專利名稱：一種含有oatp1b1啟動子和報告基因的重組質粒及篩選oatp1b1誘導劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過激活孕烷受體(PXR)來調節(jié)其下游靶基因有機陰離子轉運體IBl表達的誘導劑篩選方法。本發(fā)明還涉及含熒光報告基因的質粒。
背景技術：
肝臟是生物轉化解毒的主要器官，在肝臟中存在多種類型的藥物轉運體，對于藥物的吸收、分布和排泄起重要作用，如多藥耐藥相關蛋白，乳腺癌耐藥蛋白，有機陰離子轉運多肽家族等。0ATP1B1是有機陰離子轉運多肽家族中最為重要的成員，0ATP1B1的編碼基因SLC01B1不僅具有高度多態(tài)性，且已發(fā)現多個具有功能意義的突變型。目前已研究證實，0ATP1B1除靶向轉運非結合型膽紅素、膽汁酸、甲狀腺激素等多種內源性物質外，還介導多種具有重要臨床意義藥物的肝臟跨膜轉運，如抗惡性腫瘤藥(伊立替康、甲氨喋呤)、調血脂藥(普伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、羅蘇伐他汀、西伐他汀)、抗高血壓藥(纈沙坦、 奧美沙坦、波生坦)、抗高血糖藥(瑞格列奈、那格列奈)。0ATP1B1功能增強(如被誘導) 時，轉運底物的能力提高，進入肝細胞的底物數量增加；反之，0ATP1B1功能降低(如某些位點的基因突變)時，進入肝細胞內的底物減少。因此0ATP1B1功能改變不僅與膽紅素血癥有密切聯系，而且與藥物的療效和毒副作用緊密相關。全基因組關聯研究(Genome-wide Association Study, GffAS)表明0ATP1B1功能缺陷的*5/*5基因突變者，轉運辛伐他汀進入肝細胞的功能降低，致使辛伐他汀轉運進肝細胞的數量減少、血漿藥物濃度過高，致使其降脂療效減弱而導致肌病等不良反應增加。因此，研究藥物對0ATP1B1的誘導作用對于膽紅素血癥治療以及藥物安全合理應用有著重要的意義，見下表。0ATP1B1轉運藥物的毒副反應及解決方案等相關信息
藥物相關疾病靶器官毒副反應解決途徑采取策略普伐他汀、阿托伐他汀、高脂血癥肝內橫紋肌溶解、肌炎，提髙肝內藥物濃度，減少誘導匹伐他汀、羅蘇伐他汀“膽固醇逃逸”循環(huán)血藥濃度，調整劑量0ΛΤΡ1Β1高膽紅肝內加快肝細胞對膽紅素的誘導素血癥攝取、排泄0ATP1B1 原代培養(yǎng)的人肝細胞模型是經典的體外酶、轉運體誘導研究模型。然而，人肝細胞模型受到倫理道德、組織來源、培養(yǎng)條件、無法做到高通量等眾多限制，在實際研究中很少采用。因此，發(fā)明一種原材料易獲得、操作簡便、成本低廉、可實現高通量篩選的新方法應用在0ATP1B1誘導劑的開發(fā)研究中顯得尤為重要
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種高通量篩選0ATP1B1誘導劑的方法.本發(fā)明的另一目的是提供一種含有0ATP1B1基因啟動子(-U8to_lll 和-9957to-9940)和報告基因的重組質粒。本發(fā)明首先提供一種含有0ATP1B1啟動子和報告基因的重組質粒，所說的 OATPIBl 的啟動子區(qū)域是-U8to-lll 和-9957to_9940。其中本發(fā)明所述的含有0ATP1B1基因啟動子和報告基因的重組質粒中所述報告基因可以為螢火蟲熒光素酶基因，氯霉素乙酰轉移酶、堿性磷酸化酶、β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白、內酰胺酶等。每種熒光素酶都可以通過商業(yè)途徑獲得，也都各自有其特點。 但總的來說，由于螢火蟲熒光素酶檢測靈敏度高，檢測容易等特點是目前最常用的作為啟動子研究的報告基因。制備重組質粒的方法是已知的，例如由美國冷泉港實驗室出版社的《分子克隆實驗指南》詳細論述了重組質粒的制備方法。本發(fā)明利用上面獲得的重組質粒，通過以下方法來實現的篩選化合物的，包括如下步驟第一步將前述獲得的含有0ΑΤΡ1Β1啟動子和報告基因的重組質粒、P)(R表達質粒、以及內參質粒海腎熒光素酶共轉染至人肝癌細胞株HepG2細胞中；第二步加入待篩選的可能具有激活P)(R調節(jié)0ATP1B1基因表達的化合物；第三步采用化學發(fā)光檢測報告基因的表達以及海腎熒光素酶熒光，以二者的比值來反映不同的待篩選化合物對0ATP1B1基因表達的影響。