專利名稱：抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域中的一種免疫球蛋白及其制備方法，尤其是涉及抗孟加拉眼鏡蛇(Naja kaouthia)毒雞卵黃抗體及其制備。
背景技術(shù)：
毒蛇咬傷突發(fā)性強(qiáng)、病情重、進(jìn)展快及死亡率高，盡快、盡早應(yīng)用特異性抗蛇毒血清是治療蛇傷最有效的方法。在我國南方的劇毒蛇中，屬眼鏡蛇亞科的眼鏡蛇主要有2種，即中華眼鏡蛇(Naja atra)及孟加拉眼鏡蛇(Naja kaouthia)。中華眼鏡蛇又稱舟山眼鏡蛇，以其項(xiàng)背具有明顯的白色眼鏡狀斑紋為特征，該蛇咬傷的首選特效藥為精制中華眼鏡蛇抗毒血清。孟加拉眼鏡蛇又稱泰國眼鏡蛇，項(xiàng)背的＂眼鏡＂狀斑僅有單個圓圈，原分布于廣西西南部、云南南部及西部、孟加拉、印度東北部、尼泊爾、泰國、緬甸、越南與柬埔寨等地，近年來該蛇大量流入廣東、福建等地。孟加拉眼鏡蛇毒性較中華眼鏡蛇更大，因國內(nèi)尚無孟加拉眼鏡蛇抗毒血清，故被該蛇咬傷者致殘、致死率較高。目前，臨床多采用兩種抗毒血清聯(lián)合注射(精制中華眼鏡蛇抗毒血清+銀環(huán)蛇血清)的方式以治療孟加拉眼鏡蛇咬傷。
國產(chǎn)的精制抗蛇毒血清系用脫毒的蛇毒免疫馬匹，血漿經(jīng)胃酶消化、硫酸銨鹽析后，再進(jìn)一步精制提純，制成以去除Fc片段的IgG為主要成分的單價抗血清制劑。由于該制劑的制備至今還采用上世紀(jì)70年代的生產(chǎn)工藝，且價格昂貴、過敏反應(yīng)率高(多見有皮疹、喉頭水腫、血壓下降，四肢關(guān)節(jié)疼痛、血清病、過敏性休克等III型變態(tài)反應(yīng))，故極大地限制了其的臨床應(yīng)用。
近年來的研究表明，用原始、脫毒或γ射線照射的蛇毒作抗原，免疫母雞后12-15天，即可從雞卵黃中分離出相應(yīng)的免疫球蛋白，簡稱為卵黃抗體(Immunoglobulin yolk，簡稱IgY)。IgY在結(jié)構(gòu)上類似哺乳動物IgG，其分子量為180～210KD，包括1條67-70KD的重鏈和2條22-30的輕鏈。與現(xiàn)有的馬血清IgG相比，IgY具有產(chǎn)率高、成本低、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、過敏性小及顯著減少由于抗體采集而造成對動物的傷害等優(yōu)點(diǎn)，因此，IgY已成為新一代蛇傷特效藥物研制的一個重要方向。由于多價雞卵黃蛇毒抗體制備成本低、產(chǎn)量大、安全性高，除可替代馬血清供注射外，還可開發(fā)為口服制劑，后者在蛇傷預(yù)防方面有廣闊的應(yīng)用前景，社會及經(jīng)濟(jì)效益更為可觀。
目前，國內(nèi)外學(xué)者已制備出了抗巴西抗響尾蛇毒、抗具竅腹蛇毒、抗蝰蛇毒、抗蝮蛇毒抗眼鏡王蛇毒及抗中華眼鏡蛇等數(shù)種IgY，其在親和力及特異性方面均明顯高于馬源抗血清，但至今尚無抗孟加拉眼鏡蛇(Naja kaouthia)毒雞卵黃抗體制備及其應(yīng)用方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的品種及制備方面的不足，本發(fā)明的目的是提供一種抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY。
本發(fā)明所提供的孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體IgY，其特征是在非還原型SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，分子量約為200KD；在還原SDS-PAGE上顯示為65KD及35KD 2條帶，所述的還原SDS-PAGE的分離膠濃度為10％；采用Western Blot檢測，PVDF膜上可見至少13條染色條帶，分子量為100～0.7KD。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體的制備方法。
它通過以下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)的，一種抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體的制備方法包括以下步驟(1)雞卵黃抗體提取取經(jīng)注射孟加拉眼鏡蛇毒抗原免疫后的母雞產(chǎn)下的雞蛋，用水稀釋法從蛋黃液中提取卵黃抗體IgY粗品，去離子水與蛋黃液的比率5～12∶1，調(diào)pH至4～8，4℃放置6～12h，4℃離心15min/19000g，上清經(jīng)超濾濃縮，溶液濃度15～25mg/ml；(2)用硫酸銨鹽析法純化IgY，加入飽和硫酸銨至40～60％飽和度，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，超濾脫鹽、濃縮。
