專利名稱：全身給藥的鎮(zhèn)痛方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用河豚毒素及蛤蚌毒素一類的鈉離子通道阻斷劑全身給藥方式的鎮(zhèn)痛方法，適應(yīng)癥包括但不限于癌癥疼痛，可以應(yīng)用于機械、化學(xué)、或缺血的刺激或者發(fā)炎而導(dǎo)致的疼痛，以及神經(jīng)損傷性疼痛。
疼痛是一種患者自覺受到傷害的感覺。疼痛是與發(fā)炎，缺血，機械或其它刺激所致的實際或潛在的損傷以及組織受損相關(guān)連的。它可以是急性的或者慢性的，而且除了病人自己，第三者是無法給于準(zhǔn)確貼切的描述或界定的。
相對于不同強度的疼痛，世界衛(wèi)生組織推薦三級階梯止痛方法如下
1.使用非鴉片類的鎮(zhèn)痛藥，例如非類固醇的消炎鎮(zhèn)痛藥(NSAIDS)，可以使
用或者不使用協(xié)同鎮(zhèn)痛藥；
2.如果疼痛持續(xù)或增加到中等強度，可以使用低效力的鴉片類鎮(zhèn)痛藥，同時可
以使用協(xié)同鎮(zhèn)痛藥；
3.如果疼痛仍持續(xù)或增加到高強度，可以使用低效力的鴉片類鎮(zhèn)痛藥，同時可
以使用或者不使用非鴉片類的協(xié)同鎮(zhèn)痛藥。
可以看出，對中度到重度疼痛目前常用鴉片類鎮(zhèn)痛藥。但是醫(yī)療界向來對使用此類鎮(zhèn)痛藥有所爭議，因為它們是具有藥物成癮性的。
癌痛是眾所周知的一種非常常見的臨床癥狀，癌痛不僅嚴(yán)重地影響癌癥病人的生活和情緒，也對其家人帶來嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的治療方法是按WHO三級階梯止痛方法，對中、重度癌痛病人使用阿片類藥物，同時可配合應(yīng)用鎮(zhèn)痛輔助藥，如安眠、鎮(zhèn)靜劑以增強鎮(zhèn)痛藥的療效。這種傳統(tǒng)的方法雖然能達到鎮(zhèn)痛目的，但其缺點十分突出，其主要缺點是容易使病人產(chǎn)生耐藥性，使鎮(zhèn)痛時間縮短，用藥劑量逐漸加大，長期使用，使機體產(chǎn)生藥物依賴性，導(dǎo)致病人遭受藥物依賴的痛苦。很多病人還因擔(dān)心產(chǎn)生阿片類藥物依賴，不愿使用阿片類藥物，使其病痛無法緩解，更有很多癌痛病人因使用阿片類藥物，對治愈癌痛失去信心，用大量阿片類藥物麻醉自己，而導(dǎo)致阿片類藥物中毒死亡。
在臨床工作中如何尋到一種更新更好，即能有效鎮(zhèn)痛特別是長效鎮(zhèn)痛又不產(chǎn)生藥物耐受和藥物依賴性的新型鎮(zhèn)痛藥就成為現(xiàn)代醫(yī)務(wù)工作者的重要任務(wù)之一，這也是從根本上提高癌痛和其它疼痛病人生活質(zhì)量的需要。
作為現(xiàn)有技術(shù)，曾有報道用鈉通道阻斷劑例如利多卡因、卡馬西平，在低于阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)的濃度時即可消除外周神經(jīng)損傷的異常電活性，并在臨床上成功地消除神經(jīng)病痛和三叉神經(jīng)痛(Chard等，1989；Denos等，1992；Sotsin等，1992、1994)。然而之后的報道(竺心影，1996)，卡馬西平對肝功能有嚴(yán)重?fù)p害，妊娠初期及哺乳期婦女禁用；青光眼、嚴(yán)重心血管病癥和老年人要謹(jǐn)慎使用。利多卡因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)有興奮作用，易出現(xiàn)震顫、寒戰(zhàn)、陣發(fā)性驚厥，因此，我們認(rèn)為這兩種藥物很難作為一種新型鎮(zhèn)痛藥在臨床推廣使用，只能做為工具藥使用。該報道僅僅初步表明鈉離子阻斷劑與鎮(zhèn)痛有一定關(guān)系，鈉通道阻斷劑可能成為開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物的發(fā)展方向。但是要真正在有效長期鎮(zhèn)痛上取得突破，還得密切留意鎮(zhèn)痛機理上的不斷進展。
為此我們注意到Rabert等在1998年的報道，大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)有兩種TTX的鈉通道一種是TTX敏感通道(TTX-S)TTX阻斷其開放的IC50為1-20μM；另一種是TTX非常不敏感通道(TTX-R)TTX阻斷其開放IC50為100μM左右。人DRG感覺神經(jīng)元有TTX-S為hPN1，TTX-R為hPN3，TTX阻斷hPN3開放的IC50為80μM左右。Rabert用電生理學(xué)方法檢測哺乳動物鈉通道有兩種類型鈉電流一種是TTX-S快速失活的敏感鈉電流(TTX-SINA)一種是TTX-R緩慢失活的不敏感鈉電流(TTX-RINa)因此疼痛狀態(tài)下痛感受器的敏感化是通過TTX-R的Na+通道介導(dǎo)的，也就是在疼痛條件下(Gold，1996)增痛劑在使痛感受器敏感性增強的同時，也增加TTX-R通道的活性。
(Zapata，1997)用TTX 100-300μg進行的離體大鼠DRG一次性使用的結(jié)果，ENA受抑制的時間僅為10分鐘以上。此時，僅TTX-S與TTX發(fā)生生理藥理效應(yīng)而沒有TTX-R參與。因此這個過程中只有TTX-SINA參與，沒有TTX-RINa參與，所以，這個鎮(zhèn)痛過程肯定是非常短暫的。
在離體的條件下，其結(jié)果僅是一條DRG或DH本身的鈉通道變化，在這種條件下，只有TTX-S能與TTX發(fā)生生理藥理反應(yīng)，TTX-SINa引起的變化是很短暫的(約10分鐘以上)在這類反應(yīng)中沒有增痛劑活化TTX-R，所以沒有觀察到TTX-R對鎮(zhèn)痛的貢獻?，F(xiàn)在根據(jù)我們動物研究和臨床治療癌痛病例的觀察結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在使用TTX60μg/天，連續(xù)用藥三天，累計用藥量為180μg/3d，停藥后，產(chǎn)生連續(xù)長效鎮(zhèn)痛的治療效果是由于在這個TTX用藥量和3天的療程內(nèi)，TTX不僅與TTX-S發(fā)生生理藥理效應(yīng)，而且與活化的TTX-R充分地發(fā)生生理藥理效應(yīng)，具體地說，可以認(rèn)為在癌痛的條件下，致痛因素在使痛感受器敏感性增加的同時，也增加了TTX-R的活性，從而使TTX-R對TTX更敏感，TTX180μg/3d使TTX-R發(fā)生更有利于抑制痛感受器敏感性的變化，主要是使TTX-R的Hpn3阻斷增加，TTX-RINa也長期減少，從而抑制了痛感受器的敏感性。使之不感受病變部位產(chǎn)生的疼痛刺激，最終發(fā)揮長期鎮(zhèn)痛的作用，而且TTX-R受致痛因素的作用活化后，對TTX的反復(fù)刺激不產(chǎn)生耐受性和藥物依賴性，因此在動物(小鼠、大鼠、猴)的研究和癌痛病人的臨床治療均未出現(xiàn)藥物耐受和藥物依賴現(xiàn)象。注致痛因素增痛劑(前列腺素E2、腺苷、5-羥色胺)TTX-RINa緩慢失活的TTX敏感電流TTX-R對TTX非常不敏感的鈉離子通道TTX-R開放的IC50為對TTX非常不敏感的鈉離子通道面積TTX-S對TTX敏感的鈉通道TTX-SINA快速失活的TTX敏感電流“+”興奮作用“-”抑制作用
鑒于上述的事實，我們做出了本發(fā)明。通過全身給藥的方式，我們選用的鈉離子通道阻斷劑河豚毒素的制劑可以有效地緩解多種物理化學(xué)原因造成的疼痛，包括頑固而嚴(yán)重的癌癥疼痛，而且療效持續(xù)時間可以達到15-30天，大大超過目前最好的鴉片類鎮(zhèn)痛藥，卻又不會使病人產(chǎn)生藥物依賴或成癮。臨床觀察表明，我們發(fā)明的方法對多種癌癥都有確實的療效。
河豚毒素可以對急性或慢性疼痛都產(chǎn)生治療作用。動物試驗表明，河豚毒素對各種刺激尤其是化學(xué)刺激引發(fā)的急性疼痛的鎮(zhèn)痛作用能夠大大超過阿斯匹靈、嗎啡、哌替啶等臨床常用的鎮(zhèn)痛藥。
在急性毒性、慢性毒性、生殖毒性、遺傳變異毒性、局部毒性、一般藥理、藥物過敏性以及藥物依賴性等大量的試驗中發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明劑量范圍內(nèi)對河豚毒素的使用是安全的，不會產(chǎn)生明顯的或者是不可逆轉(zhuǎn)的毒副作用。
本發(fā)明的方法包括向感受的疼痛的哺乳動物，配合醫(yī)藥上適當(dāng)?shù)妮d體溶液，利用肌肉注射等方式全身給予有效劑量的鈉離子通道阻斷劑，從而緩解疼痛。對人的劑量的范圍在每公斤體重0.1-5μg/kg。一個療程包括在三天時間內(nèi)每天給藥不多于4次。療效常?？梢猿掷m(xù)到20天。
所用河豚毒素的濃度為96％或者更高。
上述的動物實驗和臨床研究均證明了該項研究結(jié)果完全不同于此前有關(guān)TTX的所有鎮(zhèn)痛試驗，其主要不同點
1、已往的TTX鎮(zhèn)痛動物研究均為一次性用藥。
2、已往的TTX鎮(zhèn)痛的人體研究均為一次性局部用藥。
3、已往的TTX鎮(zhèn)痛研究均為局部短時鎮(zhèn)痛(均不超過24小時)
4、已往的研究TTX對人鎮(zhèn)痛多為粘膜、角膜或淺部神經(jīng)痛。
5、本項專利是反復(fù)使用TTX肌注對人進行長期鎮(zhèn)痛。
6、本項專利中TTX對大鼠、猴和人的鎮(zhèn)痛特點是療程短，鎮(zhèn)痛時間長(15～30
天)。
7、本項專利是TTX對人的機體內(nèi)部深處臟器疼痛和癌痛進行長期鎮(zhèn)痛治療。
8、用TTX治療長期病痛包括但不局限于惡性或良性腫瘤)，對其他感覺、觸、
視、聽覺)無影響，保持意識清醒的狀態(tài)下，達到機體不感覺疼痛的治療作
用。
9、TTX治療長期病痛(包括但不局限于惡性或良性腫瘤)，均在機體處于清醒
無麻醉的條件下，發(fā)揮其長效鎮(zhèn)痛的治療效果，與用麻醉鎮(zhèn)痛有本質(zhì)區(qū)別。
10、TTX在治療各種疼痛的劑量范圍內(nèi)無特殊的明顯副作用。
11、本項專利涉及TTX反復(fù)使用不產(chǎn)生藥物耐受和藥物依
賴。實施例1 制劑河豚毒素純品由廣西南寧楓葉藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，其純度按以下方法測定儀器及試劑
儀器美國Beckman高效液相色譜儀(包括125泵，166可變波長檢測器，Gold
Nouvean色譜工作站)
藥品替曲朵辛由本公司精制，其對照品由本公司提供。
試劑庚烷磺酸鈉，日本東京化成工業(yè)株式會社；甲醇，Merck公司；水
去離子水。色譜條件
色譜柱ODS(5μm)4.6mm×250mm
柱溫30℃；
流動相0.01mol/L庚烷磺酸鈉(pH5.30)-甲醇(100∶1)
