專利名稱：遞送核酸的脂質(zhì)體組合物的制作方法
專利說明遞送核酸的脂質(zhì)體組合物 發(fā)明的領(lǐng)域 本發(fā)明涉及遞送核酸的脂質(zhì)體組合物。更特別地，發(fā)明涉及的脂質(zhì)體組合物含有pH反應(yīng)性脂類和可釋放的親水聚合物鏈的表面涂層以核酸給藥。
發(fā)明的背景 已經(jīng)開發(fā)了許多種方法來促進(jìn)遺傳物質(zhì)向特殊細(xì)胞的傳遞。這些方法可用于體內(nèi)和體外的基因轉(zhuǎn)移。對(duì)于前者，基因直接導(dǎo)入受者體內(nèi)(靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，氣霧劑，等)。在離體(或體外)的基因轉(zhuǎn)移中，基因在細(xì)胞從個(gè)體的特定組織中移出后被導(dǎo)入細(xì)胞中。然后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞再被導(dǎo)回受者體內(nèi)。
可獲得體內(nèi)和離體基因治療的遞送系統(tǒng)包括病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體或腺病毒載體，微注射，電穿孔，原生質(zhì)體融合，磷酸鈣，和脂質(zhì)體(Feigner，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417(1987)；Mulligan，R.S.，Science 260926-932(1993)；Morishita，R.，等人，J.Clin.Invest.912580-2585(1993))。
使用脂質(zhì)體載體將遺傳物質(zhì)向細(xì)胞的遞送已經(jīng)被廣泛研究。一般認(rèn)為，脂質(zhì)體囊泡被細(xì)胞通過胞飲作用攝取，并進(jìn)入溶酶體降解通路。因此，已經(jīng)做了一些努力來設(shè)計(jì)避免降解的脂質(zhì)體。
廣泛報(bào)道了作為脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層成分，使用陽(yáng)離子脂類如帶正電荷銨或含锍離子頭基的糖脂衍生物，遞送負(fù)電荷的生物分子如寡核苷酸和DNA片段。脂質(zhì)的正電荷頭基與負(fù)電荷的細(xì)胞表面相互作用，促進(jìn)生物分子和細(xì)胞的接觸和遞送。陽(yáng)離子脂類的正電荷進(jìn)一步對(duì)核酸的配合是重要的。
但是，全身給予這種陽(yáng)離子脂質(zhì)體/核酸復(fù)合體使其容易滯留在肺中。這種肺內(nèi)定植是由于傳統(tǒng)陽(yáng)離子復(fù)合體的強(qiáng)表面正電荷引起的。已有文獻(xiàn)報(bào)道，靜脈給藥后，具有報(bào)告子基因的傳統(tǒng)陽(yáng)離子復(fù)合體在肺、心、肝、腎和脾中體內(nèi)基因表達(dá)。但是，形態(tài)學(xué)檢查表明大多數(shù)表達(dá)位于肺血管的內(nèi)皮細(xì)胞層。對(duì)這種觀察現(xiàn)象的可能解釋是，肺是陽(yáng)離子脂質(zhì)體/核酸復(fù)合體靜脈注射后所遇到的第一個(gè)器官。另外，肺內(nèi)皮細(xì)胞的大表面積為陽(yáng)離子脂質(zhì)體/核酸復(fù)合體提供了容易進(jìn)入的靶標(biāo)。
盡管早期的結(jié)果是令人鼓舞的，但單一陽(yáng)離子脂質(zhì)體的靜脈注射并未證明可有效用于將基因遞送至疾病的全身部位(如實(shí)體腫瘤而不是肺腫瘤)或臨床相關(guān)的基因表達(dá)(如p53或HSV-tk)所需的部位。陽(yáng)離子脂質(zhì)體被迅速清除，并帶來了宿主的安全性問題。
另一種方法是在脂質(zhì)體中包含一種pH敏感的脂類，如棕櫚酰同型半胱氨酸(Connor，J.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811715(1984)；Chu，C.-J.和Szoka，F(xiàn).，J.Liposome Res.4(1)361(1994))。這種pH敏感的脂類在中性pH時(shí)是帶負(fù)電荷的，可被穩(wěn)定的摻入脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層中。但在弱酸性pH(pH＜6.8)下，脂質(zhì)成為中性電荷的，并改變結(jié)構(gòu)足以使脂質(zhì)體雙分子層不穩(wěn)定。當(dāng)脂質(zhì)摻入已經(jīng)被攝取進(jìn)入內(nèi)涵體的脂質(zhì)體中時(shí)，據(jù)報(bào)告其中pH為5.0-6.0之間，使之不穩(wěn)定并引起脂質(zhì)體內(nèi)容物的釋放。
另外，直接靶向腫瘤細(xì)胞較靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞更有挑戰(zhàn)性。脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體進(jìn)入腫瘤脈管系統(tǒng)的血管來源內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)容易，因?yàn)榧?xì)胞直接暴露在血液腔中。為了靶向腫瘤細(xì)胞，脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體需要從有漏洞的腫瘤血管中滲出，然后可以到達(dá)腫瘤細(xì)胞。因此復(fù)合體的穩(wěn)定性、大小、表面電荷、血液循環(huán)時(shí)間和復(fù)合體的轉(zhuǎn)染效率都是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染和表達(dá)的因素。
發(fā)明概要 因此，發(fā)明的一個(gè)目的是提供全身遞送核酸至細(xì)胞的組合物。
發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有中性陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體，一個(gè)可釋放的親水聚合物衍化的脂質(zhì)。脂質(zhì)體與核酸聯(lián)合以隨后將核酸遞送至細(xì)胞或組織，。
因此，在一個(gè)方面，發(fā)明包括用于給予核酸的組合物，包括 (a)脂質(zhì)體含有(i)具有下面結(jié)構(gòu)式的脂質(zhì)
其中每個(gè)R1和R2是具有8-24個(gè)碳原子的烷基或烯基鏈；n＝0-20；L選自(1)-X-(C＝O)-Y，(2)-X-(C＝O)-，和(3)-X，其中X和Y獨(dú)立地選自氧、NH和直接結(jié)合鍵；Z是pK小于7.4并大于大約4.0的弱堿部分。
脂質(zhì)體也含有(ii)具有下列通式結(jié)構(gòu)的化合物
其中R3是含有與二硫代芐基部分附著的連接鍵的親水聚合物；R4選自H、烷基和芳基；R5選自O(shè)(C＝O)R7、S(C＝O)R7和O(C＝S)R7；R7包括含胺的脂類；R6選自H、烷基和芳基；其中CH2-R5的方向選自鄰位和對(duì)位。
脂質(zhì)體也包括，(b)一個(gè)聯(lián)合的核酸。
在一個(gè)實(shí)施例中，X是NH，Y是氧。在另一個(gè)實(shí)施例中，L是氨基甲酸酯鍵、酯鍵或羧酸酯鍵。又在另一個(gè)實(shí)施例中，L是NH-(C＝O)-O。
在另一個(gè)實(shí)施例中，Z是咪唑。又在另一個(gè)實(shí)施例中，Z是pK值在5.0-6.5之間的部分。
脂質(zhì)體組合物一般含有1-80摩爾百分比之間的脂質(zhì)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)R1和R2是具有8-24個(gè)碳原子的無(wú)支鏈烷基和烯基鏈。例如，每個(gè)R1和R2可以是C17H35。
在另一個(gè)實(shí)施例中，n在1-20之間，或在0-10之間，或在1-10之間。
在進(jìn)一步的實(shí)施例中，R6是H，R4選自CH3、C2H5和C3H8。在另一個(gè)實(shí)施例中，R4和R6是烷基。
在一個(gè)實(shí)施例中，含胺的脂質(zhì)包括單烴尾或雙烴尾。在另一個(gè)實(shí)施例中，含胺的脂質(zhì)是具有雙烴尾的磷脂。
在一個(gè)實(shí)施例中，R3部分選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基噁唑啉、聚羥丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基-丙烯酰胺、聚羥丙基甲基丙烯酸酯、聚羥乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、其共聚物，和聚環(huán)氧乙烯-聚環(huán)氧丙烯。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，R3是聚乙二醇，R6是H和R4是CH3或C2H5。
一般地，脂質(zhì)體包括5-20摩爾之間百分比的化合物。
應(yīng)當(dāng)理解，脂質(zhì)體除了與核酸結(jié)合以外，可進(jìn)一步包括包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的治療化合物。核酸可以包裹在脂質(zhì)體至少一部分中或與脂質(zhì)體外部結(jié)合。核酸可以是DNA、RNA、其片段，或DNA或RNA寡核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，脂質(zhì)體進(jìn)一步包括將脂質(zhì)體靶向靶部位的配體。一般地，配體共價(jià)附著在化合物上親水聚合物R3的遠(yuǎn)端。在一個(gè)實(shí)施例中，配體具有與內(nèi)皮腫瘤細(xì)胞的結(jié)合親合力，以便被這些細(xì)胞攝取。例證的配體包括適合與下述受體結(jié)合的配體HER2/neu癌基因的c-erbB-2蛋白產(chǎn)物的受體、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(堿性FGF)受體、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、E-選擇素受體、L-選擇素受體、P-選擇素受體、葉酸鹽受體、CD4受體、CD19受體、αβ整合素受體和趨化因子受體。在優(yōu)選的實(shí)施例中，配體是her2、FGF、葉酸鹽和E-選擇素。應(yīng)當(dāng)理解，脂質(zhì)體可以包含一種以上類型的配體。
在另一個(gè)實(shí)施例中，脂質(zhì)體可以進(jìn)一步包括陽(yáng)離子脂質(zhì)，如將要描述的。
下面關(guān)于發(fā)明的詳述與附圖一起進(jìn)行閱讀時(shí)，發(fā)明的這些和其他目的和特征將被更全面的理解。
附圖描述

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明制備具有氨基甲酸酯連接和咪唑“Z”基團(tuán)的脂類的合成圖； 圖2A-2D顯示了根據(jù)本發(fā)明制備pH反應(yīng)性脂類的合成反應(yīng)流程圖； 圖3A-3D顯示了根據(jù)本發(fā)明pH反應(yīng)性脂類的多種結(jié)構(gòu)； 圖4描述了合成mPEG-DTB-胺-脂類的合成反應(yīng)流程圖，其中胺-配體是脂類二硬脂酰磷酯酰乙醇胺(DSPE)； 圖5描述了對(duì)-二硫代芐基氨基甲酸乙酯(DTB)連接的mPEG-DSPE共軛物的硫解斷裂機(jī)制； 圖6A-6B顯示了根據(jù)本發(fā)明制備mPEG-DTB-DSPE化合物的合成反應(yīng)流程圖，其中DTB連接是由一個(gè)烷基在空間上阻遏的； 圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明制備mPEG-DTB-配體化合物的另一個(gè)合成反應(yīng)流程圖； 圖8A是合成mPEG-DTB-脂類的一個(gè)合成反應(yīng)流程圖，在硫解斷裂過程中產(chǎn)生了一種陽(yáng)離子脂類；和 圖8B顯示了在圖8中化合物硫解斷裂后的產(chǎn)物。
發(fā)明的詳細(xì)描述 定義 如果沒有特別指出，下面的術(shù)語(yǔ)具有下列的含義。
如在此所使用的，“中性”脂類是不帶電荷的，具有非離子特性的脂類。
“帶電荷”的脂類是具有正電荷或負(fù)電荷，具有離子特性的脂類。
“形成囊泡的脂類”是指具有疏水性和極性頭基部分的兩性分子脂類，可在水中自發(fā)形成雙分子層囊泡，其例證是磷脂，或可穩(wěn)定地?fù)饺脒M(jìn)脂質(zhì)雙分子層中，疏水部分與雙分子層膜的內(nèi)疏水區(qū)相結(jié)合，極性頭基部分朝向膜的外極性表面。這種類型的形成囊泡的脂類一般含有一個(gè)或兩個(gè)疏水?；鶡N鏈或一個(gè)類固醇基團(tuán)，可能在極性頭基處含有一個(gè)化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)，如胺，酸，酯，醛或乙醇。包含在這種類型中的有磷脂，如磷脂酰膽堿(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酸(PA)，磷脂酰肌醇(PI)，和鞘磷脂(SM)，其中兩個(gè)烴鏈一般長(zhǎng)度大約在14-22碳原子之間，不飽和度不等。包含在術(shù)語(yǔ)“形成囊泡的脂類”的范圍內(nèi)的還有糖脂，如腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂，和固醇，如膽固醇。
“烷基”是指含有碳和氫的完全飽和單價(jià)基，可以是支鏈或直鏈。烷基的實(shí)例是甲基、乙基、正-丁基、叔-丁基、正-庚基和異丙基?！暗图?jí)烷基”是指1至6個(gè)碳原子的烷基，其例證是甲基，乙基，正-丁基，異-丁基，叔-丁基，異戊基，正-戊基，和異戊基。
“烯基”是指含有碳和氫的單價(jià)基，可以是支鏈或直鏈，含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵。
在此使用的“親水聚合物”是指含有可溶于水部分的聚合物，可使聚合物在室溫下具有一定程度的水溶性。親水聚合物的實(shí)施例包括聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯甲基醚，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羥丙基噁唑啉，聚羥丙基-甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基-丙烯酰胺，聚羥丙基甲基丙烯酸酯，聚羥乙基丙烯酸酯，羥甲基纖維素，羥乙基纖維素，聚乙二醇，聚天冬酰胺，上述聚合物的其共聚物，和聚環(huán)氧乙烯-聚環(huán)氧丙烯共聚物。許多這些共聚物的特性和反應(yīng)在美國(guó)專利第5,395,619和5,631,018中進(jìn)行了描述。
“含有反應(yīng)功能基團(tuán)的聚合物”或“含有可附著連接的聚合物”是指在終末端部分已經(jīng)被修飾的聚合物，但一般不是必須的，以便與另一個(gè)化合物反應(yīng)形成一個(gè)共價(jià)鍵。使聚合物具有這樣一種反應(yīng)功能基團(tuán)部分的反應(yīng)流程圖可很容易的為本領(lǐng)域那些專業(yè)技術(shù)人員所確定和/或已經(jīng)被描述，例如在美國(guó)專利5,613,018或Zalipsky等人，例如在Eur.Polymer.J.，19(12)1177-1183(1983)；Biocon j.Chem.，4(4)296-299(1993)中的描述。
“快速-可斷裂的PEG”是指一種mPEG-DTB-脂類，其中R4和R6(見下面章節(jié)IIB中的結(jié)構(gòu))是氫。
“緩慢-可斷裂的PEG”是指一種mPEG-DTB-脂類，其中二硫代芐基部分被在R4和/或R6上的一個(gè)烷基部分附著而阻遏(見下面章節(jié)IIB中的結(jié)構(gòu))。
“脂肪族二硫化物”連接是指R’-S-S-R″形式的連接，其中R’和R″是線性的或分支的烷基鏈，可被進(jìn)一步取代。
