專利名稱：對硝基苯－α－D－葡糖苷的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到α-D-葡萄糖苷酶(α-Glu)的底物對硝基苯α-D-葡萄糖苷(PNPG)的制備，及用該底物測定相應(yīng)的尿酶α-Glu的方法。
背景技術(shù)：
對硝基苯α-D-葡萄糖苷(PNPG)作為α-D-葡萄糖苷酶(α-Glu)的底物，其用途主要有四個方面①檢測中性α-D-葡萄糖苷酶(α-Glu)，作為特異性標(biāo)記酶(WHO推薦的)進行測定，診斷附睪功能障礙，從而評價優(yōu)生優(yōu)育和計劃生育效果。②可用來診斷腎疾患α-Glu，主要存在于腎小管上皮細胞刷狀緣，此酶在血清中含量很微，且分子量大，不易通過腎小球，因而尿中的α-Glu主要來自腎小管上皮細胞，故有“腎實質(zhì)酶”之稱，在各種腎實質(zhì)疾患及藥物中毒造成腎小管損傷時，此酶活性增高。尿中α-Glu的活性升高，作為腎小管損傷腎疾患的敏感指標(biāo)，在腎疾病四項關(guān)鍵尿液酶的檢驗中α-Glu作為一項。本法可以診斷的腎疾患有腎小球腎炎、腎病綜合癥、腎的藥物中毒、高血壓腎病和糖尿病腎病的早期診斷，其它腎病的診斷和預(yù)后判斷等。③檢測血清酸性α-Glu，確診糖原累積癥(Pompe)臨床上由于缺乏酸性α-Glu導(dǎo)致II型糖原累積癥，嬰兒表現(xiàn)肌張力低，心臟擴大，死于心力衰竭，成人表現(xiàn)肌無力。④在糖尿病治療中，用來篩選α-Glu抑制劑的天然藥材。此外，α-Glu的檢測還對一些代謝類疾病有意義，對肝炎、肝硬化、泌尿系統(tǒng)腫瘤(尤其是膀胱癌)有一定的參考價值，還用于溶酶體疾病和細菌酶分析。
1、關(guān)于對硝基苯α-D-葡萄糖苷(PNPG)的合成，報道較少，其合成通法是以葡糖為原料經(jīng)醋酸酐乙?；?，然后與對硝基苯酚縮合，再用甲醇鈉水解得到。第一步一般以公知醋酸酐/醋酸鈉進行乙酰化。此步收率也較高。第二步縮合反應(yīng)是關(guān)鍵，國外報道以溶劑法合成，參考日本專利用二氯甲烷作溶劑，反應(yīng)在回流下進行，可在低溫下縮合。此法反應(yīng)體系內(nèi)部均勻、溫和，但是收率較低，一般在10％-25％之間。國內(nèi)文獻報道類似物如α-巖藻糖苷的合成是用常壓熔融縮合法，這種常壓熔融法經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，糖反應(yīng)溫度極難掌握，要么反應(yīng)不完全，要么焦化，反應(yīng)產(chǎn)生大量乙酸，使反應(yīng)難向正向進行。
水解反應(yīng)也是關(guān)鍵一步，由于色團與糖基的不同使水解反應(yīng)條件差異很大，故不能套用通法。一般文獻只提及到用甲醇鈉水解，但其加入量、速度、pH值、溫度均未報道，用現(xiàn)有文獻試驗，其反應(yīng)或不完全，或過量分解。