研究發(fā)現，核受體對0ATP1B1的表達具有重要的調控作用，其中孕烷X受體(PXR) 是0ATP1B1最主要的轉錄調控因子。研究表明，P)(R被激活時，作用于0ATP1B1啟動子區(qū)域 (-128to-lll和-9957to-9940)，使OATPIBl表達水平明顯上調。如16 α -氰基孕烯醇酮 (PCN)、石膽酸、利福平等均可以通過激活P)(R而誘導0ΑΤΡ1Β1的表達增強、功能上調。P)(R的發(fā)現為研究0ATP1B1的誘導效應提供了新的思路?；谶@一思路，將構建的0ATP1B1啟動子熒光報告基因質粒、P)(R表達質粒(現有技術中已經公開，例如胡東莉等，CYP3A4和CYP2B6 藥物誘導劑體外篩選體系的建立，中國醫(yī)學工程，文章編號1672-20190007)08-0646-04) 和海腎熒光素酶一起瞬時共轉染至人肝癌細胞株HepG2細胞中，構建成雙熒光報告基因檢測平臺，即可在化學發(fā)光檢測儀上檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光與海腎熒光的比值反應不同的可能活性化合物對0ATP1B1轉運體影響。該方法的建立為高通量篩選0ATP1B1誘導劑提供了可能。從而為疾病治療、藥物相互作用、藥物安全合理運用及新藥臨床前研究提供更多的科學依據。原理作為內對照的海腎熒光素酶質粒和待測的熒光報告基因系列質粒分別編碼海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶兩種不同的蛋白質。在形成氧化熒光素過程中，通過介導電子轉移將化學能轉化為光能，因而發(fā)光。兩個報告基因在實驗宿主細胞內均無內源活性， 即1、宿主細胞內沒有這兩個報告基因；2、兩個報告基因本身不參與細胞的生理活動。可在單個樣品中連續(xù)測量。在測量過程中，首先加入熒光素酶檢測試劑II產生螢火蟲熒光信號，信號持續(xù)至少lmin，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強度后，再在同一樣品中加 A^op&Glo 試劑，將上述反應猝滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應，同時進行第二次測量。
本發(fā)明的重組質粒其中的雙熒光素酶報告基因檢測基因表達具有如下優(yōu)點1)靈敏度高、特異性強、檢測速度快、費用低、材料易獲得；2)同時具有靶向性的特點，能夠特異性檢測激活P)(R從而影響0ATP1B1表達的活性化合物；3)克服了轉染效率的影響。


圖1是本發(fā)明提供的0ATP1B1啟動子熒光報告基因重組質粒及雙酶切后的電泳圖；圖2是本發(fā)明重組質粒pGL-4. 17-0ATP1B1測序圖；圖3是本實驗的操作流程圖；圖4是利福平激活P)(R對0ATP1B1表達的影響結果；圖5是中藥單體黃芩苷激活P)(R對0ATP1B1表達的影響結果。具體的實施方式實施例1構建0ATP1B1啟動子熒光報告基因質粒，瞬時轉染至H印G2細胞，構建雙熒光報告基因技術平臺。一、材料1.質粒、細胞株pGL-4. 17熒光報告基因載體，pPEM-T載體，pcDNA3. 1-myc/hisB(-)真核表達載體美國promega公司。HepG2細胞株中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫。2.主要試劑胎牛血清(杭州四季青)；MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；50ml細胞培養(yǎng)瓶， 24孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)；RevertAid First Strand cDNA逆轉錄試劑盒 (Fermentas 公司)；Lipofectamine 2OOO 脂質體(美國 hvitrogen 公司)；DNA 提取試劑盒(promega) ；Trizol (美國 Invitrogen 公司)。3.主要儀器PCR儀(美國Hiermo)；電泳設備(北京六一)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Iliermc^orm， SeriesII)；超凈工作臺(美國thermal) ；Sirius C單管式化學發(fā)光檢測儀(Berthold公司)；GIS-2009凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon公司)；低溫微量離心機(Eppendorf公司)。