專(zhuān)利名稱(chēng)：法氏囊活性肽的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑的制備工藝，特別涉及一種法氏囊活性肽的制備工藝。
背景技術(shù)：
法氏囊活性肽是從動(dòng)物法氏囊中提取制備的含有多種肽的復(fù)合物藥品。該藥品含有家禽免疫系統(tǒng)中B淋巴細(xì)胞成熟、分化和功能化的各種必須因子，作為藥物是一種免疫調(diào)節(jié)劑。1960年，Glick等首次發(fā)現(xiàn)法氏囊提取液能提高雛雞對(duì)綿羊紅細(xì)胞產(chǎn)生的抗體水平。1976年，Baba等發(fā)現(xiàn)法氏囊提取液能使切除了法氏囊的雛雞法氏囊復(fù)生，并恢復(fù)產(chǎn)生特異性抗體和免疫球蛋白的能力。1986年，Audhya等通過(guò)高壓液相色譜分析技術(shù)和氨基酸序列分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)法氏囊提取液中發(fā)揮主要作用的成份是一種三肽(由三個(gè)氨基酸組成)，并將其命名為囊素(Bursin)。Audhya還發(fā)現(xiàn)，囊素能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化和增殖，對(duì)哺乳類(lèi)動(dòng)物(包括人)也有同樣的作用。此后，許多關(guān)于法氏囊活性肽的研究大多集中于對(duì)囊素的基礎(chǔ)研究和臨床研究，并將囊素作為法氏囊活性肽研究的參照品或標(biāo)準(zhǔn)品。有人直接采用法氏囊粗提物作為研究囊素的材料，因法氏囊粗提物中含有大量非特異的大分子蛋白質(zhì)等組織成分，給雞注射可能會(huì)引起不良反應(yīng)，甚至發(fā)生過(guò)敏而死亡，干擾或掩蓋了囊素的作用。隨著超濾技術(shù)的發(fā)展和普及，目前，人們一般采用超濾技術(shù)制備法氏囊活性肽?，F(xiàn)有技術(shù)制備法氏囊活性肽的工藝一般包括以下步驟1、用高速組織搗碎機(jī)將法氏囊勻漿，并反復(fù)凍融，以破碎細(xì)胞；2、冷凍離心；3、取上清液經(jīng)超濾系統(tǒng)超濾，回收分子量在10000以下的組分；4、冷凍真空干燥，得產(chǎn)品。
上述制備工藝存在的問(wèn)題是，用勻漿器并進(jìn)行反復(fù)凍融，不能完全破碎法氏囊中的細(xì)胞，法氏囊活性肽的利用率低，而且制備時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高。還有一種方案在上述方案的第一、第二步之間加入一個(gè)在80度下進(jìn)行熱處理去除蛋白的步驟，但這種熱處理方法對(duì)法氏囊活性肽的活性影響較大，實(shí)驗(yàn)證明，在80度下處理15分鐘，法氏囊活性肽的空斑形成細(xì)胞活性顯著下降，下降率達(dá)51.5％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種可提高法氏囊活性肽收率、縮短生產(chǎn)時(shí)間、降低生產(chǎn)成本的法氏囊活性肽的制備工藝。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案一種法氏囊活性肽的制備工藝，以法氏囊組織為原料，采用以下步驟制備步驟一、預(yù)處理將新鮮的法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗干凈；步驟二、制備勻漿液將步驟一漂洗干凈的法氏囊組織置于勻漿機(jī)中，加入預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水浸沒(méi)，并在0-10℃下進(jìn)行高速勻漿，制備成勻漿液；步驟三、制備酶處理液在步驟二所得勻漿液中加入相當(dāng)于勻漿液體積1-20％的蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0-4.0，在30-50℃下消化12-36小時(shí)，制備成酶處理液；步驟四、制備法氏囊活性肽原液在步驟三所得酶處理液中加入相當(dāng)于酶處理液重量5-30％的吸附劑攪拌均勻，吸附1-3小時(shí)，然后加入相當(dāng)于酶處理液體積10-60％的預(yù)冷至4-20℃的有機(jī)溶劑，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；步驟五、過(guò)濾將步驟四所得法氏囊活性肽原液用超濾膜過(guò)濾，得含法氏囊活性肽的濾液；步驟六、干燥在步驟五所得濾液中加入相當(dāng)于濾液體積0.01-2％的穩(wěn)定劑，混勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，得法氏囊活性肽粉劑。
步驟四中所述的吸附劑為活性白土、活性碳、氧化鋁、磷酸鈣或羥基磷灰石中的一種或幾種的混合物，所述的有機(jī)溶劑為丙酮、甲醇、乙醇或丙醇中的一種或幾種的混合物；步驟六中所述的穩(wěn)定劑為葡萄糖、蔗糖、乳糖、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、硫代硫酸鈉、苯甲酸鈉、谷氨酸鈉或維生素C中的一種或幾種的混合物。
步驟五中所述的超濾膜采用截流分子量為10000的超濾膜。
步驟五中所述的超濾膜采用截流分子量為50000的超濾膜。
本發(fā)明法氏囊活性肽的制備工藝由于采用了以上技術(shù)方案，使其與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)；1、由于在勻漿液中加入了濃鹽酸將其pH值調(diào)節(jié)至2.0-4.0，可抑制蛋白溶解酶液的活性，提高了法氏囊活性肽的穩(wěn)定性。
2、由于利用蛋白溶解酶液對(duì)法氏囊進(jìn)行處理，可使法氏囊中的細(xì)胞完全破碎，不留任何完整細(xì)胞，既避免了反復(fù)凍融，節(jié)省了時(shí)間，又提高了法氏囊活性肽的收率。
3、由于采用熱處理技術(shù)加上化學(xué)處理和物理吸附的方法去除大的雜蛋白，既提高了過(guò)濾的效率，又提高了法氏囊活性肽的收率。