2、關(guān)于尿液α-葡萄糖苷酶的檢測方法，目前國內(nèi)由于沒有與此α-Glu相對的底物，檢測方法是經(jīng)過三步法，即以麥芽糖為底物，經(jīng)α-Glu生成α-葡糖，再經(jīng)葡糖氧化酶成葡糖酸內(nèi)酯，再經(jīng)過氧化物酶形成紅色醌亞胺，本操作過程長，復(fù)雜，影響因素較多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對硝基苯-α-D葡糖苷的制備方法及其在尿液α-葡萄糖苷酶的檢測方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的對硝基苯-α-D葡糖苷的制備，是經(jīng)過以下步驟制得——β-五乙酰葡糖的制備以葡萄糖為原料進行乙酰化反應(yīng)，取0.25-0.28mol干燥葡糖，無水醋酸鈉0.4-0.6mol，醋酐2.6-3.0mol溫?zé)崛芙?，水浴上加熱回流并時時振搖1-3h，攪拌下倒入8-15倍于醋酐量的冰水中，攪拌1-3h，析出大量淺色結(jié)晶，過濾，水洗結(jié)晶，干燥，制得β-五乙酰葡糖粗品，用5-8倍量95％乙醇重結(jié)晶，得到β-五乙酰葡糖結(jié)晶，熔點mp132-134℃；——對硝基苯-α-D四乙?；咸擒盏闹苽湟陨喜溅?五乙酰葡糖為原料進行縮合反應(yīng)，以3倍-5倍克分子的對硝基苯酚縮合并作為熔媒，在攪拌下和減壓下，120-127℃油浴中使體系熔融，加入新炒過的氯化鋅，用量為β-五乙酰葡糖重量的1/4至1/3，反應(yīng)1-2h，待體系變黑，冷至60℃時，按重量體積比加入β-五乙酰葡糖的10-15倍的苯溶解縮合物，用等體積水洗，再用等體積1mol的NaOH或飽和的碳酸鈉液洗至無色，再用水洗，分出苯層，加入無水硫酸鈉和活性碳攪拌0.5-1.5h，干燥，脫色，濾液在40-55℃水浴下減壓蒸去苯，制得糖漿，糖漿以少量無水乙醇熱溶后待析品，3天后收集結(jié)晶，并以乙醇重結(jié)晶，制得對硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷，熔點mp111-113℃。
——對硝基苯-α-D葡糖苷的制備取上步的對硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷進行水解反應(yīng)，按重量體積比加入對硝基苯-α-D四乙?；咸擒?-5倍的干燥過的無水甲醇，攪拌下滴加1N或0.5N甲醇鈉0.2-0.8ml，有析出物后，冰箱過夜，次日收集結(jié)晶，用無水乙醇重結(jié)晶，制得對硝基苯-α-D葡糖苷，熔點mp216-217℃。
一種用上述方法制得的對硝基苯-α-D葡糖苷在尿液α-葡糖苷酶的檢測中的應(yīng)用，是用特異性底物對硝基苯-α-D葡糖苷去檢測尿中的α-葡糖苷酶，以診斷腎損傷，其步驟如下——試劑的配制緩沖液0.1mol/l pH5.6磷酸鹽緩沖液；終止液0.1mol/l NaoH；對硝基酚貯存液6mmol/l用0.01mol/l HCl溶液配制；對硝基酚應(yīng)用液600μmol/l用0.02mol/l NaoH液稀釋貯存液；——底物緩沖液采用底物對硝基苯-α-D葡糖苷在上述緩沖液中的濃度為20mmol/l；——酶促反應(yīng)時間在4h處；孵育溫度37℃，酶作用最佳pH值為5.6；——尿液α-葡萄糖苷酶的測定方法如下

405nm處測定吸光度。