縮寫PEG聚乙二醇；mPEG甲氧基末端的聚乙二醇；Chol膽固醇；PC磷脂酰膽堿；PHPC部分氫化的磷脂酰膽堿；PHEPC部分氫化的雞蛋磷脂酰膽堿；PHSPC部分氫化的大豆磷脂酰膽堿；DSPE二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；APD1-胺-2，3-丙二醇；DTPA二乙烯四胺五醋酸；Bn芐基；NCL中性陽(yáng)離子脂質(zhì)體；FGF成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；HDSG；組胺二硬脂酰甘油；DOTAP1，2-二油烯氧-3-(三甲胺)丙烷；DTB二硫代芐基；FC-PEG快速-可斷裂的PEG；SC-PEG緩慢-可斷裂的PEG；DDAB二甲基雙十八烷基銨；GC33N2-[N2，N5-雙(3-氨丙基)-L-ormithyl]-N，正-雙十八烷基-L-谷氨酰胺四氫三氟醋酸鹽；EtDTB，乙基-二硫代芐基；DOPE，二油?；字Ｒ掖及贰?br> II.脂質(zhì)體成分 在一個(gè)方面，發(fā)明包括一種由脂質(zhì)體和核酸組成的脂質(zhì)體組合物。脂質(zhì)體屬于一種“陽(yáng)離子中性脂質(zhì)”，是用一種親水性聚合物通過一個(gè)可釋放的結(jié)合劑衍生的一種脂質(zhì)。這些脂質(zhì)體成分現(xiàn)在將予以描述。
A.陽(yáng)離子-中性脂質(zhì) 包括在本發(fā)明脂質(zhì)體中的陽(yáng)離子-中性脂質(zhì)通常是由下面結(jié)構(gòu)所代表的一種脂類
其中每個(gè)R1和R2是含有8-24個(gè)碳原子的烷基或烯基鏈；n＝1-20，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中在1-10之間；L選自(i)-X-(C＝O)-Y，(ii)-X-(C＝O)-，和(iii)-X，其中X和Y單獨(dú)選自氧，NH和一個(gè)直接結(jié)合鍵；Z是一個(gè)弱堿性部分，其pK小于7.4并大于大約4.0。
在另一個(gè)實(shí)施例中，Z是一個(gè)pK值在4.5-7.0之間，更優(yōu)選在5-6.5之間，最優(yōu)選在5-6之間的部分。
弱堿性部分Z可使一種脂類在生理pH7.4下主要，例如超過50％是帶中性電荷的，但在低于生理pH可選擇的pH值下趨向于帶正電荷。通過實(shí)施例，和在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，Z是一個(gè)咪唑部分，其pK為大約6.0。在生理pH7.4下，此部分主要是中性的，但在低于6.0的pH值下，該部分變?yōu)橹饕菐д姷摹樽C明本發(fā)明，如下所述，制備具有咪唑部分的脂質(zhì)，并用于制備脂質(zhì)體。
只要取代作用不改變pKa至所需范圍外的值，除了咪唑，取代的咪唑以及苯并咪唑和萘并咪唑，可用作上述特定結(jié)構(gòu)中的Z部分。合適的取代基一般包括烷基，羥烷基，烷氧基，芳基，鹵素，鹵烷基，氨基，和氨基烷基。這些據(jù)報(bào)道pK的范圍在5.0至6.0之間的化合物的實(shí)施例包括，但不限于，各種甲基取代的咪唑和苯并咪唑，組胺，萘[1，2-d]咪唑，1H-萘[2，3-d]咪唑，2-苯咪唑，2-芐基苯并咪唑，2，4-聯(lián)苯基-1H-咪唑，4，5-聯(lián)苯基-1H-咪唑，3-甲基-4(5)-氯-1H-咪唑，5(6)-氟-1H-苯并咪唑，和5-氯-2-甲基-1H-苯并咪唑。
其他含氮的雜芳族化合物，如吡啶，喹啉，異喹啉，嘧啶，鄰二氮雜菲，和吡唑也可用作Z基團(tuán)。此外，具有選自下列的取代基，烷基，羥烷基，烷氧基，芳基，鹵烷基，氨基，氨基烷基和羥基的許多這樣的化合物據(jù)報(bào)道其pK在所需的范圍之內(nèi)。這些化合物包括，吡啶中的2-芐基吡啶，多種甲基-和二甲基吡啶，以及其他的低級(jí)烷基和羥烷基吡啶，3-氨基吡啶，4-(4-氨苯基)吡啶，2-(2-甲氧乙基)吡啶，2-(4-氨苯基)吡啶，2-氨基-4-氯吡啶，4-(3-呋喃基)吡啶，4-乙烯基吡啶，和4，4’-二氨基-2，2’-二吡啶，所有這些據(jù)報(bào)道其pK在5.0和6.0之間。據(jù)報(bào)道pK在所需范圍內(nèi)的喹啉類化合物包括，但不限于，3-，4-，5-，6-，7-和8-氨基異喹啉，多種低級(jí)烷基和羥基取代的喹啉和異喹啉，4-，5-，7-和8-羥喹，5-，6-，7-和8-羥喹，8-肼基喹啉，2-氨基4-甲基喹唑啉，1，2，3，4-四氫-8-羥喹，1，3-異喹啉二胺，2，4-喹啉二醇，5-氨基-8-羥喹和奎寧環(huán)。pK在所需范圍內(nèi)的還有幾種胺取代的嘧啶，如4-(N，正-二甲氨基)嘧啶，4-(正-甲氨基)嘧啶，4，5-嘧啶二胺，2-氨基-4-甲氧嘧啶，2，4-二氨基-5-氯嘧啶，4-氨基-6-甲基嘧啶，4-氨基嘧啶，和4，6-嘧啶二胺，以及4，6-嘧啶二醇。多種鄰二氮雜菲，如1，10-，1，8-，1，9-，2，8-，2，9-和3，7-鄰二氮雜菲，其pK在所需的范圍內(nèi)，大多數(shù)它們的低級(jí)烷基-，羥基-，和芳基取代的衍生物也是如此?？墒褂玫倪吝虬?，但不限于，4，5-二氫-1H-吡唑，4，5-二氫-4-甲基-3H-吡唑，1-羥基-1H-吡唑，和4-氨基吡唑。
許多氮取代的芳香族化合物，如苯胺和萘胺，也是基團(tuán)Z的合適實(shí)施例。進(jìn)一步用選自甲基或其他低級(jí)烷基，羥烷基，烷氧基，羥基，其他胺基團(tuán)，氨基烷基，鹵素和鹵烷基的基團(tuán)取代的苯胺和萘胺一般據(jù)報(bào)道其pKa在所需的范圍內(nèi)?？墒褂玫钠渌啡〈枷阕寤衔锇?-氨基吩嗪，2，3-吡嗪二胺，4-和5-氨基乙酰苯，3-和4-氨基噠嗪，2-氨基-4-甲基喹唑啉，5-氨基二氫化茚，5-氨基吲唑，3，3’，4，4’-聯(lián)苯四胺，和1，2-和2，3-二氨基蒽醌。
也包含在Z的實(shí)施例中的還有某些脂肪胺化合物，如N，N’-二甲基胍和多種取代的肼，如三甲基肼，四甲基肼，1-甲基-1-苯肼，1-萘肼，和2-，3-，和4-甲苯基肼，所有這些化合物據(jù)報(bào)道其pKa在4.5和7.0之間。pKa在此范圍內(nèi)的脂肪族化合物包括1-吡咯烷乙醯胺，1-哌啶乙醯胺，環(huán)六亞甲基四胺，和1，5-二氮雜二環(huán)[3.3.3]十一烷。
在上述特定的結(jié)構(gòu)中適合作為Z部分的還有某些氨基糖類，如將在下面圖3C-3D中所描述的。
上面的列表給出了pKa在4.5和7.0之間的化合物的實(shí)施例，它們可用作本發(fā)明脂質(zhì)共軛物中的pH反應(yīng)性基團(tuán)；這些列表并不是要進(jìn)行限制。在可選擇的實(shí)施例中，基團(tuán)Z是咪唑，苯胺，氨基糖或其衍生物。優(yōu)選地，基團(tuán)Z的有效pKa并不顯著地受其與脂類基團(tuán)附著而影響。連接的共軛物的實(shí)施例在下面列出。
發(fā)明的脂類包括連接Z部分的一個(gè)中性鍵L和脂類的尾部分。鍵L是可變化的，在優(yōu)選的實(shí)施例中可選自氨基甲酸酯，酯，酰胺，碳酸酯，尿素，胺，和醚。在一個(gè)優(yōu)選的為證實(shí)本發(fā)明制備的脂類中，制備了一個(gè)氨基甲酸酯鍵，其中L是-X-(C＝O)-Y，X是NH和Y是氧。
在脂類的尾部分，R1和R2相同或不同，可以是具有8-24個(gè)碳原子的無(wú)支鏈烷基或烯基。更優(yōu)選地，R1和R2基團(tuán)在長(zhǎng)度上在12-22個(gè)碳原子之間，R1＝R2＝C17H35(這樣基團(tuán)是一個(gè)硬脂?；?或R1＝R2＝C17H33(這樣基團(tuán)是一個(gè)油酰基)。
發(fā)明的脂類可采用標(biāo)準(zhǔn)的合成方法制備。如上所述，在證實(shí)本發(fā)明而進(jìn)行的研究中，制備了具有上面顯示的結(jié)構(gòu)的脂類，其中Z是咪唑，N＝2，L是氨基甲酸酯，和R1＝R2＝C17H35。制備實(shí)施例脂類的反應(yīng)流程圖在圖1中圖解，合成的細(xì)節(jié)在實(shí)施例1中提供。簡(jiǎn)言之，1，2-二硬脂酰甘油(化合物III)的對(duì)-硝基苯基碳酸酯從1，2-二硬脂酰-s正-甘油(化合物I)和對(duì)-硝基苯基氯甲酸酯(化合物II)中制備，并與組胺(化合物IV)反應(yīng)產(chǎn)生一種脂類(化合物V)，它具有一個(gè)通過氨基甲酸酯鍵與二硬脂酰尾連接的咪唑部分。可采用甘油替代1-氨基-2，3-丙二醇的相似路線產(chǎn)生氨基甲酸酯鍵的產(chǎn)物(L＝-O-(C＝O)-O-CH2-)。
制備具有其他連接的脂類很容易地由那些本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員采用常規(guī)的方法來完成。其他的連接包括醚(L＝-O-CH2-)和酯鍵(L＝-O-(C＝O)-)，以及尿素，酰胺和胺鍵(即，其中L＝-NH-(C＝O}-NH-，-NH-(C＝O)，或-NH-)。也可能是酮鍵，其中X是直接結(jié)合鍵。圖2A-2B圖解了胺鍵脂類的制備(圖2A)和具有含NH鍵的脂類(圖2B)。在圖2A中，組胺末端的胺與縮水甘油氯化物反應(yīng)，得到的環(huán)氧化物被水解，得到的二醇被?；?。
在圖2B中，制備了具有含NH鍵的脂類，例如已顯示的通過將組胺與甘油酸丙酮化物(2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-羧酸)的活化衍生物或四碳同系物，2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-乙酸反應(yīng)。然后二醇被去保護(hù)和?；?br> 圖2C和2D顯示了根據(jù)本發(fā)明制備pH反應(yīng)性脂類的其他反應(yīng)流程圖。在圖2C中，4-硝基安息香酸用1-氨基-2，3-丙二醇濃縮，得到酰胺鍵；二醇被?；趸鶊F(tuán)還原為胺得到產(chǎn)物，脂類-苯胺共軛物。在圖2D種，開始的濃縮反應(yīng)發(fā)生在乙醇(二?；视?和異氰酸酯之間，在產(chǎn)物中形成氨基甲酸酯鍵。
圖3A-3D顯示了根據(jù)本發(fā)明pH反應(yīng)性脂類的多種結(jié)構(gòu)，其中圖3A-3B進(jìn)一步顯示了芳香胺作為“Z”部分的脂類，圖3C-3D顯示了其氨基糖與一種脂類附著的脂類。這些脂類的合成可由本領(lǐng)域那些專業(yè)技術(shù)人員采用市售的起始原料很容易的進(jìn)行。例如，圖3A的產(chǎn)物可通過間-硝基苯溴化物和二?；视偷姆磻?yīng)而制備，形成醚鍵，然后進(jìn)行硝基的還原。圖3B的產(chǎn)物通過二醇的?；拖趸倪€原從市售的(2-硝基苯基)-1，2-乙二醇進(jìn)行制備。為了制備圖3C中顯示的氨基糖-脂質(zhì)共軛物，D-葡萄糖(呋喃糖形式)通過與兩分子的丙酮反應(yīng)而被保護(hù)，游離的羥基順序地與TsCl，疊氮化鈉和碘反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)中間硝基化合物。exocyclic diol被去保護(hù)并?；?，硝基還原為胺。圖3D的化合物以與D-半乳糖相似的方式被制備。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，pH依賴的脂類是組胺-二硬脂酰甘油(HDSG)。組胺的咪唑pKa為6。HDSG在生理pH(pH7.4)下趨向于中性，在低于6的pH下主要是帶正電荷的。
HDSG摻入的脂質(zhì)體在大約pH4至5時(shí)包裹DNA，類似于常規(guī)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體。HDSG脂質(zhì)體/復(fù)合體的表面電荷在血液循環(huán)中的生理pH下被還原。HDSG的表面電荷在pH5至6(在內(nèi)涵體和溶酶體中相同的pH)下主要是帶正電荷的，以便促進(jìn)復(fù)合體與溶酶體膜的相互作用，將核酸內(nèi)容物釋放至細(xì)胞漿中。
B.脂類-DTB-聚合物 發(fā)明的脂質(zhì)體也包含用親水聚合物通過可釋放的結(jié)合鍵衍化的脂類，如二硫代芐基部分。這種脂類聚合物成分具有通式結(jié)構(gòu)
其中R3包含一種親水聚合物，后者含有適合將聚合物與二硫代芐基部分共價(jià)附著的功能基團(tuán)。R4和R6可單獨(dú)地選擇是H，烷基或芳基，可被改變以適合二硫化物斷裂的速度。例如，為了達(dá)到更快的斷裂速度，R4和R6是氫。通過選擇烷基或芳基作為R4和R5的一個(gè)或兩個(gè)，通過空間阻遏二硫化物可獲得較慢的斷裂速度。R5含有與R7結(jié)合的連接部分，它含有一個(gè)含胺的脂類。在優(yōu)選的實(shí)施例中鍵合部分是O(C＝O)，S(C＝O)或O(C＝O)。含胺脂類R7可以是伯胺或仲胺，可選自任何數(shù)目的脂類，包括下面要描述的那些?；鶊F(tuán)CH2-R5的定位可以是鄰位或?qū)ξ弧?br> 含胺的脂類R7一般是水不溶性分子，含有至少1個(gè)?；湥兄辽?個(gè)碳原子，更優(yōu)選的是含有大約8-24個(gè)碳原子的?；湣Ｒ粋€(gè)優(yōu)選的脂類是含有一個(gè)含胺極性頭基和一個(gè)?；湹闹悺?shí)施例的脂類是含有一個(gè)單?；?，如硬脂酰胺，或兩個(gè)?；湹牧字?。優(yōu)選的具有一個(gè)含胺頭基的磷脂包括磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸。脂類的尾在大約12至大約24個(gè)碳原子之間，可以完全飽和的或不飽和的。一個(gè)優(yōu)選的脂類是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，但本領(lǐng)域的那些專業(yè)技術(shù)人員將要理解的是很廣泛的脂類都可包含在這種描述中。也可以理解的是脂類可自然地包含一個(gè)胺基團(tuán)或可被衍化含有一個(gè)胺基團(tuán)。其他不含有酰基尾的脂類部分，如膽固醇胺也是合適的。
聚合物-DTB-脂類化合物的合成在圖4中用示意圖說明。具有甲氧羰基二硫烷基末端基團(tuán)的mPEG衍生物(分子量2000和5000道爾頓)通過將2-(甲氧羰基二硫)乙胺與mPEG-氯甲酸酯反應(yīng)而制備，可很容易的通過干燥的mPEG-OH溶液的光氣化作用而制備(Zalipsky，S.等人，Biotechnol.Appl.Biochem.15100-114(1992).)。前面的化合物可通過2-氨基乙硫醇鹽酸鹽與等量的甲氧羰基烴基硫化氯的反應(yīng)而獲得，根據(jù)已發(fā)表的操作步驟(Brois，S.J.等人，J.Amer.Chem.Soc.927629-7631(1970)；Koneko，T.等人，Bioconjugate Chem.2133-141(1991))。巰基芐醇的對(duì)位和鄰位異構(gòu)體(Grice，R.等人，J.Chem.Soc.1947-1954(1963))整齊地與得到的PEG-連接的酰基二硫化物連接在一起，產(chǎn)生具有一個(gè)二硫芐醇末端基團(tuán)的mPEG。與未衍化的mPEG-OH一樣，進(jìn)行主動(dòng)的羧酸酯導(dǎo)入作用，得到對(duì)-硝基苯基羧酸酯。在乙醇胺中加入DSPE形成所需的mPEG-DTB-DSPE產(chǎn)物。制備鄰位和對(duì)位的-DTB-脂類化合物，用硅膠色譜純化，用NMR和MALD異-TOFMS進(jìn)行定性，其細(xì)節(jié)見實(shí)施例2。
圖5顯示了mPEG-DTB-DSPE共軛物在斷裂過程中硫解斷裂的機(jī)制。在斷裂過程中，磷脂酰乙醇胺以其天然的，未修飾形式被再生。
圖6A-6B顯示了mPEG-DTB-DSPE共軛物的合成反應(yīng)流程圖，該共軛物含有一個(gè)鄰接于二硫鍵的烷基，如一個(gè)更受阻遏的二硫鍵。如在實(shí)施例3A中更完全描述的，二氯甲烷中的mPEG-OH與p-硝基苯基氯甲酸酯在三乙胺(TEA)的存在下反應(yīng)形成mPEG-硝基苯基羧酸酯。二甲基甲酰胺(DMF)中的氨基醇，如1-氨基-2-丙醇或1-氨基-2-丁醇，與mPEG-硝基苯基羧酸酯在TEA的存在下反應(yīng)形成與PEG附著的仲醇。然后仲醇轉(zhuǎn)變?yōu)樗璧膍PEG-DTB-DSPE化合物，如圖6A所圖解，在實(shí)施例3A中詳述。
在這個(gè)反應(yīng)流程圖中，mPEG-甲基-二硫代芐基-硝基苯基氯甲酸酯與DSPE反應(yīng)形成所需的化合物。在mPEG-甲基-二硫代芐基-硝基苯基氯甲酸酯化合物中的硝基苯基氯甲酸酯部分在與選擇的脂類反應(yīng)過程中作為可離去的基團(tuán)，產(chǎn)生所需的產(chǎn)物?；衔镆部赏ㄟ^與如mPEG-甲基-二硫代芐基-R3的化合物反應(yīng)而產(chǎn)生，其中R3代表一個(gè)離去基團(tuán)，通過一個(gè)連接部分與苯環(huán)相連接。離去基團(tuán)在與含胺配體，如DSPE，多肽或含胺藥物反應(yīng)的過程中移位。離去基團(tuán)根據(jù)配體中胺的反應(yīng)性而選擇，優(yōu)選來自多種具有羥基或含氧離去基團(tuán)的酸性乙醇。這些包括氯化物，p-硝基苯酚，o-硝基苯酚，正-羥基-四氫鄰苯二甲酰亞胺，正-羥基琥珀酰亞胺，正-羥基-戊二酰亞胺，正-羥基降冰片烯-2，3-二羧基酰亞胺，1-羥基苯并三唑，3-羥基吡啶，4-羥基吡啶，2-羥基吡啶，1-羥基-6-三氟甲基苯并三唑，咪唑，三唑，正-甲基-咪唑，無(wú)氟苯酚，三氟苯酚和三氯苯酚。