4、由于在離心液過(guò)濾時(shí)，根據(jù)應(yīng)用目的分別選用了截流分子量為50000或10000的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，既保證了產(chǎn)品的安全性，又提高了活性多肽的比例。
5、由于在過(guò)濾液中加入了穩(wěn)定劑，提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和保存期。
將用本發(fā)明的法氏囊活性肽的制備工藝制得的法氏囊活性肽粉劑用6N HCL于120℃下真空水解24小時(shí)，除去過(guò)量鹽酸，在LC＝9A型高效液相色譜上進(jìn)行分析，測(cè)得本發(fā)明的法氏囊活性肽粉劑含有的氨基酸種類(lèi)有天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，組氨酸，賴氨酸，精氨酸。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機(jī)中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入2升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4.0，在30-50℃下靜置24小時(shí)，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入2公斤活性白土攪拌均勻，吸附2小時(shí)，然后加入12升預(yù)冷至10-15℃的丙酮，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為10000的超濾膜過(guò)濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入200ml葡萄糖，混勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實(shí)施例2取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機(jī)中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入0.5升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.0-4.0，在30-50℃下靜置18小時(shí)，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入1公斤活性碳攪拌均勻，吸附2小時(shí)，然后加入2升預(yù)冷至10-15℃的甲醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為50000的超濾膜過(guò)濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入2ml蔗糖，混勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實(shí)施例3取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機(jī)中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入1升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0-3.0，在30-50℃下靜置30小時(shí)，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入1.5公斤氧化鋁攪拌均勻，吸附2小時(shí)，然后加入3升預(yù)冷至10-15℃的乙醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為10000的超濾膜過(guò)濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入10ml明膠，混勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實(shí)施例4取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機(jī)中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入1.5升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.5-3.5，在30-50℃下靜置36小時(shí)，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入5公斤磷酸鈣攪拌均勻，吸附2小時(shí)，然后加入5升預(yù)冷至10-15℃的丙醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為50000的超濾膜過(guò)濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入50ml聚乙烯吡咯烷酮，混勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實(shí)施例5取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機(jī)中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入3升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.0-4.0，在30-50℃下靜置12小時(shí)，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入3公斤羥基磷灰石攪拌均勻，吸附2小時(shí)，然后加入8升預(yù)冷至10-15℃的丙酮和甲醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