本發(fā)明可進(jìn)一步純化用陰離子交換層析進(jìn)一步純化IgY，采用DEAE Sepharos FF柱，分別以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH 7.0)梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮，凍干，4℃保存。所得抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY的純度可達(dá)95％以上，其分子量約為200KD。
本發(fā)明步驟1中抗原制備利用蛇毒取毒器采集孟加拉眼鏡蛇毒，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，低溫真空干燥為凍干粉。使用戊二醛對蛇毒進(jìn)行減毒處理，毒性測定，層析除鹽，與福氏佐劑乳化而制成抗原；本發(fā)明步驟1中雞卵黃抗體制備抗原經(jīng)雞皮下及肌肉多位點(diǎn)注射，初次免疫采用福氏完全佐劑乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐劑乳化蛇毒，第二次免疫與第一次間隔2周，后續(xù)免疫間隔為4周。于初次免疫后的第12d收集雞蛋，可持續(xù)收集達(dá)6～8個月；本發(fā)明所述的步驟1中，去離子水與蛋黃液的比率優(yōu)選為9∶1，pH優(yōu)選為5.1，4℃放置時間優(yōu)選8h，濃縮所得的溶液濃度優(yōu)選為20mg/ml。
本發(fā)明所述的步驟2中，所述的加入飽和硫酸銨的飽和度為50％。
本發(fā)明的抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY的制備方法適用范圍較廣泛，可用于制備各種抗蛇毒IgY，所得到的抗體可用于制備預(yù)防和/或治療因毒蛇咬傷所引起的相關(guān)重癥的藥品、保健食品等，也可用于制備檢測相關(guān)蛇毒的檢驗(yàn)試劑。
本發(fā)明的抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY由孟加拉眼鏡蛇毒免疫產(chǎn)卵母雞而得，不但對孟加拉眼鏡蛇毒有專一的特異性，對眼鏡蛇科的其他屬、種的毒蛇，如中華眼鏡蛇等咬傷也有良好的治療效果。
本發(fā)明的抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY采用雞卵為載體，避免了因抗體采集而造成對動物的傷害，符合歐、美對動物權(quán)益的保護(hù)法規(guī)，還因?yàn)槠浠瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)勢，故更適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。


圖1是制備抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY方法及其檢測的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY的制備實(shí)施例1(1)孟加拉眼鏡蛇毒抗原制備成年孟加拉眼鏡蛇，體重1.5～2.0kg，使用專利號為200420046279.9所公開的取毒器取毒器，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，真空、低溫干燥為凍干粉。取蛇毒凍干粉50mg溶于5ml0.1M PBS，pH6.8，加入0.5ml 0.25％戊二醛30℃得溫度下放置2h后，利用Sephadex G-25層析除去鹽分，測定蛇毒LD50。
(2)佐劑乳化及雞免疫取22周齡的萊杭母雞(體重1.0±0.1kg)，將孟加拉眼鏡蛇毒與福氏佐劑按1∶1(V/V)充分乳化后，經(jīng)雞雙翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位點(diǎn)注射。初次免疫采用福氏完全佐劑乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐劑乳化蛇毒，第二次免疫與第一次間隔2周，后續(xù)免疫間隔為4周。于初次免疫后的第12d收集雞蛋，可持續(xù)收集達(dá)6～8個月，編號后于4℃保存，留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。
動物飼養(yǎng)條件單元式籠養(yǎng)，一雞一舍，舍內(nèi)配有棲木及干草束，喂以標(biāo)準(zhǔn)蛋雞飼料及清潔水。
(3)提取水稀釋法取免疫后雞蛋，去蛋白，分離出蛋黃液，用10倍去離子水?dāng)嚢柘孪♂?，?.1mol/L HCl調(diào)pH至5.1，4℃放置8h，4℃離心15min/19000g，上清經(jīng)超濾，濃縮為IgY水提物，溶液濃度為20mg/ml。
(4)純化
