專利名稱：含有D－氨基酸的β－淀粉樣肽聚集的調(diào)節(jié)因子的制作方法
背景技術：
1907年由巴伐利亞精神病醫(yī)生Alois Alzheimer第一次描述的阿爾茨海默氏病(AD)，是一種漸進的神經(jīng)紊亂，它首先是短期記憶消失，并發(fā)展為方向知覺的喪失，判斷力和推理能力的損害，并且最后成為癡呆。上述疾病的進程通常在開始后的4年到12年之間在一種嚴重虛弱的，不能移動的狀態(tài)中導致死亡。據(jù)估計AD折磨著65歲以上的5％至11％的人群，并且折磨著多達47％的85歲以上人群。治療AD的社會費用每年在800億美元以上，主要是由于AD病人需要全面的監(jiān)管護理(custodial care)。而且，當20世紀40年代和50年代人口爆炸期間出生的人接近AD更普遍的年齡時，AD的控制和治療將成為更為重要的健康護理問題。目前沒有顯著地延緩上述疾病發(fā)展的治療方法。對于AD的綜述，參見Selkoe，D.J.Sci.Amer.，1991年11月，68-78頁；以及Yankner，B.A.etal.(1991)N.Eng.J.Med.3251849-1857。
最近有報道(Games et al.(1995)Nature 373523-527)已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因小鼠中建立了阿爾茨海默氏型神經(jīng)病理學。上述轉(zhuǎn)基因小鼠表達高水平的人突變體淀粉樣蛋白前體并且逐漸發(fā)展出許多與AD相關的的病情。
病理學上，AD的特征是病人腦中存在獨特的損傷。這些腦損傷包括稱為神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NTFs)的異常細胞內(nèi)纖維，以及在衰老，或淀粉樣，斑塊中的淀粉樣原性蛋白的細胞外沉積物。淀粉樣沉積物也存在于AD病人的大腦血管壁內(nèi)。淀粉樣斑塊的主要蛋白組分已經(jīng)被確認為4kd的肽，稱為β-淀粉樣肽(β-AP)(Glenner，G.G.和Wong，C.W.(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.120885-890；Masters.C.et al(1985)Proc.Natl.Acad.SciUSA824245-4249)。擴散的β-AP沉積物經(jīng)常在正常成人的腦中觀察到，而AD腦組織的特征是更密集的中心致密的β-淀粉樣斑塊。(參見例如，Davies，L.etal.(1988)Neurology 381688-1693)。這些觀察表明β-AP沉積先于并且參與AD中神經(jīng)元的破壞。對β-AP的直接病原性作用的進一步支持是，已經(jīng)表明β-淀粉樣在培養(yǎng)物中和在體內(nèi)都對成熟神經(jīng)元有毒性。Yankner，B.A.et al(1989)Science245417-420；Yankner，B.A.et al(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA879020-9023；Roher，A.E.et al.(1991)Biochem.Biophys.Commun.174572-579；Kowall，N.W.etal(1991)Proc.Natl.Acad.Dci.USA 887247-7251。此外，具有荷蘭型淀粉樣變性病(HCHWA-D)的遺傳性腦出血病人已經(jīng)被表明具有一個點突變，該點突變導致在β-AP中的一個氨基酸的替換，上述荷蘭型淀粉樣變性病的特征是在大腦皮層和腦血管(cerebrovasculature)內(nèi)的擴散的β-淀粉樣沉積物。Levy，E.etal.(1990)Science 2481124-1126。這個發(fā)現(xiàn)表明β-AP序列的一個特定的改變可以使β-淀粉樣被沉淀。
天然的β-AP源自更大蛋白的水解，上述更大的蛋白稱為淀粉樣前體蛋白(APP)。Kang，j.et al.(1987)Nature 325733；Goldgaber，D.et al.(1987)Science 235877；Robakis，N.K.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 844190；Tanzi，R.E.et al.(1987)Science 235880。上述APP基因圖譜定位于染色體21，從而為在Down’s綜合癥個體的早年時期所見到的β-淀粉樣沉積物提供了一個解釋，上述Down’s綜合癥是由染色體21的三體性引起的。Mann，D.M.et al.(1989)Neropathol.Appl.Neruobiol.15317；Rumble，B.et al.(1989)N.Eng.J.Med.3201446。APP基因包含一個單一的跨膜結(jié)構域，其具有很長的延伸到細胞外環(huán)境的氨基酸末端區(qū)域(大約是蛋白的三分之二)和伸到細胞質(zhì)的較短的羧基端區(qū)域。APP信使RNA的差異剪切產(chǎn)生至少5種形式的APP，由563個氨基酸(APP-563)，695個氨基酸(APP-695)，714個氨基酸(APP-714)，751個氨基酸(APP-751)或770個氨基酸(APP-770)組成。
在APP中，天然存在的β-淀粉樣肽開始于APP-770的672位的天冬氨酸殘基。源自APP蛋白水解的β-AP的長度為39至43個氨基酸殘基，這取決于羧基端的終止位點，而顯示了異質(zhì)性。在AD病人和正常成人的血液和腦脊液中，β-AP的主要循環(huán)形式都是β1-40(“短β”)。Seubert，P.et al.(1992)Nature 359325；Shoji，M.et al.(1992)Science 258126。但是，β1-42和β1-43(“長β”)也是β-淀粉樣斑塊中的形式。Masters，C.et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824245；Miller，D.et al.(1993)Arch.Biochem.Biophys.30141；Mori，H.et al.(1992)J.Biol.Chem.26717082。盡管導致β-APP聚集并沉淀的精確分子機制還不清楚，但是上述過程已經(jīng)被比作晶核形成依賴性聚合，例如蛋白結(jié)晶，微管形成和肌動蛋白聚合。參見，例如，J.T.和Lansbury，P.T.(1993)Cell 731055-1058。在這樣的過程中，單體組分的聚合直到晶核形成后才發(fā)生。因此，這些過程的特征是在聚集發(fā)生之前有一個滯后時間，然后在晶核形成后迅速聚合?？梢酝ㄟ^加入“晶種”或預先形成的晶核加速晶核形成，上述過程導致迅速的聚合。長β形式的β-AP被表明是作為晶種，從而同時加速長和短β-AP形式的聚合。Jarrett，J.T.et al.(1993)Biochemi stry 324693。
在一項研究中，在β-AP中進行了氨基酸替換，該研究報道了當突變形式的肽和非突變形式的肽混合時，兩種β肽的突變體影響未突變的β-AP的聚合。Hilbich.C.et al.(1992)J.Mol.Biol.228460-473。等摩爾量的突變體和非突變體(即天然的)β-淀粉樣肽被用于觀察這種效應，并且據(jù)報道該突變肽為不適合體內(nèi)使用。Hilbich，C et al.(1992)，supra。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物包括由D-氨基酸，L-氨基酸或兩者組成的β-淀粉樣肽，β-淀粉樣肽反異構體，或與肼部分連接的β-淀粉樣肽的逆反異構體，其中，當該化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時，該化合物與天然β-淀粉樣肽結(jié)合，或調(diào)節(jié)其聚集或抑制天然β-淀粉樣肽的神經(jīng)毒性。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物優(yōu)選地含有3-20個D-氨基酸，更優(yōu)選地含有3-10個D-氨基酸，并且甚至更優(yōu)選地含有3-5個D-氨基酸。上述調(diào)節(jié)因子的D-氨基酸肽結(jié)構可以具有游離氨基，羧基或酰胺末端。替代地，上述氨基末端，羧基末端或兩者都可以被修飾。例如，可以利用N末端修飾基團增強化合物抑制Aβ聚集的能力。而且，可以修飾上述肽的氨基和/或羧基末端以改變上述化合物的藥物動力學性質(zhì)(例如穩(wěn)定性，生物利用度如，增強上述化合物通過血腦屏障的運送以及進入腦中，等等)。優(yōu)選的氨基末端修飾基團包括烷基，例如，甲基，乙基，或異丙基。優(yōu)選的羧基末端修飾基團包括酰胺基團，烷基或烷基酰胺基團(例如苯乙基酰胺)，羥基基團(即，肽酸還原的產(chǎn)物，生成肽醇)，?；０坊鶊F，以及乙酰基基團。更進一步地，可以修飾調(diào)節(jié)因子化合物用上可探測的物質(zhì)(例如，放射性標記)標記該化合物。
在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種化合物，該化合物具有如下結(jié)構
N，N-二甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-二甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-異丙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-異丙基酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-二甲基酰胺；N，N-二乙基(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-丙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2；1-哌啶-乙?；?(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；1-哌啶-乙?；?(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-異丙基酰胺；H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-異丙基酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-
Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-COCH3；和H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
本發(fā)明的特別優(yōu)選的化合物在實施例中提出。
本發(fā)明的另一方面涉及藥用組合物。通常，藥用組合物含有治療有效量的本發(fā)明調(diào)節(jié)因子化合物以及藥用可接受的載體。
本發(fā)明的另一方面涉及抑制天然β-淀粉樣肽聚集的方法。這些方法包括將天然β-淀粉樣肽與本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物接觸，以便抑制天然β-淀粉樣肽的聚集。
本發(fā)明的另一方面涉及在生物樣品中檢測天然β-淀粉樣肽存在與否的方法。這些方法包括將生物樣品與本發(fā)明的化合物接觸，其中上述化合物用可探測的物質(zhì)標記，并檢測與天然β-淀粉樣肽結(jié)合的上述化合物，從而在生物樣品中檢測天然β-淀粉樣肽存在與否。
本發(fā)明的另一方面涉及具有與β-淀粉樣變性病相關病癥的病人的治療方法。這些方法包括將治療有效量的本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物施用于病人，以便治療病人的與β-淀粉樣變性病相關的病癥。優(yōu)選地，上述病癥是阿爾茨海默氏疾病。本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子在治療與β-淀粉樣變性病相關的疾病中的應用或在用于治療上述疾病的藥物制造中的應用也包括在本發(fā)明中。
圖2是描述實施例2中所描述的纖絲結(jié)合檢測結(jié)果的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及可以與天然β-淀粉樣肽結(jié)合，調(diào)節(jié)天然β-淀粉樣肽(β-AP)的聚集和/或抑制天然β-APs的神經(jīng)毒性的化合物及其藥用組合物。上述化合物以一種方式被修飾，該方式允許提高生物穩(wěn)定性以及延長升高的血漿水平。本發(fā)明的調(diào)節(jié)天然β-AP聚集的化合物與天然β-AP接觸時，改變天然β-AP的聚集，在本文中上述調(diào)節(jié)天然β-AP聚集的化合物可以和β淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物、β淀粉樣調(diào)節(jié)因子或僅僅是調(diào)節(jié)因子互換使用。因此，本發(fā)明的化合物通過改變β-AP的天然聚集過程或速率，從而破壞該過程。優(yōu)選地，上述化合物抑制β-AP的聚集。本發(fā)明的化合物的特征在于包含完全由D-氨基酸殘基組成的肽結(jié)構。上述肽結(jié)構優(yōu)選地基于β-淀粉樣肽并且可以包含，例如，一段D-氨基酸序列，該D-氨基酸序列相應于在天然β-AP中發(fā)現(xiàn)的L-氨基酸序列，或一段D-氨基酸序列，該D-氨基酸序列為在天然β-AP中發(fā)現(xiàn)的L-氨基酸序列的逆反異構體，或一段D-氨基酸序列，該D-氨基酸序列為在天然β-AP中發(fā)現(xiàn)的L-氨基酸序列的逆反異構體(retro-inverso isomer)，或一段D-氨基酸序列，該D-氨基酸序列為在天然β-AP中發(fā)現(xiàn)的L-氨基酸序列的拼湊或替換形式。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物中苯丙氨酸被替換為苯丙氨酸類似物，該類似物更穩(wěn)定，并更不易于，例如，氧化代謝。
本發(fā)明包括含有D-氨基酸肽結(jié)構的調(diào)節(jié)因子化合物，上述肽結(jié)構具有游離氨基，羧基或羧酰胺末端，還包括肽結(jié)構的氨基末端，羧基末端，和/或側(cè)鏈被修飾的調(diào)節(jié)因子化合物。
可以根據(jù)本發(fā)明的β淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物與天然β-淀粉樣肽結(jié)合的能力，體外調(diào)節(jié)天然β-AP聚集的能力和/或抑制培養(yǎng)細胞的天然β-AP纖絲的神經(jīng)毒性的能力(利用本文所描述的檢測方法，例如，神經(jīng)毒性檢測，晶核形成檢測，或纖絲結(jié)合檢測)對上述β淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物進行選擇。優(yōu)選的調(diào)節(jié)因子化合物抑制天然β-AP的聚集和/或抑制天然β-AP的神經(jīng)毒性。但是，根據(jù)上述一種或兩種性質(zhì)選擇的調(diào)節(jié)因子化合物在體內(nèi)可以具有附加的性質(zhì)，這些性質(zhì)可能有利于治療淀粉樣變性病(J.S.Pachter et al.(1998)“Aβ-40Induced neurocytophathic activation of human monocytes Isblocked by Aβpeptide aggregation Inhibitors“Aβ1誘導的人單核神經(jīng)細胞病變的激活被Aβ肽聚集抑制劑阻滯?！盢eruobiologyof Aging(AbstractsThe 6thInternational Conference onAlzheimer’s Disease and Related Disorders，Amsterdam，18-23 July 1998)19，S128(Abstract 540)；R.Weltzein，A.et al.(1998))″Phagocytosis of Beta-AmyloidA Possible Requisitefor Neurotoxicity.″“β-淀粉樣的噬菌作用神經(jīng)毒性的一個可能要素?！盝.Neuroimmunology(Special IssueAbstracts of theInternational Society of Neuroimmunology Fifth InternationalCongress，Montreal，Canada，23-27 August 1998)1998，90，32(Abstract 162))。例如，調(diào)節(jié)因子化合物可以在體內(nèi)干擾天然β-AP的加工(通過直接或間接的蛋白酶抑制)或通過調(diào)節(jié)產(chǎn)生β-AP，或其它APP片段的步驟。替代地，可以根據(jù)后者的性質(zhì)選擇調(diào)節(jié)因子化合物，而不是根據(jù)在體外對Aβ聚集的抑制。此外，通過與天然β-AP的相互作用選擇的本發(fā)明的調(diào)節(jié)化合物也可以與APP或其它APP片段相互作用。更進一步地，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物的特征可以是與β-淀粉樣纖絲結(jié)合(該能力可以通過，例如，以下方法被確定放射性標記上述化合物，將上述化合物與β-淀粉樣斑塊接觸并計數(shù)或檢測，例如通過影像技術，與β-AP的病理學形式，例如斑塊，結(jié)合的上述化合物。)，而不顯著地改變β-淀粉樣纖絲的聚集能力。上述與β-淀粉樣纖絲有效結(jié)合而不顯著改變β-淀粉樣纖絲聚集的化合物可以用于，例如，檢測β-淀粉樣纖絲(例如，如本文進一步所描述的，用于診斷目的)。但是，應當理解，特定化合物與β-淀粉樣纖絲結(jié)合和/或調(diào)節(jié)其聚集的能力可以根據(jù)上述化合物的濃度而不同。因此，在低濃度時與β-淀粉樣纖絲結(jié)合不改變其聚集的化合物，在較高濃度時可能抑制上述纖絲的聚集。所有上述具有與β-淀粉樣纖絲結(jié)合和/或調(diào)節(jié)該纖絲聚集性質(zhì)的化合物將包括在在本發(fā)明中。
在本文使用時，β-淀粉樣聚集的“調(diào)節(jié)因子”用來指一種劑，該劑與β-淀粉樣肽接觸時，改變天然β-淀粉樣肽的聚集。術語“β-淀粉樣肽的聚集”是指一個過程，在該過程中上述肽相互結(jié)合形成多聚體，大部分是不溶的復合體。術語“聚集”進一步用來包括β-淀粉樣纖絲的形成，還包括β-淀粉樣斑塊。
在本文中互換使用的術語“天然β-淀粉樣肽”，“天然β-AP”以及“天然Aβ肽”包括β-淀粉樣前體蛋白(APP)的天然存在的蛋白水解切割產(chǎn)物，上述前體蛋白與β-AP聚集和β-淀粉樣變性病有關。這些天然肽包括具有39-43個氨基酸的β-淀粉樣肽(即，Aβ1 -39，Aβ1-40，Aβ1-41，Aβ1-42和Aβ1-43)。天然β-AP的氨基末端氨基酸殘基相應于770氨基酸殘基形式(“APP-770”)的淀粉樣前體蛋白的672位天冬氨酸殘基。天然β-AP的43氨基酸形式具有氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT(也在SEQID NO1中列出)，而較短的形式在羧基末端被除去了1-4個氨基酸殘基。APP-770從672位(即，天然β-AP的氨基末端)到C-末端終點(103氨基酸)的氨基酸序列在SEQ ID NO2中列出。本文所描述的用于聚集檢測的天然β-AP的優(yōu)選形式為Aβ1-40或Aβ1-42。