發(fā)明的優(yōu)點及效果1、本發(fā)明是國內(nèi)率先研究合成的α-葡糖苷酶底物之一對硝基苯-α-D吡喃葡糖苷(PNPG)。經(jīng)紫外、紅外、核磁共振、元素分析等確認，所合成底物均能達到國外產(chǎn)品水平。2、合成方法上進行了改進和提高將熔融法縮合常壓改為減壓，防止了糖的焦化，及時抽走產(chǎn)生的酸，使反應(yīng)容易進行，α型縮合物(對硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷)的收率能達25％-30％，并且省掉柱層析分型精制。水解反應(yīng)，改為滴加堿液，防止了水解不全和水解過度問題，當(dāng)原料溶解之時，隨后便是產(chǎn)物出生之時，這樣將文獻報道的5小時水解，縮短為10-20分鐘，且收率達到60％-70％。3、用自行合成的底物，率先按WHO的規(guī)范方法研究建立精漿中性α-葡糖苷酶的檢測方法，屬國內(nèi)領(lǐng)先，與進口試劑相比，無顯著性差異?？梢源孢M口試劑。4、用自行合成的專屬性底物，測定尿液α-Glu，可一步完成，方法簡單價格低廉，可在肌酐升高之前檢測，可作為腎損傷的早期指標(biāo)；本方法國內(nèi)領(lǐng)先.一步法測定國內(nèi)外未見報道，為臨床檢測提供一個專用的新方法。
具體實施例方式實施例1、對硝基苯α-D吡喃葡糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)的合成1、β-五乙酰葡萄糖的制備1000ml三頸瓶中，加入50g干燥的葡萄糖，40g無水醋酸鈉，250ml醋酐，溫?zé)崾怪芙?，水浴上加熱回流并時時振搖2h，攪拌下倒入2500ml冰水中，電磁攪拌3h，析出大量淺色結(jié)晶，傾去上層液體，過濾，水洗兩次，干燥，得粗品84g。用7倍量95％乙醇重結(jié)晶，得雪白結(jié)晶69g，mp132-134℃(文獻值132℃)2、對硝基苯-α-D-四乙酰葡糖苷的制備
24g對硝基酚，15g β-五乙酰葡萄糖混合攪拌下于125℃油浴中熔融后加入新炒過的氯化鋅3.5g，減壓下反應(yīng)，125℃油浴加熱1h，隨后冷卻至60℃，加入200ml苯，用等體積水洗兩次，等體積1mol/L NaOH水溶液洗7次，使溶液近無色，再用水洗兩次，分出苯層，加入氯化鈣及活性炭干燥脫色，攪拌1h后過濾，濾夜在45℃以下水浴減壓蒸去苯，得一糖漿，糖漿30ml無水乙醇熱溶后待析品。3天后收集結(jié)晶，并以乙醇重結(jié)晶至熔點不變，得4.5g，mp111-113℃(文獻值113℃)。
3、對硝基苯-α-D-葡糖苷的制備取8g對硝基苯-α-D-四乙酰葡糖苷，加干燥過的無水甲醇40ml，攪拌下滴加1N甲醇鈉約0.4ml，10分鐘后由澄清開始變混，有析出后，冰箱過夜，次日收集析出物，干燥，多次用無水乙醇重結(jié)晶，得3.5g，mp216-217℃，[α]D20+218.8(水0.500)。(文獻值212-214℃，[α]D22+203.3甲醇；mp210℃[α]D20為+215℃水)PNPG的結(jié)構(gòu)確認元素分析(C12H15NO8)理化值C 47.84％H 5.02％N 4.65％測試值C 47.95％H 5.07％N 4.69％紅外光譜(kBr)3452，3294(-OH)；2925(-C＝C)；1608，1487(ph)；1346(-NO2)；1236(-O-C)核磁共振譜(溶劑D2O+DMSO-D6，內(nèi)標(biāo)TMS，頻率200)8.147.25(m，4H，ph)5.57(d，1H)3.18-3.67(糖上H，9H)3.48-3.93(m 6H，H2-6)紫外最大吸收302nm，比旋光度[α]D20+218°(C 0.500，H2O)實施例2、尿液α-葡萄糖苷酶的測定方法1.本發(fā)明試劑的配制1.1底物緩沖液PNP-α-D-比喃葡萄糖苷(天津醫(yī)藥研究所合成)用0.1mol/lpH5.6磷酸鹽緩沖液配制，4℃冰箱保存；1.2終止液0.1mol/l NaoH；1.3對硝基酚貯存液(6mmol/l)用0.01mol/l HCl溶液配制，避光，4℃冰箱保存；1.4對硝基酚應(yīng)用液(600μmol/l)用0.02mol/l NaoH液稀釋貯存液，現(xiàn)配現(xiàn)用；1.5肌酐測定試劑購于Randox公司(857CR)；