①硫酸銨鹽析IgY水提物加入飽和硫酸銨至50％飽和度，充分混勻，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，用孔徑為100KD的濾膜超濾脫鹽、濃縮為IgY鹽析物；②陰離子交換層析IgY鹽析物再經(jīng)DEAE Sepharos FF柱(2.5×26cm)層析，分別以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH7.0)梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮為IgY層析物，凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2(1)孟加拉眼鏡蛇毒抗原制備成年孟加拉眼鏡蛇，體重1.5～2.0kg，使用專利號為200420046279.9所公開的取毒器取毒器，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，真空、低溫干燥為凍干粉。取蛇毒凍干粉50mg溶于5ml0.1M PBS，pH6.8，加入0.5ml 0.25％戊二醛30℃得溫度下放置2h后，利用Sephadex G-25層析除去鹽分，測定蛇毒LD50。
(2)佐劑乳化及雞免疫取22周齡的萊杭母雞(體重1.0±0.1kg)，將孟加拉眼鏡蛇毒與福氏佐劑按1∶1(V/V)充分乳化后，經(jīng)雞雙翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位點(diǎn)注射。初次免疫采用福氏完全佐劑乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐劑乳化蛇毒，第二次免疫與第一次間隔2周，后續(xù)免疫間隔為4周。于初次免疫后的第12d收集雞蛋，可持續(xù)收集達(dá)6～8個月，編號后于4℃保存，留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。
動物飼養(yǎng)條件單元式籠養(yǎng)，一雞一舍，舍內(nèi)配有棲木及干草束，喂以標(biāo)準(zhǔn)蛋雞飼料及清潔水。
(3)提取水稀釋法取免疫后雞蛋，去蛋白，分離出蛋黃液，用6倍去離子水?dāng)嚢柘孪♂?，?.1mol/LHCl調(diào)pH至4，4℃放置8h，4℃離心15min/19000g，上清經(jīng)超濾，濃縮為IgY水提物，溶液濃度為15mg/ml。
(4)純化③銨鹽析IgY水提物加入飽和硫酸銨至40％飽和度，充分混勻，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，用孔徑為100KD的濾膜超濾脫鹽、濃縮為IgY鹽析物；④子交換層析IgY鹽析物再經(jīng)DEAE Sepharos FF柱(2.5×26cm)層析，分別以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH7.0)梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮為IgY層析物，凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3(1)孟加拉眼鏡蛇毒抗原制備成年孟加拉眼鏡蛇，體重1.5～2.0kg，使用專利號為200420046279.9所公開的取毒器取毒器，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，真空、低溫干燥為凍干粉。取蛇毒凍干粉50mg溶于5ml0.1M PBS，pH6.8，加入0.5ml 0.25％戊二醛30℃得溫度下放置2h后，利用Sephadex G-25層析除去鹽分，測定蛇毒LD50。
(2)佐劑乳化及雞免疫取22周齡的萊杭母雞(體重1.0±0.1kg)，將孟加拉眼鏡蛇毒與福氏佐劑按1∶1(V/V)充分乳化后，經(jīng)雞雙翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位點(diǎn)注射。初次免疫采用福氏完全佐劑乳化蛇毒，以后均用福氏不完全佐劑乳化蛇毒，第二次免疫與第一次間隔2周，后續(xù)免疫間隔為4周。于初次免疫后的第12d收集雞蛋，可持續(xù)收集達(dá)6～8個月，編號后于4℃保存，留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。
動物飼養(yǎng)條件單元式籠養(yǎng)，一雞一舍，舍內(nèi)配有棲木及干草束，喂以標(biāo)準(zhǔn)蛋雞飼料及清潔水。
(3)提取水稀釋法取免疫后雞蛋，去蛋白，分離出蛋黃液，用13倍去離子水?dāng)嚢柘孪♂?，?.1mol/L HCl調(diào)pH至8，4℃放置8h，4℃離心15min/19000g，上清經(jīng)超濾，濃縮為IgY水提物，溶液濃度為25mg/ml。