在存在本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子的情況下，天然β-淀粉樣肽的聚集被“改變”或“調(diào)節(jié)”。術語“改變”或“調(diào)節(jié)”的各種形式將包括對β-AP聚集的抑制和對β-AP聚集的促進。與無調(diào)節(jié)因子的情況相比，當β-AP聚集的量和/或速率在存在調(diào)節(jié)因子的情況下降低時，天然β-AP的聚集被“抑制”。術語“抑制”的各種形式將包括對β-AP聚集的完全的和部分的抑制。利用實施例部分所描述的聚集檢測方法，可以通過聚集滯后時間增加的倍數(shù)或聚集的整體平臺水平(即，聚集的總量)的降低，對聚集的抑制作用進行定量。在各種實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子使聚集滯后時間增加至少1.2倍，1.5倍，1.8倍，2倍，2.5倍，3倍，4倍或5倍，例如，當上述化合物與β-AP摩爾比為1時。在其它的各種實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子對聚集的平臺水平的抑制至少10％，20％，30％，40％，50％，75％或100％。
抑制β-AP聚集的調(diào)節(jié)因子(“抑制性調(diào)節(jié)因子化合物”)可以被用于阻止或延緩β-淀粉樣沉積的開始。優(yōu)選地，本發(fā)明的抑制性調(diào)節(jié)因子化合物抑制天然Aβ肽神經(jīng)毒性聚集物的形成和/或活性(即，上述抑制化合物可以用于抑制β-AP的神經(jīng)毒性)。此外，本發(fā)明的抑制化合物可以減少預先形成的β-AP聚集物的神經(jīng)毒性，這意味著上述異質(zhì)性調(diào)節(jié)因子可以與預先形成的Aβ纖絲或可溶性的聚集物結(jié)合并調(diào)節(jié)它們固有的神經(jīng)毒性，或者上述調(diào)節(jié)因子能夠干擾單體和聚集形式的β-AP之間的平衡，并有利于無神經(jīng)毒性的形式。
替代地，在另一個實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物促進天然Aβ肽的聚集。術語“促進”的各種形式指與無調(diào)節(jié)因子時β-AP的聚集量和/或速率相比，β-AP聚集的量和/或速率在存在調(diào)節(jié)因子的情況下升高了。上述促進Aβ聚集的化合物被稱為刺激性調(diào)節(jié)因子化合物。刺激性調(diào)節(jié)因子化合物可以用于捕獲β-淀粉樣肽，例如在β-AP的聚集無害的生物區(qū)隔(biological compartment)中捕獲β-AP，從而耗盡β-AP的聚集有害的生物區(qū)隔中的β-AP。進而，刺激性調(diào)節(jié)因子化合物可以被用來促進體外聚集檢測中的Aβ聚集(例如，在實施例2中所描述的檢測)，例如在可能抑制或逆轉(zhuǎn)Aβ聚集的待測化合物的篩選檢測中(即，刺激性調(diào)節(jié)因子化合物可以作為“晶種”促進Aβ聚集的形成)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子在與摩爾量過量的β-AP接觸時能夠改變β-AP的聚集?！澳柫窟^量的β-AP”指天然β-AP的在摩爾濃度比上述調(diào)節(jié)因子的摩爾濃度大。例如，如果調(diào)節(jié)因子和β-AP的濃度都為1μM，它們被稱為是“等摩爾”的，如果調(diào)節(jié)因子的濃度為1μM而β-AP的濃度為5μM，β-AP被稱為是上述調(diào)節(jié)因子的5倍摩爾量過量。在優(yōu)選的實施方案中，當天然β-AP至少是調(diào)節(jié)因子濃度的2倍，3倍或5倍摩爾量過量時，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子能有效地改變天然β-AP的聚集。在其他的實施方案中，當天然β-AP至少是調(diào)節(jié)因子濃度的10倍，20倍或33倍，50倍，100倍，500倍或1000倍摩爾量過量時，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子能有效地改變天然β-AP的聚集。
在本文中使用時，在本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子中所使用的術語“完全由D-氨基酸組成的β-淀粉樣肽”用于包括具有與APP中的天然序列完全相同的氨基酸序列，以及具有在天然序列上可接受的氨基酸替換的，但由D氨基酸，而不是天然β-AP中所存在的天然L-氨基酸，組成的肽?？山邮艿陌被崽鎿Q為不影響和/或可能改善含D-氨基酸的肽改變天然β-AP聚集能力的氨基酸替換。并且，特定的氨基酸替換可能進一步貢獻上述肽改變天然β-AP聚集的能力，和/或可能賦予該肽其他的有利特性(例如，提高可溶性，降低與其它淀粉樣蛋白的結(jié)合，等等)。和親本肽具有相同的氨基酸序列，但其中所有的L-氨基酸都被所有的D-氨基酸取代的肽也被稱為“反”化合物。例如，如果親本肽是Thr-Ala-Tyr，其反形式為D-Thr-D-Ala-D-Tyr。
在本文中使用時，用于本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子的術語“β-淀粉樣肽的逆反異構體”是用來包括如下肽，在這些肽中氨基酸序列和天然β-AP中的序列相比是逆向的，并且所有的L-氨基酸都被置換成D-氨基酸。例如，如果親本肽是Thr-Ala-Tyr，其逆反形式是D-Tyr-D-Ala-D-Thr。與親本肽相比，逆反肽具有逆向的骨架，而基本上保留了側(cè)鏈的原始空間構象，使得逆反異構體的拓撲學和親本肽的非常相似。參見Goodman et al.″Perspectives In PeptideChemistry″pp283-294(1981)。“逆反”肽的進一步描述也參見Sisto的美國專利第4,522,752號。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子的各種其它方面及其應用，在以下的分部中詳細描述。I.調(diào)節(jié)因子化合物在一個實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物含有β-淀粉樣肽，該β-淀粉樣肽完全由D-氨基酸組成，其中該化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時與天然β-淀粉樣肽結(jié)合或調(diào)節(jié)其聚集或抑制天然β-淀粉樣肽的神經(jīng)毒性。優(yōu)選地，上述調(diào)節(jié)因子的β-淀粉樣肽由3-20個D-氨基酸組成，更優(yōu)選地3-10個D-氨基酸，甚至更為優(yōu)選地，3-5個D-氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明上述化合物中的一個苯丙氨酸被替換為一個苯丙氨酸類似物，該類似物更穩(wěn)定，并更不易于，例如，氧化代謝。
在一個實施方案中，上述調(diào)節(jié)因子的β-淀粉樣肽是進行氨基末端修飾的，例如，被含有烷基基團如C1-C6的低級烷基基團的修飾基團修飾，上述低級烷基基團如甲基，乙基或丙基基團；或環(huán)形的，雜環(huán)形的多環(huán)形的或分枝的烷基基團。適當?shù)腘末端修飾基團的例子在分部II里進一步描述。在另一個實施方案中，上述調(diào)節(jié)因子的β-淀粉樣肽是羧基末端修飾的，例如該調(diào)節(jié)因子可以含有肽酰胺，烷基肽或芳基酰胺(例如，肽苯乙基酰胺)或肽醇。適當?shù)腃-末端修飾基團的例子進一步在下文的分部II和III里描述。上述調(diào)節(jié)因子的β-淀粉樣肽可以被修飾以增強該調(diào)節(jié)因子改變β-AP聚集或神經(jīng)毒性的能力。另加地或替代地，上述調(diào)節(jié)因子的β-淀粉樣肽可以被修飾，以改變該調(diào)節(jié)因子的藥物動力學和/或用可探測的物質(zhì)標記該調(diào)節(jié)因子(在下文的分部III里進一步描述)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物含有β-淀粉樣肽的逆反異構體，其中該化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時與天然β-淀粉樣肽結(jié)合或調(diào)節(jié)其聚集或抑制天然β-淀粉樣肽的神經(jīng)毒性。優(yōu)選地，上述β-淀粉樣肽的逆反異構體由3-20個D-氨基酸組成，更優(yōu)選地3-10個D-氨基酸，甚至更為優(yōu)選地，3-5個D-氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明上述化合物中的苯丙氨酸被替換為苯丙氨酸類似物，這些類似物更穩(wěn)定，并更不易于，例如，氧化代謝。
在一個實施方案中，上述逆反異構體是進行氨基末端修飾的，例如，被含有烷基基團如C1-C6的低級烷基基團的修飾基團修飾，上述低級烷基基團如甲基，乙基或丙基基團；或環(huán)形的，雜環(huán)形的多環(huán)形的或分枝的烷基基團。適當?shù)腘末端修飾基團的例子在分部II里進一步描述。在另一個實施方案中，上述逆反異構體是羧基末端修飾的，例如可以酰胺，烷基或芳基酰胺(例如，苯乙基酰胺)或羥基(即肽酸的還原產(chǎn)物，生成肽醇)修飾。適當?shù)腃-末端修飾基團的例子進一步在下文的分部II和III里描述。上述逆反異構體可以被修飾以增強該調(diào)節(jié)因子改變β-AP聚集或神經(jīng)毒性的能力。另加地或替代地，上述逆反異構體可以被修飾，以改變該調(diào)節(jié)因子的藥物動力學和/或用可探測的物質(zhì)標記該調(diào)節(jié)因子(在下文的分部III里進一步描述)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物包括含有完全或部分D-氨基酸的β-淀粉樣肽，β-淀粉樣肽的反異構體，或與肼部分連接的β-淀粉樣肽的逆反異構體，其中，當該化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時，該化合物與天然β-淀粉樣肽結(jié)合，或調(diào)節(jié)其聚集或抑制天然β-淀粉樣肽的神經(jīng)毒性。優(yōu)選地，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物由1-20個與肼部分連接的D-氨基酸組成，更優(yōu)選地1-10個與肼部分連接的D-氨基酸，甚至更優(yōu)選地1-5個與肼部分連接的D-氨基酸，最優(yōu)選地2-4個與肼部分連接的D氨基酸。
在一個實施方案中，含有肼部分的本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物是進行氨基末端修飾的，例如，被含有烷基基團如C1-C6的低級烷基基團的修飾基團修飾，上述低級烷基基團如甲基，乙基或丙基基團。適當?shù)腘末端修飾基團的例子在分部II里進一步描述。在另一個實施方案中，上述含有肼部分的本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物用如乙?；M行羧基末端修飾。適當?shù)腃-末端修飾基團的例子進一步在下文的分部II和III里描述。上述含有肼部分的本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物可以被修飾以增強該調(diào)節(jié)因子改變β-AP聚集或神經(jīng)毒性的能力。另加地或替代地，上述含有肼部分的本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物可以被修飾，以改變該調(diào)節(jié)因子的藥物動力學和/或用可探測的物質(zhì)標記該調(diào)節(jié)因子(在下文的分部III里進一步描述)。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子優(yōu)選地是根據(jù)天然β-AP的亞區(qū)域的氨基酸序列設計的。術語“天然β-淀粉樣肽的亞區(qū)域”將包括去除了氨基末端和/或羧基末端部分的天然β-AP。術語“天然β-AP的亞區(qū)域”不包括全長的天然β-AP(即，“亞區(qū)域”不包括Aβ1-39，Aβ1-40，Aβ1 -41，Aβ1-42，Aβ1-43)。優(yōu)選的天然β-淀粉樣肽的亞區(qū)域是“Aβ聚集核心結(jié)構域”(ACD)。在本文使用時，術語“Aβ聚集核心結(jié)構域”是指天然β-淀粉樣肽的一個亞區(qū)域，當L-氨基酸形式的上述亞區(qū)域被適當修飾(例如，在氨基末端修飾)時，足以調(diào)節(jié)天然β-APs的聚集，如美國專利申請系列號08/548,998和美國專利申請系列號08/616,081中所詳細描述，上述每項申請的全部內(nèi)容明確地在此引入作為參考。優(yōu)選地，上述ACD所仿效的天然β-AP亞區(qū)域的長度少于15個氨基酸，并且更優(yōu)選地長度為3-10個氨基酸。在各種實施方案中，上述ACD所仿效的β-AP亞區(qū)域的長度為10，9，8，7，6，5，4或3個氨基酸。在一個實施方案中，ACD所仿效的β-AP亞區(qū)域是β-AP的內(nèi)部或羧基末端區(qū)域(即在1位氨基酸的氨基末端的下游)。在另一個實施方案中，ACD所仿效的β-AP亞區(qū)域是疏水性的。如本文所描述，優(yōu)選的Aβ聚集核心區(qū)域含有天然β-AP氨基酸殘基17-20或17-21(分別為Aβ17-20和Aβ17-21)或其類似物。Aβ17-20和Aβ17-21的氨基酸序列分別為Leu-Val-Phe-Phe(SEQ ID NO3)和Leu-Val-Phe-Phe-Ala(SEQ ID NO4)。
如實施例中所顯示，根據(jù)Aβ17-20和Aβ17-21的氨基酸序列設計的含D-氨基酸的調(diào)節(jié)因子是Aβ聚集的特別有效的抑制劑，并表現(xiàn)出增強的生物穩(wěn)定性和延長的升高的血漿水平。這些調(diào)節(jié)因子可以含有一段D-氨基酸序列，該D-氨基酸序列相應于Aβ17-20和Aβ17-21的L-氨基酸序列，或一段D-氨基酸序列，該D-氨基酸序列為Aβ17-20和Aβ17-21的L-氨基酸序列的反異構體，或一段D-氨基酸序列，該D-氨基酸序列為Aβ17-20和Aβ17-21的L-氨基酸序列的逆反異構體，或一段D-氨基酸序列，該D-氨基酸序列為Aβ17-20和Aβ17-21的L-氨基酸序列的拼湊或替換形式。在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)Aβ17-20和Aβ17-21的氨基酸序列設計的調(diào)節(jié)因子中的一個苯丙氨酸被替換為一個苯丙氨酸類似物，該類似物更穩(wěn)定，并更不易于，例如，氧化代謝。在其它優(yōu)選的實施方案中，上述根據(jù)Aβ17-20和Aβ17-21的氨基酸序列設計的調(diào)節(jié)因子進而含有肼部分。
基于D-氨基酸的調(diào)節(jié)因子可以具有未修飾的氨基和/或羧基末端和/或酰胺末端，或替代地，其氨基末端，羧基末端或兩者可以被修飾(下文進一步描述)。有效調(diào)節(jié)因子的肽結(jié)構通常為疏水性的，其特征為存在至少兩個獨立選自D-亮氨酸結(jié)構，D-苯丙氨酸結(jié)構和D-丙氨酸結(jié)構的D-氨基酸結(jié)構。如本文中所使用，術語“D-氨基酸結(jié)構”(如“D-亮氨酸結(jié)構”，“D-苯丙氨酸結(jié)構”或“D-丙氨酸結(jié)構”)是用來包括保持該化合物功能活性的D-氨基酸，及其D-氨基酸的類似物，衍生物和模擬物(下文詳細描述)。例如，術語“D-苯丙氨酸結(jié)構”用來包括D-苯丙氨酸以及D-環(huán)己基丙氨酸[D-Cha]，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸){[p-F]f或D-[p-F]Phe}，D-五氟苯丙氨酸{[F5]f或D-[F5]Phe}，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶基丙氨酸，D-高苯丙氨酸，甲基酪氨酸，和苯甲基絲氨酸，以及用D-賴氨酸結(jié)構，D-纈氨酸結(jié)構，或D-亮氨酸結(jié)構取代的取代物。術語“D-亮氨酸結(jié)構”用來包括D-亮氨酸，以及用D-纈氨酸，D-異亮氨酸，或其它天然或非天然的具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸，例如，D-正亮氨酸，或D-正纈氨酸取代的取代物。術語“D-纈氨酸結(jié)構”用來包括D-纈氨酸，以及用D-亮氨酸或其它天然或非天然的具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸取代的取代物。
在其它實施方案中，調(diào)節(jié)因子的肽結(jié)構包括至少兩個獨立地選自D-亮氨酸結(jié)構，D-苯丙氨酸結(jié)構，D-纈氨酸結(jié)構，D-丙氨酸結(jié)構，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構，D-賴氨酸結(jié)構的D-氨基酸結(jié)構。在另一個實施方案中，上述肽結(jié)構包括至少三個獨立地選自D-亮氨酸結(jié)構，D-苯丙氨酸結(jié)構和D-纈氨酸結(jié)構的D-氨基酸結(jié)構。在另一個實施方案中，肽結(jié)構包括至少三個獨立地選自D-亮氨酸結(jié)構，D-苯丙氨酸結(jié)構和D-纈氨酸結(jié)構，D-丙氨酸結(jié)構，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構，和D-賴氨酸結(jié)構的D-氨基酸結(jié)構。在另一個實施方案中，肽結(jié)構包括至少四個獨立地選自D-亮氨酸結(jié)構，D-苯丙氨酸結(jié)構和D-纈氨酸結(jié)構的D-氨基酸結(jié)構。在另一個實施方案中，肽結(jié)構包括至少四個獨立地選自D-亮氨酸結(jié)構，D-苯丙氨酸結(jié)構和D-纈氨酸結(jié)構的D-氨基酸結(jié)構。在優(yōu)選的實施方案中，肽結(jié)構包括至少一個苯丙氨酸類似物，該類似物比苯丙氨酸更穩(wěn)定，并更不易于，例如，氧化代謝。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物，該化合物含有公式(I) 其中，Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4各為D-氨基酸結(jié)構，并且Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4中至少有兩個獨立地選自D-亮氨酸結(jié)構，D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-高苯丙氨酸，和D-纈氨酸結(jié)構；Y，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)a的結(jié)構，其中，Xaa是任何D-氨基酸結(jié)構并且a為1-15的整數(shù)；Z，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)b的結(jié)構，其中，Xaa是任何D-氨基酸結(jié)構并且b為1-15的整數(shù)；A，可以存在或不存在，它是直接或間接與化合物連接的修飾基團；并且n為1-15的整數(shù)；其中，對Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Y，Z，A和n進行選擇，以便當化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時，化合物與β-淀粉樣肽結(jié)合或調(diào)節(jié)天然β-淀粉樣肽的聚集或抑制其神經(jīng)毒性，并且化合物更不易于被代謝，例如，氧化代謝。