2、測定方法見表1表1 α-Glu測定方法

405nm處測定吸光度其測定原理
對硝基酚在堿性溶液中呈現(xiàn)黃色，在405nm測定單位定義及標(biāo)準(zhǔn)曲線1升尿液中的α-Glu在37℃水解底物PNP-α-D-吡喃葡萄糖苷每分鐘生成1μmol的PNP相當(dāng)于1單位酶活力(U/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

結(jié)果統(tǒng)計采用兩樣本均數(shù)及樣本均數(shù)與總體均數(shù)比較的t檢驗和相關(guān)回歸分析。
實施例3、尿液α-Glu測定的方法學(xué)1.α-Glu Km值的測定測定同一份標(biāo)本在不同底物濃度時的吸光度，每管重復(fù)三次，取均值，作1/A-1/[S]曲線，由此雙倒數(shù)圖作圖得Km為4.0mmol/l，直線回歸求得Km為4.25mmol/l，本法考慮到最大反應(yīng)速度兼顧溶解度的問題，選用的底物濃度為20mmol/l，約為Km值的5倍。反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度的82.5％。
2.α-Glu最適pH值的選擇測定同一份標(biāo)本在不同pH值時的吸光度，每管重復(fù)三次，取均值，酶在pH5.6顯示最大活力(pH＜5底物緩沖液應(yīng)用終止液NaoH0.02mol/l)。
(1)磷酸鹽緩沖液(2)檸檬酸鹽緩沖液3.酶促反應(yīng)時間曲線取一份高值標(biāo)本和一份正常標(biāo)本，分別測定在0.5h，1h，2h，3h，4h，6h時的吸光度，4h處無論正常及高值標(biāo)本均保持線性。
實施例4方法學(xué)評價1.精密度取兩份標(biāo)本，一份正常，一份高值，作10個平行管，正常標(biāo)本CV為11.1％，病理標(biāo)本CV為4.5％。
2.準(zhǔn)確度2.1干擾試驗見表3表3 干擾試驗結(jié)果

以±10％內(nèi)作為干擾，當(dāng)尿中葡萄糖＜5mg/ml(即尿糖為+時)，可無明顯干擾。
2.2稀釋實驗取一份高值標(biāo)本，稀釋成4個稀釋度，分別測定吸光度，γ＝0.99。
實施例5 臨床檢測1.標(biāo)本來源1.1病理標(biāo)本2002年3月到5月，天津市公安醫(yī)院住院的腎損傷病人共40例(尿蛋白+～+++)，其中原發(fā)性腎損傷16例(慢性腎衰4例，腎移植術(shù)后4例，腎病綜合癥8例)，繼發(fā)性腎損傷24例(糖尿病腎病14例，高血壓腎病6例，化療藥物、外傷的腎損傷4例)。
1.2正常人標(biāo)本2002年4月，天津市某公司查體正常的人的尿標(biāo)本40例(18-60歲)，其中男性20例，女性20例。
2.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.