流速1.5ml/min
檢測波長205nm操作方法
精密量取替曲朵辛約10mg，置于25ml容量瓶中，加0.02％的醋酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。取樣品溶液20μl注入HPLC儀，記錄色譜圖，測定峰面積。結(jié)果
南寧楓葉藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的三批河豚毒素的純度分別測定為99.38％，98.66％和99.11％。該公司所生產(chǎn)的河豚毒素的純度按絕對法可以達到97.5％以上，按相對法則可以達到98％以上。
在以下實施例2中使用的河豚毒素制劑是注射液，規(guī)格為2ml30μg。處方如下
替曲朵辛 15mg
0.5％稀醋酸 1ml
醋酸—醋酸鈉緩沖液(PH＝3.5) 50ml(所配藥液總體積的5％)
注射用水 加至 1000ml
根據(jù)臨床前藥理藥效實驗研究結(jié)果推算替曲朵辛注射液的制劑含量。
i)按對動物的有效劑量推算臨床用藥劑量一般按對動物有效劑量的1/5計算，人
的體重分別以50、60、70kg計。
●本品對小鼠醋酸扭體的鎮(zhèn)痛ID50(半數(shù)抑制量)為2.80μg/kg(im)則人的臨床推薦用藥劑量為
2.80μg/kg×1/5×50(60，70)kg＝28.0(33.6，39.2)μg
●本品對大鼠甲醛致痛的鎮(zhèn)痛有效劑量為2.5μg/kg(im)(P＜0.01)則人的臨床推薦用藥劑量為
2.50μg/kg×1/5×50(60，70)kg＝25.0(30.0，35.0)μg
ii)按LD50值推算臨床用藥的初步劑量結(jié)合藥效學(xué)研究結(jié)果，按LD50的1/50計算臨床藥用劑量，人的體重分別按50、60、70kg計。
●本品小鼠LD50為19.394μg/kg(im)故臨床推薦用藥劑量為
19.394μg/kg×1/50×50(60，70)kg＝19.39(23.27，27.15)μg。
iii)文獻報導(dǎo)，按日本針劑規(guī)定用相當(dāng)于每公斤小鼠最低死亡劑量(為10μg/kg)的1/14的50倍(一般人體重量以50kg計)的替曲朵辛溶于0.5％的石炭酸水溶液1ml作為一次注射量(亦即相當(dāng)于人的死亡劑量的1/14)。據(jù)此推算，每只安瓿中含替曲朵辛35.7μg。
根據(jù)藥理藥效學(xué)研究結(jié)果并參考有關(guān)文獻資料，將替曲朵辛注射液的制劑的規(guī)定為2ml30μg實施例2臨床研究
在一項臨床研究中，初步觀察了替曲朵辛注射液對11位癌癥晚期病人癌性疼痛的治療作用。
1、臨床資料
1.1病例選擇本組受試病人共11例，均經(jīng)CT.病理確診為晚期惡性腫瘤患者，
按WHO標(biāo)準(zhǔn)VAS線段分級法，確認(rèn)為均伴有中度以上疼痛，男6例，女5
例，年齡最大者76歲，最小者26歲，肝癌晚期5例，平滑肌肉瘤術(shù)后復(fù)發(fā)伴
肝轉(zhuǎn)移1例，胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)2例，食道癌術(shù)后復(fù)發(fā)1例，直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)1例，
結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移1例。受試者均自愿接受本項臨床研究。
1.2藥物與用法
1.2.1替曲朵辛注射液[Tetrodin]30μg/2ml/支。
批號990122為南寧楓葉藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
1.2.2用法替曲朵辛注射液30μg/支，1次/12h肌注，連用三天(共用6支
藥)后即停藥。
1.3觀察方法
按徐國柱教授設(shè)計的替曲朵辛注射液臨床研究計劃及研究方案進行，本組受試
者均采取無對照開放試驗方法。
1.4療效評定
按徐國柱、蔡志基教授在“鎮(zhèn)痛藥臨床評價方法研究”一文中介紹的方法進行。
2、疼痛強度分級和記錄方法
受試者在接受本項臨床觀察治療前24小時及使用本藥后在觀察記錄時間內(nèi)不
使用其它鎮(zhèn)痛藥，否則退出本項研究。每次于用藥前均須在VAS線段上由受試
者標(biāo)記出自己的疼痛級別。每次用藥后分別在0.08h(5′)、0.17h(10′)、0.25h(15
′)、0.33h(20′)、0.5h(30′)、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、12h共14
個記錄時間觀察記錄受試者的疼痛強度。
2.1疼痛強度記錄方法采用WHO標(biāo)準(zhǔn)VAS線段法。
0不痛
1-4輕痛
5-6中痛
7-10重痛
3、鎮(zhèn)痛效果的判定
3.1疼痛強度差(Pain intensity difference，PID)即患者服藥前疼痛強度與服藥
后每次測定的疼痛強度之差值。
3.2總疼痛強度差(Sum of pain intensity difference，SPID)當(dāng)日每次的PID
除以相應(yīng)觀察時間之值的總和即為當(dāng)天的SPID。
3.3疼痛緩解度(Pain relief，PAR)經(jīng)詢問患者，由醫(yī)生做出如下判斷0度未
緩解；I度輕度緩解(疼痛減輕約25％)；II度中度緩解(疼痛減輕約50％)；
III度明顯緩解(疼痛減輕約75％)；IV度完全緩解(疼痛消失)。
3.4總疼痛緩解度(Total pain relief，TPAR)當(dāng)日各次(各時點)疼痛緩解度之和
即為當(dāng)天的TPAR。
3.5中度(2度)以上疼痛緩解率即疼痛緩解2度以上患者占全部受試者之比。
3.6鎮(zhèn)痛分(Analgesic score，ANS)系指各時點的PID與PAR之和。
3.7總鎮(zhèn)痛分(Total analgesic score，TANS)當(dāng)日各時點鎮(zhèn)痛分之總和即為當(dāng)
天的TANS。
3.8對患者用藥前及用藥后各日生活質(zhì)量的改變情況做出評價應(yīng)用以上各項參數(shù)
或部分參數(shù)，通過與對照組的統(tǒng)計學(xué)處理分析，可以對受試藥做出有關(guān)臨床鎮(zhèn)痛效
果的評價結(jié)論。
4、觀察結(jié)果
4.1鎮(zhèn)痛效果
受試者均于用藥后的30’(0.5h)內(nèi)出現(xiàn)不同程度的鎮(zhèn)痛效果，部分受試者在用藥后5’(0.08h)內(nèi)即出現(xiàn)明顯的鎮(zhèn)痛作用，連續(xù)用藥三天(30μg×6支＝180μg)受試者的疼痛強度均由用藥前的中度以上降至1-0級，并于第四天停止用藥后的20-30天內(nèi)未發(fā)現(xiàn)病人再出現(xiàn)疼痛，見表1-8。
4.2對日常生活質(zhì)量的影響
用藥前大多數(shù)受試者都因疼痛而使生活質(zhì)量受到中度以上的影響，用藥后
大部分受試者的生活質(zhì)量得到明顯改善，由重度干擾緩解到中度或輕度，連續(xù)
用藥三天后多數(shù)受試者恢復(fù)到0干擾，有的受試者可以同正常人一起打麻將，
去浴池洗澡，有的受試者可以遠(yuǎn)途旅行(從哈爾濱到北京)，詳見表6和典型
病例。用藥和停藥后均未見有嗜睡和成癮現(xiàn)象。
4.3不良反應(yīng)
受試者在用藥后的10’-20’內(nèi)可發(fā)生口唇、舌頭、指端和趾尖麻木，
一般維持30’左右自行消失，勿須處理。部分用過杜冷丁注射液的受試者在
初次用替曲朵辛注射液后可出現(xiàn)輕、中度惡心、嘔吐，再次用藥后即消失。部
分受試者用藥后出現(xiàn)收縮壓和舒張壓下降，大多數(shù)受試者的血壓下降幅度在
10-15mmHg(1.33-2kpa)，不須處理可在40’-50’內(nèi)自行恢復(fù)正常。少數(shù)受
試者在嘔吐時伴有心慌，持續(xù)10’-15’即自行消失。
5、小結(jié)
本組臨床觀察病例雖然不多，但按上述方法觀察和判定受試者接受替曲朵
辛注射液的鎮(zhèn)痛效果證明該藥與其它鎮(zhèn)痛藥相比有以下優(yōu)點
1、用藥量小每次用藥30μg，每日2支，連用三天共180μg。
2、療程短三天一個療程。
3、起效快用藥后5’-30’內(nèi)起效。
4、維持時間長連續(xù)用藥三天后，可維持20-30天，不出現(xiàn)疼痛(本組受試
者自99.9.21-10.8接受治療至10月10日全部停止用藥，直到10月31日
尚未接到受試者有疼痛的報告。)
5、用藥和停藥后均無嗜睡和成癮現(xiàn)象。
6、毒副作用小使用治療劑量僅有麻木感，血壓輕度下降和輕度惡心、嘔吐，
均不須處理，可自行恢復(fù)。
7、對久用杜冷丁注射液產(chǎn)生藥物依賴的受試者尚有明顯的脫癮作用。
8、對惡性腫瘤受試者的病情有緩解作用。典型病例病例一
高××，男，44歲，漢族，已婚，高中文化。
1996年3月腹痛，確診為腹后壁平滑肌瘤，手術(shù)切除。
1997年3月復(fù)發(fā)手術(shù)切除病理診斷為平滑肌肉瘤。
1999年3月發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，進行介入治療。1999.8開始因腹部脹痛難忍而使用杜冷丁注射液，現(xiàn)在每天需用3支，開始時肌注，后來直接打靜脈，已用杜冷丁注射液100多支，現(xiàn)在不用杜冷丁注射液全身軟弱無力、不能走路，站立時雙腿打顫，全身疼痛難忍，自愿接受本項臨床觀察。用藥前疼痛分?jǐn)?shù)為8，肌注替曲朵辛注射液5′后疼痛即由8降至0，連續(xù)用藥三天后能自己去公共浴池洗桑拿，去朋友家打麻將，至今沒有任何不適和疼痛感，生活正常。病例二
張××，男，26歲，漢族，未婚，初中文化，司機。
1999年3月肝區(qū)疼去醫(yī)院檢查確診為肝癌晚期。
1999年7月病情加重，腹脹腹痛難忍，用去痛片、杜冷丁注射液治療，自愿接受本項臨床觀察。用藥前疼痛分?jǐn)?shù)為8，肌注替曲朵辛注射液后從第二天開始疼痛分?jǐn)?shù)由8至降到0，生活質(zhì)量也隨之明顯提高，于停藥后即和家人一起去北京做進一步診治。病例三
謝××，女，76歲，漢族，已婚。
1996年結(jié)腸癌術(shù)后，98年發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，99年6月疼痛加劇難以忍受，服用強痛定。自愿接受本項臨床研究，用藥前疼痛分?jǐn)?shù)為6，肌注替曲朵辛注射液后20’降至0，生活質(zhì)量由10降至6，三天后恢復(fù)正常。病例四
段××，女，46歲，漢族，已婚，高中文化，教師。