實(shí)施例3B描述了mPEG-EtDTB-脂類共軛物的制備，其中二硫鍵被一個(gè)乙基部分阻遏。
圖7顯示了另一個(gè)根據(jù)本發(fā)明制備mPEG-DTB-配體化合物的合成反應(yīng)流程圖。反應(yīng)步驟的細(xì)節(jié)見實(shí)施例4A-4B。簡(jiǎn)言之，冷的1-氨基-2-丙醇與硫酸反應(yīng)形成2-氨基-1-甲基乙基硫化氫。這種產(chǎn)物與二硫化碳和酒精水溶液中的氫氧化鈉反應(yīng)產(chǎn)生5-甲基四氫噻唑-2-硫酮。鹽酸水溶液加入至5-甲基四氫噻唑-2-硫酮中并加熱。在回流一周后，產(chǎn)物，1-巰基(甲基)乙基氯化銨，被結(jié)晶和回收。這種產(chǎn)物與甲氧羰基烴基硫化氫反應(yīng)產(chǎn)生2-(甲氧羰基二硫)乙胺(ethaneamine)。2-(甲氧羰基二硫)乙胺與mPEG-氯甲酸酯使用上述圖4描述的步驟反應(yīng)產(chǎn)生所需的適合與選擇的含胺脂類反應(yīng)的mPEG-DTB-硝基苯基化合物。
實(shí)施例4B描述了mPEG-(乙基)DTB-硝基苯基合成的反應(yīng)。
圖8A顯示了另一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的mPEG-DTB-脂類化合物的制備反應(yīng)流程圖。反應(yīng)的細(xì)節(jié)在實(shí)施例5中提供。脂類1，2-二硬脂酰-s正-甘油被活化以便與mPEG-DTB-硝基苯基反應(yīng)，其制備如圖6A或圖7所述。得到的mPEG-DTB-脂類與上述缺乏磷酸鹽頭基時(shí)的化合物不同。圖8A的mPEG-DTB-脂類在斷裂前是中性的。如圖8B所示，在二硫鍵的硫解還原過程中，化合物分解產(chǎn)生陽(yáng)離子脂類。帶正電荷的脂類提供了體內(nèi)的靜電相互作用，在體內(nèi)的靶向中提供了相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)。
在上述的反應(yīng)流程圖中，已要求的化合物的R6是H。但在另一個(gè)實(shí)施例中，R6是烷基或芳基部分。在這種方法中，例如其中R4和R6都是CH3部分，α，β-不飽和?；?R’R″C＝CHCOCl，例如其中R’是CH3和R″是CH3，但可考慮任何烷基或芳基)與胺為末端的PEG反應(yīng)，得到相應(yīng)的正-PEG取代的α，β-不飽和胺。這個(gè)化合物與硫羥乙酸反應(yīng)，經(jīng)共軛添加至C＝C鍵上得到相應(yīng)的正-PEG-取代的β-(乙酰硫基)酰胺。乙酰硫基(-SCOCH3)被水解為硫基(-SH)，然后與甲基(氯亞磺酰)甲酸鹽(ClSCOOCH3)反應(yīng)，產(chǎn)生甲氧羰基二硫基(-SSCOOCH3)；這種中間產(chǎn)物與p-巰基芐醇反應(yīng)得到正-PEG-取代的β-(二硫芐醇)酰胺(具有PEG-NH-CO-CH2CR’R″-SS-p-苯基-CH2OH的結(jié)構(gòu))。然后芐醇部分與硝基苯基氯甲酸酯反應(yīng)得到如上的硝基苯基羧酸酯離去基團(tuán)。
如下面將要描述的，為支持本發(fā)明在研究中制備由陽(yáng)離子-中性脂類和聚合物-DTB-脂類組成的脂質(zhì)體。
C.核酸 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，上述脂類形成的脂質(zhì)體與核酸相結(jié)合?！敖Y(jié)合”的含義是一種治療性藥劑，如核酸，被包裹在脂質(zhì)體中央?yún)^(qū)室和/或脂質(zhì)雙分子層間隙中，與脂質(zhì)體外表面結(jié)合，或同時(shí)包裹在內(nèi)部或結(jié)合在脂質(zhì)體外面。應(yīng)理解的是治療性藥劑可以是核酸或藥物化合物。也應(yīng)理解的是藥物化合物可包裹在脂質(zhì)體中，核酸結(jié)合在脂質(zhì)體外面，或反之。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，核酸與脂質(zhì)體相結(jié)合。核酸可選自多種DNA和RNA為基礎(chǔ)的核酸，包括這些的片段和類似物。治療多種病狀的多種基因已經(jīng)被描述，目的特異基因的編碼序列可從DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到，如GenBank或EMBL。例如，以及描述了治療病毒，惡性和炎性疾病和病狀，如囊性纖維化，腺苷脫氨酶缺陷和AIDS的多核苷酸?？煽紤]通過給予腫瘤抑制基因，如APC，DPC4，NF-1，NF-2，MTS1，RB，p53，WT1，BRCA1，BRCA2和VHL來治療癌癥。
特殊核酸治療特定病狀的實(shí)例包括HLA-B7，腫瘤，結(jié)直腸癌，黑色素瘤；IL-2，癌癥，特別是乳癌，肺癌和腫瘤；IL-4，癌癥；TNF，癌癥IGF-1反義，腦腫瘤；IFN，神經(jīng)母細(xì)胞瘤；GM-CSF，腎細(xì)胞癌；MDR-1，癌癥，特別是進(jìn)展的癌癥，乳癌和卵巢癌；和HSV胸苷激酶，腦腫瘤，頭頸部腫瘤，間皮瘤，卵巢癌。
多核苷酸可以是反義DNA寡核苷酸，由與其靶標(biāo)互補(bǔ)的序列組成，一般是信使RNA(mRNA)或mRNA的前體。mRNA含有功能，或感覺和定位的遺傳信息，反義寡核苷酸的結(jié)合可滅活目的mRNA，并阻止其翻譯成蛋白質(zhì)。這樣的反義分子可根據(jù)生化試驗(yàn)來測(cè)定，該試驗(yàn)可顯示蛋白翻譯自特異的RNA，一旦RNA的序列已知，就可設(shè)計(jì)出可通過互補(bǔ)Watso 正-Crick堿基對(duì)與其結(jié)合的反義分子。這樣的反義分子一般含有10-30之間的堿基對(duì)，更優(yōu)選的在10-25之間，最優(yōu)選的在15-20之間。
反義寡核苷酸可被修飾以提高對(duì)核酸酶水解的抵抗力，這種類似物包括硫逐磷酸酯，膦酸甲酯，磷酸二酯和p-乙氧寡核苷酸(WO 97/07784)。
包裹的藥劑也可以是核糖酶、DNA酶或催化的RNA。
在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸或基因被插入進(jìn)質(zhì)粒中，優(yōu)選是一個(gè)環(huán)形的或閉合的雙鏈分子，其大小優(yōu)選在5-40Kbp(千堿基對(duì))的范圍。這樣的質(zhì)粒根據(jù)已知的方法進(jìn)行構(gòu)建，并包含一種治療性基因，即要在基因治療中表達(dá)的基因，在合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的控制下，其他在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組所必需的元件。用于基因治療制備質(zhì)粒的方法已被廣泛的了解和文獻(xiàn)參考。
多核苷酸，寡核苷酸，其他的核酸，如DNA質(zhì)粒，可通過被動(dòng)的內(nèi)陷作用在脂膜的水合作用過程中被包裹在脂質(zhì)體中。包裹多核苷酸的其他操作步驟包括以單分子的形式濃縮核酸，其中核酸懸浮在含有魚精蛋白硫酸鹽，精胺，亞精胺，組蛋白，賴氨酸，其混合物或其他合適的多陽(yáng)離子濃縮劑的水媒質(zhì)中，在可有效濃縮核酸成小顆粒的條件下。濃縮核酸分子的溶液可用于將干燥的脂膜再水合形成脂質(zhì)體，濃縮核酸以內(nèi)陷的形式在其中。
D.靶向配體 脂質(zhì)體可隨意地被制備以含有表面基團(tuán)，如抗體或抗體片段，可與細(xì)胞表面受體相互作用的小效應(yīng)劑分子，抗原和其他類似的化合物，以形成對(duì)特殊細(xì)胞群的所需的靶向結(jié)合特性。這種配體可包含在脂質(zhì)體中，通過將靶向分子衍化的脂類，或具有極性頭端化學(xué)基團(tuán)的脂類包含在脂質(zhì)體脂類中，其中該極性頭端化學(xué)基團(tuán)可用靶向分子在預(yù)先形成的脂質(zhì)體中被衍化?？蛇x擇地是，靶向部分可通過將預(yù)先形成的脂質(zhì)體與配體-聚合物-脂類共軛物孵育，而被插入進(jìn)預(yù)先形成的脂質(zhì)體中。
通過將配體共價(jià)附著于親水聚合物鏈的游離遠(yuǎn)端，脂類可被靶向配體衍化，親水聚合物鏈的近端附著在一種形成囊泡的脂類上。有許多種技術(shù)可將選擇的親水聚合物附著在選擇的脂類上，并活化聚合物的游離，未附著末端以便與選擇的配體反應(yīng)，特別是親水聚合物聚乙二醇(PEG)已經(jīng)被廣泛研究(Alien，T.M.等人，Biochemicia et Biophysica Acta 123799-108(1995)；Zalipsky，S.，Bioconjugate Chem.，4(4)296-299(1993)；Zalipsky，S.等人，F(xiàn)EBS Lett.35371-74(1994)；Zalipsky，S.等人，Bioconjugate Chemistry，705-708(1995)；Zalipsky，S.，在STEALTH LIPOSOMES(D.Lasic和F.Martin主編)第9章，CRCPress，Boca Raton，F(xiàn)L(1995))。
靶向配體為本領(lǐng)域的那些專業(yè)技術(shù)人員所熟知，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，配體是與內(nèi)皮腫瘤細(xì)胞具有結(jié)合活性的配體，更優(yōu)選地，可被細(xì)胞內(nèi)化。這樣的配體經(jīng)常與生長(zhǎng)因子受體的細(xì)胞外區(qū)結(jié)合。實(shí)施例的受體包括HER2/neu癌基因的c-erbB-2蛋白產(chǎn)物，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(堿性FGF)受體和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，E-，L-和P-選擇素受體，葉酸受體，CD4受體，CD19受體，αβ整合素受體和趨化因子受體。
III.組合物的制備 A.脂質(zhì)體成分 含有上述脂類的脂質(zhì)體，也就是陽(yáng)離子-中性脂類和聚合物-DTB-脂類，可通過多種技術(shù)制備，如在Szoka，F(xiàn).，Jr.等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)中的詳述，為支持本發(fā)明制備的脂質(zhì)體的特殊實(shí)施例將在下面描述。一般，脂質(zhì)體是多層的囊泡(MLVs)，可通過簡(jiǎn)單的脂膜水合技術(shù)來形成。在這種操作中，形成脂質(zhì)體的脂類混合物溶解在一種合適的有機(jī)溶劑中，該溶劑然后在一個(gè)容器中被蒸發(fā)，形成薄膜，脂類混合物的類型在下面詳述。然后通過一種水媒介覆蓋脂膜，水合形成MLVs，一般大小在大約0.1至10微米。
用于本發(fā)明組合物中的脂質(zhì)體包括(i)中性-陽(yáng)離子脂類和(ii)通過DTB健共價(jià)附著于親水聚合物的脂類。脂質(zhì)體也可包括其他成分，如形成囊泡的脂類或可穩(wěn)定摻入進(jìn)脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層的脂類，如甘油二酯，溶血磷脂，脂肪酸，糖脂，腦苷脂和固醇，如膽固醇。
一般，脂質(zhì)體包含大約10-90摩爾百分比的中性-陽(yáng)離子脂類，更優(yōu)選的是大約20-80摩爾百分比，還更優(yōu)選的是大約30-70摩爾百分比。包含的聚合物-DTB-脂類一般摩爾百分比為大約1-20之間，更優(yōu)選的為大約2-15摩爾百分比，還更優(yōu)選的為大約4-12摩爾百分比。在下面描述的為支持本發(fā)明進(jìn)行的研究中，脂質(zhì)體由60摩爾百分比的中性-陽(yáng)離子脂類和5摩爾百分比的聚合物-DTB-脂類組成。
根據(jù)本發(fā)明制備的脂質(zhì)體在選擇的大小范圍內(nèi)其尺寸被定量為實(shí)質(zhì)上均一的大小，一般為大約0.01至0.5微米，更優(yōu)選的在0.03-0.40微米之間。一種REV和MLV的有效的尺寸定量方法涉及通過一系列聚碳酸酯膜擠出脂質(zhì)體的水懸浮液，該膜選擇的統(tǒng)一孔徑大小范圍在0.03至0.2微米，一般為0.05，0.08，0.1，或0.2微米。膜的孔徑大小大概對(duì)應(yīng)于通過該膜擠出而產(chǎn)生的脂質(zhì)體的最大尺寸，特別是其中通過相同的膜制劑被擠出兩次或三次。均化作用的方法也可用于減小脂質(zhì)體的大小至100nm或更小(Martin，F(xiàn).J.，在SPECIALIZED DRUG DELIVERYSYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY.(P.Tyle主編)MarcelDekker，New York，267-316頁(yè)(1990))。
B.制備和定性舉例的組合物 在支持本發(fā)明而進(jìn)行的研究中，具有CMV啟動(dòng)子的pNSL熒光素酶原生質(zhì)DNA包裹在由中性-陽(yáng)離子脂類和聚合物-DTB-脂類組成的脂質(zhì)體中。通過包含葉酸或FGF作為靶向配體可完成復(fù)合體的靶向作用。根據(jù)本領(lǐng)域已知的和例如在美國(guó)專利6,180,134中所描述的的常規(guī)化學(xué)技術(shù)，一般靶向配體被共價(jià)附著在聚合物-DTB-脂類共軛物中PEG鏈的遠(yuǎn)端。
實(shí)施例7描述了給予Lewis肺癌細(xì)胞腫瘤小鼠的配方(7-1)，(7-2)，(7-3)，(7-4)，和(7-5)的制備。配方2和3含有上述圖1(化合物V)中的中性陽(yáng)離子脂類和圖4中描述的mPEG-DTB-脂類，其中R是H(在此也指“FC PEG”或“快速-可斷裂的PEG”。配方也包括一種FGF靶向配體。配方1，4和5作為比較的對(duì)照。
脂質(zhì)體-DNA復(fù)合體靜脈給予試驗(yàn)小鼠。24小時(shí)后，收集腫瘤和其他組織，分析熒光素酶的表達(dá)。結(jié)果在表1顯示。
表1 靜脈給予FGF靶向的脂質(zhì)體配方后Lewis肺癌荷瘤小鼠中熒光素酶的表達(dá) 配方編號(hào)(詳見實(shí)施例7)靶向配體熒光素酶表達(dá)(pg熒光素酶/mg蛋白)腫瘤肺肝配方7-1(HDSG/CHOL)FGF15.31.41.2配方7-2(HDSG/CHOL/F-C PEG)FGF7.81.94.5配方7-3(HDSG/PHSPC/F-C PEG)FGF1.22.03.2配方7-4(HDSG/PHSPC/PEG)FGF3.72.04.6配方7-5(DDAB/CHOL)葉酸4.3403.925.4 由DDAB(配方5)組成的脂質(zhì)體，是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體，在肺中的熒光素酶表達(dá)幾乎較其他配方高100倍。這是因?yàn)榉沃芯薮蟮谋砻娣e和肺中帶正電荷的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合體和帶負(fù)電荷的內(nèi)皮細(xì)胞表面之間的靜電荷相互作用。根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物克服了這種問題，其中使用中性-陽(yáng)離子脂類而不是陽(yáng)離子脂類。配方1-4所有都包含了HDSG中性-陽(yáng)離子脂類(圖1的化合物V)。由于脂類在生理pH(7.4)下為中性，脂質(zhì)體不會(huì)依附于肺表面，使脂質(zhì)體分布于全身。對(duì)于配方1和2，腫瘤組織中較高的熒光素酶表達(dá)反映了這種改良的生物分布作用。
實(shí)施例8-12描述了為支持本發(fā)明而進(jìn)行的其他研究，其中FGF-靶向脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體給予接種Lewis肺腫瘤的小鼠或用Matrigel注射的小鼠，Matrigel是進(jìn)行腫瘤血管系統(tǒng)靶向的一種FGF-血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。在這些研究中，根據(jù)本發(fā)明脂質(zhì)體由中性-陽(yáng)離子脂類HDSG(圖1的化合物V)和膽固醇或PHSPC組成。根據(jù)本發(fā)明PEG-DTB-脂類也包含在配方中。陽(yáng)離子脂類也包含在復(fù)合體中，以確定陽(yáng)離子脂類對(duì)復(fù)合體穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率的影響。使用兩種陽(yáng)離子脂類，DOTAP和N2-[N2，N5-雙(3-氨丙基)-L-ormithyl]-N，正-雙十八烷基-L-谷氨酰胺四氫三氟醋酸酯，在此稱為“GC33”。
