母雞、鴨、火雞等?？赏ㄟ^例如肌內(nèi)注射、皮下注射、靜脈 注射或口服將Vp28多肽遞送到動物體內(nèi)。注射多肽的量可為lOjig-lmg或根據(jù)動物的條件變化，并且重復(fù)施用多肽直到卵黃中的抗體量 達(dá)到最大?？梢愿鶕?jù)常規(guī)的抗體分離方法從所述的卵中純化抗Vp28 多肽的抗體。所述的卵本身可以千燥的、粉狀的或含水形式用作抗體 的來源。詳細(xì)的描述可參見WO 03/070258，其在此全文引用作為參考。
另外，也可以根據(jù)Huse等人(同上)概述的一般方法通 過篩選人B細(xì)胞cDNA文庫鑒定編碼具有所需特異性抗體或該抗體的結(jié) 合片段的核酸序列，重組產(chǎn)生單克隆抗體。通過重組方法進(jìn)行抗體制 備的更詳細(xì)的描述可以參見以后部分。2.抗體純化
用于蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如那些描述于早前部分的 方法，都適于本發(fā)明的Vp28多肽抗體的純化。 B.人工制備的抗體1. 一般方法
除了天然產(chǎn)生的抗體外，也可使用人工制備的抗體實施本 發(fā)明。用于重組制備具有所需特異性的抗體的一般方法為相關(guān)領(lǐng)域的 技術(shù)人員所已知，并描述于許多出版物中。例如參見U. S.專利No. 5， 665， 570。簡而言之，可以通過多種克隆技術(shù)方法例如基于聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的克隆方法篩選B細(xì)胞cDNA文庫鑒定編碼具有所需 特異性的抗體的基因，并隨后在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)。對于重組DNA 技術(shù)的一般描述參見例如Sambrook和Russell, Molecular CloningA Laboratory Manual 3d ed. 2001; Kriegler， Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual 1990 ; 以及Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology 1994。
用于重組產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的另外的方法依賴 嵌合抗體技術(shù)。 一般而言，克隆編碼非人單克隆抗體(如鼠抗體)的可變區(qū)的基因并與人恒定區(qū)的編碼序列連接產(chǎn)生所謂的"人源化"抗 體。參見例如U. S.專利Nos. 5， 502， 167; 5， 607， 847; 5， 773， 247。 該通過宿主細(xì)胞產(chǎn)生的人源化嵌合抗體適于構(gòu)建要求保護(hù)的液體IgG 和IgM標(biāo)準(zhǔn)物(calibrators)。2. 轉(zhuǎn)染和表達(dá)
多種轉(zhuǎn)染方法、宿主細(xì)胞系、和表達(dá)栽體都適于重組抗體 的表達(dá)。這些主題的詳細(xì)描述可見早前的討論Vp28多肽重組制備的部 分。3. 重組抗體的純化
可通過上述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將重組抗體純化到充分純，包括利 用如硫酸銨等物質(zhì)的選擇性沉淀；柱層析，凝膠過濾，免疫純化方法 和其他方法參見例如U. S.專利No. 4, 673， 641; Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, 1982; Sambrook 和 Russell，同上；以及Ausubel等人，同上)。 IV. Vp28多肽及其抗體的施用 A.通過飼喂施用
本發(fā)明的Vp28多肽或其抗體可以通過銅喂施用于動物， 例如蝦。在此類實施方案中，所述的多肽或抗體優(yōu)選以保護(hù)所述的多 肽或抗體不受降解的方式配制。本領(lǐng)域中描述了許多此類制劑。例如， Vp28多肽或Vp28抗體可以下列制劑飼喂給動物，在該制劑中所述的 多肽或抗體被制備成乳劑，例如與油體(oil-bodies )聯(lián)合。此類制 劑在例如美國專利Nos. 5, 948， 682 ; 6， 146， 645;和6， 210,742 中已有描述。
