專利名稱：促性腺激素釋放激素并列體二聚體－卵清蛋白的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法。
背景技術：
飼養(yǎng)機體完整的雄性動物具有生長較快，瘦肉率高，氮排泄少和對環(huán)境污染小等優(yōu)勢。因此，保持公畜機體完整性能顯著提高經(jīng)濟效益。但是，在許多國家，公畜仍被去勢。其主要目的是(1)選育優(yōu)良品種，淘汰不良種畜；(2)使性情兇猛的家畜變得溫順，便于飼養(yǎng)管理或使役；(3)治療性腺的炎癥、腫瘤、創(chuàng)傷等疾?。?4)提高肉用畜的利用價值，如公豬、公羊去勢后可消除肉中的膻味。在中國，家畜去勢術的發(fā)展雖有悠久的歷史，但仍是畜牧生產(chǎn)中一個需要解決的問題。目前去勢方法中應用最多的是手術閹割和化學去勢。但這兩種方法均有許多不足。手術閹割引起動物高度應激，外科傷口易感染，增加動物的發(fā)病率，甚至導致動物死亡。另外，由于手術閹割完全摘除了公畜的睪丸，破壞了機體完整性，使動物的日增重、飼料利用效率和肉質(zhì)降低，而且在非麻醉情況下手術去勢對動物非常殘忍，在施術過程中對人的安全也構(gòu)成威脅?；瘜W去勢是將刺激性藥物注射到家畜睪丸實質(zhì)內(nèi)，破壞睪丸組織，使睪丸萎縮，從而失去產(chǎn)生精子或分泌雄性激素的功能，以達到去勢目的。這種方法雖可避免傷口感染，但所用藥多為強刺激藥物，注入睪丸后，立即產(chǎn)生強烈的炎癥反應，使動物處于應激狀態(tài)，如體溫升高、食欲下降、疼痛等，引起免疫功能下降，降低機體抵抗力，影響動物的生產(chǎn)性能。另外，化學去勢還存在著藥物殘留問題，影響肉質(zhì)。所以同手術閹割一樣，化學去勢也不是一種理想的去勢方法。因此，研究出一種既能達到去勢目的，又不破壞公畜的機體完整性、不影響其生產(chǎn)性能和肉質(zhì)的新的去勢方法對畜牧生產(chǎn)具有重要的意義。為此，不少學者開始了免疫去勢研究，在免疫去勢方法中，主動免疫促性腺激素釋放激素的去勢效果最好。
國外一些學者在促性腺激素釋放激素免疫動物去勢方面的研究，分為下述三個階段第一階段用促性腺激素釋放激素單體與載體蛋白偶聯(lián)后免疫動物，效果很不穩(wěn)第三階段用促性腺激素釋放激素并列體二聚體與載體蛋白偶聯(lián)后免疫動物，只需微量就能達到去勢的效果。
國內(nèi)在該方面的研究迄今為止，還處在促性腺激素釋放激素單體階段。
促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白氨基酸序列為＜QHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#；#表示酰胺 G6k表示第六位的L-Gly被替換為D-Lys，k表示D-Lys(D-賴氨酸)H組氨酸W色氨酸S絲氨酸Y酪氨酸G甘氨酸kD-賴氨酸L亮氨酸R精氨酸P脯氨酸Q谷氨酰胺C半胱氨酸＜Q表示焦谷氨酸)。
促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法，主要包括三步，一是在固相多肽合成儀上合成促性腺激素釋放激素并列體；二是將促性腺激素釋放激素并列體氧化成促性腺激素釋放激素并列體二聚體；三是將促性腺激素釋放激素并列體二聚體與卵清蛋白偶聯(lián)。其中第三道制備工藝，所用時間長、聯(lián)結(jié)率低、工藝復雜，制得產(chǎn)品的成本高。

發(fā)明內(nèi)容
通過對第三步制備工藝的改進，提供一種聯(lián)結(jié)率高，所用時間短，工藝簡單的促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法。
實現(xiàn)上述目的的技術解決方案是這樣的促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法，其工藝過程包括A、促性腺激素釋放激素并列體的合成，B、促性腺激素釋放激素并列體二聚體的合成，C、促性腺激素釋放激素并列體二聚體與卵清蛋白的偶聯(lián)；其特征在于用碳二亞胺法將促性腺激素釋放激素并列體二聚體與卵清蛋白偶聯(lián)。
所述的用碳二亞胺法是，首先用蒸餾水溶解卵清蛋白，同時將與卵清蛋白等量的促性腺激素釋放激素并列體二聚體溶于偶聯(lián)緩沖液中，然后將促性腺激素釋放激素并列體二聚體溶解物倒入卵清蛋白溶解物中，再加入碳二亞胺，輕輕攪拌使其溶解，室溫下反應2小時，透析24小時，冷凍干燥即得促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白。