1998年12月腰痛逐漸加重，服去痛片可緩解，近半年伴左下肢疼痛且逐漸加重，先后服用去痛片，奧貝、非普拉宗、強痛定、杜冷丁、曲馬多止痛，經(jīng)確診為肝癌骨轉(zhuǎn)移，L3、L4 T11椎體溶骨性破壞，自愿接受替曲朵辛注射液臨床研究，用藥前疼痛分?jǐn)?shù)為9，肌注替曲朵辛注射液10’降至7，20’降至2，三天后停藥疼痛完全消失。病例五
李××，女，72歲，漢族，已婚，工人。
1999年2月腹脹，納差，經(jīng)對癥治療無效，腹部B超檢查提示肝癌，化療后緩解。
1999年9月腹脹、腹疼加重，服去痛片不能緩解，自愿接受本項臨床觀察。用藥前疼痛分?jǐn)?shù)7，肌注替曲朵辛注射液10′后由7降至0，連續(xù)用藥三天后生活基本恢復(fù)正常。病例六
李××，男，36歲，漢族，已婚，初中文化。
1999年8月經(jīng)黑龍江省腫瘤醫(yī)院確診為肝癌晚期，近日肝區(qū)疼痛加劇，肌注鹽酸哌替啶，不能完全緩解，自愿接受本項臨床觀察。用藥前疼痛分?jǐn)?shù)為7，肌注替曲朵辛注射液20′后由7降至3，連續(xù)用藥至1.5天降至0，連續(xù)用藥至第三天生活質(zhì)量達到0干擾。病例七
陳×，男，60歲，漢族，已婚，大學(xué)文化，餐館店主，旅居北愛爾蘭。
胃粘液腺癌在北愛爾蘭術(shù)后三個月復(fù)發(fā)，腹脹、腹痛日漸加重，CT見雙肺、肝和腹腔淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移，自愿接受本項臨床觀察。用藥前疼痛分?jǐn)?shù)8，肌注替曲朵辛注射液20′即由8降至0，連續(xù)三天后生活基本恢復(fù)正常。病例八
石××，男，59歲，壯族，已婚，初中文化，農(nóng)民。
胸骨后反復(fù)灼痛一年余，吞咽困難一月余，食入即吐，經(jīng)確診為食道中段癌，木后疼痛劇烈，用杜冷丁不能緩解，自愿接受本項臨床觀察。用藥前疼痛分?jǐn)?shù)8，肌注替曲朵辛注射液2支后，由8降至0，三天后生活基本恢復(fù)正常。病例九
劉××，女，69歲，漢族，已婚，高中文化，工人。
胃癌術(shù)后3年，近日發(fā)現(xiàn)左頸部淋巴腫大，病理確診胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，近日疼痛加劇，不能緩解，自愿接受本項臨床觀察。用藥前疼痛分?jǐn)?shù)9，肌注替曲朵辛注射液后3h，由9降至2，連用三天后降至0。病例十
覃××，女，52歲，壯族，已婚，初中文化，農(nóng)民。
直腸癌術(shù)后一年復(fù)發(fā)，會陰部腫物破潰，疼痛劇烈，頭昏頭痛不能講話，自愿接受本項臨床觀察。用藥前疼痛分?jǐn)?shù)7，肌注替曲朵辛注射液后1h，即由7降至0，連用三天后出院。病例十一
金××，男，63歲，漢族，已婚，大學(xué)文化，電影導(dǎo)演。
肝癌8年，近半年疼痛加劇不能緩解，本人自愿接受本項臨床觀察。用藥前疼痛分?jǐn)?shù)7，肌注替曲朵辛注射液第三天后，由7降至0，生活質(zhì)量也隨之明顯提高。
表1.替曲朵辛治療癌癥疼痛病例表實施例3 TTX對大鼠和小鼠的鎮(zhèn)痛作用藥物替曲朵辛原料藥，由南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供。批號960510，純度95％。阿斯匹林粉劑，青海制藥廠生產(chǎn)，批號940305鹽酸哌替啶粉劑，青海制藥廠生產(chǎn)，批號930412硫酸嗎啡，青海制藥廠生產(chǎn)，批號940701溶劑生理鹽水。配制方法用生理鹽水配成所需濃度的注射液。動物wistar大白鼠，昆明種小白鼠 北京醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，符合國家一級實驗動物標(biāo)準(zhǔn)。體重大鼠170-230g 小鼠18--22g性別♀♂兼用3.1大鼠皮下和肌肉注射替曲朵辛的鎮(zhèn)痛試驗(甲醛法)
用♂大鼠，隨機分組，一組為NS對照組，其余為給藥組。本試驗以嗎啡作為陽性對照。試驗前禁食12小時，飲水不限。致痛源為2.5％的甲醛(40％甲醛，北京化工三廠生產(chǎn)，批號930502，化學(xué)純，用蒸餾水稀釋成2.5％溶液作為化學(xué)致痛劑)。大鼠s.c或i.m不同劑量的受試藥物后分別放入20cm×20cm×20cm的有機玻璃觀察盒內(nèi)，30min后在大鼠右后足背s.c2.5％甲醛0.05ml/只，立即觀察記錄5min內(nèi)大鼠的疼痛反應(yīng)，表現(xiàn)為舔/咬、抽、抬右后足，并根據(jù)不同的痛反應(yīng)評分，具體為舔/咬后足時間(sec)×3+抽動后足次數(shù)×2/3+抬后足時間(sec)然后將各給藥組的痛反應(yīng)分?jǐn)?shù)與NS組的痛反應(yīng)分?jǐn)?shù)進行比較，按下式計算藥物抑制痛反應(yīng)分?jǐn)?shù)的百分率
以logit法算出替曲朵辛在該模型上的ID50值。
肌肉或皮下注射替曲朵辛在大鼠甲醛模型上的鎮(zhèn)痛強度基本相同。其鎮(zhèn)痛ID50值分別為0.82和0.93μg/kg。在本模型上替曲朵辛的鎮(zhèn)痛作用比嗎啡大3200和2900倍。結(jié)果見表2和表3
表2 替曲朵辛、嗎啡對大鼠的鎮(zhèn)痛ID50(im)
組別 動物數(shù) 痛反應(yīng)分值抑制率ID50及95％
(n) (X) (％) 可信限
NS8237.5
替曲朵辛(μg/kg)
0.3 8186.4 21.5
0.6 8132.9 44.0
1.25 872.1 69.6
2.5 867.3 71.7 0.82(0.66-1.0)
5.0 841.3 82.6 μg/kg
嗎啡(mg/kg)
0.6 8210.7 11.3
1.25 8190.7 19.7
2.5 8 158.2 33.42.63(2.32-2.98)
5.0 8 46.1 80.6mg/kg
10.0 8 13.1 94.2
表3 替曲朵辛、嗎啡對大鼠的鎮(zhèn)痛ID50(sc)
組別動物數(shù) 痛反應(yīng)分值抑制率ID50及95％
(n)(X) (％) 可信限
NS 20 203.6
替曲朵辛(μg/kg)
0.2510 152.7 25.0
0.5010 116.0 43.0
2.5010 57.2 71.9 0.93(0.56-1.56)
5.0 10 48.5 76.2 μg/kg
10.010 45.9 77.5
嗎啡(mg/kg)
2.5 10 131.2 35.6
3.5 10 51.6 74.6
5.0 10 30.1 85.2 2.74(2.24-3.35)
6.5 10 22.7 88.9 mg/kg
8.0 10 5.2 91.03.2小鼠皮下和肌肉注射替曲朵辛的鎮(zhèn)痛實驗(醋酸扭體法)小鼠隨機分組，1組為NS對照組，其余為給藥組，每組20只。本試驗以阿斯匹林和哌替啶作為陽性對照藥。實驗前禁食12小時，飲水不限。實驗以0.6％醋酸為致痛劑(36％醋酸，北京化工廠生產(chǎn)，批號940406)，i.p 0.1ml/10g。NS組20只小鼠先s.c NS，40min后i.p醋酸，5min后開始記錄10min以內(nèi)小鼠扭體數(shù)。以小鼠出現(xiàn)腰部肌肉反復(fù)收縮、拱背，臀部扭轉(zhuǎn)和后肢伸展為扭體反應(yīng)陽性。給藥組小鼠s.c或i.m給藥45min后i.p醋酸，觀察方法同NS組。將給藥組和NS組小鼠扭體數(shù)進行比較，按下列公式計算藥物抑制扭體百分率
用logit法計算半數(shù)抑制量ID50。實驗結(jié)果表明，肌肉或皮下注射替曲朵辛在小鼠醋酸扭體模型上的鎮(zhèn)痛強度基本相同。替曲朵辛的鎮(zhèn)痛強度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過阿斯匹林和哌替啶，分別是阿斯匹林的65,643(im)和74,179倍(sc)是哌替啶的617倍(sc)。結(jié)果見表4，5。
表4 替曲朵辛、阿斯匹林和哌替啶對小鼠的鎮(zhèn)痛ID50(im)
組別 動物數(shù) 扭體次數(shù)抑制率ID50及95％
(n) (n) (％) 可信限
NS 20 28.2
替曲朵辛(μg/kg)
1..25 20 20.925.9
2.520 15.743.9 2.80(2.37-3.26)
5.020 9.4 66.7 μg/kg
10.0 20 3.2 88.7
阿斯匹林(mg/kg)
10020 22.121.7
20020 14.343.9 183.8(164.9-202.4)
30020 7.2 74.4 mg/kg
40020 2.7 90.6
表5 替曲朵辛、阿斯匹林和哌替啶對小鼠的鎮(zhèn)痛ID50(sc)
組別 動物數(shù) 扭體次數(shù)抑制率ID50及95％
(n) (n) (％) 可信限
NS 20 16.7
替曲朵辛(μg/kg)
1.020 12.525.2
2.520 8.9 46.7 2.68(2.32-3.53)
5.020 6.9 58.7 μg/kg
10.0 20 2.8 82.2
阿斯匹林(mg/kg)
10020 15.018.9
20020 9.9646.2 198.8(181.7-217.5)
30020 5.6669.4 mg/kg
40020 2.7085.4
哌替啶(mg/kg)
1.020 14.223.2
2.020 8.2 55.6
3.020 6.1 67.0 1.8(1.6-2.1)
4.020 3.1 83.2mg/kg
5.020 0.3198.33.3小鼠皮下和肌肉注射替曲朵辛的鎮(zhèn)痛時-效關(guān)系研究(醋酸扭體法)
用小鼠扭體法，方法同上。測出ID50后，用2倍ID50劑量給小鼠i.m或s.c替曲朵辛，于給藥后15，30，60，120，180，240，300，330分鐘，各測定一次小鼠扭體反應(yīng)，并用阿斯匹林作對照。將各時間點鎮(zhèn)痛有效百分率繪制替曲朵辛的時效曲線。
實驗結(jié)果表明i.m和S.C給替曲朵辛后均在15min開始起效，起效后1小時達高峰，鎮(zhèn)痛作用持續(xù)約5小時，其鎮(zhèn)痛作用時間明顯比阿斯匹林長。見表6，7。
表6替曲朵辛在小鼠扭體鎮(zhèn)痛試驗中的時-效關(guān)系(sc.)
給藥后時間(min)
15 30 60 120 180 240 300 330平均扭 9.9± 8.7± 6.0± 16.9± 7.6±18.5±18.6±22.8±體數(shù) 9.44.05.5 14.4 11.713.4 11.1 10.1抑制百 分率 64.9 69.1 78.740.1 72.534.0 34.0 19.1P值*＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05
*與NS組的平均扭體數(shù)(28.2±12.4)比
表7阿斯匹林在小鼠扭體鎮(zhèn)痛試驗中的時-效關(guān)系(ig.)