在此公式的一個亞實施方案中，第五個氨基酸殘基，Xaa5，被限定在Xaa4的C末端，并且Z，Z可以存在或不存在，具有公式(Xaa)b的結(jié)構，其中，Xaa是任何D-氨基酸結(jié)構并且b為1-14的整數(shù)。因此，本發(fā)明提供了β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物，其包含公式(II) 其中，b為1-14的整數(shù)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，公式(I)中的Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4的選擇是根據(jù)Aβ17-20，或其可接受的取代物的序列。因此，在優(yōu)選的實施方案中，Xaa1是D-丙氨酸結(jié)構或D-亮氨酸結(jié)構，Xaa2是D-纈氨酸結(jié)構或D-苯丙氨酸結(jié)構，Xaa3是D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構或D-賴氨酸結(jié)構，Xaa4是D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構或D-賴氨酸結(jié)構。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，公式(II)中的Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Xaa5的選擇是根據(jù)Aβ17-21，或其可接受的取代物的序列。因此，在優(yōu)選的實施方案中，Xaa1是D-丙氨酸結(jié)構或D-亮氨酸結(jié)構，Xaa2是D-纈氨酸結(jié)構，Xaa3是D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構或D-賴氨酸結(jié)構，Xaa4是D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構或D-賴氨酸結(jié)構，Xaa5是D-丙氨酸結(jié)構或D-亮氨酸結(jié)構。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，公式(I)中的Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4的選擇是根據(jù)Aβ17-20的逆反異構體或其可接受的取代物。因此，在優(yōu)選的實施方案中，Xaa1是D-丙氨酸結(jié)構D-亮氨酸結(jié)構或D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構，D-亮氨酸結(jié)構，D-纈氨酸結(jié)構或D-賴氨酸結(jié)構；Xaa2是D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸D-吡啶丙氨酸和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構，或D-賴氨酸結(jié)構；Xaa3是D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構或D-賴氨酸結(jié)構；Xaa4是D-纈氨酸結(jié)構或D-亮氨酸結(jié)構。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，公式(II)中的Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Xaa5的選擇是根據(jù)Aβ17-21的逆反異構體，或其可接受的取代物。因此，在優(yōu)選的實施方案中，Xaa1是D-丙氨酸結(jié)構或D-亮氨酸結(jié)構或D苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構或D-賴氨酸結(jié)構；Xaa2是D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構或D-賴氨酸結(jié)構；Xaa3是D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-吡啶丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構或D-賴氨酸結(jié)構；Xaa4是D-纈氨酸結(jié)構或D亮氨酸結(jié)構；Xaa5是D-亮氨酸結(jié)構。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了含有公式(III)的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物 其中Xaa1和Xaa2各為D-氨基酸結(jié)構，并且Xaa1和Xaa2中至少兩個獨立地選自D-亮氨酸結(jié)構，D-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-高苯丙氨酸，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構，D-賴氨酸結(jié)構或D-纈氨酸結(jié)構；NH-NH是肼結(jié)構；Y，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)a的結(jié)構，其中，Xaa是任何D-氨基酸結(jié)構并且a為1-15的整數(shù)；Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’，可以存在或不存在，各為D-氨基酸或L-氨基酸結(jié)構并且Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’中至少有兩個獨立地選自D-或L-亮氨酸結(jié)構，D-或L-苯丙氨酸結(jié)構，例如，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，和D-高苯丙氨酸，D-或L-酪氨酸結(jié)構，D-或L-碘酪氨酸結(jié)構，D-或L-賴氨酸結(jié)構或D-或L-纈氨酸結(jié)構；Z，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)b的結(jié)構，其中，Xaa是任何D-氨基酸結(jié)構并且b為1-15的整數(shù)；A，可以存在或不存在，它是直接或間接與化合物連接的修飾基團；并且n為1-15的整數(shù)；其中，對Xaa1，Xaa2，Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’，Y，Z，A和n進行選擇，以便當化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時，化合物與β-淀粉樣肽結(jié)合或調(diào)節(jié)天然β-淀粉樣肽的聚集或抑制其神經(jīng)毒性，并且化合物更不易于被代謝，例如，氧化代謝。
具有以上公式(I)，(II)，或(III)的本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子中，一個可選的修飾基團(“A”)直接或間接地與調(diào)節(jié)因子的肽結(jié)構連接。(在本文使用時，術語“調(diào)節(jié)基團”和“修飾基團”可以互換使用，用于描述直接或間接地與肽結(jié)構連接的化學基團)。例如，修飾基團可以通過共價偶聯(lián)直接與肽結(jié)構連接或通過穩(wěn)定的非共價結(jié)合間接地與肽結(jié)構連接。在本發(fā)明的一個實施方案中，修飾基團與調(diào)節(jié)因子的氨基末端連接。替代地，在本發(fā)明的另一個實施方案中，修飾基團與調(diào)節(jié)因子的羧基末端連接。在其它實施方案中，修飾基團同時與調(diào)節(jié)因子的氨基和羧基末端連接。在另一個實施方案中，修飾基團與調(diào)節(jié)因子肽結(jié)構的至少一個氨基酸殘基的側(cè)鏈連接(例如，通過賴氨酸殘基的ε-氨基，通過天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的羧基，通過酪氨酸殘基，絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的羥基或其它在氨基酸側(cè)鏈的合適的反應基團)。
在存在修飾基團的情況下，對修飾基團進行選擇，以便當化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時化合物抑制天然β-淀粉樣肽的聚集。因此，由于化合物的β-AP肽從其天然狀態(tài)被修飾，本文所使用的修飾基團“A”不包括氫。在本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子中，單個修飾基團或多個修飾基團可以與肽結(jié)構連接。選擇修飾基團的數(shù)目，以便當化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時，化合物抑制天然β-淀粉樣肽的聚集。但是，n優(yōu)選地為1-60之間的整數(shù)，更優(yōu)選地為1-30之間的整數(shù)，并且甚至更優(yōu)選地為1-10或1-5之間的整數(shù)。在一個優(yōu)選的實施方案中，A是含有環(huán)狀的，雜環(huán)的，多環(huán)的，直線的或分枝的烷基的氨基末端修飾基團，并且n＝1。在其它優(yōu)選的實施方案中，A是含有氨基，烷基，芳基氨基或羥基的羧基末端修飾基團，并且n＝1。在下文的II和III分部進一步描述合適的修飾基團。
在特定的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了一種含有肽結(jié)構的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物，上述肽結(jié)構選自
(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)(SEQ ID NO5)；(D-Leu-D-Val-D-Cha-D-Phe-D-Leu)(SEQ ID NO6)；(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO7)；(D-Leu-D-Val-D-[P-F]Phe-D-Phe-D-Leu)(SEQ ID NO8)；(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F-5]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO9)；(D-Leu-D-Val-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Leu)(SEQ IDNO10)；(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO11)；(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO12)；D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQID NO13)；(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO14)；(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO15)；(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQID NO16)；(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO17)；(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO18)；(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)(SEQ IDNO19)；(D-Leu-D-Val-D-Cha-D-Cha-D-Leu)(SEQ ID NO20)；(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO21)；(D-Leu-D-Val-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO22)；(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO23)；(D-Leu-D-Val-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO24)；(D-Leu-D-Val-D-Phe)(SEQ D NO25).
任何上述特定的肽結(jié)構可以是氨基末端和/或羧基末端被修飾的，并且在下文的II和/或III分部被進一步描述。
本發(fā)明的特別優(yōu)選的調(diào)節(jié)因子包括如下N，N-二甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-異丙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-異丙酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-二甲酰胺；N，N-二乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-丙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-
Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2；1-哌啶-乙?；?(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；1-哌啶-乙?；?(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-異丙酰胺；H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-異丙酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-COCH3；和H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的化合物包括PPI-1319H-(D-Leu-D-Phe-[p-F]D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2以及PPI1019N-methyl-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2.(如上文所述，D-Cha代表D-環(huán)己基丙氨酸；[p-F]f或D-[p-F]Phe代表D-4-氟苯丙氨酸(也即對-氟苯丙氨酸)；[F5] f或D-[F5]Phe代表D-五氟苯丙氨酸；以及D-Nle代表D-正亮氨酸)。
本發(fā)明調(diào)節(jié)因子的D-氨基酸肽結(jié)構進一步用來包括其它，如本文所描述，保持了調(diào)節(jié)因子改變天然β-AP聚集的能力的肽修飾，包括類似物，衍生物和模擬物。例如，可以對本發(fā)明調(diào)節(jié)因子的D-氨基酸肽結(jié)構進一步修飾以增加穩(wěn)定性，生物藥效率，以及溶解性。本文所使用的術語“類似物”，“衍生物”和“模擬物”用來包括模仿D-肽結(jié)構的化學結(jié)構并保持D-肽結(jié)構的功能性的分子。設計肽類似物，衍生物和模擬物的方法在本領域眾所周知。例如，參見Farmer，P.S.in Drug Design(E.J.Ariens，ed.)Academic Press，NewYork，1980，vol.10，pp.119-143；Ball.J.B.and Alewood，P.F.(1990)J.Mol.Recognition 355；Morgan，B.A.and Gainor，J.A.(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24243；and Feidinger，R.M.(1989)Trends Pharmacol.Sci.10270。也參見Sawyer，T.K.(1995)″Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to PeptideMetabolism″in Taylor，M.D.and Amidon，G.L.(eds.)Peptide-based Drug DesignControlling Transport andMetabolism，Chapter 17；Smith，A.B.3rd，et al.(1995)J.Am.Chem.Soc.11711113-11123；Smith，A.B.3rd，et al.(1994)J.Am Chem.Soc.1169947-9962；and Hirschman，R.，et al.(1993)J.Am.Chem.Soc.11512550-12568。
在本文使用時，化合物X(例如，肽或氨基酸)的“衍生物”是指X的一種形式，在該形式中，化合物的一個或多個反應基團被取代基團衍生化。肽衍生物的例子包括氨基酸側(cè)鏈，肽主鏈，或氨基或羧基末端被衍生化的肽(例如，甲基化酰胺連接的肽化合物)。在本文使用時的化合物X的“類似物”是指一種化合物，該化合物保持X的功能活性所必需的化學結(jié)構并含有某些與X不同的化學結(jié)構。天然肽的類似物的例子是包括一個或多個非天然存在的氨基酸的肽。在本文使用時，化合物X的“模擬物”是指一種化合物，在該化合物中，X的功能活性所必需的化學結(jié)構被其它模擬X構象的化學結(jié)構取代。肽模擬物的例子包括肽主鏈被一個或多個苯二氮雜分子取代的肽化合物(參見例如，James，G.L.et al.(1993)Science 2601937-1942)。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物的類似物用來包括一個或多個D-氨基酸被同源的氨基酸取代并保持原始調(diào)節(jié)因子的性質(zhì)的化合物。優(yōu)選地，保守氨基酸取代在一個或多個氨基酸殘基進行?！氨Ｊ匕被崛〈笔侵赴被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代。在本領域中，已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，中性極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分枝側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)以及芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。在本發(fā)明調(diào)節(jié)因子的肽結(jié)構中，可以進行同源取代的非限制性例子包括用D-酪氨酸，D-吡啶丙氨酸或D-高苯丙氨酸取代D-苯丙氨酸，用D-纈氨酸或其它天然或非天然的具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸取代D-亮氨酸，和/或用D-亮氨酸或其它天然或非天然的具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸取代D-纈氨酸。
術語模擬物，特別是，肽模擬物，用來包括同電子排列體。在本文使用時，術語“同電子排列體(isostere)”用來包括一種化學結(jié)構，該化學結(jié)構可以被第二種化學結(jié)構取代，因為其立體構象符合第二種結(jié)構的特異性結(jié)合位點。上述術語特別地包括本領域技術人員眾所周知的肽主鏈修飾(即，酰胺鍵模擬物)。這些修飾包括酰胺氮，α-碳，酰胺碳的修飾，酰胺鍵的完全取代，以及延伸，切除或主鏈交聯(lián)。已知幾種肽主鏈修飾，包括ψ[CH2S]，ψ[CH2NH]，ψ[CSNH2]，ψ[NHCO]，ψ[COCH2]和ψ[(E)或(Z)CH＝CH]。在以上所用的術語中，ψ表示酰胺鍵不存在。取代酰胺基團的結(jié)構列在括號中。