碳二亞胺是化學性質(zhì)極為活潑的化合物，能使氨基和羧基之間脫水形成酰胺鍵，本方法中使用的是水溶性碳二亞胺，其化學名稱為1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺，它既可與羧基結(jié)合，也可與氨基結(jié)合，卵清蛋白上的羧基先與碳二亞胺反應生成中間產(chǎn)物，再與促性腺激素釋放激素并列體二聚體上的氨基反應而形成偶聯(lián)物。
所述偶聯(lián)緩沖液從Pierce公司購得。
透析的目的是除去未反應的促性腺激素釋放激素并列體二聚體、碳二亞胺及反應副產(chǎn)物。
所述制備方法中，促性腺激素釋放激素并列體二聚體∶卵清蛋白∶碳二亞胺為1∶1∶50。
所述卵清蛋白為雞卵清蛋白。
所述透析的分子量截留為10000。
所述加入碳二亞胺后的溶液的pH值為6.5～7.5。
所述透析溫度為4℃。
本發(fā)明工藝方法的有益效果體現(xiàn)在幾個方面，一是，聯(lián)結(jié)率高，用紫外線吸收法測得其連接效率為95％以上；二是采用碳二亞胺法，在室溫下的反應時間是2小時，比國外技術的7小時，縮短了5小時，提高了生產(chǎn)效率；三是本發(fā)明工藝方法簡單，工藝路線短，操作簡便。
具體實施例方式
實施例將200μl蒸餾水溶解2mg卵清蛋白，同時將2mg促性腺激素并列體二聚體溶于0.5μl的偶聯(lián)緩沖液(Pierce公司)中，然后將促性腺激素并列體二聚體溶解物倒入雞卵清蛋白溶解物中，再加入100mg的碳二亞胺，輕輕攪拌使其溶解，調(diào)pH值為7.0左右，室溫下反應2小時，然后在4℃下透析24小時，分子量截留10000，目的是除去未反應的促性腺激素釋放激素并列體二聚體及偶聯(lián)過程中的反應副產(chǎn)物，再置于凍干機中冷凍干燥24小時既可。
權利要求
1.促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法，其工藝過程包括A、促性腺激素釋放激素并列體的合成，B、促性腺激素釋放激素并列體二聚體的合成，C、促性腺激素釋放激素并列體二聚體與卵清蛋白的偶聯(lián)；其特征在于用碳二亞胺法將促性腺激素釋放激素并列體二聚體與卵清蛋白偶聯(lián)。
2.根據(jù)權利要求1所述的促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法，其特征在于所述的用碳二亞胺法是，首先用蒸餾水溶解卵清蛋白，同時將與卵清蛋白等量的促性腺激素釋放激素并列體二聚體溶于偶聯(lián)緩沖液中，然后將促性腺激素釋放激素并列體二聚體溶解物倒入卵清蛋白溶解物中，再加入碳二亞胺，輕輕攪拌使其溶解，室溫下反應2小時，透析24小時，冷凍干燥即得促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白。
3.根據(jù)權利要求1所述的促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法，其特征在于所述制備方法中，促性腺激素釋放激素并列體二聚體∶卵清蛋白∶碳二亞胺為1∶1∶50。
4.根據(jù)權利要求1所述的促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法，其特征在于所述卵清蛋白為雞卵清蛋白。
5.根據(jù)權利要求1所述的促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法，其特征在于所述透析的分子量截留為10000。
6.根據(jù)權利要求1所述的促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法，其特征在于所述加入碳二亞胺后的溶液的pH值為6.5～7.5。
7.根據(jù)權利要求1所述的促性腺激素釋放激素并列體二聚體—卵清蛋白的制備方法，其特征在于所述透析溫度為4℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及促性腺激素釋放激素并列體二聚體－卵清蛋白的制備方法，其特征在于用碳二亞胺法將促性腺激素釋放激素并列體二聚體與卵清蛋白偶聯(lián)。采用本發(fā)明的方法，聯(lián)結(jié)率高，用紫外線吸收法測得其連接效率為95％以上；縮短了5小時，提高了生產(chǎn)效率；本發(fā)明工藝方法簡單，工藝路線短，操作簡便。
文檔編號C07K14/77GK1508153SQ0215720
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月18日 優(yōu)先權日2002年12月18日
發(fā)明者章孝榮, 方富貴, 章孝榮 方富貴 申請人:章孝榮, 方富貴