給藥后時間(min)
10 20 30 40 70 100 130平均扭體 11.4 ±10.9 ±1.98 ±4.8 ±6.8 ± 11.8 ± 11.8±數(shù) 9.9 10.10.2 1.11.42.5 9.5抑制百分 38.441.189.274.1 65.9 37.136.2率P值*＞0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＞0.05*與NS組的平均扭體數(shù)(18.5±6.4)比
表8 替曲朵辛在小鼠扭體鎮(zhèn)痛試驗中的時-效關(guān)系(im.)*與NS對照組的平均扭體數(shù)(28.2±14.3，n＝20)比較。
表9 阿斯匹林在小鼠扭體鎮(zhèn)痛試驗中的時-效關(guān)系(sc)*與NS對照組的平均扭體數(shù)(28.2±14.3，n＝20)比較。實施例4 替曲朵辛的身體依賴性實驗
對替曲朵辛的藥物成癮可能性在三種動物種屬(昆明小鼠，Wistar大鼠和廣西猴(恒河猴的亞種))和四種動物模型上作了研究。藥物替取朵辛原料藥粉。南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供。純度86％；鹽酸嗎啡，青海制藥廠生產(chǎn)，批號940701溶劑生理鹽水配制方法用生理鹽水(NS)配成所需濃度的溶液。體重大鼠190-230g，小鼠20-25g，猴3-6kg。性別大、小鼠雌雄各半，猴雌雄搭配。組動物數(shù)小鼠20只，大鼠10只，猴3-6只。每只接受容量小鼠0.1ml/10g；大鼠0.2ml/100g，猴0.1ml/kg。4.1小鼠催促跳躍試驗；
小鼠隨機分組，陽性對照組sc嗎啡20mg/kg；TTX設(shè)置兩組，其劑量分別為8μg/kg、14μg/kg，NS組給等容量NS，以上各組均恒量給藥7天。第8天早830末次給藥后2小時用10mg/kgM5050(s.c)催促，記錄每只小鼠的跳躍發(fā)生率和跳躍次數(shù)。
結(jié)果經(jīng)單因素方差分析表明，嗎啡組出現(xiàn)了明顯的跳躍反應(yīng)，跳躍發(fā)生率和跳躍次數(shù)與替取朵辛組和NS對照組比均有顯著性差異(P＜0.05)；而替取朵辛組與NS對照組比則無顯著性差異(P＞0.05)。這表明，在所用劑量下，替取朵辛對小鼠s.c一周恒量給藥后與NS結(jié)果一樣，均未出現(xiàn)身體依賴性指癥(見表10)。
表10.替取朵辛、嗎啡和NS組小鼠跳躍結(jié)果比較
組別 小鼠數(shù) 跳躍率 跳躍次數(shù)
(n) (％) (X±SD)
嗎啡組20 90.0* 19.7±16.3*
替取朵辛(大) 20 10.0#0.70±2.70#
替取朵辛(小) 20 10.0#1.30±3.90#
NS組 10 20.0 0.80±2.20
*與NS組比較P＜0.05。
#與NS組比較P＞0.05。4.2大鼠催促戒斷試驗
大鼠隨機分為陽性對照組和替取朵辛給藥組。給藥方案嗎啡組sc嗎啡劑量分別為5、10、15、20、25、30、35mg/kg各1天，每天給藥3次；替取朵辛設(shè)兩個劑量組，劑量分別為1.5μg/kg、3.0μg/kg，每天給藥3次，遞增劑量給藥7天，分別達10.5和15μg/kg。第8天早830末次給藥后2小時用2mg/kgM5050(s.c)催促，按觀察表(附1)記錄戒斷反應(yīng)和體重下降程度，并評分。
結(jié)果表明替取朵辛兩個劑量組的戒斷癥狀分和體重下降分均與NS組相近，都明顯低于嗎啡組并有非常顯著性差異(P＜0.01)。這表明，替取朵辛對大鼠在所試劑量下長期給藥未產(chǎn)生任何身體依賴性反應(yīng)(見表11)。
表11 替取朵辛、嗎啡和NS催促戒斷分值比較
組別 組鼠數(shù) 戒斷癥狀分 體重下降分
(n)(X±SD) (X±SD)
嗎啡組 8 7.38±1.16** 10.00±2.60**
替取朵辛(大) 7 0.30±0.90 0.00±0.00
替取朵辛(小) 10 0.20±0.60 0.00±0.00
NS組 10 0.40±1.20 0.00±0.00
**與替取朵辛組和NS組比P＜0.01.4.3大鼠自然戒斷試驗
大鼠催促戒斷試驗后繼續(xù)給藥2周，嗎啡組劑量依次為40、50、60mg/kg各3天，70mg/kg4天，每天給藥3次。替取朵辛劑量同前。連續(xù)給藥21天，停藥觀察大鼠體重下降情況，每天稱體重3次，至體重恢復(fù)。
從表3結(jié)果看，替取朵辛兩個劑量組連續(xù)給藥3周，停藥后體重變化不大，各時間點體重與NS組比較均無顯著性差異(P＞0.05)，且第48小時的體重均比NS組高，替取朵辛小劑量組的體重已恢復(fù)并超過停藥前。而嗎啡組的體重明顯下降，與NS組及替取朵辛組的體重比有非常顯著性差異(P＜0.01)。這表明，替取朵辛在大鼠自然戒斷試驗中，沒有產(chǎn)生身體依賴性指征。
表12 替取朵辛、嗎啡組體組體重變化情況比較
(X±SD，體重下降百分率％)
停藥后時間組別 n 12h 30h36h 48h嗎啡組10-7.82±2.57**13.0±2.90** -10.76±3.67 -9.37±4.13替取朵辛(小) 10-3.04±2.49 -0.58±1.43-1.79±1.82 4.05±1.82替取朵辛(大) 9 -4.83±1.80 -3.99±2.19-4.45±3.32 -0.79±4.21NS10-2.57±3.12 -4.77±5.18-2.92±5.13 -1.17±4.04**與替取朵辛組及NS組比P＜0.014.4猴催促戒斷試驗
將猴分為嗎啡陽性對照組、NS陰性對照組和替取朵辛組，每天給藥3次(830，1430，2030)。陽性對照組im嗎啡，以劑量遞增法形成嗎啡依賴模型。劑量為3、6mg/kg各3天，9、12mg/kg各4天，第3周15mg/kg維持至1個月。替取朵辛的劑量為1、2、3μg/kg，各一周，第4周增至4μg/kg時發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)(嘔吐)，又降至3μg/kg，共給藥1個月。第31天早上830末次給藥1小時，sc納洛酮1mg/kg，立即觀察給藥后1小時內(nèi)猴的戒斷癥狀及體重變化百分率，并按觀察表(附件2)評分。
結(jié)果經(jīng)組間t檢驗表明，替取朵辛組和NS組的戒斷癥狀分值和體重下降百分率均明顯低于嗎啡組(P＜0.01)，而替取朵辛組的戒斷癥狀分值和體重下降百分率均與NS組非常接近，說明替取朵辛長期給藥后用嗎啡拮抗劑納洛酮催促未出現(xiàn)嗎啡樣戒斷癥狀，提示替取朵辛長期給藥后不會引起身體依賴性(見表13)。
表13 替取朵辛、嗎啡和NS組催促戒斷試驗結(jié)果(X±SD)
組別n戒斷癥狀分體重下降％
嗎啡組 361.0±2.6** 6.6±1.7**
替取朵辛組 62.6±4.6 0.4±0.8
NS組32.6±4.6 0.7±0.6
**與替取朵辛和NS組比(P＜0.01)4.5猴自然戒斷試驗
將猴分為嗎啡陽性對照，NS陰性對照組和替取朵辛組，試驗步驟和給藥方法同催促戒斷試驗。30天后維持催促試驗大劑量繼續(xù)給藥至90天，然后停止給嗎啡、替取朵辛和NS，觀察停藥一周內(nèi)各組猴的戒斷癥狀和體重變化情況，每天3次，并按觀察表(附2)評分。
從表14、15結(jié)果可以看出，替取朵辛在連續(xù)給藥三個月后停藥觀察一周，未出現(xiàn)任何戒斷癥狀。停藥的前3天個別猴有時有些興奮多動現(xiàn)象，但很快消失。體重非但沒有減輕反而比給藥期間增加。嗎啡對照組則出現(xiàn)明顯的戒斷癥狀，說明替取朵辛在所試劑量下長期給藥不會出現(xiàn)身體依賴性。
表14 各組猴自然戒斷期間戒斷癥狀分值比較(X±SD)
表15 各組猴自然戒斷期間體重變化百分率(X±SD)
**與替取朵辛和NS組比P＜0.01。附1
大鼠催促實驗戒斷癥狀觀察表
年月日注 總得分附2
猴戒斷癥狀觀察表
附3
猴戒斷癥狀分級、評分方法一、分級1、輕度恐懼、打哈氣、流淚、顫抖、顏面潮紅、出汗、啼鳴、爭斗不和、食欲下降、 稀便。2、中度意向性震顫、厭食、豎毛、肌肉抽搐、抱腹、腹瀉、無力躺臥。3、重度極度不安、閉目側(cè)臥、異常姿勢、嘔吐、面色蒼白、明顯肌痙攣。4、極重度衰竭狀態(tài)(無表情，呼吸困難，脫水)、體重明顯下降、循環(huán)衰竭、死亡。二、評分<級差分+癥狀分>輕度級差分5分，每個癥狀3分，同一個癥狀一天內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)時減1分。中度級差分10分，每個癥狀4分，同一個癥狀一天內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)時減1分。重度級差分17分，每個癥狀4分，同一個癥狀一天內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)時減1分。極重度級差分32分，衰竭狀態(tài)20分，死亡30分。三、評分依據(jù)癥狀等級不同，得分應(yīng)有區(qū)別，同一等級中癥狀種類的多少，得分應(yīng)有區(qū)別，但不應(yīng)比級差分值大。3個次級癥狀等于高一級癥狀分值，如3個輕度癥狀分<5+3×3>＝1個中等癥狀分<10+4>。3個中等癥狀分<10+4×3>＝1個重度癥狀分<17+5>。出現(xiàn)衰竭狀態(tài)或死亡時，其他癥狀都看不到，故給的分值相當(dāng)于輕、中、重癥狀分的總和。實施例5替曲朵辛的一般藥理學(xué)研究藥物TTX原料藥，由南寧楓葉藥業(yè)公司提供，純度91.0％，用生理鹽水溶解后配成相應(yīng)濃度，供腹腔注射(每10g鼠注射0.1ml)氯化鈉注射液天津市氨基酸公司，批號97091162；咖啡因上海試劑二廠，批號950801；安定注射液天津市氨基酸公司人民制藥廠，批號970424；嗎啡中國藥品生物制品檢定所，批號1201-9612；戊巴比妥鈉北京通縣育才精細(xì)化工廠，批號950427。動物昆明種小鼠體重為17-25g，雌雄各半，每批試驗動物的體重差異≤5g.動物許可證號津科動管001號。健康雜種犬，雌雄各半，體重10-15kg，本院實驗動物室提供，外購，飼養(yǎng)一周后使用。5.1對神經(jīng)系統(tǒng)的影響5.1.1.對小鼠一般行為的影響
取體重17-22g的小鼠30只，雌雄各半，隨機分組每，組10只小鼠，腹腔注射TTX劑量分別為2.5、5、10μg/kg，給藥后15分鐘觀察小鼠的一般行為表現(xiàn)、姿勢、步態(tài)、有無流涎、肌顫及瞳孔等變化。試驗結(jié)果表明，小鼠一次給與TTX2.5μg/kg、5μg/kg、10μg/kg后，一般行為表現(xiàn)如姿勢、步態(tài)均正常，無流涎、肌顫等現(xiàn)象，也無瞳孔變化；只有10μg/kg組小鼠給藥后活動減少，閉眼。5.1.2.對小鼠自主活動的影響
將體重17-22g的小鼠雌雄各半，隨機分組，每組12只，TTX設(shè)2.5、5、10μg/kg三個劑量組，陽性對照藥設(shè)中樞興奮劑咖啡因10mg/kg組和中樞抑制劑安定5mg/kg組，另外一組為空白對照(生理鹽水)。試驗時于腹腔注射藥物15分鐘后將小鼠分批放入TDW-02通用動物活動記錄儀內(nèi)，穩(wěn)定5分鐘后開始測量。每批放入小鼠4只，給藥組與對照組交替進行試驗，記錄5分鐘內(nèi)各組動物自主活動數(shù)，以此比較給藥組與陽性對照組及空白對照組小鼠自主活動數(shù)有無差異，用t檢驗判斷差異的顯著性。
試驗結(jié)果表明TTX 2.5、5μg/kg小鼠的自主活動數(shù)與空白對照組比較無顯著性差異(P＞0.05.)，10μg/kg組小鼠的自主活動數(shù)顯著減少(P＜0.01＝；咖啡因與各組比較均顯示明顯的興奮作用；安定為中樞抑制劑，自主活動數(shù)明顯少于空白對照組，而TTX10μg/kg組小鼠的自主活動數(shù)與其無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見表16。
表16.替曲朵辛對小鼠自主活動的影響
藥物 劑量 動物數(shù) 自主活動數(shù)
(只)(X±SD)
生理鹽水 ---- 12 591±111
咖 啡 因 10mg/kg 12 777±178*** ...