(4)純化⑤銨鹽析IgY水提物加入飽和硫酸銨至60％飽和度，充分混勻，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，用孔徑為100KD的濾膜超濾脫鹽、濃縮為IgY鹽析物；⑥子交換層析IgY鹽析物再經(jīng)DEAE Sepharos FF柱(2.5×26cm)層析，分別以0.075、0.15及0.3mol/L PB(pH7.0)梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮為IgY層析物，凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 試驗(yàn)例1抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY的效價及純度檢測抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY效價及純度檢測的具體步驟如下(1)效價測定①雙向免疫擴(kuò)散法用0.9％氯化鈉溶液配制成1.5％瓊脂糖凝膠，煮沸熔化后倒入平板中，室溫放置15min，打孔，7孔為一組，中央1孔，周邊6孔，孔徑均為4mm，中心孔加孟加拉眼鏡蛇毒150μg/15μl，周圍孔加1∶2～64倍比稀釋的IgY溶液15μl，1∶2孔的抗體起始濃度均為30mg/ml，置37℃水浴鍋孵育24～48h，考馬斯亮蘭R-50染色。結(jié)果顯示IgY水提物的效價為1∶2，IgY鹽析物的效價為1∶8，IgY層析物的效價達(dá)到1∶16。
②間接Elisa法以20μg/ml pH9.6孟加拉眼鏡蛇毒碳酸緩沖液100μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，4℃放置過夜；以pH7.4 0.05％PBS Tween 20緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，再以含3％BSA的0.01％PBS-Tween 20封閉液100μl/孔封閉酶標(biāo)板，37℃溫育2h；取出后洗滌、甩干，每孔加IgY稀釋液100μl，以非免疫卵黃的提取液作陰性對照，37℃溫育1.5h；洗滌后加入兔抗雞IgY-HRP，顯色，酶標(biāo)儀測定A值，計(jì)算批內(nèi)及批間差異。結(jié)果顯示IgY水提物效價為6.33×104；IgY鹽析物效價為65.17×104，IgY層析物效價為104.58×104。批內(nèi)差異為1.57％，批間差異為7.32％。
(2)純度及分子量測定參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，按SDS-PAGE法進(jìn)行。還原、非還原SDS-PAGE濃縮膠濃度均為5％，分離膠濃度均為10％，上樣量約為100μg。結(jié)果顯示IgY水提物含6個主要雜質(zhì)帶，分子量分別為25KD和50～66KD之間，經(jīng)50％硫酸銨沉淀去除了56～66KD之間的4條雜質(zhì)帶，經(jīng)DEAE柱層析進(jìn)一步去除了25KD附近的2條雜質(zhì)帶，IgY層析物在非還原型SDS-PAGE上僅顯示一條濃染帶，達(dá)到電泳純度。加入DTT后，IgY二硫鍵被打開，顯示IgY的重鏈約為65KD，輕鏈約為35KD，據(jù)此計(jì)算出IgY分子量約為200KD。
(3)交叉免疫性測定制備瓊脂糖凝膠板，打孔，5孔為一組(中央1孔，周邊4孔)，中央孔加蛇毒15μl，周邊孔加倍比稀釋(1∶2～16)的IgY層析物溶液15μl，1∶2孔的IgY起始濃度均為30mg/ml，，于37℃培養(yǎng)箱放置40小時作免疫擴(kuò)散。觀察中央孔與周邊孔之間的沉淀線。結(jié)果顯示經(jīng)層析純化的抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY對舟山眼鏡蛇(Naja atra，Na)及眼鏡王蛇(Ophiophagus Hannah，Oh)有高度交叉免疫(+++)，對銀環(huán)蛇(Bungarusmulticinctus，Bm)、金環(huán)蛇(Bungarus fasciatus，Bf)及國產(chǎn)圓斑蝰(Vipera russelii inChina，VrC)有中度交叉免疫(++)。該結(jié)果表明，抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY除可用于眼鏡蛇科毒蛇咬傷的治療外，還可作為抗圓斑蝰抗體的替代品用于臨床急救。
試驗(yàn)例2抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY對蛇毒的中和及保護(hù)性實(shí)驗(yàn)抗孟加拉眼鏡蛇毒IgY中和及保護(hù)性實(shí)驗(yàn)的具體步驟如下(1)Western Blot檢測孟加拉眼鏡蛇毒經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)入PVDF膜，封閉液中緩慢搖蕩1小時，抗體層析物孵育，4℃靜置12h，用PBST漂洗，兔抗雞IgY-HRP孵育1h，漂洗，DAB顯色。結(jié)果顯示PVDF膜上可見13條黃褐色條帶，分子量從100～0.7KD，說明IgY層析物對孟加拉眼鏡蛇毒的主要抗原均有特異性地結(jié)合。