各種配方靜脈給予患腫瘤或Matrigel的小鼠，給藥后24小時(shí)在Matrigel或腫瘤，肺和肝中測(cè)定熒光素酶的表達(dá)。在一個(gè)研究中(實(shí)施例10)，腫瘤細(xì)胞和Matrigel被接種在同一只小鼠相對(duì)的兩側(cè)腹部。結(jié)果在表2-6中顯示。 表2配方編號(hào)(詳見實(shí)施例8)靶向配體熒光素酶表達(dá)(pg熒光素酶/mg蛋白)Matrigel肺肝配方8-1(DOTAP/Chol)無(wú)28.62286.118.1配方8-2(HDSG/PHSPC)FGF16.0126.73.1配方8-3(HDSG/PHSPC/FC-PEG)FGF8.94.11.2配方8-4(HDSG/DOTAP/PHSPC)無(wú)9.94.41.7配方8-5(HDSG/DOTAP/PHSPC)FGF10.33.81.6配方8-6(HDSG/DOTAP/PHSPC/FC-PEG)FGF14.22.01.3配方8-7(HDSG/GC33/PHSPC)無(wú)10.5223.12.7配方8-8(HDSG/GC33/PHSPC)FGF11.2121.33.1配方8-9(HDSG/GC33/PHSPC/FC-PEG)FGF11.396.02.2表3配方編號(hào)(詳見實(shí)施例9)靶向配體熒光素酶表達(dá)(pg熒光素酶/mg蛋白)腫瘤肺配方9-1(DOTAP/Chol)無(wú)3.418317.0配方9-2(HDSG/PHSPC)FGF6.5306.4配方9-3(HDSG/PHSPC/FC-PEG)FGF5.62.8配方9-4(HDSG/DOTAP/PHSPC)無(wú)4.49.7配方9-5(HDSG/DOTAP/PHSPC)FGF17.17.4配方9-6(HDSG/DOTAP/PHSPC/FC-PEG)FGF4.34.6配方9-7(HDSG/GC33/PHSPC)無(wú)2.478.0配方9-8(HDSG/GC33/PHSPC)FGF1.4377.2配方9-9(HDSG/GC33/PHSPC/FC-PEG)FGF2.142.1 表4配方編號(hào)(詳見實(shí)施例10)靶向配體熒光素酶表達(dá)(pg熒光素酶/mg蛋白)腫瘤Matrigel肺肝配方10-1(DOTAP/Chol)無(wú)16.813.638956.8139.5配方10-2(HDSG/DOTAP/CHOL)無(wú)37.127.891.72.3配方10-3(HDSG/DOTAP/CHOL)FGF22.187.323.61.0配方10-4(HDSG/DOTAP/CHOL/FC-PEG)FGF179.410.15.52.6配方10-5(HDSG/GC33/PHSPC)無(wú)20.05.12.27.9配方10-6(HDSG/GC33/PHSPC)FGF38.918.82.01.2配方10-7(HDSG/GC33/PHSPC/FC-PEG)FGF16.74.32.12.2表5配方編號(hào)(詳見實(shí)施例11)靶向配體熒光素酶表達(dá)(pg熒光素酶/mg蛋白)Matrigel肺肝配方11-1(DOTAP/Chol)無(wú)35.0102929.3116.9配方11-2(HDSG/PHSPC)FGF34.31.62.1配方11-3(HDSG/DOTAP/PHSPC)FGF45.51.72.3配方11-4(HDSG/DOTAP/CHOL)無(wú)40.962.03.0配方11-5(HDSG/DOTAP/CHOL)FGF21.461.24.0配方11-6(HDSG/DOTAP/CHOL/FC-PEG)FGF64.54.01.6配方11-7(HDSG/DOTAP/CHOL)唾液酸Lewix-X42.834.12.2配方11-8(HDSG/DOTAP/CHOL)FGF38.112.42.6 表6配方編號(hào)(詳見實(shí)施例12)靶向配體熒光素酶表達(dá)(pg熒光素酶/mg蛋白)1腫瘤肺肝配方12-1(DOTAP/Chol)無(wú)72.1273214.0174.4配方12-2(HDSG/PHSPC)(＞5天)FGF17.59.23.5配方12-3(HDSG/PHSPC)(1天)FGF32.88.43.9配方12-4(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)(＞5天)無(wú)22.312.26.2配方12-5(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)(1天)FGF33.423.22.5 1在給予配方12-1，12-3和12-5的脂質(zhì)體后24小時(shí)和給予配方12-2和12-4后5天測(cè)定表達(dá)。
表2-6中的數(shù)據(jù)顯示采用HDSG中性-陽(yáng)離子脂類而不是常規(guī)的陽(yáng)離子脂類可使DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體達(dá)到更廣泛的生物分布作用。例如可通過對(duì)配方9-1和9-2比較肺和腫瘤中的熒光素酶表達(dá)可發(fā)現(xiàn)這種特征。當(dāng)中性陽(yáng)離子脂類包含在脂質(zhì)體中時(shí)可達(dá)到這種增強(qiáng)的生物分布作用，即使除了中性-陽(yáng)離子脂類以外還存在陽(yáng)離子脂類時(shí)，當(dāng)比較配方10-1和10-2的結(jié)果時(shí)也可發(fā)現(xiàn)同樣的特征。
FGF靶向配體對(duì)體內(nèi)基因表達(dá)的效果可通過用配方9-2和9-3的比較以及配方9-5和9-6的比較，配方10-3和10-4的比較而發(fā)現(xiàn)。在這些配方中，當(dāng)復(fù)合體含有FGF靶向配體時(shí)熒光素酶表達(dá)更高，有時(shí)是顯著地更高。
配方9-7，9-8和9-9與配方10-5，10-6和10-7的比較顯示將GC33的量從22.5摩爾百分比減少至11.25摩爾百分比可將熒光素酶的表達(dá)從肺中轉(zhuǎn)移至腫瘤或Matrigel。表達(dá)水平的這種轉(zhuǎn)移是由于脂質(zhì)體-DNA復(fù)合體表面電荷的減少，表明全身給藥后，在生理pH時(shí)表面電荷的缺乏增加了復(fù)合體在血液的滯留時(shí)間，并改變了組織的分布。
實(shí)施例13-15描述了多種脂質(zhì)體配方對(duì)KB荷瘤小鼠的體內(nèi)給藥。在這些研究中，復(fù)合體含有靶向表達(dá)葉酸的腫瘤細(xì)胞的葉酸配體。配方在實(shí)施例13-15中進(jìn)行描述，靜脈給藥后腫瘤肺和肝中的熒光素酶表達(dá)在表7-9中顯示。
表7配方編號(hào)(詳見實(shí)施例13)靶向配體熒光素酶表達(dá)(pg熒光素酶/mg蛋白)腫瘤肺肝配方13-1(DOTAP/Chol)無(wú)4.216727.213.3配方13-2(HDSG/PHSPC)葉酸4.22.51.0配方13-3(HDSG/PHSPC/FC-PEG)葉酸7.32.41.0配方13-4(HDSG/DOTAP/PHSPC)葉酸1.03.31.0配方13-5(HDSG/DOTAP/PHSPC/FC-PEG)葉酸10.52.71.1配方13-6(HDSG/GC33/PHSPC)葉酸6.032.90.7配方13-7(HDSG/GC33/PHSPC/SC-PEG)葉酸4.85.01.0配方13-8(HDSG/GC33/PHSPC/FC-PEG)葉酸2.813.31.1 表8劑量編號(hào)(詳見實(shí)施例14)靶向配體熒光素酶表達(dá)(pg熒光素酶/mg蛋白)腫瘤肺肝配方14-1(DOTAP/Chol)無(wú)5.9481.41.9配方14-2(HDSG/DOTAP/Chol)葉酸3.32.21.6配方14-3(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)葉酸3.67.61.2配方14-4(HDSG/DOTAP/Chol)葉酸1.23.31.2配方14-5(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)葉酸2.54.41.1表9配方編號(hào)(詳見實(shí)施例15)靶向配體熒光素酶表達(dá)(pg熒光素酶/mg蛋白)腫瘤肺肝配方15-1(DOTAP/Chol)無(wú)6.911575.710.5配方15-2(HDSG/PHSPC)葉酸6.22.20.9配方15-3(HDSG/PHSPC/FC-PEG)葉酸2.91.90.9配方15-4(HDSG/DOTAP/PHSPC)葉酸0.32.21.0配方15-5(HDSG/DOTAP/PHSPC/FC-PEG)葉酸0.82.01.3配方15-6(HDSG/DOTAP/Chol)葉酸2.017.01.1配方15-7(HDSG/DOTAP/Chol/FC-PEG)葉酸2.43.02.1 表7-9顯示了中性-陽(yáng)離子脂類的包涵體與用陽(yáng)離子脂類制備的脂質(zhì)體(配方13-1，14-1，15-1)相比所觀察到的生物分布發(fā)生了改變。最高的轉(zhuǎn)染在配方13-5觀察到，它是由中性-陽(yáng)離子脂類，PEG-DTB-脂類和葉酸靶向配體組成的脂質(zhì)體。
VI.實(shí)施例 下面的實(shí)施例是要說明而決不是要限制本發(fā)明。
材料下面的材料從指定的來源獲得部分氫化的大豆磷脂酰膽堿(VemonWalden Inc.，Green Village，NJ)；膽固醇(Solvay Pharmaceuticals，TheNetherlands)；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二甲基雙十八烷銨(DDAB)(AvantiPolar Lipids，Inc.，Birmingham，AL)。
方法 采用Coulter N4-MD(Coulter，Miami FL)進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射。
Zeta-電位采用Malver Instruments，Inc.的ZETASIZER 2000來測(cè)量Zeta電位。儀器如下操作測(cè)量的數(shù)目3；測(cè)量之間的延遲5秒；溫度25C；粘度0.89cP；介電常數(shù)79；單元類型毛細(xì)流；zeta限度-150mV至150mV。 實(shí)施例1制備舉例的中性-陽(yáng)離子脂類 A.制備二硬脂酰甘油的鄰-硝基苯基碳酸酯 如在圖1中所圖解的，1，2-二硬脂酰-s正-甘油(500mg，0.8mmol；化合物I)用苯共沸干燥(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器3次)。鄰-硝基苯基氯甲酸酯(242mg，1.2mmol，1.5當(dāng)量；化合物II)，4-二甲基氨基吡啶(10mg，0.08mmol，0.1當(dāng)量)，和三乙胺(334μl，204mmol，3當(dāng)量)加入至CHCl3(5ml)中的1，2-二硬脂酰甘油中。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。TLC顯示反應(yīng)完成?；旌衔镉肅HCl3(50ml)稀釋，用10％檸檬酸(3×15mL)提取。有機(jī)層被干燥(MgSO4)并蒸發(fā)得到固體。固體(淺橙色)用乙腈(4×3ml)沖洗去掉過量的p-硝基苯基氯甲酸酯。二硬脂酰甘油(化合物III)的產(chǎn)物，鄰-硝基苯基碳酸酯，在真空下經(jīng)P2O5干燥。產(chǎn)量557mg(88％)。
1H NMR(360MHz，DMSO-D6，)δ0.88(t，CH3，6H)；1.26(s，CH2 58H)；1.62(m，CH2CH2CO，4H)；2.4(2xt，CH2CO，4H)；4.2(dd，反式CH2OCO，1H)；4.35(m，CH2OCOO，2H)；4.5(dd，順式CH2OCO，1H)；5.38(m，CH2CHCH2，1H)；7.4(d，C6H5，2H)；8.3(d，C6H5，2H)。
B.制備組胺和二硬脂酰甘油的氨基甲酸酯 1，2-二硬脂酰甘油(350mg，0.44mmol，化合物III)的鄰-硝基苯基碳酸酯加入至CHCl3(1ml)中的組胺(46mg，0.40mmol，0.9當(dāng)量；化合物IV)和DMSO(200μl)中。吡啶(300μl；化合物V)加入至溶液中。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜(-20h)。TLC(CHCl3∶MeOH＝90∶10)顯示反應(yīng)趨向完成。溶劑被蒸發(fā)。產(chǎn)物(化合物VI)溶解在CHCl3中，倒在硅膠(Aldrich，230-400目，60A)柱上，用下列溶劑洗脫，CHCl3∶CH3COCH3＝90∶10，40ml(洗脫的上部)；CHCl3∶IPA＝80∶20，40ml(產(chǎn)物洗脫)；CHCl3∶IPA＝70∶30，40ml(更多的產(chǎn)物洗脫)。含有純產(chǎn)物的餾分混合在一起，并蒸發(fā)。產(chǎn)物在真空下經(jīng)P2O5干燥，得到白色固體(236mg，80％產(chǎn)量)。1H NMR(360MHZ，CDCl3/MeOH＝1∶1用TMS)δ0.88(t，CHS，6H.)；1.28(s，CH2，56H；1.62(m，CH2CH2CO，4H)；2.34(2xt，CH2CO，4H)；2.77(t，CH2CH2NH，2H)；3.18(t，CH2CH2CO，2H)；4.05-4.2(dd，順式和反式CH2CHCH2，4H)；5.13(m，CH2CHCH2，1H)；608(s，組胺，1H)；7.53(s，組胺，1H)。 實(shí)施例2 合成mPEG-DTB-DSPE 反應(yīng)流程圖在圖4中圖解。
mPEG-MeDTB-硝基苯基碳酸酯(300mg，0.12mmol，1.29當(dāng)量)溶解在CHCl3(3ml)中。DSPE(70mg，0.093mol)和TEA(58.5μl，0.42mmol，4.5當(dāng)量)加入至PEG溶液中，在50℃(油浴溫度)下攪拌。15分鐘后，TLC顯示反應(yīng)沒有完成。然后每10分鐘加入TEA(10μl，和20μl)的兩部分和少部分mPEG-MeDTB-硝基苯基碳酸酯(50mg，30mg，10mg)，直至反應(yīng)完成。溶劑被蒸發(fā)。產(chǎn)物混合物溶解在MeOH中，加入1g C8硅。再次蒸發(fā)溶劑。含有C8硅的產(chǎn)物加至柱的頂端，用MeOH洗脫∶H2O梯度(壓力)，MeOH∶H2O＝30∶70，60ml；MeOH∶H2O＝50∶50，60ml；MeOH∶H2O＝70∶30，140ml(初始物質(zhì)洗脫)；MeOH∶H2O＝75∶25＝40ml；MeOH∶H2O＝80∶20，80ml(產(chǎn)物洗脫)；MeOH∶H2O＝85∶15，40ml；MeOH∶H2O＝90∶10，40ml；MeOH＝40ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶10，40ml?；旌虾儺a(chǎn)物的餾分并蒸發(fā)干燥以得到無(wú)色濃稠液體的產(chǎn)物。添加叔丁醇(5ml)，凍干，然后在真空條件下經(jīng)P2O5干燥以得到白色蓬松的固體產(chǎn)物(252mg，89％產(chǎn)率)。
鄰位-和對(duì)位-DTB-DSPE復(fù)合物通過硅凝膠層析純化(氯仿中的甲醇梯度0-10％，≈70％單獨(dú)的產(chǎn)率)，通過NMR和MALD異-TOFMS確證結(jié)構(gòu)。(對(duì)位共扼的1H NMR(d6-DMSO，360MHz)δ0.86(t，CH3，6H)，1.22(s，脂質(zhì)的CH2，56H)，1.57(m，CH2CH2CO2，4H)，2.50(2xt，CH2CO2，4H)，2.82(t，CH2S，2H)，3.32(s，OCH3，3H)，3.51(m，PEG，≈180H)，4.07(t，PEG-CH2OCONH，2H)，4.11 & 4.28(2xdd甘油的CH2CH，.2H)，4.98(s，芐基-CH2，2H)，5.09(m，脂質(zhì)的CHCH2)，7.35 & 7.53(2xd，芳香族的，4H)ppm。鄰位共扼僅在5.11(s，CH2，2H)和7.31(d，1H)，7.39(m，2H)7.75(d，1H)ppm上的芐基和芳香族信號(hào)不同。
MALD異-TOFMS產(chǎn)生以相等的44Da距離間隔的離子分布，相當(dāng)于環(huán)氧乙烷重復(fù)單位。對(duì)位和鄰位異構(gòu)體化合物的平均分子量分別是3127和3139Da(理論分子量≈3100Da)。 實(shí)例3 mPEG-DTB-DSPE的合成 A.mPEG-MeDTB-DSPE 此反應(yīng)流程解在圖6A-6B中。