安定 5.0mg/kg 12 23±203 ***
替曲朵辛 2.5μg/kg 12 547±99...
替曲朵辛 5.0μg/kg 12 540±118 ...
替曲朵辛 10μg/kg 12 442±98 **
表示與生理鹽水比較**P＜0.01；***P＜0.001
表示與咖啡因比較 P＜0.001
表示與安定比較...P＜0.0015.1.3.延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗
做正式試驗之前先摸清使動物100％入睡的戊巴比妥鈉劑量，經(jīng)予試確定此劑量為40mg/kg。
將20-25g小鼠50只，雌雄各半，隨機分組，每組10只。設(shè)TTX三個劑量組(2.5μg/kg、5μg/kg、10μg/kg)陽性對照藥安定組為2.5mg/kg，空白對照(生理鹽水)組。試驗時對照組腹腔注射生理鹽水，給藥組按上述劑量注射被試藥物，出現(xiàn)峰作用前10-15分鐘給動物按40mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，記錄小鼠翻正反射消失的潛伏期，觀察藥物對戊巴比妥鈉的睡眠時間是否具有延長作用，比較給藥組與對照組之間的差異，用t檢驗判斷差異的顯著性。
試驗結(jié)果表明，TTX 2.5μg/kg、5μg/kg、10μg/kg與空白對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)；與陽性對照藥安定比較具有顯著性差異(P＜0.001＝.說明TTX在所用劑量下沒有中樞鎮(zhèn)靜作用，結(jié)果見表17。
表17.替曲朵辛對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間的影響
藥物 劑量動物數(shù) 睡眠時間
(只)(X±SD)min
生理鹽水 ----10 33.3±14.5
安定 2.5mg/kg10 146.2±53.0***
替曲朵辛 2.5μg/kg 10 35.1±26.2
替曲朵辛 5.0μg/kg 10 36.3±18.7
替曲朵辛 10μg/kg10 26.6±22.5
表示與生理鹽水比較***P＜0.001
表示與安定比較P＜0.0015.1.4.肌肉松弛作用
選取18-22g的小鼠，雌雄各半，禁食4小時，隨機分組，每組10只。設(shè)TTX三個劑量組(2.5μg/kg、5μg/kg、10μg/kg)，陽性對照藥安定5mg/kg組，空白對照(生理鹽水)組。將小鼠放在一以50度角置于桌面的金屬網(wǎng)上，任其攀附爬行，觀察1小時不跌落者為合格，然后給藥組腹腔注射藥物，對照組注射生理鹽水，再置網(wǎng)上任其爬行，觀察50分鐘，自行跌落者可將其再放回網(wǎng)上，連續(xù)跌落三次為陽性表示該藥有效。試驗結(jié)果用精確概率法進行計算，比較各組間差異的顯著性。
試驗結(jié)果表明，與空白對照組比較TTX各劑量組均無顯著性差異(P＞0.05)，而與陽性對照藥安定組比較，差異非常顯著(P＜0.001＝，說明TTX在所用劑量下對肌張力沒有影響，結(jié)果見表18。
表18.替曲朵辛肌肉松弛作用(攀網(wǎng)法)
藥物劑量 動物數(shù) 有效動物數(shù)
(只)(只)
生理鹽水---- 10 0
安定5mg/kg 10 8***
替曲朵辛2.5μg/kg 10 0
替曲朵辛5.0μg/kg 10 0
替曲朵辛10μg/kg 10 0
表示與生理鹽水比較***P＜0.001
表示與安定比較P＜0.0015.1.5.對麻醉犬心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)的影響
家犬，戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈麻醉；仰臥固定，分離股動脈，插管記錄動脈血壓，分離對側(cè)股靜脈用于補液，將鼻夾式呼吸換能器(TR-61ZT)夾在鼻孔內(nèi)，記錄呼吸頻率和幅度，針狀電極記錄II導(dǎo)心電圖，以上指標(biāo)同步記錄在RM-6000多導(dǎo)記錄儀上。
動物術(shù)畢穩(wěn)定30分鐘以上，待各參數(shù)值穩(wěn)定后，記錄給藥前各參數(shù)值，由臀部肌肉注射給藥，對照組給予同等體積的生理鹽水，分別于給藥后15，30，45，60，90，120，180min記錄各參數(shù)值。
試驗結(jié)果表明，各給藥組在觀察期間在各時間點的血壓、心率、呼吸幅度及呼吸頻率與給藥前或平行對照組相比均未見明顯差異(P＞0.05)。提示替曲朵辛在所試劑量下對麻醉犬血壓、心率、呼吸幅度及呼吸頻率均無影響。實施例6 替取朵辛的毒性實驗藥品替曲朵辛原料藥，純度99％，由南寧楓業(yè)制藥有限公司提供，用時以蒸餾水稀釋至所需濃度，用醋酸調(diào)至PH4～5。動物Wistar大鼠，130-170g昆明小鼠，17-22g，雌雄各半。6.1小鼠急性毒性實驗
動物禁食12小時后按體重隨機分組，每組10-20只，雌雄各半，不同途徑(iv，ip，sc，im)給藥后即刻觀察動物的一般情況和毒性反應(yīng)及一周內(nèi)死亡情況記錄動物的死亡時間，對死亡動物即時進行尸檢，觀察肝、腎等重要器官有無出血、壞死等異常表現(xiàn)。若有肉眼可見變化則需進行病理檢查。死亡結(jié)果用Bliss法統(tǒng)計，計算LD50。
小鼠不同途徑注射替取朵辛后的毒性反應(yīng)基本相同，主要毒性反應(yīng)為不安，興奮，四肢抽搐，尿失禁，呼吸困難、直至呼吸衰竭而死亡。iv給藥后1-15分鐘出現(xiàn)死亡，其它途徑給藥后，一般在20-60分鐘內(nèi)死亡。死亡小鼠無性別差異。死亡動物尸檢未見異常，未死動物通常在1小時后恢復(fù)正常。各給藥途經(jīng)的LD50值見表19、20、21、22。
表19 iv替曲朵辛后小鼠死亡分布及LD50測定結(jié)果劑量 劑量對數(shù)動物數(shù)死亡動物死亡率機率單位 LD50(μg/kg) (X) (只) (只)(％) (Y) (95％可信限)11.8 1.070 1010 107.03810.0 1.000 107 705.4938.5 0.929 105 505.000 8.3(7.5-9.2)7.2 0.859 103 304.4796.1 0.788 101 103.722
表20 ip替曲朵辛后小鼠死亡分布及LD50測定結(jié)果劑量劑量對數(shù) 動物數(shù)死亡動物 死亡率 機率單位 LD50(μg/kg)(X) (只) (只)(％)(Y) (95％可信限)11.81.070 109 90 6.19710.01.000 108 80 5.8278.5 0.929 104 40 4.7479.0(8.2-9.8)7.2 0.859 101 10 3.7196.1 0.788 100 0 2.464
表21 sc替曲朵辛后小鼠死亡分布及LD50測定結(jié)果劑量劑量對數(shù) 動物數(shù) 死亡動物 死亡率 機率單位 LD50(μg/kg)(X) (只) (只) (％) (Y) (95％可信限)22.91.360 101010 7.24619.51.290 108 80 5.83516.51.271 105 50 5.00016.2(14.7-17.8)14.11.149 102 20 4.16312.01.079 101 10 3.734
表22 im替曲朵辛后小鼠死亡分布及LD50測定結(jié)果劑量 劑量對數(shù) 動物數(shù)死亡動物死亡率 機率單位 LD50(μg/kg) (X)(只) (只)(％)(Y) (95％可信限)21.490 1.332 2018 90 6.2819.711 1.296 2013 65 5.3918.189 1.260 204 20 4.6 19.4(18.9-19.9)16.734 1.224 200 06.2大鼠急性毒性實驗
動物禁食12小時后按體重隨機分組，每組10只，雌雄各半，不同途徑(iv，im)給藥后即刻觀察動物的一般情況和毒性反應(yīng)及一周內(nèi)死亡情況記錄動物的死亡時間，對死亡動物即時進行尸檢，觀察肝、腎等重要器官有無出血、壞死等異常表現(xiàn)。若有肉眼可見變化則需進行病理檢查。死亡結(jié)果用Bliss法統(tǒng)計，計算LD50。結(jié)果顯示，im.后約10-20′，iv.后約1-5′，動物表現(xiàn)出不同程度的后肢無力，呼吸加快，平臥，重者出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸困難(潮式呼吸)直至呼吸衰竭致死(一般在注射后1h內(nèi))個別動物在iv.1′后抽搐片刻死亡。存活下來的動物呈抑制狀態(tài)，在注射約1h后逐漸恢復(fù)。連續(xù)觀察7天，未見其它異常及死亡。死亡動物大體解剖未見異常(結(jié)果見表23、24)。
表23 大鼠一次im.替取朵辛后動物死亡分布及LD50測定結(jié)果劑量 對數(shù)劑 動物數(shù) 死亡動物 死亡率 機率單 LD50值(μg/kg) 量(X)(只) (只) (％)位(Y) (95％可信限)23.359 1.36810 1010021.490 1.33210 9 90 6.2818.77919.771 1.29610 7 70 5.5218.189 1.26010 4 40 4.75(17.993-19.599)16.734 1.22410 1 10 3.72
表24 大鼠一次iv.替取朵辛后動物死亡分布及LD50測定結(jié)果劑量 對數(shù)劑 動物數(shù) 死亡動物 死亡率 機率單 LD50值(μg//kg) 量(X)(只)(只) (％) 位(Y) (95％可信限)21.6711.33610 9 90 6.2820.3711.30910 6 60 5.2519.41419.1491.28210 6 60 5.2118.0001.25510 1 10 3.72(18.690-20.165)
16.920 1.228 10 1 10 3.726.3恒河猴肌注替曲朵辛28天毒性試驗藥物替曲朵辛注射液，南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供。純度84％，每安瓿30μg/ml。溶劑0.02％乙酸，滅菌注射用水大同市惠達制藥廠生產(chǎn)，批號960404。配制方法取15kg/ml特脫定針劑14ml，加入2.8ml 0.02％乙酸溶液，充分混勻，配成12.5μg/ml濃度(V組)。取濃度為12.5μg/ml特脫定溶液6ml，加入0.02％乙酸溶液9ml，充分混勻，配成5μg/ml濃度(IV組)。取濃度為5μg/ml特脫定溶液4ml，加入6ml 0.02％乙酸溶液，充分混勻，配成2μg/ml濃度(III組)。動物恒河猴，雌雄各10只。動物年齡3-4歲，動物體重♂3.29±0.47kg，♀3.76±0.35kg試驗分組
劑 量猴有效 人用臨床 動物數(shù)組別治療劑量日劑量
μg/kg/d μg/m2/d 的倍數(shù) (CDD)倍數(shù)♀ ♂I空白對照 00 0 0 2 2II溶劑對照 00 0 0 2 2III低劑量組1.0 13.50 2 1 2 2IV中劑量組 2.5 33.75 5 2.5 2 2V高劑量組 6.25 84.38 12.5 6.25 2 2