通過飼喂施用的Vp28多肽或其抗體的量可以變化，但是 通常以大約0. 5g-500g/噸(ton)祠料的量存在，并且經(jīng)常以大約 lg-100g/噸伺料的量存在，通常為5-25或50g/噸飼料的量。
可以在生長的任何階段通過飼喂施用Vp28多肽或其抗 體。優(yōu)選可以在動物離開孵化場以后的任何時候在他們?nèi)菀妆┞队?WSSV的地方施用該多肽或抗體。
在一定的時間間隔將含有Vp28多肽或其抗體的伺料提供 給壞以維持保護(hù)。例如，對于在PL15或以上階段的蝦，優(yōu)選每天給予 該祠料3 - 4次；對于較大的動物，至少每天給予兩次該祠料。典型地， 銅喂頻率不低于每天一次。B.通過重組藻類施用
施用本發(fā)明的Vp28多肽或重組抗體的另外的方法是使用 重組藻類遞送系統(tǒng)，如美國專利申請No. 20030022359所描述的，此 處全文引用。簡而言之，所述的遞送系統(tǒng)是轉(zhuǎn)基因藻類，其包含轉(zhuǎn)基 因，所述的轉(zhuǎn)基因包含編碼至少一種肽例如Vp28多肽的多核苷酸，以及用于驅(qū)動所述的多核苷酸在藻類中表達(dá)的啟動子。優(yōu)選地，所述的 轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步包含終止轉(zhuǎn)錄的終止子以及轉(zhuǎn)錄所需的所有其他遺傳元 件。所述的轉(zhuǎn)基因藻類優(yōu)選進(jìn)一步表達(dá)該肽。
重組Vp28多肽或抗體的遞送可通過口服施用上述的轉(zhuǎn)基 因藻類實現(xiàn)，或?qū)⒈惶幚淼膭游锝氚退龅霓D(zhuǎn)基因藻類的混 懸液中。實施例
提供以下的實施例只是為了例證而不是為了限制。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將容易認(rèn)識到可改變或修飾許多非關(guān)鍵參數(shù)來產(chǎn)生基本相似 的結(jié)果。實施例1.病毒蛋白和蛋白片段的表達(dá)
評估了來自WSSV的四種主要核殼和包膜蛋白質(zhì)。使用 MacVector軟件包模擬了每種蛋白質(zhì)的一級和二級結(jié)構(gòu)基序。使用多 重預(yù)測算法(multiple predictive algorithms)對基于每種蛋白質(zhì) 的氨基酸序列對二級結(jié)構(gòu)特征的預(yù)測進(jìn)行了檢驗。平均來自每種預(yù)測 方法的結(jié)果，并使用該信息以及另外的對親水性、表面概率、撓性和 抗原性指數(shù)的預(yù)測性信息選擇欲在融合系統(tǒng)中表達(dá)的每種蛋白質(zhì)部 分?？赡軡撛诘嘏c病毒宿主中的細(xì)胞受體相互作用的病毒蛋白質(zhì)的部 分可能暴露于蛋白質(zhì)的表面。另外，每種蛋白質(zhì)的相互反應(yīng)性部分可 能被包含于單一結(jié)構(gòu)域中。通過使用預(yù)測性信息，選擇將預(yù)計與細(xì)胞 受體相互作用的每種病毒蛋白質(zhì)的可能部分。
4吏用Invitrogen/>司的PurePro Caulobacter表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)具有大約每升培養(yǎng)基1克被表達(dá)的蛋白的非常高 水平產(chǎn)量的潛力。這是一個優(yōu)勢，因為需要大量的蛋白質(zhì)進(jìn)行商業(yè)應(yīng) 用。該系統(tǒng)也分泌蛋白質(zhì)至培養(yǎng)基中，在那里其可以被容易地濃縮和 純化。另外，Caulobacter在非常廉價的培養(yǎng)基中生長良好，因此降 低了制備成本。
修改表達(dá)方案以使用標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵設(shè)備制備分泌的可溶性 蛋白形式的表達(dá)的蛋白融合體，這消除或簡化了被表達(dá)的融合蛋白的 溶解、復(fù)性和純化。實施例2.使用Vp28蛋白質(zhì)片段對WSSV感染的抑制