其它可能的修飾包括N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])，或主鏈交聯(lián)以形成內(nèi)酰胺以及其它環(huán)狀結(jié)構。本發(fā)明調(diào)節(jié)因子化合物的其它衍生物包括C-末端羥甲基衍生物；O-修飾的衍生物(例如，C-末端羥甲基苯甲基醚)；N-末端修飾的衍生物，包括被取代的酰胺例如烷基酰胺和肼酰胺；以及C-末端苯丙氨酸殘基被苯乙基酰胺類似物取代的化合物(例如，Val-Phe-苯乙基酰胺作為三肽Val-Phe-Phe的類似物)。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物可以被摻入藥物組合物中(在下文V分部進一步描述)，并且如下文VI分部所進一步的描述，可以被用于檢測和治療的方法中。II.修飾基團在某些實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物直接或間接地與至少一個修飾基團(簡寫為MG)偶聯(lián)。術語“修飾基團”用來包括直接與D-氨基酸肽結(jié)構連接的結(jié)構(例如，通過共價偶聯(lián))，以及間接與肽結(jié)構連接的結(jié)構(例如，通過穩(wěn)定的非共價結(jié)合或通過與另加的氨基酸殘基，或其模擬物，類似物或衍生物共價偶聯(lián)，上述另加的氨基酸殘基，或其模擬物，類似物或衍生物可以與Aβ-衍生的D-氨基酸肽結(jié)構側(cè)面相連)。例如，修飾基團可以與Aβ-衍生的D-氨基酸肽結(jié)構的氨基末端或羧基末端偶聯(lián)，或與核心結(jié)構域側(cè)面的肽或模擬肽區(qū)域偶聯(lián)。替代地，修飾基團可以與Aβ-衍生的D-氨基酸肽結(jié)構至少一個D-氨基酸殘基的側(cè)鏈偶聯(lián)，或與核心結(jié)構域側(cè)面的肽或模擬肽區(qū)域偶聯(lián)(例如，通過賴氨酰殘基的ε-氨基基團，通過天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的羧基，通過酪氨酸殘基，絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的羥基或氨基酸側(cè)鏈上其它合適的反應基團)。可以通過本領域眾所周知的連接化學結(jié)構的手段和方法，連接D-氨基酸肽結(jié)構共價偶聯(lián)的修飾基團，上述化學結(jié)構包括，例如，酰胺，烷基氨基，氨基甲酸鹽，脲或酯鍵。
術語“修飾基團”用來包括不與自然狀態(tài)的天然Aβ肽天然偶聯(lián)的基團。因此，術語“修飾基團”不包括氫。選擇修飾基團以便當調(diào)節(jié)因子化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時其改變，優(yōu)選地抑制，天然β-淀粉樣肽的聚集；或者當其與天然β-淀粉樣肽接觸時它抑制天然β-淀粉樣肽的神經(jīng)毒性。盡管無意于在機制上進行限制，在含有修飾基團的調(diào)節(jié)因子的實施方案中，該修飾基團被認為是作為增強該調(diào)節(jié)因子破壞Aβ聚集的能力的關鍵藥效基團起作用的。
在優(yōu)選的實施方案中，該修飾基團含有烷基基團。在本文中使用時，術語“烷基”指具有1至10個碳原子的直鏈或支鏈的碳氫基團。典型的烷基基團包括甲基，乙基，二甲基，二乙基，n-丙基，異丙基，n-丁基，異丁基，2-丁基，叔丁基，n-戊基，和n-己基。烷基基團可以是未取代的，或可以在一個或多個位置被取代，例如用以下基團取代鹵素，烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，芳基，雜環(huán)，羥基，氨基，硝基，硫醇，胺，亞胺，酰胺，膦酸酯，膦，羰基，羧基，甲硅烷基，醚，硫醚，磺?；?selenoethers)，酮，醛，酯，-CF3，-CN等等。優(yōu)選的烷基是甲基，乙基，二甲基，二乙基，n-丙基，異丙基。
在另一個實施方案中，一個修飾基團，例如甲基基團，與另一個修飾基團偶聯(lián)。在另一個實施方案中，用兩個修飾基團修飾本發(fā)明調(diào)節(jié)因子化合物中的D-氨基酸。因此，優(yōu)選的修飾基團包括1-哌啶乙?；鶊F。
在一個優(yōu)選的實施方案中，修飾基團包括環(huán)狀的，雜環(huán)的，多環(huán)的或分枝的烷基基團。在本文中使用時，術語“環(huán)狀基團”用來包括環(huán)狀的飽和或不飽和(即，芳香族的)基團，該基團具有大約3-10個，優(yōu)選地大約4-8個，并且更優(yōu)選地大約5-7個碳原子。典型的環(huán)狀基團包括環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基和環(huán)辛基。環(huán)狀基團可以是未取代的或在一個或多個環(huán)位置被取代。因此，環(huán)狀基團可以被取代，例如用以下基團取代鹵素，烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，芳基，雜環(huán)，羥基，氨基，硝基，硫醇，胺，亞胺，酰胺，膦酸酯，膦，羰基，羧基，甲硅烷基，醚，硫醚，磺酰基，硒酯(selenoethers)，酮，醛，酯，-CF3，-CN等等。
術語“雜環(huán)基團”用來包括環(huán)狀的飽和或不飽和(即，芳香族的)基團，該基團具有大約3-10個，優(yōu)選地大約4-8個，并且更優(yōu)選地大約5-7個碳原子，其中，環(huán)結(jié)構包括大約1-4個雜環(huán)原子。雜環(huán)基團包括吡咯烷，oxolane，thiolane，咪唑，惡唑，哌啶，哌嗪，嗎啉和嘧啶。雜環(huán)的環(huán)可以在一個或多個位置被取代，例如用這些取代物取代鹵素，烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，芳基，其它雜環(huán)，羥基，氨基，硝基，硫醇，胺，亞胺，酰胺，膦酸酯，膦，羰基，羧基，甲硅烷基，醚，硫醚，磺?；?，硒酯(selenoethers)酮，醛，酯，-CF3，-CN等等。如下文所描述，雜環(huán)可以與其它環(huán)狀基團橋接或融合。
在本文中使用時，術語“多環(huán)基團”用來指兩個或多個飽和或不飽和(即，芳香族的)的環(huán)，在上述環(huán)中，兩個相鄰的環(huán)共用兩個或多個碳原子，例如，環(huán)是“融合的環(huán)”。通過非相鄰的原子連接的環(huán)被稱為“橋接”環(huán)。多環(huán)基團的各個環(huán)可以用上文所描述的取代物取代，作為例子如鹵素，烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，羥基，氨基，硝基，硫醇，胺，亞胺，酰胺，膦酸酯，膦，羰基，羧基，甲硅烷基，醚，硫醚，磺酰基，硒酯(selenoethers)酮，醛，酯，-CF3，-CN等等。
優(yōu)選的多環(huán)基團是含有順式十氫化萘結(jié)構的基團。盡管無意于在機制上進行限制，但是由于順式十氫化萘結(jié)構的存在所導致的修飾基團的“彎曲”的構象，被認為是參與了修飾基團破壞Aβ聚集的功效。因此，其它模擬順式十氫化萘“彎曲構象”的結(jié)構也可以被用作修飾基團。含有可以被用作修飾基團結(jié)構的順式十氫化萘的例子是膽烷酰基結(jié)構，例如cholyl基團。例如，通過聚集核心結(jié)構域與膽酸，一種膽汁酸的反應，可以在調(diào)節(jié)因子化合物的氨基末端修飾上cholyl基團。此外，根據(jù)本領域已知的方法可以在調(diào)節(jié)因子化合物的羧基末端修飾上cholyl基團(參見例如，Wess，G.et al.(1993)Tetrahedron Letters，34817-822；Wess，G.et al.(1992)Tetrahedron Letters 33195-198；and Kramer，W.et al.(1992)J.Biol.Chem.26718598-18604)。Cholyl的衍生物和類似物也可以用作修飾基團。例如，優(yōu)選的Cholyl的衍生物是具有游離氨基基團的Aic(3-(O-氨乙酸-異)-Cholyl)，上述游離氨基基團可以被進一步用于修飾調(diào)節(jié)因子化合物(例如，可以通過Aic的游離氨基基團引入一種螯合99mTc的基團)。在本文中使用時，術語“膽烷?；Y(jié)構”用來包括cholyl基團及其衍生物和類似物，特別是那些保留了四環(huán)的順式十氫化萘構型的結(jié)構。膽烷?；Y(jié)構的例子包括源自其它膽汁酸的基團，例如脫氧膽酸，石膽酸，熊脫氧膽酸，鵝脫氧膽酸，和豬脫氧膽酸，以及其它相關的結(jié)構，例如膽烷酸，蟾蜍靈和resibufogenin(盡管后兩種化合物不是優(yōu)選地用作修飾基團)。其它含有順式十氫化萘的化合物的例子是5β-膽烷-3α-ol((+)-二氫膽固醇的順式十氫化萘異構體)。膽汁酸和其它類固醇結(jié)構和命名法的描述參見New，W.R and McKean，M.L.Biochemistry of Steroidsand Other Isopentanoids，University Park Press，Baltimore，MD，Chapter 2。
除了含有順式十氫化萘的基團外，其他多環(huán)基團也可以被用作修飾基團。例如，源自類固醇或β-內(nèi)酰胺的修飾基團是合適的修飾基團。在一個實施方案中，修飾基團是“生物素基(biotinyl)結(jié)構”，該結(jié)構包括生物素基基團及其類似物和衍生物(例如2-亞氨基生物素基基團)。在另一個實施方案中，修飾基團可以包括“含有熒光素的基團”，例如源自Aβ-衍生的肽結(jié)構與5-(和6-)-羧基熒光素，琥珀酰亞胺酯或熒光素異硫氰酸酯反應的基團。在其它各種實施方案中，修飾基團包括N-乙酰神經(jīng)氨基團，反式-4-可鐵寧(cotinine)羧基基團，2-亞氨基-1-咪唑烷乙?；鶊F，(S)-(-)-indoline-2-羧基基團，薄荷氧乙?；鶊F，2-降冰片烷乙?；鶊F，γ-氧-5-二氫苊丁?；鶊F(-)-2-氧絡-4-四氫噻唑羧基基團，四氫-3-呋喃甲酰基團，2-亞氨生物素基基團，二乙烯基三胺五乙酰基基團，4-嗎啉羰基基團，2-硫苯乙?；鶊F或2-硫苯磺?；?。
除了以上說討論的環(huán)狀，雜環(huán)和多環(huán)基團外，其它類型的修飾基團也可以用于本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子。例如，疏水基團和分枝烷基基團可以是適當?shù)男揎椈鶊F。例子包括乙酰基基團，苯基乙酰基基團，二苯基乙?；鶊F三苯基乙?；鶊F，異丁?；鶊F，4-甲基戊?；鶊F，反式-肉桂?；鶊F，丁?；鶊F和1-金剛烷羰基基團。
另一種類型的修飾基團是含有作為β-轉(zhuǎn)角模擬物的非天然氨基酸的化合物，例如在Tsang，K.Y.et al.(1994)J.Am.Chem.Soc.1163988-4005；Diaz，H and Kelly，J.W.(1991)TetrahedronLetters 415725-5728；and Diaz.H et al.(1992)J.Am.Chem.Soc.1148316-8318中所描述的基于二苯并呋喃的氨基酸。這樣的基團的一個例子是肽-氨基乙基二苯并呋喃基-proprionic酸(Adp)基團(例如DDIIL-Adp)(SEQ ID NO31)。這種類型的修飾基團可以進一步含有一個或多個N-甲基肽鍵，以便在這種類型的化合物和天然β-AP相互作用時引入對天然β-AP聚集的空間位阻。
另一種類型的修飾基團是NH-OR基團，其中R可以是任何本文描述的修飾的或未修飾的烷基或環(huán)烷基基團。
適當修飾基團的非限制性例子，以及它們相關的修飾試劑在以下列出修飾基團 修飾試劑甲基- 甲胺，F(xiàn)moc-D-[Me]-Leu-OH，甲胺和溴乙?；囊一? 乙胺，乙醛，氰氫硼化鈉(sodiumcyanoborohydride)，乙胺和溴乙酰基肽丙基- 丙胺，丙醛和氰氫硼化鈉，丙胺和溴乙?；漠惐?異丙胺，異丙胺和溴乙?；倪哙? 哌啶和溴乙?；囊阴；?乙酐，醋酸二甲基-甲胺，甲醛和氰硼化氫鈉二乙基-乙醛和氰硼化氫鈉膽酸基-膽酸石膽酸基- 石膽酸豬脫氧膽酸基- 豬脫氧膽酸鵝脫氧膽酸基- 鵝脫氧膽酸熊脫氧膽酸基- 熊脫氧膽酸3-羥基肉桂?；?3-羥基肉桂酸4-羥基肉桂?；?4-羥基肉桂酸2-羥基肉桂?；?2-羥基肉桂酸3-羥基-4-甲氧基肉桂?；?-羥基-4-甲氧基肉桂酸4-羥基-3-甲氧基肉桂?；?-羥基-3-甲氧基肉桂酸2-羧基肉桂?；?2-羧基肉桂酸3-甲?；郊柞；? 3-甲酰基苯甲酐4-甲?；郊柞；? 4-甲酰基苯甲酐3，4-二羥基氫化肉桂酰基3，4-二羥基氫化肉桂酸3，7-二羥基-2-萘酚基 3，7-二羥基-2-萘甲酸4-甲酰基肉桂?；? 4-甲?；夤鹚?-甲?；窖跻阴；?2-甲?；窖跻阴Ｋ?-甲?；?1-萘酚基 1，8-napthaldehydic acid4-(羥甲基)苯甲?；?4-(羥甲基)苯甲酸4-羥苯基乙?；?4-羥苯基乙酸3-羥基苯甲?；?3-羥基苯甲酸4-羥基苯甲酰基 4-羥基苯甲酸5-乙內(nèi)酰脲甲?；? 5-乙內(nèi)酰脲甲酸L-hydroorotyl L-hydroorotic acid4-甲基戊酰 4-甲基戊酸2，4-二羥基苯甲?；?，4-二羥基苯甲酸3，4-二羥基肉桂?；?，4-二羥基肉桂酸3，5-二羥基-2-萘酚基3，5-二羥基-2-萘甲酸3-苯甲?；榛?-苯甲酰基丙烷酸反式-肉桂?；? 反式-肉桂酸苯乙?；揭宜崧?lián)苯乙酰基 聯(lián)苯乙酸三苯乙?；? 三苯乙酸2-羥苯基乙酰基 2-羥苯基乙酸3-羥苯基乙?；? 3-羥苯基乙酸4-羥苯基乙酰基 4-羥苯基乙酸(±)-扁桃基 (±)-扁桃酸(士)-2，4-二羥基-3，3-二(±)-全內(nèi)酯甲基丁?；□；? 丁酰酐異丁?；?異丁酰酐己?；? 己酰酐丙酰基 丙酰酐3-羥基丁?；?β-丁酸內(nèi)酯4-羥基丁酰基 γ-丁酸內(nèi)酯3-羥基丙?；?β-丙酸內(nèi)酯2，4-二羥基丁酰基α-羥基-β-丁酸內(nèi)酯1-金剛烷羰基 1-金剛烷羧酸乙醇?；?乙醇酸DL-3-(4-羥苯基)乙酰基DL-3-(4-羥苯基)乙酸3-(2-羥苯基)丙?；? 3-(2-羥苯基)丙酸4-(2-羥苯基)丙?；? 4-(2-羥苯基)丙酸D-3-苯基乳酰基 D-3-苯基乳酸氫化肉桂?；?氫化肉桂酸3-(4-羥苯基)丙?；? 3-(4-羥苯基)丙酸L-3-苯基乳酰基 L-3-苯基乳酸4-甲基戊酰 4-甲基戊酸3-吡啶基乙酰基 3-吡啶基乙酸4-吡啶基乙?；? 4-吡啶基乙酸異煙酰基4-喹啉羧基 4-喹啉羧酸1-異喹啉羧基 1-異喹啉羧酸3-異喹啉羧基 3-異喹啉羧酸優(yōu)選的修飾基團包括含有甲基的基團，含有乙基的基團，含有丙基的基團和含有哌啶的基團，例如，1-哌啶-乙?；鶊F。III.Aβ調(diào)節(jié)因子的另加的化學修飾本發(fā)明的Aβ-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物可以被進一步的修飾，以改變化合物特定的性質(zhì)而保留化合物改變Aβ聚集和抑制Aβ神經(jīng)毒性的能力。例如，在一個實施方案中，該化合物被進一步的修飾以改變化合物的藥效動力學性質(zhì)，例如體內(nèi)穩(wěn)定性或半衰期。在另一個實施方案中，化合物被進一步的修飾以便用可探測的物質(zhì)標記該化合物。在另一個實施方案中，化合物被修飾以便化合物與另加的治療部分偶聯(lián)。示意地，本發(fā)明的的調(diào)節(jié)因子可以表示為MG-ACD，其中上述調(diào)節(jié)因子含有直接或間接與至少一個修飾基團偶聯(lián)的D-氨基酸Aβ聚集核心結(jié)構域；而被進一步修飾以改變調(diào)節(jié)因子性質(zhì)的化合物可以表示為MG-ACD-CM，其中，CM代表附加的化學修飾。
為了進一步對上述化合物進行化學修飾，例如改變化合物的藥效動力學性質(zhì)，可以對反應基團進行衍生化。例如，當修飾基團與聚集核心結(jié)構域的氨基末端終點連接時，化合物的羧基末端可以被進一步修飾。優(yōu)選的C-末端修飾包括那些降低化合物作為羧肽酶底物活性的修飾。優(yōu)選的C-末端修飾物的例子包括酰胺基團(即，肽酰胺)，烷基或芳基酰胺基團(即，乙基酰胺基團或苯乙基酰胺基團)，羥基基團(即，肽醇)和各種非天然氨基酸，例如D-氨基酸β-丙氨酸。替代地，當修飾基團與聚集核心結(jié)構域的羧基末端連接時，化合物的氨基末端可以被進一步修飾，例如，以便降低化合物作為氨肽酶底物的活性。
通過化合物與可探測物質(zhì)的反應，調(diào)節(jié)因子化合物可以被進一步修飾以對化合物進行標記。合適的可探測物質(zhì)包括各種酶，互補基團，熒光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的例子包括辣根過氧化酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，乙酰膽堿酯酶；合適的互補基團的例子包括鏈親和素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括繖形酮，熒光素，熒光素異硫氰酸鹽，若丹明，dichlorotriazinylamine熒光素，丹酰氯化物或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括發(fā)光氨；以及合適的放射性物質(zhì)的例子包括14C，123I，124I，125I，131I，99mTc，35S或3H。在一個優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)因子化合物是用14C放射性標記的，標記是通過將14C摻入到調(diào)節(jié)因子化合物的修飾基團或者一個或多個氨基酸結(jié)構進行的。標記的調(diào)節(jié)因子可以用于評測化合物的體內(nèi)藥效動力學，以及檢測Aβ聚集，例如用于診斷目的。利用標記的調(diào)節(jié)因子化合物可以在源自病人的體內(nèi)或在體外樣品中檢測Aβ聚集。
優(yōu)選地，作為體內(nèi)診斷制劑使用時，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物用放射性的锝或碘標記。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用锝，優(yōu)選地99mTc，標記的調(diào)節(jié)因子化合物。用锝標記肽化合物的方法在本領域中是已知的(參見例如，美國專利號5,443,815，5,225,180和5,405,597，all by Dean et al.；Stepniak-Biniakiewicz，D.，et al.(1992)J.Med.Chem.35274-279；Frirzberg，A.R.，etal.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854025-4029；Baidoo，K.E.，et al.(1990)Cancer Res.Suppl.50799s-803s；and Tegan，L.and Smith，C.K.(1995)Science 270980-982)。可以選擇修飾基團，上述修飾基團提供了可以引入99mTc的螯合基團的位點，例如具有游離氨基基團的膽酸的Aic衍生物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用放射性碘標記的調(diào)節(jié)因子化合物。例如，Aβ序列內(nèi)的苯丙氨酸殘基(如Phe19和Phe20)可以被放射性的碘酪氨酸殘基取代。幾種碘放射性同位素中的任何一種都可以被摻入以制造診斷制劑。優(yōu)選地，123I(半衰期＝13.2小時)被用于全身閃爍圖(whole bodysintigraphy)，124I(半衰期＝4天)用于正電子發(fā)射斷層攝影(PET)125I(半衰期＝60天)(PET)被用于代謝周轉(zhuǎn)研究和131I(半衰期＝8天)被用于全身計數(shù)和延遲低分辨率影像研究。