注1.猴體表面積計算公式
體表面積(m2)＝0.118×體重(kg)2/3(體重按4kg計算)
2.空白對照注射等體積注射用水。給藥途徑im給藥體積0.5ml/kg體重給藥時間每日一次，在上午830-1030時給藥給藥期限28天注射部位兩后腿股四頭肌，每天輪換進行注射，注射量＞2ml時，分兩個部位進行注射。分析和測量儀器半自動生化分析儀(VITALAB MICRO，荷蘭)AVL-9130鈉鉀氯分析儀(美國)多參數(shù)血細(xì)胞計數(shù)分析儀(JT-IR，美國)IMPACT400自動生化分析儀(美國)心電圖儀(國產(chǎn))實驗結(jié)果
替曲朵辛1.0、2.5和6.25μg/kg g/kg 3個劑量組，分別相當(dāng)于人用臨床日劑量1.0、2.5和6.25倍。另設(shè)注射用水空白對照及0.02％乙酸溶劑對照各1組。每組恒河猴4只，雌雄各半。每天im一次，連續(xù)28d。結(jié)果表明，6.25μg/kg組動物每次給藥后均出現(xiàn)明顯中毒癥狀，主要表現(xiàn)為嘔吐，有1/4的動物ALT和ALP異常升高、眼瞼紅腫、輕癱等。2.5μg/kg組個別動物(1/4)出現(xiàn)嘔吐現(xiàn)象，AChE活性下降41.2％。1.0μg/kg組、空白對照組和溶劑對照組動物一般生理指標(biāo)觀察、病理組織學(xué)檢查、血液學(xué)及血液生化檢查、眼科檢查等均未見與給藥相關(guān)的有毒理學(xué)意義的顯著變化。注射替曲朵辛稀乙酸液的局部D28時鏡下可見肌肉壞死等損傷。恢復(fù)期(D56)未見動物注射部位有肌肉損傷。在本試驗條件下，替曲朵辛對恒河猴無毒劑量為1.0μg/kg。實施例7替曲朵辛的局部用藥毒性試驗7.1替曲朵辛對家兔局部肌肉刺激性試驗藥物替曲朵辛注射液，南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供。純度84％，濃度15μg/1ml，用0.02％稀醋酸水溶液或生理鹽水稀釋配成所需濃度；陽性對照品為青霉素鉀鹽。批號106930100，天象人生物工程有限責(zé)任公司產(chǎn)品。給藥劑量替曲朵辛對家兔的給藥劑量按照猴的有效劑量折算。實驗動物新西蘭大耳白兔。動物年齡13～18周動物體重2.0～2.5kg。性別和數(shù)量，雄性，8只，隨機分成4組。替曲朵辛稀醋酸組，替曲朵辛生理鹽水組，0.02％稀醋酸對照組，青霉素鉀鹽陽性對照組，每組動物為2只。試驗結(jié)果
替曲朵辛稀醋酸組、替曲朵辛生理鹽水組、0.02％稀醋酸(賦形劑)組和青霉素鉀鹽(陽性對照)組給藥后未觀察到家兔有松毛、精神萎靡、厭食和行動困難等癥狀。
替曲朵辛稀醋酸組、替曲朵辛生理鹽水組、0.02％稀醋酸(賦形劑)組和青霉素鉀鹽(陽性對照)組給藥后未觀察到家兔局部皮膚有紅斑、水腫等變化。替曲朵辛生理鹽水組家兔肌肉注射給藥48h后；肉眼未見注射部位股四頭肌充血、壞死、硬變及其它病理變化。
替曲朵辛稀醋酸組、賦形劑組(0.02％稀醋酸)、陽性對照組(青霉素鉀鹽)家兔肌肉注射給藥48h后，肉眼可見注射部位股四頭肌充血、壞死病理變化。替曲朵辛生理鹽水組家兔肌肉注射給藥48h后，鏡下未見注射部位股四頭肌有明顯的組織病理學(xué)改變。替曲朵辛稀醋酸組、賦形劑組(0.02％稀醋酸)、陽性對照組(青霉素鉀鹽)家兔肌肉注射給藥48h后，鏡下可見注射部位股四頭肌有明顯的肌纖維變性、壞死及周圍區(qū)域的充血和出血改變。
以上結(jié)果表明，替曲朵辛稀醋酸組(0.56μg/kg)、0.02％稀醋酸(賦形劑)組和青霉素鉀鹽陽性對照組(15.4萬u/kg)對家兔均有明顯的刺激反應(yīng)。而替曲朵辛生理鹽水組(0.56μg/kg)對家兔肌肉未見有刺激反應(yīng)。說明其刺激成分為0.02％稀醋酸，而受試濃度的替曲朵辛本身對家兔肌肉沒有刺激反應(yīng)。7.2替曲朵辛對豚鼠全身過敏性反應(yīng)藥物替曲朵辛注射液，南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供。純度84％，濃度15μg/1ml，用0.02％稀醋酸水溶液或生理鹽水稀釋配成所需濃度；陽性對照品為牛血清白蛋白，批號950303，上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。給藥劑量豚鼠全身性過敏試驗所用劑量是按照猴的有效劑量折算而來，為0.95μg/kg。實驗動物豚鼠，Hartley系。性別和數(shù)量24只，雌雄各半，隨機分成3組(替曲朵辛組，10％牛血清白蛋白陽性對照組和賦形劑組)每組動物8只。動物年齡8-12周。動物體重250克-300克。實驗方法
按動物體重以0.95μg/kg算出每只動物所需總量，再以0.5ml 0.2％稀醋酸總體積算出所配制的濃度，按此濃度配制溶液。因致敏和激發(fā)周期較長，動物體重變化較大，按0.95μg/kg算出每只動物的致敏藥液和激發(fā)藥液的濃度也有差異。賦形劑組為0.02％稀醋酸水溶液。給藥溶量致敏為0.5ml，激發(fā)為1.0ml。10％牛血清白蛋白陽性組取牛血清白蛋白1g加生理鹽水至10ml即可。給藥容量致敏為0.5ml，激發(fā)為1.0ml。致敏方法替曲朵辛組，將配好的替曲朵辛致敏藥液給予每只豚鼠腹腔注射0.5ml，隔天一次，連續(xù)給藥三次，賦形劑組和10％牛血清白蛋(陽性對照)組，給藥方法同替曲朵辛組。然后各組動物又分2小組，每小組動物為4只。激發(fā)方法第一小組首次腹腔注射給藥后的第14天，給予激發(fā)藥液1ml由后腳掌外側(cè)靜脈注射一次。第二小組于首次給藥后的第21天，給予激發(fā)藥液同量同途徑注射一次。立即觀察受試動物有無搔鼻、噴嚏、豎毛、抽搐、呼吸困難、大小便失禁、休克和死亡等過敏反應(yīng)。試驗結(jié)果
替曲朵辛(0.95μg/kg)組和0.02％稀醋酸(賦形劑)組激發(fā)后，未觀察到豚鼠有明顯的全身過敏反應(yīng)癥狀出現(xiàn)。10％牛血清白蛋白(陽性對照)組激發(fā)后幾分鐘，豚鼠出現(xiàn)程度不同的抓鼻、豎毛、不安、噴嚏以及有一只豚鼠死亡等過敏反應(yīng)(見表25)。該實驗結(jié)果證明替曲朵辛0.95μg/kg對豚鼠全身過敏反應(yīng)為陰性，該劑量范圍內(nèi)使用是安全的。
表25 替曲朵辛對豚鼠全身性過敏試驗結(jié)果
注*(-)無異常反應(yīng)。
(+)抓鼻，豎毛，噴嚏，不安，呼吸急迫，輕度紫紺。
(++)豎毛，呼吸明顯困難，紫紺，四肢無力，腹部貼地爬行。
(+++)死亡。
** 反應(yīng)動物數(shù)/受試動物數(shù)7.3溶血性試驗和血管刺激試驗試驗材料替曲朵辛注射液(Tetrodotoxin inection)，南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供。動物大耳白兔7.3.1溶血性試驗
取試管7支，按下表配比量依次加入2％的家兔紅細(xì)胞(RBC)懸液和生理鹽水，搖勻，置于37℃恒溫箱放置30分鐘取出。試管編號 1 2 3 4 5 6 72％RBC懸液(ml)2.52.52.52.52.52.52.5生理鹽水(ml) 2.02.12.22.32.42.22.5藥液(ml) 0.50.40.30.20.10.3* -*0.02％稀醋酸水溶液
加入不同量的藥液，第6管加入與第三管等量的0.02％的醋酸水溶液作為與藥液等pH對照管，第7管不加藥液。
搖勻后置于37℃恒溫箱，15分鐘后第一次觀察記錄，以后每隔1小時觀察記錄記錄1次，共觀察4小時。結(jié)果判斷1.如各管溶液的顏色與對照管相同即為陰性，一般以第3管即0.3ml藥液，在2小時內(nèi)不產(chǎn)生溶血作用即可供注射用。2.如溶液呈紅色透明即為溶血。3.如溶液中有棕色或者紅棕色沉淀，表示有紅細(xì)胞聚集。如振蕩試管，凝聚物可均勻分散開，或者將凝聚物取出置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在蓋玻片邊緣滴2滴生理鹽水，在顯微鏡下觀察，凝聚的紅細(xì)胞能被沖散者均可判為假凝聚，試藥可供臨床應(yīng)用若凝聚物不能被搖散，或者在玻片上不能沖散者則判為真凝聚，試藥不能供臨床應(yīng)用。
如發(fā)現(xiàn)溶血或者紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象，將藥液作對倍稀釋，按上述試驗程序再進行試驗。試驗結(jié)果
加不同量的替曲朵辛管、溶劑對照及鹽水對照管，加樣后連續(xù)觀察4小時，各管未見溶血現(xiàn)象。7.3.2血管刺激試驗試驗分組共分三個試驗組，每組5只動物。藥物組給藥劑量為1.0μg/kg。溶媒組對照0.02％稀醋酸水溶液。鹽水對照組生理鹽水。注射容量
均為2.0ml，耳靜脈部位先消毒，而后緩慢推注，1分鐘推注完。試驗期限
每天靜脈注射給藥1次，連續(xù)10天。給藥結(jié)束后24小時，每組活殺3只動物取注射部位的血管作病理檢查，每組留下的動物繼續(xù)觀察2周，活殺取注射部位的血管作病理學(xué)檢查。觀察記錄
每天上下午各觀察記錄1次，直到試驗結(jié)束。觀察的指標(biāo)包括注射部位的血管變化(血管顏色及手觸摸的軟硬度感)、全身的中毒反應(yīng)、食量(初步觀察進食情況，不作稱量計算)和體重(給藥前、給藥結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束時稱體重)等。一般表現(xiàn)
給藥期間及停藥后，動物給予替曲朵辛后精神狀態(tài)、體重(表26)、體溫(表27)、攝食未見異常。
表26 替曲朵辛靜脈注射對家兔體重(kg)的影響注Δn＝5.*n＝2。
表27 替曲朵辛靜脈注射對家兔體溫(℃)的影響注Δn＝5.*n＝2。給藥局部血管反應(yīng)
替曲朵辛注射液耳緣靜脈給予家兔，連續(xù)10天，注射血管未見變紅、變硬及腫脹等表現(xiàn)。停藥時及停藥2周后，取注射部位的組織進行病理檢查。結(jié)果顯示注射部位靜脈血管結(jié)構(gòu)正常，血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，血管壁未見炎癥反應(yīng)。因此，在本實驗條件下，替曲朵辛無溶血作用。替曲朵辛1.0μg/kg靜脈注射對家兔血管無明顯刺激作用。實施例8替曲朵辛的致突變試驗8.1替曲朵辛對沙門氏菌的誘試驗(Ames試驗)材料和方法替曲朵辛原料藥，南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供，純度95.6％。敵克松(P-Dimethylaminobenzenediazosulfonic Acid Sodium Salt)，縮寫Dexon，東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)，粉劑，溶于水。二氨基芴(2-Amino-fluoren)，縮寫2-AF，粉劑，溶于二甲基亞砜。Purum公司產(chǎn)品。二羥基蒽醌(1，8-Dihydroxyanthraquinone)，縮寫DAN，粉劑，溶于二甲基亞砜。Sigma公司產(chǎn)品。溶劑0.02％醋酸溶液。溶液配制與保存用萬分之一電子分析天平稱取TTX，無菌條件下，用溶劑配制成1mg/ml溶液，4℃存放。試驗前稀釋至所需濃度。實驗菌株選用TA97、TA98、TA100和TA102四株標(biāo)準(zhǔn)測試菌株。菌株由國內(nèi)其它實驗室提供。菌株在液氮冷凍下保存。劑量設(shè)計
