人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3c1及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人源化抗人腦鈉肽中和性基因工程抗體3C1制備方法，包括：將噬菌體?；?C1用NocI和NotI雙酶切后插入到pET22b質(zhì)粒構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET22b-3C1；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS得到基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS；經(jīng)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)、純化，復(fù)性后得到重組目的蛋白3C1。本發(fā)明還公開了人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1在制備腦性鹽耗綜合征等顱腦疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法具有快速、成本低、人源化等優(yōu)點(diǎn)，且適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是用基因工程方法生產(chǎn)一種能夠快速中和血漿中腦鈉肽成分的基因工程抗體及其制備方法，及其在腦性鹽耗綜合征治療中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]腦性鹽耗綜合征(cerebral salt wasting syndrome, CSWS)是頡腦疾病常并發(fā)的一種嚴(yán)重危害患者生命健康的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為:低血鈉、高尿鈉和低血容量，其發(fā)病率較高，尤其是在重度顱腦外傷和各種原因所致的蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage，SAH)患者中發(fā)病率更高。研究表明，CSWS的發(fā)病為中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過分泌腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide, BNP)影響腎臟對鈉的重吸收而引起。
[0003]血液循環(huán)中的BNP為含32個氨基酸的多肽，最初從豬腦中分離提取，后來發(fā)現(xiàn)心臟亦能合成與分泌，而且濃度比腦內(nèi)高。此外它也存在于肺、腎上腺等組織中。BNP有強(qiáng)大的利尿利鈉、擴(kuò)血管、降血壓的作用。在腦組織，BNP主要在下丘腦合成，這部分腦組織受損時能大量釋放BNP，以緩解顱內(nèi)高壓。過度分泌的BNP常常導(dǎo)致患者出現(xiàn)低血鈉、高尿鈉和低血容量，危及生命。
[0004]CSffS患者的基本治療原則是:補(bǔ)充血容量和保持正鈉平衡。然而補(bǔ)充鈉鹽只能緩解癥狀，并不能減少鈉從腎臟的繼續(xù)丟失，效果往往不佳。部分學(xué)者曾試用鹽皮質(zhì)激素-醋酸氟氫可的松來治療低鈉血癥，雖然它能增加腎臟對鈉的從吸收，改善患者癥狀，但這類藥物可引起嚴(yán)重的低血鉀和高血糖癥狀。因此，發(fā)展新的治療途徑來快速中合血液中的BNP對于CSWS的治療具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明首次提出了一種能夠快速中和血漿中腦鈉肽成分的基因工程抗體(3C1)及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過基因工程技術(shù)制備抗血漿腦鈉肽的基因工程抗體。該新型抗體是完全人源化的，可特異性中和血漿中腦鈉肽，適用于腦性鹽耗綜合征相關(guān)性疾病的治療。人源化是指，抗體基因全部由人類抗體基因所編碼，可大大減少異源抗體對人類機(jī)體造成的免疫副反應(yīng)。
[0006]本發(fā)明提出了一種中和人腦鈉肽的基因工程抗體3C1的制備方法，包括以下步驟:
[0007]a)將從噬菌體抗體文庫淘篩獲得的能特異性識別腦鈉肽的噬菌體?；?3C1)用NocI和NotI雙酶切后插入到pET22b質(zhì)粒，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET22b_3Cl ;將pET22b-3Cl (氨芐青霉素抗性)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS得到基因工程菌pET22b-3Cl/BL21(DE3)pLysS。
[0008]b)將基因工程菌pET22b-3Cl/BL21 (DE3)pLysS涂板，挑取單克隆菌至2YT培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，按1: 100比例轉(zhuǎn)接后繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltol ^ 0.4，加ImM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)4個小時；離心收集菌體，超聲破菌，獲得包涵體后洗滌、溶解，取上清過N1-NTA親和柱，純化產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性處理，獲得高純度、高活性的目的蛋白。
[0009]其中，所述步驟b)中2YT培養(yǎng)基的成分為胰蛋白胨1.6g，酵母提取物Ig和氯化鈉0.5g溶于IL蒸餾水中。
[0010]其中，所述步驟b)中將經(jīng)離心獲得含重組蛋白3C1的菌體先重懸于pH8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中，隨后與100 μ g/ml溶菌酶混合，于30°C裂解30分鐘，于4°C進(jìn)行超聲破菌，經(jīng)12000r/min離心15min獲得包涵體。