進而，本發(fā)明調(diào)節(jié)因子化合物的另加修飾可以賦于該化合物另加的治療特性。即，另加的化學修飾可以含有另加的功能部分。例如，一種降解或溶解淀粉樣斑塊的功能部分可以被偶聯(lián)到該調(diào)節(jié)因子化合物上。以在這種形式，本發(fā)明的MG-ACD部分負責將該化合物引導到Aβ肽并破壞Aβ肽的聚集，而另加的功能部分在該化合物被引導到這些位點后負責降解或溶解淀粉樣斑塊。
在一種替代的化學修飾中，本發(fā)明的β-淀粉樣化合物是以“前藥”的形式制備的，其中該化合物自身不調(diào)節(jié)Aβ的聚集，但是在體內(nèi)代謝時它能夠被轉(zhuǎn)化成本文定義的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物。例如，在這種類型的化合物中，上述調(diào)節(jié)基團是以前藥的形式存在的，該形式在代謝時能夠被轉(zhuǎn)化為活性調(diào)節(jié)基團。這樣的前藥形式的修飾基團在本文中稱為“次級修飾基團”。在本領域中已知有許多制備限制代謝的肽前藥的策略，以便優(yōu)化運送基于肽的藥物的活性形式(參見，例如，Moss，J.(1995)in Peptide-Based Drug DesignControlling Transport and Metabolism，Taylor，M.D.and Amidon，G.L.(eds)，Chapter 18)。特地調(diào)整了另加的策略，以便達到基于“順序代謝”的CNS運送(參見，例如，Bodor，N.，et al.(1992)Science2571698-1700；Prokai，L.，et al.(1994)J.Am.Chem.Soc.1162643-2644；Bodor，N.and Prokai，L.(1995)inPeptide-Based Drug DesignControlling Transport andMetabolism，Taylor，M.D.and Amidon.G.L.(eds)，Chapter 14)。在本發(fā)明調(diào)節(jié)因子的前藥形式的一個實施方案中，修飾基團含有烷基酯以促進血腦屏障的通透性。
可以通過本領域中已知的常規(guī)技術制備本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物。調(diào)節(jié)因子的肽組分可以用常規(guī)技術合成，例如在Bodansky，M.Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag，Berlin(1993)and Grant，G.A.(ed)，Synthetic PeptidesA User’sGuide，W.H.Freeman and Company，New York(1992)中所描述的技術。自動化肽合成儀可以通過商業(yè)途徑獲得(例如，Advanced ChemTech Model 396；Milligen/Bioseach 9600)。此外，可以通過常規(guī)的方法，將一種或多種修飾基團與源自Aβ的肽組分(例如，Aβ聚集核心結(jié)構域)連接，上述常規(guī)方法如通過氨基基團(例如，肽氨基末端的α-氨基基團)，羧基基團(例如，肽的羧基末端)，羥基基團(例如，酪氨酸，絲氨酸蘇氨酸殘基上)或氨基酸側(cè)鏈上的其它適合的反應基團(參見，例如，Greene，T.W and Wuts，P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Inc.，New York(1991))。D-氨基酸β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子合成的示例在實施例1中進一步描述。IV.篩選檢測本發(fā)明的另一方面涉及選擇β-淀粉樣聚集的調(diào)節(jié)因子的方法。在該方法中，待測化合物與天然β-淀粉樣肽接觸，根據(jù)待測化合物改變天然β-AP聚集(例如，已知或促進聚集)的能力，測量天然β-AP的聚集然后選出調(diào)節(jié)因子。在一個優(yōu)選的實施方案中，待測化合物與摩爾過量的天然β-AP接觸。通過指示β-AP聚集的適當檢測指標，可以確定在待測化合物存在的情況下天然β-AP聚集的量和/或速率，如本文所描述(參見，例如，實施例2)。
在優(yōu)選的檢測中，在待測化合物存在的情況下天然β-AP被溶解成溶液并在晶核形成檢測(參見實施例2)中評測天然β-AP的聚集，晶核形成檢測是通過測量溶液在405nm的表觀吸收而評測溶液隨著時間的渾濁度變化(在實施例2中進一步描述，也參見Jarret et al.(1993)Biochemistry 324693-4697)。在無β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子的情況下，在含有β-AP的溶液中，在滯后時間內(nèi)溶液的A405nm通常保持相對穩(wěn)定，但是隨后，當β-AP聚集并從溶液中析出時，溶液的A405nm迅速地增加，最后到達一個平臺水平(即，溶液的A405nm隨時間顯示S形動力學)。相反，在抑制β-AP聚集的待測化合物存在的情況下，溶液的A405nm與無調(diào)節(jié)因子時相比降低了。因此，與無調(diào)節(jié)因子時相比，在抑制調(diào)節(jié)因子存在的情況下，溶液可能表現(xiàn)出滯后時間增加，聚集斜率減小和/或平臺水平降低。類似地，上述篩選β-淀粉樣聚合調(diào)節(jié)因子的方法可以用于篩選促進β-AP聚集的調(diào)節(jié)因子。因此，與無調(diào)節(jié)因子時相比，在促進β-AP聚集的調(diào)節(jié)因子存在的情況下，溶液的A405nm增加了(例如，與無調(diào)節(jié)因子時相比，溶液可能表現(xiàn)出滯后時間減少，聚集斜率增加和/或平臺水平升高)。
另一個適用于本發(fā)明篩選方法的檢測，晶種延伸檢測，也在實施例2中進一步描述。在上述檢測中，在存在或不存在待測化合物的情況下，β-AP單體和聚集的β-AP“晶種”被結(jié)合在一起，并且根據(jù)染料甲基脫硫氫對甲苯胺磺酸與β-纖絲接觸時，該染料的發(fā)射增加對β-纖絲形成的量進行檢測。而且，在存在或不存在調(diào)節(jié)因子的情況下，通過對β-AP制備物的電子顯微技術(EM)分析可以檢測β-AP聚集。例如，在抑制β-AP聚集的調(diào)節(jié)因子存在的情況下，通過EM檢測，β淀粉樣纖絲的形成減少了(即，在調(diào)節(jié)因子存在時，β-纖絲的量或數(shù)目減少了)，而在促進β-AP聚集的調(diào)節(jié)因子存在的情況下，β纖絲的形成增加了(即，在調(diào)節(jié)因子存在時，β-纖絲的量或數(shù)目增加了)。
另一個用于篩選合適調(diào)節(jié)因子的本發(fā)明的優(yōu)選篩選方法是實施例3中所描述神經(jīng)毒性檢測。篩選出抑制神經(jīng)毒性Aβ聚集的形成和/或抑制預先形成的Aβ纖絲的神經(jīng)毒性的化合物。這種神經(jīng)毒性檢測被認為是對體內(nèi)神經(jīng)毒性的預測。因此，調(diào)節(jié)因子化合物在體外神經(jīng)毒性檢測中的抑制活性是對該化合物在體內(nèi)的類似神經(jīng)毒性抑制活性的預測。V.藥用組合物本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物的藥用組合物。在一個實施方案中，上述組合物含有在治療或預防上足以改變，并優(yōu)選地抑制，天然β-淀粉樣肽聚集的有效量的β淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物，以及藥用上可接受的載體。在另一個實施方案中，組合物含有在治療或預防上足以抑制天然β-淀粉樣肽的神經(jīng)毒性的有效量的β淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物，以及藥用上可接受的載體?！爸委熡行Я俊笔侵敢粋€量，該量在所需要的劑量和時間內(nèi)能有效地達到合乎需要的治療效果，例如減少或逆轉(zhuǎn)β-淀粉樣沉積物和/或減少或逆轉(zhuǎn)Aβ神經(jīng)毒性。調(diào)節(jié)因子的治療有效量可能根據(jù)一些因素而改變，例如疾病狀態(tài)，年齡，性別和個體體重，以及調(diào)節(jié)因子在個體中產(chǎn)生所需反應的能力?？梢哉{(diào)整劑量服法以便提供最佳的治療反應。治療有效量也可以是調(diào)節(jié)因子在治療上的有益作用超過其毒性或損害作用的有效量。利用實施例6所描述的基于細胞的檢測可以檢測本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子的潛在神經(jīng)毒性，并且可以選出不表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)毒性的治療有效調(diào)節(jié)因子。在一個優(yōu)選的實施方案中，治療有效量的調(diào)節(jié)因子足以改變，優(yōu)選地抑制，摩爾過量的天然β-淀粉樣肽的聚集?！邦A防有效量”是指一個量，該量在所需要的劑量和時間內(nèi)能有效地達到合乎需要的治療效果，例如防止β-淀粉樣沉積或抑制β-淀粉樣沉積率和/或傾向于形成β-淀粉樣沉積物的病人中的Aβ神經(jīng)毒性?？梢匀缟衔乃龅膶χ委熡行Я康拇_定那樣，對預防有效量進行確定。通常，由于預防劑量在病人疾病之前或疾病的較早期使用，預防有效量將少于治療有效量。
在確定β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子的治療或預防有效量時，可能考慮的一個因素是病人生物區(qū)隔中，例如病人腦脊液(CSF)中，天然β-AP的濃度。據(jù)估計CSF中天然β-AP的濃度為3nM(Schwartzman，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918368-8372)。β淀粉樣調(diào)節(jié)因子的治療或預防有效量的一個非限制性范圍是0.01nM-10μM。應當注意劑量值可能隨待減輕的疾病的嚴重性而不同。進而，應當理解，對于任何特定的病人，必須根據(jù)個體的需要以及管理或監(jiān)督上述組合物給藥的專業(yè)人員的判斷，隨時間調(diào)整特定的劑量服法，并且，本文提出的劑量范圍僅僅是示例性的，并不用來限制所要求的組合物的范圍或?qū)嵺`。
組合物中的活性化合物的量可能根據(jù)一些因素而改變，例如疾病狀態(tài)，年齡，性別，和個體的體重，上述各個因素可能影響個體中天然β-AP的量?？梢哉{(diào)整劑量服法以便提供最佳的治療反應。例如，可以施用單一快速濃注，隨時間施用幾次分開的劑量，或根據(jù)治療狀況的緊急事件的預示，可以按比例減少或增加劑量。為了給藥的簡易性和劑量的一致性，以劑量單元的形式配制注射用的組合物是特別有用的。在本文中使用時，劑量單元形式是指物理上分離的單元，該單元是對被治療的哺乳動物接受體適合的單位劑量；每個單位包含預先確定數(shù)量的活性化合物以及必需的藥用載體，該化合物數(shù)量是經(jīng)過計算的以便產(chǎn)生所需的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)定是直接取決于(a)活性化合物的獨特性和所獲得的特定的治療效果，和(b)在組合這樣的活性化合物以治療個體的敏感性領域的內(nèi)在局限。
在本文中使用時，“藥用上可接受的載體”包括任何和所有的生理上可兼容的溶劑，分散介質(zhì)，涂層，抗細菌劑和抗真菌劑，等滲的和吸收延遲劑，等等。在一個實施方案中，載體是適合于非腸道給藥。優(yōu)選地，載體適合于對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如，脊柱內(nèi)或大腦內(nèi))給藥。替代地，載體適合于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)或肌肉給藥。在另一個實施方案中，載體適合于口服給藥。藥用上可接受的載體包括無菌水溶液或分散劑以及用于臨時制備無菌注射溶液或分散劑的無菌粉末。這些介質(zhì)和制劑在藥用活性物質(zhì)中的應用在本領域中是眾所周知的。除了任何與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或制劑外，可考慮在本發(fā)明的藥用組合物中其它介質(zhì)或制劑使用。輔助的活性化合物也可以被摻入到組合物中。
通常，治療組合物在制造和儲存的條件下必須是無菌并穩(wěn)定的。組合物可以被配制成溶液，微滴乳狀液，脂質(zhì)體，或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)包括，例如，水，乙醇，多羥基化合物(例如，甘油，丙烯甘油，和液態(tài)聚乙二醇，等等)，和它們的適當混合物?？梢员３诌m當?shù)牧鲃有裕?，通過使用涂層劑如卵磷脂，在分散劑的情況通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑。在許多情況下，在組合物中包含等滲制劑，例如，糖，多醇類如甘露醇，山梨醇，或氯化鈉是優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^在組合物中包括延遲吸收的制劑，例如，一硬脂酸鹽和凝膠，延長可注射組合物的吸收。而且，可以在延時釋放的制劑中施用調(diào)節(jié)因子，例如在包含緩慢釋放的聚合體的組合物中?；钚曰衔锟梢耘c防止化合物快速釋放的載體一起制備，上述載體例如控制釋放的制劑，包括植入式運送系統(tǒng)和微囊密封的運送系統(tǒng)?？梢岳蒙锟山到獾?，生物適合的聚合體，例如乙烯醋酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，膠原蛋白，polyorthoesters，聚乳酸和聚乳酸，聚乙醇酸共聚物(PLG)。制備上述制劑的許多方法已授與專利的，或?qū)τ诒绢I域的技術人員通常是已知的。
無菌注射溶液可以通過以下方法制備在合適的溶劑中摻入所需量的活性化合物(例如，β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子)以及按照需要摻入上文列舉的一種成分或幾種成分的組合，然后無菌過濾。通常，通過將活性化合物摻入到含有基礎分散介質(zhì)和其它上文列舉的所需成分的無菌載體中，可以制備分散劑。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，該方法從先前無菌過濾的溶液中產(chǎn)生活性成分加上另加的所需成分的粉末。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物可以與一種或多種另加的提高調(diào)節(jié)因子化合物溶解性的化合物一起配制。加入到制劑中以提高調(diào)節(jié)因子的溶解性的優(yōu)選化合物是環(huán)糊精衍生物，優(yōu)選地為羥基丙基-γ-環(huán)糊精。含有用于將肽運送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的環(huán)糊精衍生物的運送載體在Bodor，N.，et al.(1992)Science 2571698-1700中有所描述。對于本文所描述的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子，在制劑中包含濃度為50-200mM的羥基丙基-γ-環(huán)糊精能夠增加該化合物的水溶性。除了提高溶解性外，在制劑中包含環(huán)糊精衍生物可能具有其它有利的效應，因為有報道表明β-環(huán)糊精自身能夠與Aβ肽反應并在體外抑制纖絲的形成(Camileri，P.，et al.(1994)FEBS Leters 341256-258)。因此，結(jié)合使用本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物和環(huán)糊精衍生物對Aβ聚集的抑制可能比單獨使用調(diào)節(jié)因子自身更強。環(huán)糊精的化學修飾在本領域中是已知的(Hanessian.S.，et al.(1995)J.Org.Chem.604786-4797)。除了在含有本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子的藥用組合物中作為添加劑外，環(huán)糊精衍生物自身也可以用作修飾基團，并因此也可以與Aβ肽化合物共價偶聯(lián)形成本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物。
增強調(diào)節(jié)因子化合物的腦攝取的另一個優(yōu)選制劑在鹽溶液中含有吐溫-80，聚乙烯乙二醇(PEG)和乙醇。上述的優(yōu)選制劑的一個非限制性例子是在鹽溶液中含有0.16％吐溫-80，1.3％PEG-3000和2％乙醇。
在另一個實施方案中，含有本發(fā)明調(diào)節(jié)因子化合物的藥用組合物被配制得能夠使該調(diào)節(jié)因子跨過血腦屏障(BBB)運送。本領域中已知的提高跨BBB運送的各種策略可以被改造以適用于本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子，從而增強該調(diào)節(jié)因子跨BBB的運送(這些策略的綜述參見，例如，Pardidge，W.M.(1994)Trends in Biotechnol.12239-245；Van Bree，J.B.et al(1993)Pharm.World Sci.152-9；和Padridge，W.M.et al.(1992)Pharmacol Toxicol.713-10)。在一種途徑中，調(diào)節(jié)因子被化學修飾以形成增強跨膜運送的前藥。適當?shù)幕瘜W修飾包括脂肪酸與調(diào)節(jié)因子通過酰胺或酯連接的共價連接(參見，例如，Shashoua的美國專利4,933,324和PCT PublicationWO 89/07938；Hesse et al.；的美國專利5,284,876；Toth et al.(1994)J.Drug Target.2217-239 and Shashoua，V.E et al.(1984)J.Med.Chem.27659-664)和該調(diào)節(jié)因子的糖基化(參見，例如，Poduslo et al的美國專利5,260,308)?？梢栽谡{(diào)節(jié)因子中使用N-?；被嵫苌镆孕纬伞爸缘摹鼻八?參見，例如，Hashimoto et al.的5,112,863)。