如下進(jìn)行使用Vp28片段對WSSV感染的抑制。使用總共12 只9升的塑料水族箱(31 ppt鹽度30匸)來從動物被接收到實驗結(jié)束時 安置動物。所述的箱子在兩上分離的架系統(tǒng)(rack system)上隨機(jī)分 布，每個架系統(tǒng)具有其自己的水循環(huán)系統(tǒng)。除了測試組，還使用兩個 崗哨箱(sentinel tank)和兩個陽性對照箱來分別監(jiān)測從暴露箱的可 能的病原體逃逸以及確定病毒的毒力。
制備6種實驗性祠料用于生物測定。兩種病毒融合蛋白， 一種含有Vp28片段，另一種含有Vp35片段，單獨使用或以兩種不同 的濃度組合使用來制備擠壓的祠料。在組織感染前祠喂未成熟的南美 白對蚱(Penaeus vannamei)該實驗飼料72小時。
如下檢驗WSSV的感染性。關(guān)閉水循環(huán)系統(tǒng)，加入等于箱 中總生物量5%的量的新鮮制備的WSSV陽性蝦組織。使蝦飼喂所述的 感染組織2小時，然后重新啟動水循環(huán)系統(tǒng)。幾乎所有的組織通常在 最初的幾分鐘內(nèi)被消耗掉，但是所述的蝦還在靜水中孵育以最大接觸。 在連續(xù)的3天進(jìn)行該過程。
在將壞暴露于WSSV感染的組織后，以每小時4. 5升的速 率更換水(每天更換1， 200% )。溫度維持在30。C。在病原體暴露之 后，繼續(xù)祠喂壞合適的實驗飲食或?qū)φ诊嬍?。對下列事項每天監(jiān)測動 物兩次，共14天祠喂形式的改變、改變的行為、形態(tài)改變以及死亡。 瀕死的蝦從箱中除去并凍存在-80。C用于以后的PCR分析。在30天終 止時，計數(shù)所有存活的蝦，處死并存檔用于以后的PCR分析。
結(jié)果表明祠喂含有表達(dá)的Vp28片段融合蛋白的飲食的蝦 防止蝦感染W(wǎng)SSV感染。平均80%的接受每噸25克或每噸5克的Vp28 融合體的箱中的蝦存活，而低于25%的對照蝦存活。Vp35融合蛋白沒 有表現(xiàn)對WSSV攻擊的任何防護(hù)作用。那些在祠料中接受Vp28和Vp35 融合蛋白混合物的動物也表現(xiàn)相對對照的增強的存活。實施例3.白斑綜合征病毒攻擊
將太平洋白蝦(南美白對蝦(Peneaus vannamei)，平均 重量5g)分組，并裝在位于水生生境架系統(tǒng)(Aquatic Habitats rack system )上的9升的流通箱中。每只箱有4 - 8只動物，每組3只箱子。
將人工海鹽溶解于Nano純的蒸餾水中至28ppt的最終鹽度，并保持在 28"C。將蝦置于9個箱中，并飼喂3種不同祠料中的一種。對照飼料 是Zeigler Brothers SI-35生長(grow-out)飼料。兩種實驗飼料 使用磨細(xì)的SI-35為基質(zhì)在實驗室制備。IgY飼料具有以0.1%加入的 抗Vp28 IgY。 Vp28銅料通過加入40ml/kg的來自CP Kelco run AB04903的粗液體培養(yǎng)基(估計的Vp28融合體濃度為10-40克/噸最 終的飼料)來制備。在該實驗中，Vp28融合體是通過Invitrogen's PurePro Caulobacter Expression System制備的Vp28片段1E (SEQ ID NO: 4)與來自Caulobacter cresentus的表面陣列蛋白RsaA融合 的重組多肽?？筕p28 IgY是在雞中產(chǎn)生的針對Vp28融合體的抗體。 所述的液體培養(yǎng)基已經(jīng)被冷凍6個月，并在使用前慢慢融化。融化的 液體培養(yǎng)基和反萃取(back-extracted)的最終飼料的Western印跡 顯示融合體90%完整。如實施例2所述將蝦暴露于WSSV進(jìn)行攻擊。 在最初WSSV暴露10天后以及在最終暴露7天后，給予不同祠料的不 同組的存活顯示于圖2中。