為10000的超濾膜過(guò)濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入80ml硫代硫酸鈉，混勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實(shí)施例6取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機(jī)中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入4升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.5-3.5，在30-50℃下靜置20小時(shí)，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入3.5公斤活性白土和羥基磷灰石的混合物攪拌均勻，吸附2小時(shí)，然后加入10升預(yù)冷至10-15℃的甲醇和乙醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為50000的超濾膜過(guò)濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入100ml苯甲酸鈉，混勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實(shí)施例7取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機(jī)中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入0.3升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.5-4.0，在30-50℃下靜置30小時(shí)，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入2.5公斤活性白土和活性碳的混合物攪拌均勻，吸附2小時(shí)，然后加入6升預(yù)冷至10-15℃的乙醇和丙醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為10000的超濾膜過(guò)濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入150ml維生素C，混勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
權(quán)利要求
1.一種法氏囊活性肽的制備工藝，其特征在于，以法氏囊組織為原料，采用以下步驟制備步驟一、預(yù)處理將新鮮的法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗干凈；步驟二、制備勻漿液將步驟一漂洗干凈的法氏囊組織置于勻漿機(jī)中，加入預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水浸沒(méi)，并在0-10℃下進(jìn)行高速勻漿，制備成勻漿液；步驟三、制備酶處理液在步驟二所得勻漿液中加入相當(dāng)于勻漿液體積1-20％的蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0-4.0，在30-50℃下消化12-36小時(shí)，制備成酶處理液；步驟四、制備法氏囊活性肽原液在步驟三所得酶處理液中加入相當(dāng)于酶處理液重量5-30％的吸附劑攪拌勻勻，吸附1-3小時(shí)，然后加入相當(dāng)于酶處理液體積10-60％的預(yù)冷至4-20℃的有機(jī)溶劑，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；步驟五、過(guò)濾將步驟四所得法氏囊活性肽原液用超濾膜過(guò)濾，得含法氏囊活性肽的濾液；步驟六、干燥在步驟五所得濾液中加入相當(dāng)于濾液體積0.01-2％的穩(wěn)定劑，混勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，得法氏囊活性肽粉劑。
2.如權(quán)利要求1所述的法氏囊活性肽的制備工藝，其特征在于步驟四中所述的吸附劑為活性白土、活性碳、氧化鋁、磷酸鈣或羥基磷灰石中的一種或幾種的混合物，所述的有機(jī)溶劑為丙酮、甲醇、乙醇或丙醇中的一種或幾種的混合物；步驟六中所述的穩(wěn)定劑為葡萄糖、蔗糖、乳糖、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、硫代硫酸鈉、苯甲酸鈉、谷氨酸鈉或維生素C中的一種或幾種的混合物。
3.如權(quán)利要求1所述的法氏囊活性肽的制備工藝，其特征在于步驟五中所述的超濾膜采用截流分子量為10000的超濾膜。
4.如權(quán)利要求1所述的法氏囊活性肽的制備工藝，其特征在于步驟五中所述的超濾膜采用截流分子量為50000的超濾膜。
全文摘要
一種法氏囊活性肽的制備工藝，以法氏囊組織為原料，包括預(yù)處理、制備勻漿液、制備酶處理液、制備法氏囊活性肽原液、過(guò)濾、干燥等步驟。在其中的過(guò)濾步驟中，可根據(jù)應(yīng)用目的分別選用截流分子量為10000或50000的超濾膜。本發(fā)明的法氏囊活性肽的制備工藝簡(jiǎn)單、周期短，產(chǎn)品收率高、純度高、穩(wěn)定性好，其產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物保健和生物制品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1563086SQ20041001751
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月7日
發(fā)明者繆德年, 樊生超, 姚惠娟, 周廣禮 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所