二、實驗方法1. OATPIBl啟動子熒光報告基因質粒的構建1. 1血樣采集和DNA抽提采集健康志愿者外周靜脈血5mL，至于EDTA抗凝的玻璃試管，貯存于_40°C冰箱備用。按照標準苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，置于4°C冰箱備用。1. 20ATP1B1PCR1.2.1引物設計根據人的0ATP1B1啟動子序列及P)(R與其啟動結合的區(qū)域設計引物
結合區(qū)l(-128to_lll)引物F為上游5'端引物，其中包含19個0ATP1B1基因啟動子互補堿基，一個KpnI識別位點，2保護堿基；引物R為上游3'端引物，其中包含19個0ATP1B1基因啟動子互補堿基，一個Nhel 識別位點，2保護堿基；引物 F TCGGTACCCCAGTGATGATTAACCACC引物 R :CCCGATCG CCAGGTGGTATCTCCAGTC結合區(qū)2(-9957to-9940)引物F為上游5'端引物，其中包含19個0ATP1B1基因啟動子互補堿基，一個Hind III識別位點，2保護堿基；引物R為上游3'端引物，其中包含19個0ATP1B1基因啟動子互補堿基，一個B10I 識別位點，2保護堿基；引物FTCAAGCTTCAAGCAGGGGCAATCTGTC
引物RCCCTCGAGGAGGGAGTAGGCAATGCTC
1. 2. 2擴增片段(--128to-lll) ；(-9957to-!
1. 2. 3擴增體系
前引物(10 μ M)0. 5μ 1
后引物(10 μ Μ)0. 5μ 1
dNTP (2. 5mM)1. 5μ 1
rTaq 酶(5u/ μ 1)0. 20 μ 1
10XPCR buffer2. 5μ 1
MgCl 20. 5μ 1
ddH2017. 30 μ 1
cDNA2μ 1
最終反應體系25 μ 1
1.2. 4擴增條件
結合區(qū)1擴增條件
95 0C5分
95 0C30秒
56 0C30秒40循環(huán)
72 0C1分
72 0C5分
結合區(qū)2擴增條件
95 0C5分
95 0C30秒
60 0C30秒40循環(huán)
72 0C1分
72 0C5分1.3擴增產物回收擴增產物于1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳60min，溴乙錠染色，于紫外燈下切下目的條帶膠塊。用QIAGEN公司的凝膠回收試劑盒回收目的片斷，步驟如下①切好的膠塊稱重后置于1.5EP管內，加3倍于凝膠重量的QXlbuffer，加入 lOulQIAEX II (玻璃粉末)；顛倒混勻，充分重懸QIAEX II。②50°C水浴lOmin，每^iin顛倒混勻EP管，重懸玻璃粉末。③ 13000r/min 離心 lmin，棄上清。④加500ul QXlbuffer，重懸玻璃粉末。⑤ 13000r/min 離心 lmin，棄上清。⑥加入500ul buffer PE，重懸玻璃粉末。⑦ 13000r/min 離心 lmin，棄上清。⑧在50烤箱干燥3-5min，直到沉淀變白。⑨加入20ul ddH20，室溫孵育5min充分溶解。1. 4把OATPIBl的PCR產物連接在pPEM_T載體上，提取質粒，酶切和測序。擴增產物均用rTaq酶于70°C，10min加“A”。與pGEM-Τ載體進行連接反應，反應體系2Xligation buffer 5. Oul，力口 “Α” 的 per 產物 3. 5ul，T vector 0. 5ul, T41igase LOul ； 16°C水浴過夜。連接產物轉化JM109大腸桿菌，步驟如下①連接產物20ul加入200ul自制的JM109感受態(tài)細菌中，輕輕旋轉數次混勻，冰上放置30min。②42°C水浴熱休克80s。③快速置冰上冷卻2_;3min。④加入不含Amp的LB液體培基800ul。⑤37°C，150r/min,振搖 Ih。⑥ 13000r/min 離心 10s，去上清 800ul。⑦重懸沉淀，均勻涂布于Amp陽性的LB固體培養(yǎng)基上。⑧倒置培養(yǎng)板于37°C培養(yǎng)16h。挑菌落培養(yǎng)，從大腸桿菌中提取與目的片斷相連的T質粒，堿裂解法小量抽提質粒DNA，進行酶切鑒定。重組克隆使用SPIN柱抽提純化質粒，用于測序。OMEGA D6942-01試劑盒提取質粒步驟如下I離心收集1.5_5ul菌液沉淀。II加入250ul包含RNA酶的solution I (細菌重懸液)，充分重懸沉淀