本申請中引用的所有專利、專利申請和其他公開包括公開 的氨基酸或多核苷酸序列在此整體引入作為參考，用于所有目的。 序列表SEQ ID NO :1編碼Vp28的核酸，CDS 323.937 登錄號AF173993121 181 241 301 361 421 481 541 G01 661 721 781 841 901 961 1021 1081SEQ ID NO : 2 Vp28全長多肽序列MDLSFTLSVVSAILAITAVIAVFIVIFRYHKTVTKT正THTDNIET麗DENLRIPVTAEV GSGYFKMTDVSFDSDTLGKDCIRNGKSDAQMKEEDADLVITPVEGRALEVTVGQNLTTFGAPIAATAGGNLFDMYVHVTYSGTETESEQ ID NO : 3 Vp28多肽片段4C (SEQ ID NO : 2的107-150, 44a- a-)cccaagagagcaaaacttcttcccca^ca_a_tctcctcgactsttctggcagacacatccgttgasggaatagaccctggcttactgtsacgtaaaaggcgacagctcgc仁tgccaattgtcctgttacgtactctgtggtttcacgaggttgtcatcaccttttttt仁tgtcctcgccgaaaaaaactcgtcatggatctttctttcactctttcggtcgtgtcggccatcctcgccstcactgctgtgattgctgtatttattgtgatttttaggtatcatcgaaacccaacatggatgcsttcctgtgactgctgaggttggatcaggct3cttceiagatgactgatgtgtcctttgattgggcaaaacaatggaaagtctgatgcacagaagatgcggatcttgtcatcactcccgtgcactcgaagtgactgtggggcagaatctcacctttgaggggtgtggaacgaaaga_tca_acatcactggttaacccatraaaggcctttgtcggtagctcC33C3CCtCCtccttcacccccgtctctattgatgaggatgaagttggcacctttgtgtgtggt3ccacctttggcgcaccaattgcagctaccgccggtggaaatcttttcgacatgfcacgtgcacgtcacctactctggcactgagaccgagtaaataaatcgtgcttttttstatagttaatattacaacaataagaattgaggaaaattttattgacctacttaaccttcttgctagtttaagtgactggawagtttagcaatattatccttgaacgggaaacatgcaccaatta
ALEVTVGQNLTFEGTFKVWNNTSRKIMTGMQMVPKINPSKAFVSEQ ID NO : 4 Vp28多肽片段IE (SEQ ID NO : 2的28—114 87 a. a.)RYHNTVTI(TIETHTDNIETNMDENLRIPVTAEVGSGYFKMTDVSFDSDTLGKIKIRNG KSDAQMKEEDADLVIT VEGRALEVTVGQSEQ ID NO : 5 Vp28多肽片段5A (SEQ ID NO : 2的102-204 103 a.a.)PVEGRALEVTVGQNLTFEGTFKVWNNTSRKINITGMQMVPK諸SKAFVGSSNTSSF TPVSIDEDEVGTFVCGTTFGAPIAATAGGNLFDMYVHVTYSGTETBSEQ ID NO : 6 Vp28多肽片段6A (SEQ ID NO : 2的150-204， 55 a, a,)SEQ ID NO : 7 Vp28多肽片段3E (SEQ ID NO : 2的28-204， 177a.a.)RYHNTVTKTIETHTDNIETNMDENLRIPVTAEVGSGYFKMTDVSFDSDTLGKIKIRNGGTETESEQ ID NO: 8 Vp28片段2D (SEQ ID NO: 2的28-150, 123 a. a.)RYHNTVTKT正THTDNIETNMDENLRIPVTAEVGSGYFKMTDVSFDSDTLGKJKIKNGKINPSKAFV
權(quán)利要求
1.分離的多肽，其包含Vp28肽，所述的Vp28肽由SEQ ID NO2的28-204位的至少44個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列組成，其中，所述的多肽抑制甲殼類動物的白斑綜合征病毒(WSSV)感染。
2. 權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID N0: 2 的28 - 204位的至少50個連續(xù)氨基酸。