替曲朵辛最高受試濃度為100μg/皿，最低濃度為0.01μg/皿，按10倍依次遞增。Dexon為四菌株的直接誘變劑對照，劑量為50μg/皿，2-AF為TA97、TA98和TA100的間接誘變劑對照，濃度為40μg/皿，DAN為TA102菌株的間接誘變劑對照，濃度為100μg/皿。各項試驗的描述和指標(biāo)檢測要求
試驗方法采用沙門氏菌誘變性試驗預(yù)培養(yǎng)方法，每測試點做三個平行樣本，重復(fù)試驗一次，結(jié)果取兩次試驗的均值。在活化與非活化兩種條件下進行試驗，每次試驗應(yīng)平行設(shè)有空白對照溶劑對照，S9對照及相應(yīng)的陽性對照。在確認(rèn)細(xì)菌背景生長良好的條件下，計數(shù)回變菌落數(shù)。如供試品引起的回變菌落數(shù)超過對照一倍以上，并有劑量反應(yīng)關(guān)系時，應(yīng)判供試品誘變試驗陽性，否則為陰性。實驗結(jié)果
替曲朵辛在0.01-100.0(最大溶解濃度μg/皿濃度范圍內(nèi)，在活化和非活化兩種測試條件下，均不誘發(fā)TA97、TA98、TA100和TA102四株菌突變率升高，表明替曲朵辛在Ames試驗中無基因誘變性。結(jié)果見表28、29。
表28 陽性誘變劑對沙門氏菌的誘變試驗結(jié)果濃度 回變菌落數(shù)(個/皿±SD)(μg/皿)S9 TA97 TA98 TA100 TA1020.0 -138±1836±5130±11270±45
+116±2740±11 154±21263±10Dexon(50.0) -1567±315 604±86 562±50858±79DMSO+126±4130±5129±17242±102-AF(40.0) -97±17 26±797±13
+1293±366 1538±3351795±303DAN(100.0) - 379±99
+ 906±69
表29 替曲朵辛對沙門氏菌誘變試驗結(jié)果濃度回變菌落數(shù)(個/皿±SD)(μg/皿)S9 TA97 TA98 TA100 TA1020.0 -138±1836±5 130±11270±45溶劑* -122±1730±8 140±12281±530.01-126±9 37±15132±15273±420.10-110±1631±9 123±25290±341.0 -114±2532±10131±17301±6610.0-114±1536±4 131±18282±63100.0 -126±1530±8 139±11292±550.0 +116±2740±11154±21263±10溶劑* +106±1938±13147±15277±280.01+142±1246±11142±18280±250.10+114±2444±19139±17266±301.0 +110±2442±13130±17299±5110.0 +108±2043±8149±14276±33100.0+119±3744±8127±16273±28*0.02％稀醋酸8.2替曲朵辛對CHL細(xì)胞染色體畸變試驗材料和方法替曲朵辛原料藥，南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供，純度95.6％。實驗細(xì)胞中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)，經(jīng)鑒定細(xì)胞核型穩(wěn)定，無支原體污染。劑量設(shè)計
高劑量為50％細(xì)胞生長抑制濃度，由于該藥毒性大，本試驗IC50劑量選擇120.0、60.0、30.0、15.0、7.5μg/ml，試驗結(jié)果替曲朵辛IC50未測出，因此，本試驗以替曲朵辛最大溶解度作為試驗最高劑量，依次遞減，具體劑量見表1、2。對照品空白(蒸餾水)、溶劑(0.02％醋酸)、S9混合液(0.5ml)及陽性對照直接誘變劑絲裂霉素C(MMC)，(0.25μg/ml)，間接誘變劑環(huán)磷酰胺(CP)，(20μg/ml)。代謝活化為彌補傳代培養(yǎng)細(xì)胞沒有代謝活化系統(tǒng)，用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)大鼠肝微粒體酶(S9)，進行體外代謝活化試驗。藥物作用時間在無代謝活化條件下，藥物與細(xì)胞作用24及48h收獲細(xì)胞。有代謝活化條件下，因(S9)具有一定毒性，藥物、S9混合物與細(xì)胞作用6h，洗滌、換液，于24及48h收獲細(xì)胞。標(biāo)本制作藥物與細(xì)胞作用24及48h收獲細(xì)胞，制做標(biāo)本。方法將3×104個CHL細(xì)胞接種于25ml培養(yǎng)瓶中(pH7.0)，37℃，5％二氧化碳箱培養(yǎng)72h后，加入不同濃度的替曲朵辛(以終濃度計算劑量)，S9用量為0.5ml，分別于24或48h收獲細(xì)胞。收獲細(xì)胞前4h加入秋水仙素，終止細(xì)胞分裂。經(jīng)低滲、固定、制作標(biāo)本、染色等。鏡檢選擇分散良好的中期相，每一試驗劑量標(biāo)本，在油鏡下分析100個中期分裂相。觀察染色單體型、染色體型及多倍體等變化，不計裂隙。以百分率表示畸變率。結(jié)果判定CHL細(xì)胞結(jié)果判定
畸變率＜5％陰性(-)
畸變率＞5％可疑(±)
畸變率＞10％ 陽性(+)
畸變率＞20％ 陽性(++)
畸變率＞50％ 陽性(+++)
如果某一測試點呈現(xiàn)可重復(fù)的并有統(tǒng)計學(xué)意義的增加(X2)，符合上述一條即可判為陽性。實驗結(jié)果
非代謝活化條件下替曲朵辛對CHL細(xì)胞染色體畸變作用結(jié)果見表30。表30 非代謝活化條件下替曲朵辛對CHL細(xì)胞染色體畸變作用觀察**P＜0.01與溶劑對照組比較
結(jié)果表明，實驗24及48h，空白對照染色體畸變率均為0％，溶劑對照染色體畸變率分別為3和2％，替曲朵辛在5.0-20.0μg/ml濃度范圍內(nèi)染色體畸變率在0-2％之間，染色體為結(jié)構(gòu)畸變。陽性藥物對照絲裂霉素C染色體畸變率分別為72和99％(P＜0.01)。
代謝活化條件下替曲朵辛對CHL細(xì)胞染色體畸變作用見表31。表31 代謝活化條件下替曲朵辛對CHL細(xì)胞染色體畸變作用觀察被試物 S9混合液 細(xì)胞收獲 觀察細(xì)胞數(shù) 染色體畸變率(μg/ml)(ml) 時間(h) (個)(％)空白對照- 24100 2溶劑對照- 24100 1溶劑對照0.5 24100 1S9 對照0.5 24100 1替曲朵辛 5.0 0.5 24100 0
10.0 0.5 24100 3
20.0 0.5 24100 0環(huán)磷酰胺 20.0 - 24100 0
20.0 0.5 24100 50**空白對照- 48100 2溶劑對照- 48100 2溶劑對照0.5 48100 3S9對照 0.5 48100 0替曲朵辛 5.0 0.5 48100 1
10.0 0.5 48100 1
20.0 0.5 48100 1環(huán)磷酰胺 20.0 - 48100 3
20.0 0.5 48100 42****P＜0.01與S9對照組比較
結(jié)果表明，實驗24及48h，空白對照染色體畸變率均為2％，溶劑對照染色體畸變率分別為1％和2％，溶劑加S9對照染色體畸變率分別為1％和3％，S9對照染色體畸變率為1％和0％，替曲朵辛在5.0-20.0μg/ml濃度范圍內(nèi)染色體畸變率在0％-3％之間，染色體為結(jié)構(gòu)性畸變。陽性藥物對照環(huán)磷酰胺染色體畸變率分別為50％和42％(P＜0.01)，而非代謝活化條件下環(huán)磷酰胺染色體畸變率為0％和3％。
以上結(jié)果表明，在非代謝活化條件下，空白對照，溶劑對照，替曲朵辛5.0-20.0μg/ml濃度范圍內(nèi)，染色體畸變率均在正常范圍，陽性對照絲裂霉素C染色體畸變率顯著增高。在代謝活化條件下，空白對照，溶劑對照，溶劑加S9對照，S9對照，替曲朵辛在5.0-20.0μg/ml濃度范圍內(nèi)染色體畸變率也均在正常范圍，陽性對照環(huán)磷酰胺染色體畸變率則顯著增高。同時，環(huán)磷酰胺若無代謝活化系統(tǒng)存在染色體畸變率則正常。以上結(jié)果表明本試驗系統(tǒng)可靠。因此，替曲朵辛在5.0-20.0μg/ml濃度范圍內(nèi)未見誘發(fā)染色體畸變率明顯增高。8.3替曲朵辛小鼠髓細(xì)胞微核試驗材料與方法替曲朵辛注射液，南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供，純度84％。實驗動物小白鼠，AMS系，年齡60-70天，雄性每組6只。體重18-24g。劑量設(shè)計
替曲朵辛給藥劑量設(shè)計
劑量約相當(dāng)LD50倍數(shù)
(μg/kg)
10 1/2～1
5 1/4～1/2
2.5 1/8～1/4試驗方法
10μg/kg給藥后分別于12、24、36、48、72h取材，觀察不同時間點小鼠微核率是否有變化。然后確定取材和時間。同時設(shè)溶劑對照、陽性對照(環(huán)磷酰胺60mg/kg)組，均為給藥后24小時取材觀察。給藥途徑和次數(shù)
肌肉注射(im)，兩次給藥，首次給藥后20小時第二次給藥，首次給藥后24h處死動物取材。給藥體積為0.03ml/10g體重。實驗結(jié)果
替曲朵辛10μg/kg組給藥后12，24，36，48及72h微核細(xì)胞率見表1。各組微核率均在正常范圍，根據(jù)上述結(jié)果，選定處死動物取材時間為首次給藥后24h。
表32.替曲朵辛(10μg/kg)給藥小鼠不同時間微核率
時間 多染紅細(xì)胞數(shù)微核細(xì)胞數(shù) 微核細(xì)胞率(％)
(小時)(個)(個) (x±SD)
12600022 3.7±2.2
2460008 1.3±1.0
36600018 3.0±1.1
48600016 3.0±1.3
72600024 4.0±2.5
溶劑24600013 2.2±0.8
替曲朵辛10，5，2.5，μg/kg三個劑量組誘導(dǎo)給藥后取材觀察，其結(jié)果見表33。10μg/kg組的微核率為4.3‰，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢測，與溶劑對照組比較差異比較顯著(P＜0.05)。其它各劑量組微核率均在正常范圍，陽性對照組與溶劑對照組比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢測差異非常顯著(P＜0.01)。
表33.替曲朵辛不同劑量給藥微核率劑量 多染紅細(xì)胞數(shù)微核細(xì)胞數(shù) 微核細(xì)胞率(‰)(μg/kg) (個)(個) (x±SD)10 600026 4.3±1.6*5600015 2.5±1.52.5 600013 2.2±1.3溶劑 600013 2.2±0.8CP(60μg/kg) 6000279 46.5±12.8**●與溶劑對照組比較P＜0.05**與溶劑對照組比較P＜0.01