(2)動物保護(hù)實(shí)驗(yàn)選用NIH系健康小鼠20只，隨機(jī)分成2組，每組10只。試驗(yàn)組將孟加拉眼鏡蛇毒1.5mg/kg與IgY層析物10mg/kg在無菌試管內(nèi)混合，置25℃恒溫水浴箱中孵育60min，腹腔注射。對照組將孟加拉眼鏡蛇毒1.5mg/kg直接進(jìn)行腹腔給藥，記錄給藥后24h內(nèi)小鼠的存活率。結(jié)果顯示試驗(yàn)組10只小鼠全部存活，而對照組均2h內(nèi)死亡。該試驗(yàn)表明，IgY層析物可特異性中和孟加拉眼鏡蛇毒，阻止孟加拉眼鏡蛇毒對機(jī)體的攻擊。
權(quán)利要求
1.一種制備孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體其特征是在非還原型SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，分子量約為200KD；在還原SDS-PAGE上顯示為65KD及35KD 2條帶，所述的還原SDS-PAGE的分離膠濃度為10％；采用Western Blot檢測，PVDF膜上可見至少13條染色條帶，分子量為100～0.7KD。
2.一種制備抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體的方法，其特征是包括以下步驟(1)雞卵黃抗體提取取經(jīng)注射孟加拉眼鏡蛇毒抗原免疫后的母雞產(chǎn)下的雞蛋，用水稀釋法從蛋黃液中提取lgY粗品，去離子水與蛋黃液的比率5～12∶1，調(diào)pH至4～8，4℃放置6～12h，4℃離心15min/19000g，上清經(jīng)超濾濃縮，溶液濃度15～25mg/ml；(2)用硫酸銨鹽析法純化IgY，加入飽和硫酸銨至40～60％飽和度，4℃放置2小時，離心，棄上清，沉淀溶入PBS，超濾脫鹽、濃縮。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是對步驟(2)所得的產(chǎn)物進(jìn)一步純化用陰離子交換層析進(jìn)一步純化IgY，采用DEAE Sepharos FF柱，分別以0.075、0.15及0.3mol/LpH 7.0的PB梯度洗脫，收集目的溶液，超濾脫鹽、濃縮，凍干，4℃保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是步驟(1)中孟加拉眼鏡蛇毒抗原抗原制備利用蛇毒取毒器采集孟加拉眼鏡蛇毒，毒液按1∶4比例加蒸餾水稀釋，離心，低溫真空干燥為凍干粉；使用戊二醛對蛇毒進(jìn)行減毒，層析除鹽，與福氏佐劑乳化而制成抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的步驟(1)中，去離子水與蛋黃液的比率為9∶1，pH為5.1，4℃放置8h，4℃離心15min/19000g，上清經(jīng)超濾濃縮，溶液濃度為20mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的步驟(2)中，所述的加入飽和硫酸銨的飽和度為50％。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體(IgY)及其制備方法。本發(fā)明通過水稀釋法從蛋黃液中提取IgY粗品，再用硫酸銨鹽析法純化IgY，取沉淀溶入PBS，超濾脫鹽、濃縮；用陰離子交換層析進(jìn)一步純化lgY，超濾脫鹽、濃縮，凍干，保存?zhèn)溆?。所述的IgY在非還原型SDS－PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，分子量約為200KD；在還原SDS－PAGE上顯示為65KD及35KD 2條帶，所述的還原SDS－PAGE的分離膠濃度為10％；采用Western Blot檢測，PVDF膜上可見至少13條染色條帶，分子量為100～0.7KD。該抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體的制備方法適用范圍較廣泛，可用于制備各種抗蛇毒雞卵黃抗體，所得到的抗體可用于制備預(yù)防 和/或治療因毒蛇咬傷所引起的相關(guān)重癥的藥品、保健食品等，也可用于制備檢測相關(guān)蛇毒的檢驗(yàn)試劑。
文檔編號C07K1/00GK1858064SQ20061003576
公開日2006年11月8日 申請日期2006年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月2日
發(fā)明者孔天翰, 劉四紅, 董偉華, 黃熱平, 黃劭, 覃媛 申請人:廣州蛇毒研究所, 孔天翰