3. 權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID NO: 2 的28 - 204位的至少100個連續(xù)氨基酸。
4. 權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID N0: 3、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。
5. 權(quán)利要求l的分離的多肽，其中所述的Vp28肽由SEQ ID NO: 7 的氨基酸序列組成。
6. 權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述的曱殼類動物是對壞屬成員。
7. 編碼多肽的分離的核酸，其中所述的多肽包含Vp28肽，所述的 Vp28肽由SEQ ID NO: 2的28 - 204位的至少44個連續(xù)氨基酸組成，其 中，所述的多肽抑制曱殼類動物的白斑綜合征病毒(WSSV)感染。
8. 權(quán)利要求7的分離的核酸，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID NO: 2 的28 - 204位的至少50個連續(xù)氨基酸。
9. 權(quán)利要求7的分離的核酸，其中所述的Vp28肽包含SEQIDNO:2 的28 - 204位的至少100個連續(xù)氨基酸。
10. 權(quán)利要求7的分離的核酸，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。
11. 權(quán)利要求7的分離的核酸，其中所述的Vp28肽由SEQ IDNO: 7的氨基酸序列組成。
12. 權(quán)利要求7的分離的核酸，其中所述的甲殼類動物是對蝦屬成員。
13. 抑制甲殼類動物白斑綜合征病毒(WSSV)感染的方法，所述的方法包括給所述的甲殼類動物施用多肽，其包含Vp28肽，所述的Vp28 肽由SEQ ID NO: 2的28 - 204位的至少44個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列 組成。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID N0:2的 28 - 204位的至少50個連續(xù)氨基酸。
15. 權(quán)利要求13的方法，其中所述的Vp28肽包含SEQ IDN0:2的 28 - 204位的至少100個連續(xù)氨基酸。
16. 權(quán)利要求13的方法，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8。
17. 權(quán)利要求13的方法，其中所述的Vp28肽由SEQ ID N0:7的氨 基酸序列組成。
18. 權(quán)利要求13的方法，其中所述的施用包括給所述的甲殼類動 物喂祠所迷的多肽。
19. 權(quán)利要求13的方法，其中所述的甲殼類動物是對蝦屬成員。
20. 抑制甲殼類動物白斑綜合征病毒(WSSV)感染的方法，所述的 方法包括給所述的甲殼類動物施用多肽，該多肽包含SEQ ID N0:2的氨 基酸序列。
21. 甲殼類動物的祠料，其中所述的飼料包含權(quán)利要求1中所示的 多肽或包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列的多肽。
22. 權(quán)利要求21的祠料，其中所述的甲殼類動物是對蝦屬成員。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制甲殼類動物，特別是對蝦屬種(Penaeus sp.)的甲殼類動物的白斑綜合征病毒(WSSV)感染的新組合物。更具體而言，所述的新組合物包含多肽或特異結(jié)合所述多肽的抗體，其中所述的多肽的氨基酸序列對應(yīng)于WSSV的表面蛋白Vp28的至少一部分。還公開了編碼本發(fā)明的Vp28多肽的多核苷酸序列。還公開了使用所述新組合物抑制甲殼類動物的WSSV感染的方法。
文檔編號C07H21/04GK101166752SQ200480028623
公開日2008年4月23日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日
發(fā)明者K·R·克里姆佩爾 申請人:艾克博蒂技術(shù)公司