按前述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得相關(guān)系數(shù)γ＝0.99，斜率0.06524，以下測定酶的濃度(U/L)＝吸光度*1/斜率＝吸光度*15.333.參考范圍的測定見表4表4 40例健康成人的尿α-Glu測定結(jié)果

*男性與女性相比，無明顯差異(P＞0.01)4.腎損傷標(biāo)本測定見表5表5 不同原因腎損傷尿α-Glu測定結(jié)果

各種原因所致的腎損傷與健康人相比均存在顯著性差異。
5.α-Glu的測定與尿微量白蛋白測定的相關(guān)性及陽性率(見表6)的比較α-Glu與微量白蛋白相關(guān)系數(shù)γ＝0.44(n＝22)，t＝2.19，P＜0.05，二者呈正相關(guān)。
表6 α-Glu與微量白蛋白的陽性率比較

(α-Glu的正常范圍為0.243-0.588U/mmolCr，尿微量白蛋白正常范圍為0-22.5mg/dl)實施例6 男性不孕癥附睪中性α-葡糖苷酶的臨床測定材料和方法一、試劑及儀器1、試劑對照品對硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷(P-Nitriophenyl-α-D-glucopyranosidePNPG，購置Sigma公司)。罌粟精素(Castanospermine，購置Sigma公司)。對硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷(天津醫(yī)藥科學(xué)研究所合成并提供)。硝基苯酚、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉、碳酸鈉、等均為分析純。
2、試液配制(1)磷酸鹽緩沖液，PH為6.8(0.1mol/l)參照中華人民共和國藥典(2000版)[25]。(2)對照品及自己合成的對硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG底物含5g/l及1％十二烷基硫酸鈉)緩沖液，每次測定都需新配制。(3)罌粟精素(10mmol/l)儲存液精稱1mg罌粟精素溶于0.53蒸餾水中，-20℃儲存。1mmol/l溶液精取0.1ml 10mmol/l儲備液加入0.9ml蒸餾水中，分裝為每份0.2ml貯存于4℃，其余部分-20℃貯存。(4)碳酸鈉(0.1mol/l用蒸餾水溶解)。(5)對硝基苯酚(PNP)標(biāo)準(zhǔn)液配制(PNP5mmol/l)將適量PNP精稱于棕色容量瓶中，用蒸餾水稀至刻度，使其充分溶解、搖勻，在4℃貯存(在讀吸光值之前1小時完成)。
3、儀器、紫外分光光度計(ShimadzmUV-260)等。
二、測定主要步驟如下(1)備好水浴箱，37℃孵育。
(2)空白對照管將試管中加入上述配制好的PNPG溶液200μl，再加入20μl的蒸餾水。
(3)精液對照管將待測精漿20μl加到含200μlPNPG和20μl罌粟精素(1mmol/l)的實驗管中。
(4)實驗管將待測精漿20μl加到含200μlPNPG的實驗管中。
以上各管，在振蕩器中振搖后，將其放入37℃水浴中孵育4小時，(孵育溫度和孵育時間至關(guān)重要)孵育結(jié)束后，向每管均加1ml碳酸鈉(0.1mol/l)以終止孵育并旋轉(zhuǎn)混勻后，放入比色杯內(nèi)，在紫外分光光度計，波長為405nm處測各管的吸光值。
試驗表明，用合成的對硝基苯酚α-D-吡喃葡糖苷試劑可以代替進口的對硝基苯酚α-D-吡喃葡糖苷試劑作底物，測定附睪功能特異性酶(即精漿中中性α-葡糖苷酶)的含量。
權(quán)利要求