[0011]其中，所述步驟b)中洗滌步驟中采用的洗滌液成分為:含2mol/L尿素的50mmol/L pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化鈉及2% TritonX-100 (v/v)，溶解步驟中采用的裂解液成分為:含 8mol/L 尿素的 100mmol/L pH8.0Tris-HCl, 0.5mol/L 氯化鈉，5mmol/L β -疏基乙醇及Smmol /I,咪唑。
[0012]其中，所述復(fù)性處理過程為:將1mg經(jīng)N1-NTA親和柱純化得到的變性基因工程抗體3C1逐滴加入到10ml復(fù)性液中，4°C過夜后，用透析緩沖液及PBS于4°C分別透析12小時，獲得有活性的重組蛋白3C1 ;其中，所述復(fù)性液成分為:含2mol/L尿素的100mmol/LpH8.0Tris-HCl及0.5mol/L L-精氨酸,所述透析液成分:含20nmol/L氯化鈉的80mmol/LpH8.0Tris-HCl 及 0.4mol/L 尿素。
[0013]其中，所述基因工程菌pET22b-3Cl/BL21 (DE3) pLysS的脫氧核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示,氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0014]本發(fā)明還提出的人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1具有特異性中和腦鈉肽活性的人源化單抗的體外活性。所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1通過間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，檢測3C1與BNP的特異性結(jié)合；通過直接競爭ELISA法檢測BNP多肽對3C1的中和效應(yīng)；通過點(diǎn)雜交法(dot-blot)檢測3C1對BNP的檢測靈敏度達(dá)到10ng。
[0015]根據(jù)本發(fā)明制備方法得到的人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1，其基因全長為717bp，對應(yīng)239個氨基酸，單鏈抗體分子量約為25128.82 ;等電點(diǎn)預(yù)測值為9.28，為堿性蛋白；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示3C1含45% α螺旋，39% D折疊，5% β轉(zhuǎn)角；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示3C1重鏈(VH)和輕鏈(VL)形成一個疏水口袋，Linker游離于此結(jié)構(gòu)之外，符合單鏈抗體(scFv)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，明顯具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間構(gòu)象。
[0016]本發(fā)明還提出一種人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1在制備治療腦性鹽耗綜合征的藥物中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明通過運(yùn)用基因工程技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)，直接從人抗體基因庫中篩選能與人腦鈉肽抗原特異性結(jié)合的抗體，獲得其抗體基因并表達(dá)，用作臨床腦性鹽耗綜合征的治療。
[0018]本發(fā)明人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法具有快速、成本低、人源化等優(yōu)點(diǎn)，且適合工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明方法制備得到的人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1可用于治療腦性鹽耗綜合征等顱腦相關(guān)性疾病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1所示為重組質(zhì)粒pET22b_3Cl示意圖。
[0020]圖2所示為本發(fā)明人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的純化圖；
[0021]圖3所示為本發(fā)明人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的三維空間蛋白結(jié)構(gòu)圖；
[0022]圖4所示為本發(fā)明人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1與BNP特異性結(jié)合的間接ELISA檢測結(jié)果；
[0023]圖5所示為本發(fā)明人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1被BNP特異性中和的競爭ELISA檢測結(jié)果；
[0024]圖6所示為本發(fā)明人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1對BNP檢測靈敏度的點(diǎn)雜交檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0025]結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0026]本發(fā)明的中和人腦鈉肽的基因工程抗體的制備方法，包括以下具體步驟:
[0027]a)人源性抗體3C1的基因工程菌pET22b_3Cl/BL21 (DE3) pLysS的構(gòu)建
[0028]將從人源性噬菌體抗體文庫中獲得的能特異性識別腦鈉肽表位的3C1基因用限制性內(nèi)切酶NocI和NotI雙酶切后插入到表達(dá)質(zhì)粒pET-22b中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET22b-3Cl ;將重組后的表達(dá)質(zhì)粒pET22b-3Cl轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 (DE3) pLysS，獲得能穩(wěn)定分泌人源性抗體3C1的基因工程菌pET22b-3Cl/BL21 (DE3) pLysS。其中，3C1基因序列如SEQID N0.1 所示。
[0029]重組質(zhì)粒pET22b_3Cl如圖1所示,其中，f 1rigin:載體在受體菌中的復(fù)制起始位點(diǎn)；2.Not1:表示限制性內(nèi)切酶(位于第166位堿基序列)；3.Nco1:表示限制性內(nèi)切酶(位于第220位堿基序列)；4.3C1表示插入在NotI和NcoI間的目的基因(含717個堿基)；
5.1ac1:表不產(chǎn)生IacI阻遏基因的啟動子基因；6.Ap表不氨節(jié)抗性標(biāo)記基因。
[0030]b)人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備
[0031]i)將步驟a)中的基因工程菌pET22b_3Cl/BL21(DE3)pLysS于2YT培養(yǎng)基(胰蛋白胨1.6g，酵母提取物lg，氯化鈉0.5g溶于IL蒸餾水中滅菌)中37°C培養(yǎng)過夜，按1: 100比例轉(zhuǎn)接后繼續(xù)培養(yǎng)至光密度值OD6tltlnm~0.4，加ImM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)4個小時進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)4°C，6000rpm, 15分鐘離心獲得含目的重組蛋白3C1的菌體。菌體先重懸于50mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris_HCl，pH8.0)中，隨后與溶菌酶(100 μ g/ml)混合，30°C裂解30分鐘，于4°C進(jìn)行超聲破菌，12000r/min離心15min獲得包涵體。
[0032]其中，溶菌酶儲存液濃度50mg/ml(500x)，每升(L)培養(yǎng)基中溶菌酶的用量為2ml。
[0033]其中，上述包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在在細(xì)胞內(nèi)凝集；形成無活性的固體顆粒；一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等,環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA,以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-lum,具有很聞的密度(約1.3mg/ml)，無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。包涵體具有一定量的二級結(jié)構(gòu)，他們可能在復(fù)性的啟動階段中具有一定的作用。
[0034]ii)將步驟i)中的包涵體進(jìn)行復(fù)性處理:取包涵體懸浮在9倍體積的洗滌緩沖液中，洗滌2次，隨后離心(4 V，12000r/min,)。其中，洗滌液成分為:50mmol/LTris-HCl (pH8.0)含 2mol/L 尿素(Urea)，0.5mol/L 氯化鈉(NaCl), 2 % TritonX-100 (v/v)；每升洗滌液中含 Tris-HC150mmol (7.882 克)，尿素 2mol (120 克)，氯化鈉 0.5mol (29.22克)，TritonX-100 (20ml)。獲得的包涵體溶于裂解液中4°C過夜，隨后12000r/min離心15min，上清經(jīng)0.22 μ m濾器過濾進(jìn)一步去除菌體碎片，上清中變性的基因工程抗體3C1濃度通過BCA蛋白法測定。其中，裂解液成分為:100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)含8mol/L尿素(Urea), 0.5mol/L 氯化鈉(NaCl), 5mmol/L β -巰基乙酉享(β-ME), 5mmol/L 咪唑；每升裂解液中含 Tris-HCl10mmol (15.764 克)，尿素 8mol (480 克)，氯化鈉 0.5mol (29.22 克)，β -巰基乙醇(β -ME) 5mmol (0.39 克)，咪唑 5mmol (0.34 克)。
[0035]iii)將步驟ii)的包涵體變性產(chǎn)物上清液通過N1-NTA親和柱進(jìn)行純化，獲得變性的3C1基因工程抗體3C1。隨后，將1mg純化的變性基因工程抗體3C1逐滴加入到10mi復(fù)性液中，4°C過夜后，用透析緩沖液及PBS于4°C分別透析12小時，獲得有活性的3C1。其中，復(fù)性液成分:100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)含 2mol/L 尿素(Urea), 0.5mol/L L-精氨酸(L-Arg);透析液成分:80mmol/L Tris-HCl (pH8.0)含 20nmol/L 氯化鈉(NaCl), 0.4mol/L尿素(Urea)。
[0036]本發(fā)明的人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1，序列如以下SEQ ID N0.2所示:

【權(quán)利要求】