在另一個增強跨BBB運送的途徑中，肽或肽模擬物調(diào)節(jié)因子與第二種肽或蛋白連接，從而形成嵌合蛋白，其中第二種肽或蛋白通過吸附介導的或受體介導的胞吞轉(zhuǎn)運作用而通過BBB。因此，通過調(diào)節(jié)因子與第二種肽或蛋白的偶聯(lián)，嵌合蛋白跨過BBB轉(zhuǎn)運。第二種肽或蛋白可以是腦毛細管內(nèi)皮細胞受體的配基。例如，一種優(yōu)選的配基是特異地與腦毛細管內(nèi)皮細胞運鐵蛋白受體結(jié)合的單克隆抗體(參見例如，美國專利號5,182,107和5,154,924和PCT Publications WO93/10819和WO95/02421，all by Friden et al.)。其它合適的可以介導跨過BBB的肽或蛋白包括組蛋白(參見例如，美國專利號4,902,505 by Pardridge and Schimmel)以及配基例如生物素，葉酸，煙酸，泛酸，核黃素，硫胺，吡哆醛和抗壞血酸(參見，例如，Heinstein的美國專利5,416,016和5,108,921)。此外有報道表明葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT-1能夠轉(zhuǎn)運糖肽([Met5]腦啡肽的L-絲氨酰-β-D-葡萄糖苷類似物)跨過BBB(Polt，R.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 917114-1778)。因此，調(diào)節(jié)因子化合物可以與這樣的糖肽偶聯(lián)以使調(diào)節(jié)因子錨定GLUT-1葡萄糖轉(zhuǎn)運體。例如，在氨基末端用調(diào)節(jié)基團Aic(3-(O-氨基乙基-異)-cholyl，一種具有游離氨基的膽酸衍生物)可以利用常規(guī)方法通過Aic的氨基基團與糖肽偶聯(lián)。嵌合蛋白可以通過重組DNA技術(例如，通過形成編碼融合蛋白的嵌合基因)形成，或通過調(diào)節(jié)因子與第二種肽或蛋白的化學交聯(lián)形成嵌合蛋白。多種化學交聯(lián)制劑在本領域中是已知的(例如，可以通過商業(yè)途徑從Pierce，Rocord IL獲得)。可以選擇化學交聯(lián)制劑，以便允許上述調(diào)節(jié)因子與第二種肽或蛋白的高效偶聯(lián)，并允許隨后對連接基團的水解以釋放具有生物活性的調(diào)節(jié)因子。例如，可以使用基于生物素-親和素的連接系統(tǒng)。
在另一種增強跨BBB轉(zhuǎn)運的途徑中，上述調(diào)節(jié)因子被裝入到載體(carrier vector)中，上述載體介導跨BBB的運送。例如，上述調(diào)節(jié)因子可以被包入到脂質(zhì)體中，如帶正電荷的單層脂質(zhì)體(參見，例如，F(xiàn)aden的PCT Publications WO 88/07851 and WO 88/07852)或被包入到多價的球體中(參見，例如Khan et al.，的美國專利5,413,797；Mathiowitz et al.等人的美國專利5,271,961和Gombotzet al等人的5,019,400)。進而，可以修飾載體以使其定向于跨BBB轉(zhuǎn)運。例如，載體(如脂質(zhì)體)可以用一種分子共價修飾，上述分子能夠被活躍地轉(zhuǎn)運跨過BBB，或者用腦內(nèi)皮細胞受體的配基修飾，如與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合的單克隆抗體(參見，例如，PCTpublication WO91/04014 by Collins and WO 94/01278 by Greiget al.)。
在另一種增強調(diào)節(jié)因子跨BBB轉(zhuǎn)運的途徑中，上述調(diào)節(jié)因子與另一種劑同時給藥，上述劑的功能為透化BBB。這樣的BBB“透化劑”的例子包括緩激肽和緩激肽激活劑(參見，例如，Malroy-Camine的美國專利5,112,596)和Kozarich等人的美國專利5,268,164中所公布的肽化合物。
體外測量上述調(diào)節(jié)因子化合物在腦脊液(CSF)中的穩(wěn)定性的方法，以及在動物模型中測量該調(diào)節(jié)因子化合物的腦吸收程度的方法，可以被用作對該化合物的體內(nèi)效力的預測。測量CSF穩(wěn)定性和腦吸收的適當檢測方法分別在實施例7和8中描述。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物可以被配制成藥用組合物，其中該調(diào)節(jié)因子化合物是唯一的活性化合物或，替代地，該藥用組合物可以含有另加的活性化合物。例如，可以聯(lián)合使用兩種或多種調(diào)節(jié)因子化合物。進而，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物可以與一種或多種其他具有抗淀粉源性特性的劑組合。例如，調(diào)節(jié)因子化合物可以與非特異性的膽堿酯酶抑制劑塔克林(tacrine)(COGNEX，Parke-Dayis)組合。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物作為包裝好的制劑提供。上述包裝好的制劑可以包括盛于容器中的本發(fā)明的藥用組合物并印刷說明書，用本發(fā)明的藥用組合物治療具有與β-淀粉樣變性病相關的疾病，如阿爾茨海默氏病的病人的。VI.使用Aβ調(diào)節(jié)因子的方法本發(fā)明的另一方面涉及改變β-淀粉樣肽的聚集或抑制其活性的方法。在本發(fā)明的方法中，天然β淀粉樣肽與β淀粉樣調(diào)節(jié)因子接觸，以便上述天然β-淀粉樣肽的聚集被改變或該天然β-淀粉樣肽的神經(jīng)毒性被抑制。在一個優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)因子抑制天然β-淀粉樣肽的聚集。在另一個實施方案中，調(diào)節(jié)因子促進天然β淀粉樣肽的聚集。優(yōu)選地，相對于調(diào)節(jié)因子的量而言，摩爾過量的β-AP的聚集在與上述調(diào)節(jié)因子接觸時被改變。
在本發(fā)明的方法中，天然β淀粉樣肽可以與調(diào)節(jié)因子在體內(nèi)或體外接觸。因此，術語“與......接觸”用來包括調(diào)節(jié)因子與天然β-AP制備物在體外接觸以及將上述調(diào)節(jié)因子運送到天然β-AP存在的部位。因為調(diào)節(jié)因子化合物與β-AP相互作用，調(diào)節(jié)因子化合物可以被用于在體內(nèi)或體外探測天然β-AP。因此本發(fā)明調(diào)節(jié)因子化合物的一個用途是作為檢測天然β-AP在生物樣品中或在病人體內(nèi)存在的診斷制劑。進而，利用本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物對天然β-AP的探測可以被用于診斷病人的淀粉樣變性病。此外，由于本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物破壞了β-AP的聚集和抑制了β-AP的神經(jīng)毒性，上述調(diào)節(jié)因子化合物可以被用于治療或預防β-淀粉樣變性病相關的疾病。因此本發(fā)明調(diào)節(jié)因子化合物的另一用途是作為改變天然β-AP聚集和/或神經(jīng)毒性的治療制劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物在體外應用，例如，用于對樣品(例如，生物液體的樣品)中的β-AP進行探測和定量。為了便于探測，可以用可探測的物質(zhì)修飾調(diào)節(jié)因子化合物。用于本方法的天然β-AP的來源可以是，例如，腦脊液的樣品(例如，源自AD病人，和由于家族史而對AD敏感的成人，或正常成人)。將天然β-AP樣品與本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子接觸，并測量β-AP的聚集，例如通過實施例2所描述的檢測方法。然后β-AP樣品的聚集程度可以和β-AP濃度已知的，同樣與調(diào)節(jié)因子接觸的對照樣品的聚集程度進行比較，上述結(jié)果可以用于指示病人是否對β-淀粉樣變性病敏感或具有與β-淀粉樣變性病相關的疾病。而且，可以通過檢測摻入到調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)基團檢測β-AP。例如，利用可探測物質(zhì)(例如，一種酶，如過氧化物酶)標記的鏈親和素或親和素探針可以檢測如本文所描述的摻入生物素的化合物(例如，氨基末端生物素化的β-AP肽)的調(diào)節(jié)因子。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物用于體內(nèi)檢測，并且，如果需要的話，定量病人中的β-AP沉淀，例如，幫助在病人中診斷β淀粉樣變性病。為了便于檢測，調(diào)節(jié)因子化合物可以用可探測的物質(zhì)標記，優(yōu)選地可以在病人體內(nèi)探測的99mTc或放射性碘(在上文進一步描述)。標記的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物被施用于病人，并且經(jīng)過一段充分的時間以允許該調(diào)節(jié)因子在淀粉樣沉淀部位的富集后，通過常規(guī)的影像技術探測標記的調(diào)節(jié)因子化合物?？梢灾苯犹綔y由標記的化合物產(chǎn)生的放射性信號(例如，通過全身計數(shù))，或替代地，放射性信號可以被轉(zhuǎn)化成自顯影圖或計算機掃描上的圖，以允許對病人中的淀粉樣沉積進行成像。利用放射性標記的蛋白對對淀粉樣變性病進行成像的方法在本領域中是已知的。例如，用123I或99mTc標記血清淀粉樣P組分(SAP)已經(jīng)被用于對全身淀粉樣變性病進行成像(參見，例如，Hawkins，P.N.and Pepys，M.B.(1995)Eur.J.Nucl.Med.22595-599)。在各種放射性碘的同位素中，優(yōu)選地123I(半衰期＝13.2小時)被用于全身閃爍圖譜，124I(半衰期＝4天)被用于正電子發(fā)射斷層攝影(PET)。125I(半衰期＝60天)被用于代謝周轉(zhuǎn)研究，131I(半衰期＝8天)被用于全身計數(shù)和延遲低分辨率影像研究。類似于用放射性標記的SAP進行的研究，本發(fā)明的標記的調(diào)節(jié)因子化合物可以以單劑快速濃注的形式，例如含有100μg標記化合物，帶有180MBq放射性的快速濃注，通過適當?shù)耐緩?例如，靜脈內(nèi)，脊柱內(nèi)，腦內(nèi))被輸送到病人。
本發(fā)明提供了探測天然β-淀粉樣肽在生物樣品中存在或不存在的方法，該方法包括將生物樣品與本發(fā)明的化合物接觸，并探測該化合物與天然β-淀粉樣肽的結(jié)合，從而探測天然β-淀粉樣肽在生物樣品中的存在或不存在。在一個實施方案中，β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物和生物樣品在體外接觸。在另一個實施方案中，通過對病人施用β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物而使β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物和生物樣品接觸。對于體內(nèi)給藥，優(yōu)選地該化合物是用放射性锝或放射性碘標記。
本發(fā)明還提供了探測天然β-淀粉樣肽的方法以便于β-淀粉樣原性疾病的診斷，該方法包括將生物樣品與本發(fā)明的化合物接觸并探測與天然β-淀粉樣肽結(jié)合的上述化合物以便于對β-淀粉樣源性疾病的診斷。在一個實施方案中，β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物在體外接觸。在另一個實施方案中，通過對病人施用β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物而使β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物和生物樣品接觸。對于體內(nèi)給藥，優(yōu)選地該化合物是用放射性锝或放射性碘標記。優(yōu)選地，上述方法的應用便于對阿爾茨海默氏疾病的診斷。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了改變天然β-AP聚集或抑制β-AP神經(jīng)毒性的方法，該方法可以用于預防，治療或防止與β-淀粉樣變性病相關的疾病，如阿爾茨海默氏疾病。本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物可以降低天然β-AP的聚集對培養(yǎng)的神經(jīng)細胞的毒性。進而，上述調(diào)節(jié)因子化合物還具有降低預先形成的Aβ纖絲的神經(jīng)毒性的能力。因此，本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子化合物可以被用于已知或防止病人中神經(jīng)毒性Aβ纖絲的形成(例如，在易于發(fā)生β-淀粉樣沉積的病人中進行預防)，并可以被用于在已經(jīng)表現(xiàn)出β-淀粉樣沉積的病人中治療性地逆轉(zhuǎn)β-淀粉樣變性病。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子與病人中的(如，病人的腦脊液或大腦中的)天然β-淀粉樣肽接觸，從而改變天然β-AP的聚集和/或抑制天然β-AP的神經(jīng)毒性。調(diào)節(jié)因子化合物可以單獨施用于病人，或替代地，調(diào)節(jié)化合物可以與其他治療性的活性制劑聯(lián)合使用(例如在部分IV中所討論的)。使用聯(lián)合療法時，上述治療性制劑可以在單一的藥用組合物中一起施用，在獨立的藥用組合物中共同施用，或依次施用。
可以通過任何適當?shù)?，能在病人中有效抑制天然?AP聚集的途徑施用上述調(diào)節(jié)因子，盡管在特定的優(yōu)選方案中該調(diào)節(jié)因子是通過非腸道途徑施用的，該途徑對于病人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是最為優(yōu)選的。CNS施用的可能途徑包括脊椎內(nèi)施用和腦內(nèi)施用(例如腦血管內(nèi)施用)。替代地，該化合物可以，例如，口服施用，腹腔內(nèi)施用，靜脈內(nèi)施用或肌肉內(nèi)施用。對于非-CNS施用途徑，該化合物可以在一種制劑中施用，該制劑允許跨BBB運送。某些調(diào)節(jié)因子可能不經(jīng)任何另加的進一步修飾就可以跨BBB運送，而其它可能需要進一步修飾，如在IV部分中所描述。
將治療化合物運送到病人的CNS的適當適當方式和設施在本領域中是已知的，包括腦血管庫(cerebrovascular reservoirs)(例如，Ommya or Rikker庫；參見，例如，Raney，J.P.et al.(1988)J.Neurosci.Nurs.2023-29；Sundaresan，N.et al.(1989)Oncology 315-22)，鞘內(nèi)運送的導管(例如Port-a-Cath，Y-導管等等；參見例如，Plummer，J.L.(1991)Pain44215-220；Yaksh，T.L.et al.(1986)Pharmacol.Biochem.Behav.25483-485)可注射的胸內(nèi)庫(例如，Sphinalgestic；參見例如，Brazenor，G.A.(1987)Neurosurgey 21484-491)，可植入式灌注泵系統(tǒng)(例如，Infusaid；參見例如，Zierski，J.et al.(1988)Acad Neurochem.Suppl.4394-99；Kanoff，R.B.(1994)J.Am.Osteopath.Assoc.94487-493)和滲透泵(由Alza Corporation銷售)。一種特別優(yōu)選的施用方式是通過可植入式的，可通過外部編程的灌注泵。適當?shù)墓嘧⒈孟到y(tǒng)和庫系統(tǒng)在Blomquist的美國專利5,368,562中和在Doan的美國專利4,731,058中有所描述，由Pharmacia Deltec Inc.開發(fā)。
本發(fā)明的改變β-AP體內(nèi)聚集的方法，尤其是抑制β-AP聚集的方法，可以被用于治療與不正常的β淀粉樣聚集和沉積相關的疾病，從而降低β淀粉樣沉積的速率和/或減少β淀粉樣沉積的程度，從而減輕疾病的進程。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法被用于治療阿爾茨海默氏疾病(例如單個發(fā)生的或家族性的AD，包括表現(xiàn)出AD綜合癥的個體和易于發(fā)生家族性AD的個體)。該方法可以被用于預防或治療其它臨床發(fā)生的β-淀粉樣沉積例如在Down’s綜合癥個體中的沉積和在具有Dutch型淀粉樣變性病(HCHWA-D)的遺傳性腦出血的病人中的沉積。對β-AP聚集的抑制是優(yōu)選的治療方法，但是通過將β-AP捕獲于不導致神經(jīng)損傷的位點，促進β-AP聚集的調(diào)節(jié)因子也可以被用于治療。
此外，在單個發(fā)生的包含體肌炎(IBM)的病理學中涉及β-淀粉樣前體蛋白在肌纖維中的不正常聚集(Askana，V.et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931314-1319；Askanas，V.et al.(1995)Current Opinion in Rheumatology 7486-496)。因此本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子可以被用于治療或預防β-AP，或APP在非神經(jīng)部位的不正常聚集的疾病，例如通過將上述調(diào)節(jié)因子運送到肌纖維而治療IBM。
本發(fā)明在下文的實施例中進一步闡述，這些實施例不應該被認為是限制性的。調(diào)節(jié)因子在檢測實驗中改變天然β-淀粉樣肽聚集和/或抑制天然β-淀粉樣肽神經(jīng)毒性的能力，預示該調(diào)節(jié)因子在體內(nèi)執(zhí)行相同功能。
本發(fā)明在下文的實施例中進一步闡述，這些實施例不應該被認為是限制性的。在本申請的全文中引用的所有參考文獻，專利和發(fā)表的專利申請以及圖都在此引入作為參考。實施例1含有D-氨基酸的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物的制備可以通過固相肽合成，例如利用下文的基于Nα-9-芴基甲氧基羰基(FMOC)的保護策略，制備含D-氨基酸的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子。從2.5毫摩爾的FMOC-Val-Wang樹脂開始，利用4倍過量的保護氨基酸，1-羥基苯并三唑(HOBt)和二異丙基碳二亞胺(DIC)，依次加入各個氨基酸。偶聯(lián)后，根據(jù)茚三酮試驗的測定，如果需要的話進行重偶聯(lián)。每次合成可以最簡單地描述為一次3分鐘去保護(25％哌啶/N-甲基-吡咯烷酮(NMP))，一次15分鐘去保護，5次1分鐘NMP洗滌，一次60分鐘偶聯(lián)循環(huán)，5次NMP洗滌和茚三酮測試。對于N-末端修飾，用N-末端修飾制劑代替FMOC-D-氨基酸并按照以上的方法與700mg完全合成(assemble)的肽-樹脂偶聯(lián)。通過三氟乙酸(TFA)(82.5％)，水(5％)，苯硫基甲烷(5％)，苯酚(5％)，乙硫醇(2.5％)處理2小時將上述肽從樹脂上移走，然后在冷乙醚中將肽沉淀。離心使固相沉淀(2400rpm×10min)，將乙醚倒去。把該固體重新懸浮在乙醚中，沉淀，然后第2次倒去乙醚。將固體溶于10％乙酸中并凍干至干燥。為了進行制備純化和隨后的特征分析，將60mg固體溶于25％乙氰(ACN)/0.1％TFA，并上樣到高效液相層析(HPLC)柱。
替代地，可以通過制造商建立的0.25毫摩爾水平合成的自動化方法，在Rainin PS3肽合成儀上合成含有D-氨基酸的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子。在四倍過量的0.4M N-甲基嗎啉(NMM)/二甲基甲酰胺(DMF)中，用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲陽離子-六氟-磷酸(HBTU)/FMOC-D-氨基酸偶聯(lián)60分鐘。在偶聯(lián)與偶聯(lián)之間，通過與20％哌啶/DMF反應20分鐘將FMOC基團除去。通過95％TFA/水處理將肽移去，并用乙醚沉淀。將沉淀重懸浮于40％乙氰/水懸浮并凍干。需要時用制備性HPLC將上述材料用15％-50％乙氰在Vydac C18層析柱(21-250mm)上層析60分鐘純化。