mPEG(5K)-OH(40g，8mmol)與甲苯共沸干燥(總?cè)莘e為270ml，250ml通過Dea正-Stark蒸餾得來)。二氯甲烷(100ml)加入mPEG-OH中。在4℃(冰水)下，P-硝基苯基氯甲酸酯(2.42g，12mmol，1.5當(dāng)量)和TEA(3.3ml，24mmol，3當(dāng)量)被加入PEG溶液中，同時(shí)注意防潮濕。形成了淺黃色TEA氫氯化物鹽。15分鐘后離開冷卻浴，室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。TLC顯示(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)反應(yīng)完成。蒸發(fā)溶劑。殘余物溶解在乙酸乙酯中(~50℃)。濾出TEA氫氯化物鹽，并用溫的乙酸乙酯洗滌。蒸發(fā)溶劑，用異丙醇再結(jié)晶產(chǎn)物(三次)。產(chǎn)量38.2g(92％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ3.55(s，PEG，45OH)；4.37(t，PEG-CH2，2H)；7.55(d，C6H5，2H)；8.31(d，C6H5，2H)。
1-氨基-2-丙醇(1.1ml，14.52mmol，3當(dāng)量)和TEA(2.02ml，14.52mmol，3當(dāng)量)加入mPEG(SK)-硝基苯基碳酸酯(25g，4.84mmol)的DMF(60ml)和CH2CI2(40ml)溶液中。它是黃色清亮溶液。室溫下攪拌反應(yīng)混合物30分鐘。TLC(CHCl3∶MeOH＝90∶10)顯示反應(yīng)趨向于完成。蒸發(fā)溶劑(二氯甲烷)。在產(chǎn)物混合物的DMF溶液(60ml)中加入異丙醇(250ml)。產(chǎn)物立即沉淀，然后用iPrOH再結(jié)晶(三次)。產(chǎn)量22.12g(90％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ.98(d，CH3CH(OH)CH2，3H)；3.50(s，PEG，180H)；4.03(t，PEG-CH2，2H)；4.50(d，CH3CHOH，1H)；7.0(t，mPEG-OCONH)。
mPEG(5K)-尿烷-2-甲基丙醇(22.12g，4.34mmol)與甲苯(45ml)共沸干燥。其中加入二氯甲烷(60ml)。甲烷磺酰氯(604.6μl，7.81mmol，1.8當(dāng)量)和TEA(3.93ml，28.21mmol，6.5當(dāng)量)在0℃加入mPEG-溶液中同時(shí)繼續(xù)攪拌并注意防潮。30分鐘后，離開冷卻浴，在室溫下攪拌反應(yīng)混合物16h。蒸發(fā)溶劑。添加乙酸乙酯以去除TEA鹽。用異丙醇再結(jié)晶產(chǎn)物(三次)。產(chǎn)量20.27g(90％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.27(d，CH3CHOSO2CH3，3H)；3.162(s，CH3O2SOCH，3H)；3.50(s，PEG，180H)；4.07(t，PEG-CH2，2H)；4.64(q，CH3CHOH，1H)；7.43(t，mPEG-OCONH)。
mPEG(5K)-尿烷-2甲基-甲烷砜(10.27g，1.98mmol)與甲苯(20ml，每次)共沸干燥。0℃(在冰水中)添加氫化鈉(377mg，9.4mmol，4.75eq)至無(wú)水甲苯(60ml)中。5分鐘后，三苯甲硫醇(3.92g，14.6mmol，7.15當(dāng)量)加到溶液中。10分鐘后，mPEG-尿烷-2甲基-甲烷砜(10.27gm，1.98mmol)被加入反應(yīng)混合物。它變成黃色溶液。45分鐘后，TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)顯示反應(yīng)趨向于完成。反應(yīng)混合物中加入醋酸(445.57μl，7.42mmol，3.75當(dāng)量)以中和過量的氫化鈉。溶液變得濃稠和發(fā)白。蒸發(fā)溶劑，用乙酸乙酯(30ml)和異丙醇(70ml)再結(jié)晶固體。產(chǎn)物混合物不完全溶解，但濾出沉淀。然后，用異丙醇/叔丁醇(100ml/20ml)再結(jié)晶產(chǎn)物混合物。產(chǎn)量8.87g(84％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ.74(d，CH3CHSC(C6H5)3，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.0(t，PEG-CH2，2H)，4.64(q，CH3CHOH，1H)；7.49(t，mPEG-OCONH)；7.20-7.41(m，SC(C6H5)3，15H)。
mPEG(5K)-尿烷-2甲基-三苯甲硫醇(8.87g，1.65mmol)0℃被溶解在TFA/CH2Cl2(10ml/10ml)中。在劇烈攪拌下，添加甲氧羰基烴基硫化氯(185.5μl，1.99mmol，1.2當(dāng)量)到溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)混合物15分鐘。TLC(CHCI3∶MeOH＝90∶10)顯示反應(yīng)完成。蒸發(fā)溶劑。用異丙醇∶叔丁醇(80ml∶20ml)再結(jié)晶產(chǎn)物混合物兩次。叔丁醇(5ml)加入產(chǎn)物中，然后凍干和在真空條件下經(jīng)P2O5干燥以得到白色蓬松的固體產(chǎn)物(8.32g，97％產(chǎn)率)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.17(d，CH3CHSSCOOCH3，3H)；3.42(s，PEG，180H)；3.84(s，CH3OCOSSCH，3H)；4.05(t，mPEG-CH2，2H)；7.38(t，mPEG-OCONH，1H)。
mPEG(5K)-尿烷乙基(甲基)二硫代羰基甲醇鹽(8.32g，1.6mmol)被溶解在無(wú)水甲醇(20ml)和氯仿(2.5ml)中。巰基芐醇(592mg，4mmol，2.5eq)的無(wú)水甲醇溶液(2ml)被加到PEG-溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)混合物18h。蒸發(fā)溶劑，用乙酸乙酯/異丙醇，30ml/100ml再結(jié)晶產(chǎn)物混合物(3次)。NMR顯示——形成了16％產(chǎn)物。于是，另一部分巰基芐醇(322mg，2.18mmol，1.8eq)的MeOH(2ml)溶液在0℃(冰水)逐滴地加入產(chǎn)物混合物的MeOH/CHCI3溶液(24ml/lml)中。添加完成(-10分鐘)后，離開冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)混合物24h。TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)顯示反應(yīng)完成。蒸發(fā)溶劑，然后用乙酸乙酯/異丙醇，30ml/100ml再結(jié)晶產(chǎn)物混合物。產(chǎn)量7.25g，(94％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.56(d，CH3CHSSC6H5CH2OH，3H)；3.29(CH3O-PEG，3H)；3.50(s，PEG，450H)；4.03(t，mPEG-CH2，2H)；4.46(d，HOCH2C6H5，2H)；5.16(t，HO CH2C6H5，1H)；7.30(d，C6H5，2H)；7.40(br t.mPEG-OCONH，1H)；7.50(d，C6H5，2H)。
mPEG(5K)-尿烷-乙基(甲基)-二硫代芐醇(6.75g，1.27mmol)被溶解在CHCI3(30ml)中，P-硝基苯基氯甲酸酯(513mg，2.54mmol，2當(dāng)量)在0℃(冰水)下被加入其中。5分鐘后，添加三乙胺(531μl，3.81mmol，3當(dāng)量)。30分鐘后離開冰浴，并室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。溶劑被蒸發(fā)。產(chǎn)物混合物溶解在乙酸乙酯中。TEA鹽被過濾掉，然后蒸發(fā)溶劑。然后用乙酸乙酯/異丙醇，30ml/100ml(三次)再結(jié)晶產(chǎn)物混合物。產(chǎn)量6.55g(94％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.17(d，CH3CHSSC6H5，3H)；3.24(CH3O-PEG，3H)；3.40(s，PEG，180H)；4.03(br t，mPEG-CH2，2H)；5.28(S，C6H5CH2OCO，2H)；7.45-8.35(m，C6H5)2，8H)。
mPEG-MeDTB-硝基苯基碳酸酯(766mg，0.14mmol，1.29eq)被溶解在CHCl3(5ml)中。DSPE(70mg，0.093mol)和TEA(58.5μl，0.42mmol，4.5eq)被加入PEG-溶液中，50℃下(油浴溫度)攪拌。20分鐘后，TLC顯示反應(yīng)沒有趨向于完成。添加更多的mPEG-MeDTB-硝基苯基碳酸酯(總共1239mg，0.23mmol，2.47當(dāng)量)和1-羥基苯并三唑(HOBt)(25mg，0.19mmol，2當(dāng)量)。20分鐘后，TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2，及鉬和茚三酮)顯示反應(yīng)完成。溶劑被蒸發(fā)。產(chǎn)物混合物溶解在溫的(42℃)乙酸乙酯中。它是混濁的溶液(TEA鹽沉淀)。過濾溶液，并蒸發(fā)溶劑。
在產(chǎn)物混合物中加入MeOH和2g的C8硅。溶劑再次蒸發(fā)。含C8硅的產(chǎn)物被加在柱的頂端，用MeOH∶H2O梯度(壓力)洗脫，MeOH∶H2O 30∶70，100ml；MeOH H2O50∶50，100ml；MeOH H2O 70∶30，250ml(起始反應(yīng)物洗脫)；MeOH H2O 75∶25＝40ml；MeOH H2O 80∶20，200ml(產(chǎn)物洗脫)；MeOH＝100ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2，100ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝75∶36∶6，100ml?；旌虾儺a(chǎn)物的餾分并蒸發(fā)干燥以得到無(wú)色濃稠液體的產(chǎn)物。添加叔丁醇(5ml)，凍干，然后在真空條件下經(jīng)P2O5干燥以得到白色蓬松的固體產(chǎn)物(457mg，83％產(chǎn)率)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ0.83(d，2(CH3)，3H)；1.16(d，CH3CHSSC6H5，3H)；1.21(s，28(CH2，56H)；1.47(br m，CH2CH2CO，4H)；2.23(2xt，CH2CH2CO，4H)；3.50(s，PEG，180H)；4.04(br t，mPEG-CH2，2H)；4.05(trans d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.24(cis d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.97(s，C6H5OCO-DSPE，2H)；5.03(br s，(PO4CH2CH，1H)；7.32(d，C6H5 2H)；7.53(d，C6H5，2H)；7.52(br s，mPEG-OCONH，1H)。MALD異-TOFMS產(chǎn)生以相等的44Da距離間隔的鐘形分布的離子，相當(dāng)于環(huán)氧乙烷重復(fù)單位。共扼物和mPEG-硫醇(大部分裂解的二硫化物)的平均分子質(zhì)量是6376和5368Da(理論分子質(zhì)量——6053和5305道爾頓)。
B.mPEG-乙基DTB-DSPE mPEG-尿烷乙基(乙基)二硫代羰基甲醇鹽(2g，0.90mmol)溶解在無(wú)水甲醇(8ml)中。開始時(shí)溶液是混濁的，但5分鐘后變成清亮溶液。PEG-溶液中加入巰基芐醇(265.2mg，1.79mmol，2當(dāng)量)。室溫下攪拌反應(yīng)混合物30小時(shí)。在反應(yīng)溶液中加入乙醚(70ml)以沉淀產(chǎn)物，并保持4℃過夜。過濾白色固體，并用乙酸乙酯/乙醚，30ml/70ml再結(jié)晶。產(chǎn)量1.96g，(94％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ0.86(d，CH3CH2CHSSC6H5CH2OH，3H)；1.42(p，CH3CH2CHSSC6H5CH2OH，1H)；1.64(p，CH3CH2CHSSC6H5CH2OH，1H)；3.51(s，PEG，180H)；4.03(t，mPEG-CH2，2H)；4.47(d，HOCH2C6H5，2H)；5.20(t，HOCH2C6H5，1H)；7.31(d，C6H5，2H)；7.42(br t，mPEG-OCONH，1H)；7.49(d，C6H5，2H)。
正-羥基-s-降冰片烯-2，3-二羧基酸酰亞胺(HONB)(48mg，0.269mmol)在50℃(油浴溫度)下加入DSPE(55mg，0.073mmol)的CHCI3(3ml)溶液。3-4分鐘后，它變成清亮的溶液。然后，添加mPEG-EtDTB-硝基苯基氯甲酸酯(334mg，0.134mmol)，隨后加三乙胺(TEA，45μl，0.329mmol)。20分鐘后，TLC(CHCI3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)顯示反應(yīng)趨向于完成(鉬和茚三酮噴霧)。溶劑被蒸發(fā)。產(chǎn)物混合物溶解在甲醇中，與C8硅(1g)混合，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)作用去除溶劑。固體殘余物被加在CS-柱頂端，然后用MeOH∶H2O梯度(壓力)洗脫，MeOH∶H2O＝30∶70，60ml；MeOH∶H2O＝50∶50，60ml；MeOH∶H2O＝70∶30，140ml；MeOH∶H2O＝75∶25＝140ml(起始反應(yīng)物洗脫)；MeOH∶H2O＝80∶20，80ml；MeOH∶H2O＝90∶10，140ml(產(chǎn)物洗脫)；MeOH＝40ml；CHCI3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶10，40ml?；旌虾儺a(chǎn)物的餾分并蒸發(fā)干燥以得到無(wú)色濃稠液體的產(chǎn)物。添加叔丁醇(5ml)，凍干，然后在真空條件下經(jīng)P2O5干燥以得到白色蓬松的固體產(chǎn)物(175mg，78％產(chǎn)率)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ0.85(d，2(CH3)，6H；d，CH3CHSSC6H5，3H)；1.22(s，28(CH2)，56H)；1.49(br m，CH2CH2CO，4H)；2.24(2xt，CH2CH2CO，4H)；3.50(s，PEG，180H)；4.04(br t，mPEG-CH2，2H)；4.08(trans d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.27(cis d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.98(s，C6H5CH2OCO-DSPE，2H)；5.06(brs，(PO4CH2CH，1H)；7.34(d，C6H5，2H)；7.53(d，C6H5，2H)；7.55(br s，mPEG-OCONH，1H)。
實(shí)例4 mPEG-DTB-硝基苯氯甲酸酯的合成 本反應(yīng)流程圖見圖7所示。
A.1-(巰甲基)-氯化乙銨的合成步驟 1.2-氨基-1-甲基乙基硫酸氫鹽 1-氨基-2-丙醇(22.53g，0.3mol)在冰浴中劇烈攪拌，在1小時(shí)內(nèi)緩慢加入硫酸(16.10ml，0.3mol)，燒瓶中將形成濃霧和極其粘稠的溶液。加樣完成后在低壓環(huán)境下加熱到170℃～180℃，反應(yīng)液將變?yōu)榈稚?。?dāng)所有水份除去后(接近1小時(shí))冷卻至室溫。在冷卻過程中會(huì)形成一種玻璃樣的褐色固體(用甲醇研磨后可結(jié)晶)，然后溶解于60℃水(50ml)中，并加入足量甲醇制成80％甲醇溶液。冷卻時(shí)，形成的結(jié)晶需經(jīng)過濾和P2O5干燥。產(chǎn)量17.17g(37％)，1H NMR(D6-DMSO)δ1.16(d，CH3，3H)；δ2.78(dd，NH3-CH2，1H)；δ2.97(dd，NH3-CH2，1H)；δ4.41(m，CH-OSO3，1H)；δ7.69(s，H3N，3H)。熔點(diǎn)248°～250℃(實(shí)際250℃)。