以上結(jié)果表明，10μg/kg(相當(dāng)于1/2LD50)組經(jīng)肌肉注射誘導(dǎo)給藥后，微核率略有升高，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢測，與溶劑對照組比較差異比較顯著(P＜0.05)。但實際意義不大。其它各劑量組微核率均在正常范圍。實施例9替曲朵辛的生殖毒性試驗材料與方法替曲朵辛注射液，南寧楓葉藥業(yè)有限公司提供，純度84％。對照品溶劑對照，0.02％醋酸溶液；空白對照注射用水；陽性對照環(huán)磷酰胺，均為醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)。動物上海種小鼠，雌鼠250只；雄鼠80只。動物年齡80-100天，健康性成熟未生育受精小鼠，體重25-35克左右(♀)，30-40克左右(♂)劑量設(shè)計TTX給藥劑量分別為2.5、5.0和10.0μg/kg。陽性對照藥環(huán)磷酰胺給藥劑量為20mg/kg。給藥小鼠每天稱一次體重，根據(jù)體重變化，調(diào)整給藥量。劑距劑距以等比排列，相鄰組間相差2倍。
每只動物的接收容量V/10g體重)所有給藥組及對照組動物給藥容量為0.03ml/10g體重。給藥期雄性動物不給藥，雌性動物連續(xù)給藥期從妊娠第6天至妊娠第15天連續(xù)給藥10天，每天一次，肌肉注射。環(huán)磷酰胺在小鼠妊娠第11天時單次肌肉注射。給藥途徑臨床給藥途徑，肌肉注射。試驗方法
分別于妊娠d0、6、9、12、15和18稱母鼠體重，比較各組體重變化。于妊娠d18用頸推脫臼法處死母鼠，剖腹觀察母鼠內(nèi)臟器官及妊娠情況。對所有活胎鼠進行外觀畸形檢查。取半數(shù)活胎鼠用Bouin氏液固定三天后做徒手切片檢查內(nèi)臟，另半數(shù)用95％酒精固定茜素紅染色做骨骼標(biāo)本檢查。胎鼠觀察指標(biāo)活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、總著床數(shù)、胎鼠身長、尾長、體重、有無外觀、內(nèi)臟及骨骼畸形、上枕骨骨化程度等。實驗數(shù)據(jù)采用的統(tǒng)計分析方法各組母鼠平均體重，胎鼠體重、身長、尾長，用t檢驗檢查有無顯著性差別，活胎率、死胎率、畸形率用X2檢驗。實驗結(jié)果
替曲朵辛對母鼠的影響臨床癥狀和死亡給藥期間孕鼠一般狀況良好，給藥后籠旁觀察未見明顯異常癥狀和體征。
替曲朵辛2.5、5.0和10.0μg/kg三個劑量組妊娠d12母鼠體重，與溶劑對照組和注射用水對照組相比無明顯差別。妊娠d18替曲朵辛10.0μg/kg組母鼠體重有下降趨勢，與注射用水對照組相比，P＜0.05，差別顯著。該高劑量組母鼠體重增重下降至0.3±3.4g，與注射用水組3.2±2.1g相比較，P＜0.01，差別非常顯著。溶劑對照組妊娠d18天母鼠增重也有下降趨勢，與注射用水對照組相比，P＜0.05，有顯著性差別。環(huán)磷酰胺陽性對照組母體增重4.9±1.8g與溶劑對照組1.5±3.1g和注射用水組3.2±2.1g比，P均＜0.01，差別顯著。陽性對照組母鼠體重增加，可能與胎仔發(fā)育不良有關(guān)。
替曲朵辛給藥三個劑量組對活胎率、死胎率及胚胎早期吸收率與溶劑對照組和注射用水對照組相比，均無顯著性差別，P＞0.05，陽性對照組環(huán)磷酰胺對上述指標(biāo)也無明顯影響。說明替曲朵辛各給藥組及環(huán)磷酰胺20mg/kg于妊娠d11單次肌注均無胎毒作用。
替曲朵辛對胎鼠生長發(fā)育未見明顯影響。三個給藥組胎鼠的身長、尾長和體重測量結(jié)果與溶劑對照組和注射用水對照組相比均無顯著性差別(P＞0.05)。而環(huán)磷酰胺組胎鼠形體短小，胎鼠身長、尾長與體重與二個陰性對照組比較P＜0.01，差別非常顯著。
替曲朵辛對胎鼠骨骼系統(tǒng)發(fā)育無明顯影響。替曲朵辛三個給藥組上枕骨骨化程度均是0級和1級骨化，與溶劑對照組和注射用水對照組之間無顯著性差別。而環(huán)磷酰胺陽性對照組上枕骨III級骨化占6.4％，IV級骨化占89.6％與溶劑對照和注射用水對照組0％相比較，P＜0.05和0.01，差別顯著和非常顯著。
對替曲朵辛三個劑量組的胎鼠進行外觀畸形檢查，未見替曲朵辛的致外觀畸形作用。溶劑對照、注射用水對照組胎鼠也未發(fā)現(xiàn)外觀畸形。而陽性對照組環(huán)磷酰胺給藥胎鼠受檢查胎鼠258個，248個胎鼠出現(xiàn)外觀畸形，畸形率達96.1％，主要表現(xiàn)為形體短小、露腦、短尾、缺尾、短肢畸形等。
對替曲朵辛2.5、5.0和10.0μg/kg給藥組的89、146和106個胎鼠進行內(nèi)臟檢查，未發(fā)現(xiàn)替曲朵辛致內(nèi)臟畸形作用。二個陰性對照組也未發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟畸形，而環(huán)磷酰胺給藥組126個受檢胎鼠108個出現(xiàn)內(nèi)臟畸形主要表現(xiàn)為腭裂、腦缺失等，畸形率為87.5％。
替曲朵辛三個劑量組未發(fā)現(xiàn)骨骼畸形，而環(huán)磷酰胺陽性對照組則出現(xiàn)嚴(yán)重的骨骼畸形，主要表現(xiàn)為顱骨缺失、腰椎融合、無肋、無胸骨等，骨骼總畸形率為100％，與溶劑對照組和注射用水對照組相比較，P＜0.01，差別均非常顯著。替曲朵辛2.5、5.0和10.0μg/kg三個給藥組均出現(xiàn)少肋等骨骼變異，變異率為2.1、3.4和2.8％，與溶劑對照組和注射用水對照組少肋骨骼變異率2.0和1.4％相比較，無顯著性差別。結(jié)論
環(huán)磷酰胺陽性對照組引起胎鼠明顯的外觀、內(nèi)臟和骨骼畸形，表明選用上海種小鼠為試驗?zāi)Ｐ?，對致畸劑反?yīng)敏感。溶劑對照組和注射用水對照組對受孕率、活胎、死胎及早期吸收胎率，胚胎生長發(fā)育、畸形率等均在正常范圍，證明本次試驗結(jié)果是可靠的。
替曲朵辛三個給藥組，尤其是劑量高達10μg/kg(相當(dāng)于1/2小鼠肌注LD50)，母鼠出現(xiàn)體重及體重增重下降等輕度毒性反應(yīng)的情況下，對小鼠也未發(fā)現(xiàn)胚胎毒性及胎鼠外觀、內(nèi)臟和骨骼畸形，提示在本試驗選用的給藥時間和給藥劑量下，對上海種小鼠無胚胎毒性和致畸胎作用。
前述描述和具體實例只是為了揭示本發(fā)明的最佳實現(xiàn)方式以及原則，這是應(yīng)該可以理解。在相關(guān)領(lǐng)域的專業(yè)人士有能力對本發(fā)明進行修正和增加但不會脫離本發(fā)明的精神和范圍-大家可以理解這正是此申請所提出的權(quán)利要求項所要加以限制的。
權(quán)利要求
1.一種針對哺乳動物的疼痛的經(jīng)全身給藥的鎮(zhèn)痛方法，包括向所述的哺乳動物，重復(fù)全身給予有效劑量的純度為96％以上的河豚毒素或蛤蚌毒素，及其類似物。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述河豚毒素及其類似物是指分子式為C11H17N3O8的氨基喹唑啉化合物及其衍生物，包括但不局限于去水河豚毒素，胺基河豚毒素，甲氧基河豚毒素，乙氧基河豚毒素，脫氧河豚毒素及河豚酸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述全身給藥是指肌肉注射、皮下注射、靜脈注射、口服、舌下含服、皮膚貼敷、滲透泵植入、膠原、噴霧劑或肛門栓劑。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述疼痛為機械、化學(xué)、或缺血的刺激或者發(fā)炎而導(dǎo)致。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述疼痛為神經(jīng)損傷性疼痛。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述疼痛為癌癥疼痛。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述河豚毒素或和蛤蚌毒素，及其類似物的給藥劑量范圍為每公斤體重0.1到5μg。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的重復(fù)給藥是指在療程內(nèi)每日給藥一次或一次以上。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述哺乳動物包括但不限于生育年齡的雌性。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述河豚毒素并不會產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的副作用。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述河豚毒素并不會在給藥部位產(chǎn)生局部肌肉刺激。
12.如權(quán)利要求項1所述的方法，其中，所述河豚毒素并不會在所述哺乳動物體內(nèi)誘發(fā)全身過敏性反應(yīng)。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述河豚毒素并不會在所述哺乳動物體內(nèi)誘發(fā)溶血現(xiàn)象或血管刺激。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述的重復(fù)給藥是指在療程內(nèi)每日可以每3到12小時給藥一次。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述療程為1到10天，首選是3天，并可以重復(fù)1次或以上。
16.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述注射制劑包括一種河豚毒素的醋酸溶液。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的蛤蚌毒素，是指分子式為C10H17N7O4·2HCl的化合物及其衍生物。
18.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述疼痛是由以下癌癥中的一種產(chǎn)生肝癌，直腸癌，血癌、骨癌、淋巴癌、食道癌、生殖器癌、前列腺癌、消化道癌、胃癌、結(jié)腸癌，乳房癌、呼吸道癌、肺癌、支氣管癌、泌尿系統(tǒng)癌、淋巴瘤和皮膚癌。
全文摘要
本發(fā)明為哺乳動物的疼痛提供了一種新的經(jīng)全身給藥的鎮(zhèn)痛方法。本方法包括向所述的哺乳動物,重復(fù)全身給予有效劑量的純度為96%以上的河豚毒素或蛤蚌毒素,從而緩解疼痛。
文檔編號C07D491/16GK1356104SQ0012451
公開日2002年7月3日 申請日期2000年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月18日
發(fā)明者董慶濱, 沈希光 申請人:威克斯醫(yī)療儀器有限公司