可以用常規(guī)方法合成各種N-末端修飾的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物。按上述方法在適當?shù)臉渲现苽渫耆Ｗo的、與樹脂結(jié)合的肽以最終得到羧基末端的肽酸。將小部分的各種肽樹脂(例如，13-20μmole)等分到獨立的反應容器中。以常規(guī)的方式，用NMM中的20％哌啶將各個樣品中的N-末端FMOC保護基團除去，隨后用DMF充分洗滌。各個肽樹脂樣品的未保護的N-末端α-氨基基團可以用以下方法中的一種修飾方法A，用含有游離羧基酸基團的修飾制劑偶聯(lián)修飾制劑(五當量)預先溶于NMP，DMSO或這兩種溶劑的混合物。HOBT和DIC(各種制劑的五當量)被添加到溶解的修飾劑中，并將得到的溶液添加到一當量的游離氨基肽樹脂中。偶聯(lián)過夜進行，隨后洗滌。如果在肽樹脂小樣的茚三酮測試表明偶聯(lián)不完全，用1-羥基-7-azabenzotriazole(HOAt)代替HOBt。
方法B，以預活化形式得到修飾制劑的偶聯(lián)修飾制劑(五當量)預先溶于NMP，DMSO或這兩種溶劑的混合物，并被添加到一當量的肽樹脂中。二異丙基乙酰胺(DIEA；六當量)被添加到活化的修飾劑和肽樹脂的懸浮物中。偶聯(lián)過夜進行，隨后洗滌。如果在肽樹脂小樣的茚三酮測試表明偶聯(lián)不完全，重新偶聯(lián)。
第二次偶聯(lián)后(如果需要的話)，N-末端修飾的肽樹脂在減壓的條件下干燥，并如上文所述通過除去側(cè)鏈保護基團將其從樹脂上裂解下來。用分析型的反相HPLC確認在得到的粗肽中存在主要產(chǎn)物，并用Millipore Sep-Pak cartridges或制備型反相HPLC純化。用質(zhì)譜或高場核磁共振譜確認在該產(chǎn)物中存在合乎需要的化合物。
方法C，用溴乙?；闹虚g產(chǎn)物制備N-末端烷基取代的肽用溶于DMF的1，3-二異丙基碳亞胺(DIC)(13當量)可以將樹脂與溴乙酸(12當量)偶聯(lián)。得到的溴乙酰基取代的肽與初級或次級胺反應時可以被修飾，上述初級或次級胺包括甲胺，乙胺丙胺，異丙胺和哌啶。反應在60％的DMSO/DMF中進行，并通常在24小時后完成。
方法D，通過還原烷基化制備N-末端烷基取代的肽將肽溶解于(或部分溶解于)含0-10％甲醇的水中后，其與醛(5-8當量)和氰硼酸鈉(10-16當量)反應。根據(jù)醛的類型和所需要的取代的程度調(diào)整當量數(shù)。用1M的HCl將的到的溶液的pH值調(diào)為2，并在2維持1小時。通過HPLC監(jiān)控反應，并且反應通常在兩小時后完成。在室溫將混合物濃縮并用HPLC純化。
方法E，C-末端修飾用常規(guī)的Fmoc化學在2-氯三苯甲游基樹脂上合成肽，但是最終的D-氨基酸基團的偶聯(lián)是Boc保護的。用8/1/1的二氯甲烷(DCM)/乙酸/三氟甲醇將肽從樹脂上移去，并將混合物濃縮。將殘余的肽溶解于20％乙氰，冰凍并凍干過夜。用1-羥基-7-azobenzotriazole(HOAt)和DIC在堿性條件下(pH＝11，用DIEA調(diào))將BOC粗保護的肽酸與一當量的胺偶聯(lián)。過夜攪拌后反應完成，并用水沉淀肽。與DCM中的25％TFA反應1小時將BOC基團裂解，并用HPLC純化肽。實施例2β-淀粉樣聚集檢測可以用下文描述的聚集檢測方法的一種或兩種，對β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物和天然β-AP混合時調(diào)節(jié)天然β-AP聚集的能力(例如，抑制或促進)進行檢測。用于聚集檢測的天然β-AP(β-AP1-40)可以通過商業(yè)途徑從Bachem(Torrance，CA)獲得。
A. 晶核形成檢測用晶核形成檢測測定待測化合物改變(例如抑制)從單體β-AP形成β-AP纖絲過程的早期事件的能力。成核聚集機制的特征是在晶核形成之前觀察到一個遲滯時間，隨后肽迅速形成纖絲，表現(xiàn)為渾濁度的線性升高。通過光散射(渾濁度)，可以對β-AP單體聚集之前的時間延遲以及形成不溶纖絲的程度進行定量。當最大渾濁度達到一個平臺后聚集達到平衡。通過測量溶液在405nm隨時間的表觀吸收值(A405nm)，確定在有或無各種濃度的β-AP淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物時天然β-AP的渾濁度。測量渾濁度的敏感度閾值在15-20μM β-AP。與無調(diào)節(jié)因子時的渾濁度相比，存在調(diào)節(jié)因子時渾濁度隨時間降低，意味著調(diào)節(jié)因子抑制單體β-AP形成β-AP纖絲。進行上述檢測時可以利用攪拌或搖動以加速聚合，從而提高檢測的速度。此外，可以調(diào)整上述檢測以適合96孔板模式，以便篩選多種化合物。
為了進行晶核形成檢測，首先將Aβ1-40肽溶于HFIP(1，1，1，3，3，3-六氟代-2-丙醇；Aldrich 10，522-8)，濃度為2mg肽/ml，并在室溫溫育30min。HFIP溶解的肽在水浴超聲波儀最高設置值超聲5min，然后在氬氣流下蒸發(fā)至干燥。肽薄膜用無水二甲亞砜(DMSO)重新懸浮，濃度為6.9mg/ml(25×濃度)，如前所述超聲5min，然后通過0.2微米尼龍注射過濾器(VWR cat.No.28196-050)過濾。將待測化合物以100×濃度溶于DMSO。在玻璃瓶中將4體積的溶于DMSO的25×Aβ1-40肽與1體積的溶于DMSO的待測化合物混合，并混勻以便使Aβ肽與待測化合物摩爾比為1∶1。對于不同的摩爾比，在加入Aβ1-40之前將待測化合物用DMSO稀釋，以便使DMSO和Aβ1-40的最終濃度保持恒定。對照樣品中不包含待測化合物。然后將10微升混合物加入到Corning Costar極低結(jié)合96孔板的孔底部(Corning Costar，Cambridge MA；cat.No.2500)。將90微升水加入孔中，將板在旋轉(zhuǎn)搖動儀上以恒定速度在室溫下?lián)u動30秒，在孔中繼續(xù)加入100μl的2×PTL緩沖液(20nM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 7.4)，將板重新?lián)u動30秒，并通過Bio-Rad Model 450Microplate Reader測量在405nm的表觀吸收值從而取得基線(t＝0)渾濁度讀數(shù)。然后將板放回搖動儀并繼續(xù)搖動5小時。在15分鐘的時間間隔取得渾濁度讀數(shù)。
在無任何調(diào)節(jié)因子時，β-淀粉樣聚集導致天然β-AP溶液的渾濁度升高(即，在405nm表觀吸收值隨時間增加)。因此，與無調(diào)節(jié)因子化合物的對照樣品相比，包含有效抑制調(diào)節(jié)因子化合物的溶液顯示出渾濁度降低(即，與對照樣品相比，在405nm表觀吸收值隨時間更小)。
作為用渾濁度對β-淀粉樣聚集進行定量的替代方法，硫黃素T(Th-T)熒光也可以用于在晶核形成檢測中對β-淀粉樣聚集進行定量(用于定量β-淀粉樣聚集的Th-T熒光在下文晶種延伸檢測中有進一步的描述)。
B.纖絲結(jié)合檢測纖絲結(jié)合檢測需要以下材料Millipore多槽過濾裝置(Millipore multifilter apparatus)；12×75玻璃管；GF/F25mm玻璃濾膜；4℃的PBS/0.1％吐溫20(PBST)；Aβ纖絲；放射性化合物；非放射性化合物；帶加樣頭的Eppendorf重復加樣器；標簽；鑷子；以及真空吸塵器。
在該檢測中，每個樣品以一式三份進行。首先，大約在8天前制備“老化的”Aβ纖絲，上述老化是通過將1ml的一小份溶于4％DMSO/PBS溶液中的200μM Aβ1-40肽在37℃搖動8天進行的。上述“老化的”Aβ肽可以直接在細胞上檢測或在-80℃冷凍。
用PBST稀釋上述200μM的Aβ纖絲以得到4μM的溶液(用PBST將320μl稀釋到16ml)。用重復加樣器在每管加入上述溶液的100μL的小樣。
本發(fā)明β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物的2μM-200fM稀釋液的制備如下用DMSO 1∶3稀釋5mM的儲存液以得到1.667的儲存液(用400μlDMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋1.667mM的儲存液以得到0.5556的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋555.556μM的儲存液以得到185.19的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋185.185μM的儲存液以得到61.728的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋61.728μM的儲存液以得到20.576的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋20.576μM的儲存液以得到6.8587的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋6.859μM的儲存液以得到2.2862的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋2.286μM的儲存液以得到0.7621的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋762.079nM的儲存液以得到254.03的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋254.026nM的儲存液以得到84.675的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋84.675nM的儲存液以得到28.225的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋28.225nM的儲存液以得到9.4084的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋9.408nM的儲存液以得到3.1361的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋3.136nM的儲存液以得到1.0454的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋1.045nM的儲存液以得到0.3485的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋348.459pM的儲存液以得到116.15的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用DMSO 1∶3稀釋116.153pM的儲存液以得到38.718的儲存液(用400μl DMSO稀釋200μl)。
用PBST 1∶25稀釋185.185μM的儲存液以得到7.4074的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋61.728μM的儲存液以得到2.4691的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋20.576μM的儲存液以得到0.823的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋6.859μM的儲存液以得到0.2943的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋2.286μM的儲存液以得到0.0914的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋762.079nM的儲存液以得到30.483的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋254.026nM的儲存液以得到10.161的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋84.675nM的儲存液以得到3.387的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋28.225nM的儲存液以得到1.129的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋9.408nM的儲存液以得到0.3763的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋3.136nM的儲存液以得到0.1254的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋1.045nM的儲存液以得到0.0418的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋348.459pM的儲存液以得到13.938的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
用PBST 1∶25稀釋116.153pM的儲存液以得到4.6461的儲存液(用1.2ml PBST稀釋50μl)。
然后將β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物(200μl)加入到含有Aβ纖絲的合適的管中。
按照常規(guī)的放射性安全方法配制放射性標記的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物，用PBS/0.1％吐溫-20溶液稀釋以使最終濃度為20,000dpm每100μL。用重復加樣器在每管中加入100μL小樣的放射性標記的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物。上述樣品用Parafilm膜覆蓋并在塑料放射性袋中37℃溫育過夜。
為了過濾樣品，預先用小體積的PBST浸濕濾器。按照制造商的說明，在兩個Millipore多槽過濾裝置每個過濾槽裝上GF/F濾膜。將上述樣品從37℃溫育中取出并且利用小體積(～5ml)的冷PBST緩沖液過濾。然后用另外兩個5mL體積的冷PBST緩沖液洗滌樣品管。在最后一次加入樣品后，允許真空抽氣大約2分鐘將濾膜抽至半干燥，并將濾膜轉(zhuǎn)移到標記的、用于碘記數(shù)(iodination counting)的管中。記錄1分鐘的計數(shù)，數(shù)據(jù)繪制成圖，并按照制造商的說明用Prism程序(圖PAD)分析上述圖。
C.晶種延伸檢測可以用晶種延伸檢測測定Aβ單體溶液中，加入多聚Aβ纖維“晶種”后Aβ纖維形成的速率。待測化合物防止單體Aβ進一步沉積到先前已沉積的淀粉樣物質(zhì)的能力，是通過利用熒光直接指示β-片形成而測定的。與晶核形成檢測對比，晶種的添加使得晶核立即形成，并且預先形成的纖絲不需要持續(xù)混合即可繼續(xù)生長，因此在開始聚合之前無滯后時間。由于上述檢測利用穩(wěn)態(tài)聚合條件，可以在此第二檢測中在不同的條件下，和在加入另加的淀粉樣結(jié)構探針的條件下，對陽性化合物在晶核形成檢測中的活性進行確認。
在晶種延伸檢測中，單體Aβ1-40在存在“晶種”核心的條件下溫育(在控制的穩(wěn)態(tài)條件下，大約允許百分之十摩爾的Aβ聚合)。然后將溶液的樣品用硫代四羥酮醇(thioflavin)T(Th-T)稀釋。Th-T與Aβ的聚合體特異性的結(jié)合產(chǎn)生一種熒光復合物，使得纖絲形成程度的測量成為可能(Levine，H(1993)Protein Science2404-410)。具體而言，Th-T與聚集的β-AP的結(jié)合，而不是與單體的或松散結(jié)合的β-AP的結(jié)合，產(chǎn)生一個450nm(ex)的新激發(fā)峰，并增強了482nm(em)的發(fā)射，而與之相比游離染料分別為385(ex)和445(em)。將含有足量纖絲的聚集樣品的小樣與Th-T混合，使得通過重復取樣檢測反應混合物成為可能。在過量單體存在下觀察線性增長曲線。對硫代四羥酮醇T響應的β-片纖絲的形成與晶核形成檢測中觀察到的渾濁度的升高相平行。
用于晶種延伸檢測的Aβ單體溶液的是通過在1/25體積的二甲亞砜(DMSO)中溶解適當量的Aβ肽而制備，然后加入1/2體積的水和1/2體積的2×PBS(10×PBSNaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na2HPO4·7H2O4.3mM，KH2PO41.4mM pH 7.2)使最終濃度為200μM。為了制備晶種儲存液，將1ml的Aβ單體制備物在37℃溫育8天并依次通過18，23，26和30號的針頭分別25，25，50和100次以進行剪切。通過30號針頭每50次后取出2μl剪切材料的樣品進行熒光測量，直到達到熒光單位(FU)平臺。待測化合物的配制是通過將適當量的待測化合物溶于1×PBS中，使終濃度達到1mM(10×儲存液)。如果不溶的話，上述化合物被溶于1/10體積的DMSO中并用1×PBS稀釋至1mM。進一步配制1/10稀釋液，以測試每種供選化合物在100μM和10μM的作用。
為了進行晶種延伸檢測，每種樣品被設置成50μl的200μM單體，125FU的剪切晶種(依賴于晶種的批次的一個可變量，通常為3-6μl)和10μl的10×調(diào)節(jié)因子溶液。然后用1×PBS將樣品體積調(diào)到100μl的終體積。通常測試每種調(diào)節(jié)因子的兩個濃度100μM和10μM，相當于單體和調(diào)節(jié)因子的摩爾比為1∶1和1∶10。對照試驗包括未加晶種的反應以確認新鮮的單體不含有晶種，以及在無任何調(diào)節(jié)因子的加入晶種的反應，作為與待選調(diào)節(jié)因子比較的參照。檢測時在37℃溫育6小時，每小時取出2μl樣品進行熒光測量。為了測量熒光，2μl的Aβ樣品被加入到400μl的硫代四羥酮醇-T溶液(50mM磷酸鉀，10mM硫代四羥酮醇-T，pH 7.5)。樣品用旋渦混合器混合后，在0.5ml的微量石英比色皿中讀取EX450nm和EM482nm的數(shù)值(Hitachi4500熒光計)。
β-淀粉樣聚集導致硫代四羥酮醇-T的發(fā)射增強。因此，含有有效抑制性調(diào)節(jié)因子化合物的樣品，表現(xiàn)為與無上述調(diào)節(jié)因子化合物的樣品相比發(fā)射降低。實施例3β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物的分析在本實施例中，配制了在此描述的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物并利用實施例2中所描述的聚集檢測測試了它們抑制天然β-淀粉樣肽聚集的能力。第一系列實驗的結(jié)果在下文的表1，II和III中總結(jié)。
表II(續(xù))
*晶核形成檢測數(shù)據(jù)的平均數(shù)是在2.5，1.25和0.6μM化合物測量得到的在晶核形成檢測中用5μM Aβ1-40和5μM，1.25μM，3μM，1μM或0.3μM待測化合物對上述調(diào)節(jié)因子化合物進行評測。延遲時間上的改變(Δlag)表示為在存在待測化合物(5μM，2.5μM，1.25μM，3μM，1μM或0.3μM)時觀察到的延遲時間和對照的延遲時間的比率。
表III
表III(續(xù))
(nvl)＝D-正纈氨酸
(nle)＝D-正亮氨酸[3-I]y＝3-碘-D-酪氨酸p-F]f＝對-氟-D-苯丙氨酸PPI-1801是文獻中報道的H-LPFFD-OH的乙酰胺類似物。配制上述化合物并測試其活性以進行比較。結(jié)果表明在本文所用的檢測中，上述化合物與纖絲的結(jié)合很弱。
與之相比，表I，II，III所顯示的結(jié)果以及圖2表明本發(fā)明的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子是Aβ聚集的有效抑制劑。