2.5-甲基噻唑烷-2-硫酮 2-氨基-1-甲基乙基硫酸氫鹽(23.03g，148mmol)和二硫化碳(10.71ml，178mmol，1.2當(dāng)量)置于一250ml圓底燒瓶?jī)?nèi)攪拌(內(nèi)含50％乙醇40ml)，緩慢地逐滴加入氫氧化鈉(13.06g，327mmol，2.2當(dāng)量)溶于50％乙醇50ml)。滴加氫氧化鈉過程中，所有反應(yīng)起始物均溶解于液體中并變?yōu)槌壬７磻?yīng)經(jīng)40分鐘反流(85℃)后轉(zhuǎn)呈鮮黃色，并有厚重的沉淀形成。蒸發(fā)乙醇，然后溫?zé)岬乃芤航?jīng)過Buchner漏斗過濾除去所有水溶性雜質(zhì)。余下的結(jié)晶溶解于溫乙醇并加入溫水制成80％水溶液。冷卻并冷凍該混合物，最終生成長(zhǎng)針樣結(jié)晶。產(chǎn)量14.64g(75％)。1H NMR(D6-DMSO)δ1.33(d，CH3，3H)；δ3.50(m，R3CH，1H)；δ3.95(dd，正-CH2，1H)；δ4.05(m，正-CH2，1H)；δ10.05(s，NH，1H)。熔點(diǎn)92.5～93.5℃(實(shí)際94～95℃)。
3.1-(巰甲基)乙基氯化銨 5-甲基噻唑烷-2-硫酮(6.5g，49mmol)置于一250ml圓底燒瓶?jī)?nèi)。加入一種鹽酸水溶液(40ml，含18％水)并在油浴中加熱。整個(gè)反應(yīng)需經(jīng)一周時(shí)間反流(120℃)。在這一周中還需3次加入1ml濃縮鹽酸，并用TLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)(使用乙酸乙酯作為洗脫劑)。利用紫外線、水合茚三酮和碘蒸汽可使這些物質(zhì)顯色。在大多數(shù)時(shí)間里反應(yīng)物是混雜的——反應(yīng)起始反應(yīng)物是油性的，濃于水；一周后油性起始反應(yīng)物耗盡(盡管TLC下仍可見)。除去加熱裝置令反應(yīng)物冷卻至室溫，冷凍結(jié)晶起始反應(yīng)物。過濾結(jié)晶的起始反應(yīng)物。過濾物脫水并經(jīng)P2O5干燥，用NaOH去除所有水份和鹽酸。粗產(chǎn)物經(jīng)兩份二乙醚洗滌(每次50ml)除去所有起始反應(yīng)物，再用P2O5干燥。產(chǎn)量2.83g(45％)。1H NMR(D6-DMSO)δ1.33(d，CH3，3H)；δ2.92(m，正-CH2，2H)；δ3.12(m，SH，1H)；δ3.18(m，R3-CH，1H)；δ8.23(bs，NH3，3H)。熔點(diǎn)80～82℃(實(shí)際92～94℃)。
B.mPEG-乙基-PTB-硝基苯基氯甲酸酯的合成 1.2-氨基-1-甲基乙基硫酸氫鹽 1-氨基-2-丁醇(15ml，158mmol)置于100ml圓底燒瓶?jī)?nèi)，在冰浴條件下劇烈攪拌。在1小時(shí)的過程中緩慢加入硫酸(8.43ml，158mmol)。燒瓶中將形成濃霧和及其粘稠的溶液。加樣完成后在與真空裝置連接的低壓環(huán)境下加熱到170℃～180℃。加熱過程中反應(yīng)液將變?yōu)榈稚?。?dāng)所有水份除去后(接近1小時(shí))冷卻至室溫。在冷卻過程中會(huì)形成一種玻璃樣的褐色固體，溶解于熱水(50ml)，然放置冰箱過夜。冷卻時(shí)，形成的結(jié)晶需經(jīng)過慮和P2O5干燥。產(chǎn)量9.98g(37％)。1H NMR(D6-DMSO)δ0.87(t，CH3，3H)；δ1.51(q，CH3-CH2，2H)；δ2.82(dd，NH3-CH2，1H)；δ3.00(dd，NH3-CH2，1H)；δ4.21(m，CH-OSO3，1H)；δ7.70(s，H3N，3H)。
2.5-甲基噻唑烷-2-硫酮 2-氨基-1-乙基-硫酸氫乙酯(9.98g，59mmol)和二硫化碳(4.26ml，71mmol，1.2當(dāng)量)置于一100ml圓底燒瓶?jī)?nèi)攪拌(內(nèi)含50％乙醇15ml)。非常緩慢地逐滴加入溶于50％乙醇(20ml)的氫氧化鈉(5.20g，130mmol，2.2當(dāng)量)。滴加氫氧化鈉的過程中，所有反應(yīng)起始物均溶解于液體中并變?yōu)槌壬７磻?yīng)經(jīng)40分鐘反流(85℃)后轉(zhuǎn)呈鮮黃色，并有厚重的沉淀形成。蒸發(fā)乙醇，然后水溶液經(jīng)過Buchner漏斗過濾除去所有水溶性雜質(zhì)。余下的結(jié)晶溶解于溫乙醇并加入溫水制成80％水溶液。冷卻并冷凍該混合物，最終生成長(zhǎng)針樣結(jié)晶。產(chǎn)量7.28g(86％)。1H NMR(D6-DMSO)δ0.88(t，CH3，3H)；δ1.66(in，CH3-CH2，2H)；δ3.58(m，R3CH，1H)；δ3.93(m，正-CH2，2H)；δ10.06(s，NH，1H)。熔點(diǎn)76～78℃(實(shí)際76.6～76.9℃)。
3.1-(巰甲基)乙基氯化銨 5-甲基噻唑烷-2-硫酮(7.24g，50mmol)置于一250ml圓底燒瓶?jī)?nèi)。加入一種鹽酸水溶液(45ml，含18％水)并在油浴中加熱。加熱過程中，整個(gè)反應(yīng)需經(jīng)一周時(shí)間反流(120℃)。在這一周中還需4次加入1ml濃縮鹽酸，并用TLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)(使用乙酸乙酯作為洗脫劑)。利用紫外線、水合茚三酮和碘蒸汽可使這些物質(zhì)顯色。在大多數(shù)時(shí)間里反應(yīng)物是混雜的——反應(yīng)起始反應(yīng)物是油性的，濃于水；一周后油性起始反應(yīng)物耗盡(盡管TLC下仍可見)。除去加熱裝置令反應(yīng)物冷卻至室溫，冷凍后結(jié)晶并過濾結(jié)晶的起始反應(yīng)物。過濾物脫水并經(jīng)P2O5干燥，用NaOH去除所有水份和鹽酸。粗產(chǎn)物經(jīng)兩份二乙醚洗滌(每次50ml)除去所有起始反應(yīng)物，再用P2O5干燥。產(chǎn)量3.66g(52％)。1H NMR(D6-DMSO) 實(shí)例5 mPEG-DTB-脂類的合成 本反應(yīng)設(shè)計(jì)見圖8A所示。
1，2-二硬脂酰-s正-甘油(500mg，0.8mmol)與苯共沸3次進(jìn)行干燥。對(duì)硝基苯基氯甲酸酯(242mg，1.2mmol，1.5當(dāng)量)，二甲基氨基吡啶(DMAP)(10mg，0.08mmol，0.1當(dāng)量)以及TEA(334.5μl，2.4mmol，3當(dāng)量)加到1，2-二硬脂酰甘油和CHCl3的混合物(5ml)中。室溫?cái)嚢?小時(shí)，由TLC(甲苯∶乙酸乙酯＝7∶3)顯示反應(yīng)完成。產(chǎn)物混合物隨后進(jìn)行萃取用10％檸檬酸去除二甲基氨基吡啶(DMAP)，用乙腈(3ml，4次)去除多余的對(duì)硝基苯基氯甲酸酯。純化產(chǎn)物在真空條件下經(jīng)P2O5干燥。產(chǎn)量557mg(88％)。1H NMR(CHCl3，360MHz)50.88(t，end CH3，6H)；1.25(s，28xCH2，56H)；1.58(m，CH2CH2CO，4H)；2.34(2xt，CH2CO，4H)；4.22(trans d，CH2OCOC17H35，1H)；4.35(m，OCOOCH2CH，2H)；4.51(cis d，CH2OCOC17H35，1H)；5.37(m，OCOOCH2CH，1H)；7.39(d，C6H5，2H)8.28(d，C6H5，2H)。
乙二胺(42μl，0.63mmol，5倍過量)和吡啶(200μl)加到CHCl3(1ml)中。2-二硬脂酰-s正-對(duì)硝基苯基碳酸酯(100mg，0.13mmol)溶于CHCl3(1ml)，在0℃(冰水)用巴斯德移液管逐滴加入至乙二胺溶液并持續(xù)過夜(16小時(shí))。由TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O 90∶18∶2，和CHCl3∶MeOH＝90∶10)顯示反應(yīng)完成。蒸發(fā)溶劑以去除吡啶。然后，產(chǎn)物混合物溶解于CHCl3，上柱(Aldrich，Silicagel，60_，200-400目)，并經(jīng)CHCl3洗脫∶CH3COCH3和CHCl3∶MeOH梯度，CHCl3∶CH3COCH3＝90∶10，60ml(洗脫的上部)；CHCl3∶NeOH＝90∶10，60ml(洗脫的產(chǎn)物)。混合含純凈產(chǎn)物的各個(gè)餾分并蒸發(fā)。加入叔丁醇在真空條件下經(jīng)P2O5干燥。產(chǎn)量64mg(75％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ.83(t，end CH3，6H)；1.22(s，28xCH2，56H)；1.51(m，CH2CH2CO，4H)；2.25(2xt，CH2CO，4H)；2.83(m，H2NCH2CH2NH，2H)；3.21(m，H2NCH2CH2NH，2H)；4.10-4.14(m & cis d，COOCH2CHCH2，4H)；5.17(m，OCOOCH2CH，1H)；7.78(m，H2NCH2CH2NH，2H)。
mPEG-MeDTB-硝基苯基氯甲酸酯(400mg，0.162mmol，2.2當(dāng)量)溶于CHCl3(2ml)中。1，2-硬脂酰-s正-乙烯胺(51mg，0.075mmol)和TEA(37μl，0.264mmol，3.52當(dāng)量)同時(shí)加入到溶液中，然后45℃攪拌20分鐘進(jìn)行反應(yīng)，TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2，而且CHCl3∶MeOH＝90∶10)顯示反應(yīng)完成。蒸發(fā)溶劑后，產(chǎn)物混合物溶于甲醇中，繼而加入2g C8硅石，并再次蒸發(fā)溶劑。此后含產(chǎn)物混合物的C8硅石加到C8柱的頂部(Supelco，Supel clean，Lot no.SP0824)并用MeOH∶H2O梯度(壓力)洗脫，MeOH∶H2O＝60∶40，40ml；MeOH∶H2O＝70∶30，80ml(起始反應(yīng)物洗脫)；MeOH∶H2O＝80∶20，40ml；MeOH∶H2O＝90∶10＝20ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝5∶80∶15，20ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶10，40ml(產(chǎn)物洗脫)?；旌虾儍舢a(chǎn)物的各個(gè)餾分并蒸發(fā)，所得產(chǎn)物為無(wú)色粘稠液體。加入叔丁醇(5ml)，然后凍干溶液并在真空條件下經(jīng)P2O5干燥，產(chǎn)物為白色固體。(200mg，產(chǎn)量89％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δδ.83(t，CH3，6H)；1.22(s，28xCH2，56H)；1.48(m，CH2CH2CO，4H)；2.25(2xt，CH2CO，4H)；3.10(m，HNCH2CH2NH，4H)；3.50(s，PEG，180H)；4.04(t，mPEG-CH2，2H)；4.09(trans d，COOCH2CHCH2，1H)；4.25(cis d，COOCH2CHCH2，1H)；4.98(s，C6H5CH2OCO，2H)；5.23(m，COOCH2CHCH2，1H)；7.18(m，NHCH2CH2NH，2H)；7.33(d，C6H5，2H)；7.38(m，mPEG-OCONH，1H)；7.52(d，C6H5，2H)。實(shí)例6 含核酸脂質(zhì)體的制備 脂質(zhì)體的制備是將所需的脂質(zhì)組分以所需的摩爾比例溶于有機(jī)溶劑制成溶液，然后與pH4～5的5％葡萄糖水合。脂質(zhì)組分和組分的摩爾比例在下面例子中有詳述。
編碼熒光素酶的pNSL質(zhì)粒按美國(guó)專利5,851,818所述構(gòu)建，所需兩個(gè)質(zhì)粒均來自市售產(chǎn)品，pGFP-N1質(zhì)粒(來自Clontech，Palo Alto，CA)，pGL3-C(來自Promega Corporation，Madison，WI)。熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒DNA溶液緩慢加入酸性脂質(zhì)體溶液中，持續(xù)攪拌10分鐘。
依據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法(Gabizon A等人，Bioconjugate Chem.，1999，10289)將FGF或葉酸配體共軛至馬來酰亞胺-PEG-DSPE上。DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物與mPEG-DSPE，F(xiàn)GF-PEG-DSPE或者葉酸-PEG-DSPE微膠粒溶液共同孵育20分鐘，并不斷攪拌以使配體-PEG-脂質(zhì)能夠插入到預(yù)先形成的脂質(zhì)體中。
實(shí)例7 在腫瘤組織中的活體轉(zhuǎn)染和表達(dá) A.腫瘤模型 KB腫瘤細(xì)胞(100萬(wàn)細(xì)胞)皮下接種至裸鼠側(cè)腹部。給予小鼠低葉酸飲食以上調(diào)KB腫瘤細(xì)胞上葉酸受體的表達(dá)。此模型用于以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶向目標(biāo)的葉酸共軛脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。
Lewis肺癌細(xì)胞(100萬(wàn)細(xì)胞)皮下接種至B6C3-F1鼠側(cè)腹部。FGF受體在血管內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞上均有表達(dá)。此模型用于以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶向目標(biāo)的FGF共軛脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。
B.脂質(zhì)體配方 在實(shí)例6中按照如下的脂質(zhì)組分制備了5種脂質(zhì)體配方。
配方No.7-1 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的60摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的40摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.7-2 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的60摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的40摩爾百分比mPEG-DTB-DSPE(FC PEG)總脂質(zhì)的5摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.7-3 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比mPEG-DTB-DSPE(″FC PEG)總脂質(zhì)的5摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.7-4 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比mPEG-DSPE總脂質(zhì)的5摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.7-5 組分量DDAB總脂質(zhì)的55摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的45摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μg葉酸靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 C.體內(nèi)給藥 15只接種了Lewis肺癌細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分入4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，接受上述配方1-5中的一種。脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物靜脈注入小鼠(劑量為200μg DNA質(zhì)粒)，24小時(shí)后收集腫瘤和其他組織，組織提取物的熒光素酶表達(dá)經(jīng)熒光素酶法測(cè)定，結(jié)果見表1。實(shí)例8 FGF-靶向脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物的體內(nèi)給藥 A.Matrigel腫瘤模型 小鼠Matrigel_腫瘤模型用于以FGF-血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶向目標(biāo)的腫瘤血管系統(tǒng)。Matrigel_中的血管內(nèi)皮細(xì)胞類似于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，這些Matrigel_內(nèi)皮細(xì)胞(只是內(nèi)皮細(xì)胞，沒有腫瘤細(xì)胞)模擬了腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞被用于研究以FGF為靶向目標(biāo)的脂質(zhì)體/核酸復(fù)合物的活體轉(zhuǎn)染和表達(dá)。當(dāng)注入小鼠皮下后，Matrigel_形成固體膠狀物并誘發(fā)迅速而強(qiáng)烈的血管反應(yīng)。