1.一種人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: a)將特異性識別腦鈉肽的噬菌體?；?C1用NocI和NotI雙酶切后插入到pET22b質(zhì)粒中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET22b-3Cl ;將所述重組質(zhì)粒pET22b-3Cl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS，得到基因工程菌 pET22b-3Cl/BL21 (DE3)pLysS ； b)將所述基因工程菌pET22b-3Cl/BL21(DE3)pLysS涂板，挑取單克隆菌至2YT培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，按1: 100比例轉(zhuǎn)接后繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltol ^ 0.4，加ImM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)4個小時；離心收集菌體，超聲破菌，獲得包涵體后洗滌、溶解，取上清過N1-NTA親和柱，純化產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性處理，獲得重組目的蛋白3C1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述步驟b)中2YT培養(yǎng)基的成分為胰蛋白胨1.6g，酵母提取物Ig和氯化鈉0.5g溶于IL蒸餾水中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述步驟b)中將經(jīng)離心獲得含重組蛋白3C1的菌體先重懸于pH8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中，隨后與100 μ g/ml溶菌酶混合，于30°C裂解30分鐘，于4°C進(jìn)行超聲破菌，經(jīng)12000r/min離心15min獲得包涵體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述步驟b)中洗漆步驟中采用的洗漆液成分為:含2mol/L尿素的50mmol/LpH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化鈉及2% TritonX-100 (v/v)，溶解步驟中采用的裂解液成分為:含 8mol/L 尿素的 100mmol/L ρΗ8.0Tris-HCl, 0.5mol/L 氣化納，5mmol/L β -疏基乙醇及Smmol /I,咪唑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述復(fù)性處理過程為:將1mg經(jīng)N1-NTA親和柱純化得到的變性基因工程抗體3C1逐滴加入到10ml復(fù)性液中，4°C過夜后，用透析緩沖液及PBS于4°C分別透析12小時，獲得有活性的重組蛋白3C1 ;其中，所述復(fù)性液成分為:含2mol/L尿素的100mmol/L pH8.0Tris-HCl及0.5mol/L L-精氨酸,所述透析液成分:含20nmol/L氯化鈉的80mmol/L pH8.0Tris-HCl及0.4mol/L 尿素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1的制備方法，其特征在于，所述基因工程菌pET22b-3Cl/BL21 (DE3) pLysS的脫氧核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法得到的人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1，其特征在于，3C1基因全長為717bp，對應(yīng)239個氨基酸，單鏈抗體分子量約為25128.82 ;等電點(diǎn)預(yù)測值為9.28，為堿性蛋白；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示3C1含45% α螺旋，39%D折疊，5% β轉(zhuǎn)角；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示3C1重鏈和輕鏈形成一個疏水口袋，鏈接部游離于此結(jié)構(gòu)之外，符合單鏈抗體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間構(gòu)象。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1，其特征在于，所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1具有特異性中和腦鈉肽活性的人源化單抗的體外活性；所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1在間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測中與BNP特異性結(jié)合，在直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法檢測中對BNP多肽具有中和效應(yīng)，在點(diǎn)雜交法檢測中對BNP檢測靈敏度為10ng。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述人腦鈉肽的中和性基因工程抗體3C1在制備治療腦性鹽耗綜合征的藥物 中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P25/00GK104073502SQ201310100086
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月26日
【發(fā)明者】張巍, 唐健 申請人:華東師范大學(xué)