實施例6神經(jīng)毒性檢測利用大鼠或人的神經(jīng)元來源的細胞系(分別為PC-12細胞或NT-2細胞)和活性指示劑3，(4，4-二甲基噻唑-基)2，5-二苯基-四唑溴化物(MTT)，可以在基于活細胞的檢測中，在有或無β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子的條件下對天然β-淀粉樣肽聚集的神經(jīng)毒性進行檢測(類似的基于細胞的活性檢測的描述參見，例如，Shearman，M.S.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911470-1474；Hansen，M.B.et al.(1989)J.Immun.Methods 119203-210)。PC-12是一種大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系，可以從美國典型培養(yǎng)物保存中心，Rockville，MD(ATCC CRL 1721)獲得。MTT(可以通過商業(yè)途徑從Sigma Chemical Co.獲得)是生色的底物，在活細胞中它從黃色被轉(zhuǎn)化成藍色，可以通過分光光度法探測。
為了檢測天然β-淀粉樣肽的神經(jīng)毒性，首先配制新鮮的Aβ單體和老化的Aβ聚集物。從凍干的粉末中配制溶于100％DMSO的Aβ1-40并立即用H2O稀釋到終體積的一半，然后用終體積一半的2×PBS稀釋，以便得到最終濃度為200μM的肽，4％DMSO。用這種方式配制并立即在細胞上測試的肽被稱為“新鮮”的Aβ單體。為了配制“老化”的Aβ聚集物，將肽溶液置于1.5ml的Eppendorf管中并在37℃溫育八天以使得纖絲形成。這樣“老化的”Aβ肽可以直接在細胞上測試或在-80℃冷凍。利用PC12和NT2細胞檢測新鮮單體和老化聚集物神經(jīng)毒性。PC12細胞通常在Dullbecco’s修正的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)，上述培養(yǎng)基含有10％的馬血清，5％胎牛血清，4mM谷氨酸鹽，和1％慶大霉素。NT2細胞通常在用10％胎牛血清，2mM谷氨酸鹽和1％慶大霉素補充的OPTI-MEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL CAT.#31985)中培養(yǎng)。在處理之前3-4小時將每孔10-15,000細胞放入96孔組織培養(yǎng)板中，每孔90μl的新鮮培養(yǎng)基。然后用組織培養(yǎng)基1∶10直接稀釋新鮮或老化的Aβ肽溶液(10μl)，以便使最終濃度在1-10μM肽之間。細胞在含有肽的條件下37℃溫育48小時，不更換培養(yǎng)基。在細胞暴露于β-AP制備物的最后3小時，在培養(yǎng)基中加入MTT以使最終濃度為1mg/ml并在37℃繼續(xù)溫育。在與MTT溫育2小時后，去除培養(yǎng)基并且將細胞在100μL異丙醇/0.4N HCl中振動使之裂解。在每孔中加入等體積的PBS并將板繼續(xù)振動10分鐘。利用微量板讀數(shù)儀在570nm測量每孔的吸收，以測定活細胞數(shù)量。
利用上述檢測，確認了單獨的老化(5到8天)Aβ1-40聚集物，而不是單獨的新鮮Aβ1-40單體，的神經(jīng)毒性。實驗表明將神經(jīng)細胞與漸增的新鮮Aβ1-40溫育對細胞無顯著的毒性，而將神經(jīng)細胞與漸增的5天或8天Aβ1-40聚集物的溫育導致漸增的神經(jīng)毒性。老化的Aβ1-40聚集物對于PC12細胞和NT2細胞的毒性的EC50都是1-2μM。
為了確定β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物對Aβ1-40聚集物的神經(jīng)毒性的影響，調(diào)節(jié)因子化合物與Aβ1-40單體在如實施例2所描述的常規(guī)晶核檢測條件下預先溫育，并且在溫育后特定的時間間隔取出β-AP/調(diào)節(jié)因子溶液的小樣，并且1)評估溶液的渾濁度作為對聚集的測量以及2)將溶液加入到培養(yǎng)的神經(jīng)細胞中48小時，在該時間利用MTT評估細胞的生存能力以確定溶液的神經(jīng)毒性。另外，可以檢測β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物減少預先形成的Aβ1-40聚集物的神經(jīng)毒性的能力。在這些實驗中，在無任何調(diào)節(jié)因子的條件下溫育單體預先形成Aβ1-40聚集物。然后將調(diào)節(jié)因子化合物與預先形成的Aβ1-40聚集物在37℃溫育24小時，之后收集β-AP/調(diào)節(jié)因子溶液并且如上文所述評定其神經(jīng)毒性。
實施例7檢測調(diào)節(jié)因子化合物在腦脊液中穩(wěn)定性調(diào)節(jié)因子化合物在腦脊液中的穩(wěn)定性可以通過下文所述的體外檢測進行檢測。制備含有75％恒河猴CSF(可通過商業(yè)途徑從Northern Biomedical Research獲得)，23％無菌磷酸鹽緩沖液和2％二甲亞砜(v/v)(Aldrich Chemical Co.，Catalog No.27，685-5)的CSF溶液。將待測調(diào)節(jié)因子化合物加入到CSF溶液中以使最終濃度為40μM或15μM。所有的樣品處理都是在層流罩(laminarflow hood)中進行，并且在檢測中待測溶液維持在37℃。24小時后，通過加入終濃度為25％(v/v)的乙腈而抑制溶液的酶活性。用反相型HPLC在室溫下分析樣品(在0時間點和24小時時間點)。使用微孔柱子以達到最大的靈敏度。用于分析型HPLC的參數(shù)如下溶劑系統(tǒng)A0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液(v/v)B0.085％TFA/乙腈，1％H2O(v/v)注射和梯度注射100-250μL的待測樣品運行10％的B 5min.，然后10-70％B大于60min。
利用Hewlett Packard 1090系列II HPLC進行色譜分析。用于分離的柱子是C4，5μm，1×250mm(Vydac#214TP51)。流動速率是50μL/min并且在214，230，260和280nm監(jiān)測待測化合物的洗脫情況。
實施例8腦提取檢測對大鼠進行靜脈給藥后，測定了我們的Aβ衍生肽的腦水平。在開他敏/甲苯噻嗪麻醉下，通過插入在左頸靜脈中的導管使雄性Sprague-Dawley鼠(219-302g)接受靜脈注射(4mL/kg的劑量體積施用1分鐘以上)。每種測試化合物的實際施用劑量列在

圖1中。
在給藥后60分鐘，將導管插入左頸主動脈以便能夠進行左前腦的灌注從而去除腦血液。如(Triguero et al.(1990)J.Neurochem.541882-1888)所描述由于毛細血管損耗(capillary depletion)左前腦血液被排空。這種確立的技術將腦脈管系統(tǒng)從軟組織中分離出來，并因此，允許精確測定研究中的化合物穿過血腦屏障的濃度，。通過LC/MS/MS測定了存在于腦中的親本化合物的量。
上述檢測被用于測量腦對以下調(diào)節(jié)因子的吸收化合物 劑量PPI 結(jié)構 分子量 濃度mg/kg(mg/mL) IV1324TFA.H-(l-[F5]f-fvl)-NH28411.204.91318TFA.H-(lf-D-Cha-vl)-NH27570.291.01319TFA.H-(lf-[p-F]f-vl)-NH27691.706.61327TFA.H-(l-[p-F]f-[p-F]f-vl)-NH27870.984.01301TFA.H-(lvf-D-Cha-l)-NH27570.702.91302TFA.H-(lvf-[p-F]f-l)-NH27690.190.71328TFA.H-(l-[F5]f-[F5]f-vl)-NH29310.291.21322TFA.H-(l-D-Cha-fvl)-NH27570.030.11303TFA.H-(lvf-[F5]f-l)-NH28410.271.01326TFA.H-(l-D-Cha-D-Cha-vl)- 7630.050.2NH21320TFA.H-(lf-[F5]f-vl)-NH28410.703.0*小寫字母注釋指D-構型結(jié)果總結(jié)于圖1中。本文所描述的β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物在下面的表格中總結(jié)。
表IV
對等實施例本領域的技術人員將認識到，或僅僅利用常規(guī)實驗就能確認本文所描述的本發(fā)明的特定實施方案的許多對等實施例。上述的對等實施例將被包括在下面的權利要求中。
序列表<110>Praecis Pharmaceuticals，Inc.<120>MODULATORS OF β-淀粉樣肽聚集調(diào)節(jié)分子<130>PPI-068CPPC<140>PCT/US00/05574<141>2000-03-03<150>USSN 60/122,736<151>1999-03-04<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>43<212>PRT<213>Homo sapiens<214>智人<400>1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Het Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr35 40<210>2<211>103<212>PRT<213>Homo sapiens<214>智人<400>2Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val1 5 10 15His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 25 30Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val35 40 45Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile50 55 60His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg65 70 75 80His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr GLu Asn Pro Thr Tyr Lys85 90 95Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn100<210>3<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列的描述淀粉樣沉積抑制肽<400>3Leu Val Phe Phe<210>4<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列的描述淀粉樣沉積抑制肽<400>4Leu Val Phe Phe Ala1 權利要求
1.一種含有以下結(jié)構的化合物 其中Xaa1和Xaa2各為D-氨基酸結(jié)構，并且Xaa1和Xaa2中至少兩個獨立地選自D-亮氨酸結(jié)構，D-苯丙氨酸結(jié)構，D-酪氨酸結(jié)構，D-碘酪氨酸結(jié)構，D-賴氨酸結(jié)構或D-纈氨酸結(jié)構；NH-NH是肼結(jié)構；Y，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)a的結(jié)構，其中，Xaa是任何D-氨基酸結(jié)構并且a為1-15的整數(shù)；Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’，可以存在或不存在，各為D-氨基酸或L-氨基酸結(jié)構并且Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’中至少有兩個獨立地選自D-或L-亮氨酸結(jié)構，D-或L-苯丙氨酸結(jié)構，D-或L-酪氨酸結(jié)構，D-或L-碘酪氨酸結(jié)構，D-或L-賴氨酸結(jié)構或D-或L-纈氨酸結(jié)構；Z，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)b的結(jié)構，其中，Xaa是任何D-氨基酸結(jié)構并且b為1-15的整數(shù)；A，可以存在或不存在，它是直接或間接與化合物連接的修飾基團；并且n為1-15的整數(shù)；其中，對Xaa1，Xaa2，Xaa1’，Xaa2’，Xaa3’，Y，Z，A和n進行選擇，以便當所述的化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時，該化合物與β-淀粉樣肽結(jié)合或調(diào)節(jié)天然β-淀粉樣肽的聚集或抑制其神經(jīng)毒性，并且該化合物更不易于被代謝。
2.一種含有如下結(jié)構的化合物，該結(jié)構選自H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-COCH3；and H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
3.一種含有如下結(jié)構的化合物 其中，Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4各為D-氨基酸結(jié)構，并且Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4中至少有兩個獨立地選自D-亮氨酸結(jié)構，D-環(huán)己基丙氨酸，D-4-氟苯丙氨酸(對-氟苯丙氨酸)，D-五氟苯丙氨酸，氯苯丙氨酸，溴苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，D-高苯丙氨酸，D-賴氨酸，和D-纈氨酸結(jié)構；Y，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)a的結(jié)構，其中，Xaa是任何D-氨基酸結(jié)構并且a為1-15的整數(shù)；Z，可以存在或不存在，它是具有公式(Xaa)b的結(jié)構，其中，Xaa是任何D-氨基酸結(jié)構并且b為1-15的整數(shù)；A，可以存在或不存在，它是直接或間接與所述的化合物連接的修飾基團；并且n為1-15的整數(shù)；其中，對Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Y，Z，A和n進行選擇，以便當所述的化合物與天然β-淀粉樣肽接觸時，該化合物與天然β-淀粉樣肽結(jié)合或調(diào)節(jié)天然β-淀粉樣肽的聚集或抑制其神經(jīng)毒性，并且該化合物更不易于被代謝。
4.一種含有如下結(jié)構的化合物，該結(jié)構選自N，N-二甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-異丙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-異丙酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-二甲酰胺；N，N-二乙基-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-乙基-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；N-乙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N-丙基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；N，N-二乙基-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-)-NH2；H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2；1-哌啶-乙酰-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；1-哌啶-乙酰-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-異丙酰胺；H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-異丙酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-甲酰胺；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2；H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2；N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH；H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-COCH3；和H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
5.一種具有結(jié)構化合物H-(D-Leu-D-Phe-[p-F]D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2.
6.一種具有結(jié)構化合物N-甲基-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2
7.一種藥用組合物，其含有權利要求1，2，3，4，5或6任何一項中的治療有效量的化合物以及藥用上可接受的載體。
8.一種抑制天然β-淀粉樣肽聚集的方法，該方法包括將天然β-淀粉樣肽與權利要求1，2，3，4，5，或6任何一項中的化合物接觸，以便抑制天然β-淀粉樣肽的聚集。
9.一種在生物樣品中檢測天然β-淀粉樣肽存在與否的方法，該方法包括將生物樣品與任何權利要求1，2，3，4，5，或6的化合物接觸，其中上述化合物用可探測的物質(zhì)標記；并且檢測化合物與天然β-淀粉樣肽的結(jié)合從而檢測生物樣品中天然β-淀粉樣肽存在與否。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物和生物樣品是在體外接觸。
11.根據(jù)權利要求9的方法，其中通過在病人中施用β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物將β-淀粉樣調(diào)節(jié)因子化合物與生物樣品接觸。
12.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述的化合物用放射性锝或放射性碘標記。
13.一種治療具有與β-淀粉樣變性病相關病癥的病人的方法，包括在病人中施用任何權利要求1，2，3，4，5，或6的化合物的治療有效量，以便治療與具有β-淀粉樣變性病相關病癥的病人。
14.根據(jù)權利要求13的方法，其中所述病癥是阿爾茨海默氏病。
全文摘要
提供了調(diào)節(jié)天然β－淀粉樣肽聚集的化合物。本發(fā)明的調(diào)節(jié)因子含有一種肽,上述肽優(yōu)選地基于β－淀粉樣肽,完全由D－氨基酸組成。優(yōu)選地,該肽含有3－5個D－氨基酸殘基,并包括至少兩個獨立地選自D－亮氨酸,D－苯丙氨酸和D－纈氨酸的氨基酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中,該肽是β－淀粉樣肽的逆反異構體(Retro－Inverso Isomer),優(yōu)選地為Aβ
文檔編號C07K7/06GK1362967SQ00807192
公開日2002年8月7日 申請日期2000年3月3日 優(yōu)先權日1999年3月4日
發(fā)明者M·A·芬戴斯, K·菲利普斯, G·L·奧爾森, C·塞爾夫 申請人:普雷西斯藥品公司