1.一種對硝基苯-α-D-葡糖苷的制備，其特征在于該對硝基苯-α-D-葡糖苷是以葡糖為原料，用硝酸鉀或硝酸鈉經(jīng)乙?；?，減壓下縮合，水解步驟制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對硝基苯-α-D-葡糖苷的制備，其特征是所述的對硝基苯-α-D葡糖苷經(jīng)過以下步驟制得——β-五乙酰葡糖的制備以葡萄糖為原料進行乙酰化反應(yīng)，取0.25-0.28mol干燥葡糖，無水醋酸鈉0.4-0.6mol，醋酐2.6-3.0mol溫?zé)崛芙猓∩霞訜峄亓鞑r時振搖1-3h，攪拌下倒入8-15倍于醋酐量的冰水中，攪拌1-3h，析出大量淺色結(jié)晶，過濾，水洗結(jié)晶，干燥，制得β-五乙酰葡糖粗品，用5-8倍量95％乙醇重結(jié)晶，得到β-五乙酰葡糖結(jié)晶，熔點mp132-134℃；——對硝基苯-α-D四乙?；咸擒盏闹苽湟陨喜溅?五乙酰葡糖為原料進行縮合反應(yīng)，以3倍-5倍克分子的對硝基苯酚縮合并作為熔媒，在攪拌下和減壓下，120-127℃油浴中使體系熔融，加入新炒過的氯化鋅，用量為β-五乙酰葡糖重量的1/4至1/3，反應(yīng)1-2h，待體系變黑，冷至60℃時，按重量體積比加入β-五乙酰葡糖的10-15倍的苯溶解縮合物，用等體積水洗，再用等體積1mol的NaOH或飽和的碳酸鈉液洗至無色，再用水洗，分出苯層，加入無水硫酸鈉和活性碳攪拌0.5-1.5h，干燥，脫色，濾液在40-55℃水浴下減壓蒸去苯，制得糖漿，糖漿以少量無水乙醇熱溶后待析品，3天后收集結(jié)晶，并以乙醇重結(jié)晶，制得對硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷，熔點mp111-113℃?！獙ο趸?α-D葡糖苷的制備取上步的對硝基苯-α-D四乙?；咸擒者M行水解反應(yīng)，按重量體積比加入對硝基苯-α-D四乙?；咸擒?-5倍的干燥過的無水甲醇，攪拌下滴加1N或0.5N甲醇鈉0.2-0.8ml，有析出物后，冰箱過夜，次日收集結(jié)晶，用無水乙醇重結(jié)晶，制得對硝基苯-α-D葡糖苷，熔點mp216-217℃。
3.一種權(quán)利要求1和2中制得的對硝基苯-α-D-葡糖苷在尿液α-葡糖苷酶的檢測中的應(yīng)用，其特征在于用特異性底物對硝基苯-α-D-葡糖苷去檢測尿中的α-葡糖苷酶，以診斷腎損傷，其步驟如下——試劑的配制緩沖液0.1mol/l pH5.6磷酸鹽緩沖液；終止液0.1mol/l NaoH；對硝基酚貯存液6mmol/l用0.01mol/l HCl溶液配制；對硝基酚應(yīng)用液600μmol/l用0.02mol/l NaoH液稀釋貯存液；——底物緩沖液采用底物對硝基苯-α-D葡糖苷在上述緩沖液中的濃度為20mmol/l；——酶促反應(yīng)時間在4h處；孵育溫度37℃，酶作用最佳pH值為5.6；——尿液α-葡萄糖苷酶的測定方法如下
405nm處測定吸光度。
全文摘要
對硝基苯－α－D葡糖苷的制備及其應(yīng)用。以D－葡萄糖為原料，經(jīng)醋酐進行乙?；?，與對硝基苯酚縮合，然后以甲醇鈉水解制得底物。本發(fā)明成功合成了α－PNPG，建立了α－Glu尿酶的一步檢測法。本底物檢測尿α－Glu的最佳底物濃度為20mmol/L，反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度的82.5％，最適宜的pH為5.6，促酶反應(yīng)時間為4小時，尿液正常標(biāo)本CV為11.1％，病理標(biāo)本CV為4.5％，當(dāng)尿中葡萄糖＜5mg/ml可無明顯干擾。正常標(biāo)本男性女性無明顯差異P＞0.01，不同原因的腎損傷與健康人相比有顯著性差異P＜0.01和P＜0.05。結(jié)論本底物可特異性檢測尿酶α－Glu，并可一步法完成，方法簡單，價格低廉，對各種腎臟損傷α－Glu升高，均有統(tǒng)計學(xué)意義，可作為腎損傷的尿α－Glu有用指標(biāo)。
文檔編號C07H15/00GK1712407SQ20041007794
公開日2005年12月28日 申請日期2004年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月23日
發(fā)明者孫家莉, 王金良, 邵長風(fēng), 褚捷 申請人:天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所