R.脂質(zhì)體配方 在實(shí)例6中按照如下的脂質(zhì)組分制備了9種脂質(zhì)體配方。
配方No.8-1 組分量DOTAP總脂質(zhì)的55摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的45摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μg 配方No.8-2 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.8-3 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.8-4 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg 配方No.8-5 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.8-6 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.8-7 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的42.5摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的22.5摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒250μg 配方No.8-8 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的42.5摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的22.5摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒250μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.8-9 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的42.5摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的22.5摩爾百分PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒250μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 C.體內(nèi)給藥 27只小鼠注射了Matrigel_。植入Matrigel 6天后，小鼠被隨機(jī)編入處理組中(n＝3)，接受上述B章節(jié)中所述的9種配方之一的處理。靜脈注射脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，劑量為200μg DNA質(zhì)粒。FGF靶向脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物給藥后24小時(shí)后檢測(cè)Matrigel、肺以及肝臟熒光素酶的表達(dá)，結(jié)果如表2所示。 實(shí)例9 體內(nèi)給藥FGF靶向脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物 A.試驗(yàn)動(dòng)物 小鼠用Lewis肺癌細(xì)胞接種，如實(shí)例7A所述。
B.脂質(zhì)體配方 按照實(shí)例6所述制備了9種如下脂質(zhì)組分的脂質(zhì)體配方。
配方No.9-1 組分量DOTAP總脂質(zhì)的55摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的45摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μg 配方No.9-2組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.9-3 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.9-4 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg 配方No.9-5 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.9-6 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比 FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.9-7 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的42.5摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的22.5摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒250μg 配方No.9-8 組分HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的42.5摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的22.5摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒250μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.9-9 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的42.5摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的22.5摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒250μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 C.體內(nèi)給藥 接種腫瘤細(xì)胞9天后，27只荷瘤小鼠隨機(jī)分入處理組中(n＝3)，接受上述9種配方之一，配方(9-1)至配方(9-9)的處理。靜脈注射脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，劑量為200μg DNA質(zhì)粒。FGF靶向脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物給藥后24小時(shí)檢測(cè)腫瘤、肺以及肝熒光素酶的表達(dá)，結(jié)果如表3所示。 實(shí)例10 體內(nèi)給藥FGF靶向脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物 A.試驗(yàn)動(dòng)物 小鼠用Lewis肺癌細(xì)胞接種，如實(shí)例7A所述。在兩側(cè)側(cè)腹部注入Matrigel，如實(shí)例8A所述。
B.脂質(zhì)體配方 按照實(shí)例6制備了7種如下脂質(zhì)組分的脂質(zhì)體配方。
配方No.10-1 組分量DOTAP總脂質(zhì)的55摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的45摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μg 配方No.10-2 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比CHOL總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg 配方No.10-3 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比CHOL總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.10-4 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比CHOL總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.10-5 組分量 HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的53.75摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的11.25摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg 配方No.10-6 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的53.75摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的11.25摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.10-7 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的53.75摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的11.25摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 C.體內(nèi)給藥 接種腫瘤細(xì)胞9天后，21只荷瘤小鼠隨機(jī)分入處理組中(n＝3)，接受上述7種配方之一，配方(10-1)至配方(10-7)的處理。靜脈注射脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，劑量為200μg DNA質(zhì)粒。FGF靶向脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物給藥后24小時(shí)檢測(cè)Matrigel、腫瘤、肺以及肝熒光素酶的表達(dá)，結(jié)果如表4所示。
實(shí)例11 體內(nèi)給藥FGF靶向脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物 A.試驗(yàn)動(dòng)物 Matrigel植入小鼠，如實(shí)例8A所述。
B.脂質(zhì)體配方 按照實(shí)例6制備了8種如下脂質(zhì)組分的脂質(zhì)體配方。
配方No.11-1 組分量DOTAP總脂質(zhì)的55摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的45摩爾百分比 熒光素酶質(zhì)粒100μg 配方No.11-2 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.11-3 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.11-4 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比CHOL總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg 配方No.11-5 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比CHOL總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.11-6 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比CHOL總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的4摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg FGF靶向配體 15FGF/脂質(zhì)體 配方No.11-7 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比CHOL總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgsialyl-Lewis X靶向配體15/脂質(zhì)體 配方No.11-8 組分量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的45摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的20摩爾百分比CHOL總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 C.體內(nèi)給藥 植入Matrigel 6天后，24只小鼠隨機(jī)分入處理組中(n＝3)，接受上述8種配方之一，配方(11-1)至配方(11-8)的處理。靜脈注射脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，劑量為200μg DNA質(zhì)粒。FGF靶向脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物給藥后24小時(shí)檢測(cè)Matrigel、肺和肝熒光素酶的表達(dá)，結(jié)果如表5所示。
實(shí)例12 體內(nèi)給藥FGF靶向脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物 A.試驗(yàn)動(dòng)物 小鼠用Lewis肺癌細(xì)胞接種，如實(shí)例7A所述。
B.脂質(zhì)體配方 按照實(shí)例6制備了5種如下脂質(zhì)組分的脂質(zhì)體配方。
配方No.12-1 組分量DOTAP總脂質(zhì)的55摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的45摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μg 配方No.12-2 組分(＞5天)量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比 熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.12-3 組分(1天)量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.12-4 組分(＞5天)量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 配方No.12-5 組分(1天)量HDSG中性陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1中化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的1摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μgFGF靶向配體15FGF/脂質(zhì)體 C.體內(nèi)給藥 接種腫瘤細(xì)胞9天后，15只荷瘤小鼠隨機(jī)分入處理組中(n＝3)，接受上述5種配方之一，配方(12-1)至配方(12-5)的處理。靜脈注射脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，劑量為100μg DNA質(zhì)粒。配方12-1、12-3和12-5給藥后24小時(shí)，配方12-2和12-4給藥后5天，分別檢測(cè)腫瘤、肺和肝熒光素酶的表達(dá)，結(jié)果如表6所示。實(shí)例13 體內(nèi)給予葉酸-靶向的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物 A.試驗(yàn)動(dòng)物 小鼠接種KB癌細(xì)胞，并如實(shí)例7A所述飼養(yǎng)。
B.脂質(zhì)體配方 如實(shí)例6所述用以下脂質(zhì)組分制備八個(gè)脂質(zhì)體配方 配方No.13-1 組分量DOTAP總脂質(zhì)的55摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的45摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μg 配方No.13-2 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.13-3 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的4摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.13-4 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.13-5 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的4摩爾百分比 熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.13-6 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的42.5摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的22.5摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒250μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.13-7 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的42.5摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的22.5摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比SC-PEG總脂質(zhì)的4摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒250μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.13-8 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的42.5摩爾百分比GC33總脂質(zhì)的22.5摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的4摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒250μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 C.體內(nèi)給藥 接種瘤細(xì)胞后9天，24只荷瘤小鼠被隨機(jī)分進(jìn)處理組(n＝3)，用配方(13-1)至配方(13-8)的配方之一處理。脂質(zhì)體-DNA聯(lián)合體以100μg DMA質(zhì)粒的劑量靜脈內(nèi)給藥。給藥后24小時(shí)，檢測(cè)腫瘤、肺和肝中的熒光素酶表達(dá)。結(jié)果顯示在表7中。 實(shí)例14體內(nèi)給予葉酸-靶向的脂質(zhì)體-DNA聯(lián)合體 A.試驗(yàn)動(dòng)物 小鼠接種KB癌細(xì)胞，并如實(shí)例7A所述飼養(yǎng)。
B.脂質(zhì)體配方 如實(shí)例6所述用以下脂質(zhì)組分制備六個(gè)脂質(zhì)體配方 配方No.14-1 組分量DOTAP總脂質(zhì)的55摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的45摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μg 配方No.14-2 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.14-3 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的4摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.14-4 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的45摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的20摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.14-5 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的45摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的20摩爾百分比 膽固醇總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的4摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 C.體內(nèi)給藥 接種瘤細(xì)胞后9天，18只荷瘤小鼠被隨機(jī)分進(jìn)處理組(n＝3)，用配方(14-1)至配方(14-6)的配方之一處理。脂質(zhì)體-DNA聯(lián)合體以100μg DNA質(zhì)粒的劑量靜脈內(nèi)給藥。給藥后24小時(shí)，檢測(cè)腫瘤、肺和肝中的熒光素酶表達(dá)。結(jié)果顯示在表8中。 實(shí)例15 體內(nèi)給予葉酸靶向的脂質(zhì)體-DNA聯(lián)合體 A.試驗(yàn)動(dòng)物 小鼠接種KB癌細(xì)胞，并如實(shí)例7A所述飼養(yǎng)。
B.脂質(zhì)體配方 如實(shí)例6所述用以下脂質(zhì)組分制備七個(gè)脂質(zhì)體配方 配方No.15-1 組分量DOTAP總脂質(zhì)的55摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的45摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒100μg 配方No.15-2 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.15-3 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的40摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的60摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的4摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.15-4 組分量 HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.15-5 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比PHSPC總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的2.3摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.15-6 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的35摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 配方No.15-7 組分量HDSG中性-陽(yáng)離子脂質(zhì)(圖1的化合物V)總脂質(zhì)的35摩爾百分比DOTAP總脂質(zhì)的30摩爾百分比膽固醇總脂質(zhì)的35摩爾百分比FC-PEG總脂質(zhì)的2.3摩爾百分比熒光素酶質(zhì)粒200μg葉酸靶向配體30葉酸/脂質(zhì)體 C.體內(nèi)給藥 接種瘤細(xì)胞后9天，21只荷瘤小鼠被隨機(jī)分進(jìn)處理組(n＝3)，用配方(15-1)至配方(15-7)的配方之一處理。脂質(zhì)體-DNA聯(lián)合體以100μg DMA質(zhì)粒的劑量靜脈內(nèi)給藥。給藥后24小時(shí)，檢測(cè)腫瘤、肺和肝中的熒光素酶表達(dá)。結(jié)果顯示在表9中。
盡管本發(fā)明已經(jīng)就特殊實(shí)施例進(jìn)行了描述，顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的情況下做出各種變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種給予核酸的組合物，包含
(a)含有以下部分的脂質(zhì)體
(i)具有如下結(jié)構(gòu)式的脂質(zhì)
其中每個(gè)R1和R2是具有8-24個(gè)碳原子的烷基或烯基鏈；
n＝0-20；
L選自(1)-X-(C＝O)-Y，(2)-X-(C＝O)-，和(3)-X，其中X和Y獨(dú)立地選自氧、NH和直接結(jié)合鍵；
Z是pK小于7.4并大于大約4.0的弱堿部分；和
(ii)具有如下通式結(jié)構(gòu)的化合物
其中R3是親水聚合物，包含附著二硫代芐基部分的連接鍵；R4選自H、烷基和芳基；R5選自O(shè)(C＝O)R7、S(C＝O)R7和O(C＝S)R7；R7包括含胺的脂質(zhì)；和R6選自H、烷基和芳基；其中CH2-R5的方位選自鄰位和對(duì)位；和
(b)與所述脂質(zhì)體相結(jié)合的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中X是NH，Y是氧。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中L是氨基甲酸鹽鍵、酯鍵或碳酸酯鍵。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中L是NH-(C＝O)-O-CH2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中Z是咪唑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其包含1-80摩爾百分比之間的脂質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中Z是pK值在5.0-6.5之間的部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中每一個(gè)R1和R2是具有8-24個(gè)碳原子之間的無(wú)支鏈烷基或烯基鏈。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中每一個(gè)R1和R2是C17H35。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中n在1-10之間。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中R6是H，R4選自CH3、C2H5和C3H8。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中含胺脂質(zhì)包括單烴尾或雙烴尾。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中含胺脂質(zhì)是具有雙烴尾的磷脂。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中R4和R6是烷基。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中R3選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基噁唑啉、聚羥丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基-丙烯酰胺、聚羥丙基甲基丙烯酸酯、聚羥乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、其共聚物，和聚環(huán)氧乙烯-聚環(huán)氧丙烯。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中R3是聚乙二醇。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中R6是H，R4是CH3或C2H5。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的脂質(zhì)體包括5-20摩爾百分比之間的化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包括脂質(zhì)體中包裹的治療性化合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的核酸被包裹在所述脂質(zhì)體至少一部分中。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述的核酸選自DNA、RNA、其片段和寡核苷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包括靶向脂質(zhì)體到靶部位的配體，所述的配體在所述化合物上共價(jià)地附著在親水聚合物R3的遠(yuǎn)端。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，其中的配體具有對(duì)內(nèi)皮腫瘤細(xì)胞的結(jié)合親合力，以被這種細(xì)胞內(nèi)化。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，其中的配體選自E-選擇素、Her-2和FGF。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，其中所述的配體選自HER2/neu癌基因的c-erbB-2蛋白產(chǎn)物、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)受體(堿性FGF)受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、E-選擇素受體、L-選擇素受體、P-選擇素受體、葉酸受體、CD4受體、CD19受體、αβ整合素受體和趨化因子受體。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的脂質(zhì)體進(jìn)一步包含陽(yáng)離子脂質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種體內(nèi)或體外遞送核酸的脂質(zhì)體組合物。組合物中的脂質(zhì)體含有(i)在生理的pH下是中性電荷，在低于生理pH的pH值下是正電荷的脂類；和(ii)通過二硫代芐基鍵與親水聚合物連接的脂類。脂質(zhì)體與核酸聯(lián)合以遞送給細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07D233/54GK1617710SQ0282490
公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月12日
發(fā)明者黃世昆, S·扎利普斯基, 張偉明 申請(qǐng)人:阿爾扎公司