III加入250ul solution II (細菌裂解液)，輕輕顛倒混勻4-6次，室溫孵育^iin 充分裂解細菌。IV加入350ul solution 111(蛋白沉淀液)，輕微顛倒混勻6-8次，使蛋白質充分沉淀。V 13000g 室溫離心 lOmin。VI轉移上清于 HiBind 柱，13000r/min 離心 lmin。ΥΠ加入 500ul Buffer HB，13000r/min 離心 lmin。VDI加入 700ul Wash Buffer，13000r/min 離心 lmin。IX重復步驟VIL
7
X 13000r/min 空轉 2min。XI換新的無菌1.5EP管，加入HiBind柱中60ul ddH20，室溫孵育anin。13000r/min 離心 lmin，收集質粒。1. 5將測序證實插入片段無PCR錯配的質粒DNA和PGL4. 10載體用內切酶雙酶切， 用瓊脂糖電泳分別回收插入片段及載體，使用凝膠塊快速鏈接。轉化JM109大腸桿菌，挑取單克隆抽提質粒，酶切鑒定，步驟同上。1.6重組克隆進一步培養(yǎng)擴增。使用PR0MEGA中量質粒提取試劑盒制備質粒DNA。質粒DNA保存在70%乙醇中保持無菌狀態(tài)，_20°C凍存待用。步驟如下I 50ul 菌液加入 50ml LB 液體培基中，220rpm/min 振搖 12_16h。II 5000g離心5min收集細菌，棄上清，在濾紙上留盡余液。III加入3ml細胞重懸液(cell resuspension solution)用槍充分打勻。IV加入3ml細胞裂解液(cell lysis solution)，輕輕顛倒3-5次，靜置3min。V加入 5ml 平衡液(neutralization solution)，輕輕顛倒 5-6 次，直立 2_3min， 至白色沉淀出現。VI將藍色干凈的離心柱放在新的50ml離心管上。ΥΠ將上清導入干凈的離心柱，靜置anin。VDI 3000g 離心 5min。IX將濾液導入結合柱(binding column)，用廢的50ml離心管收集下清，3000g離心3min，棄下清。X結合柱中加入20ml洗脫液，1500g離心5min，棄下清，3000g重復離心5-10min。XI空轉后濾紙吸盡乙醇。ΧΠ加入800ul ddH20，3000g離心5min，干凈的50ml離心管收集下清，最后移入 1. 5EP管中分裝-40°C保存待用。2. PXR cDNA表達質粒的構建2. IRNA抽提和逆轉錄用iTrzol從原代培養(yǎng)的肝細胞中提取總RNA，用RevertAid First Strand cDNA 逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。2. 2PXRPCR2. 2.1 引物2. 2. 2擴增編碼區(qū)長度2. 2. 3擴增體系2. 2. 4擴增條件2. 3把PXR的PCR產物連在pPEM_T載體上和測序2. 4將測序證實插入片段無PCR錯配的質粒DNA和pcDNA3. 1-myc/hisB (-)載體雙酶切，用瓊脂糖電泳分別回收插入片段及載體，使用凝膠塊快速鏈接。轉化JM109大腸桿菌，挑取單克隆抽提質粒，酶切鑒定。重組克隆進一步培養(yǎng)擴增，抽提質粒DNA。質粒DNA保存在70%乙醇中保持無菌狀態(tài)，-20°C凍存待用。3.雙熒光報告基因檢測
步驟如下3. 1.培養(yǎng)H印G2細胞;待H印G2細胞生長至對數期時，消化以每孔2 X IO5個細胞的密度接種至M孔板， 待細胞生長至80%。3. 2.共轉染3. 2. 1每孔分別需轉入600ng P)(R質粒，300ng 0ATP1B1啟動子熒光報告基因質粒和50ng海參熒光素酶。用適量不含抗生素和胎牛血清的培養(yǎng)液分別稀釋DNA和 Lipofectamine2000脂質體后，將二者混合，室溫放置20min。3. 2. 2用PBS清洗細胞三次，然后每孔加入不含胎牛血清MEM培養(yǎng)基1ml。3. 2. 3將上述混合物(DNA/脂質體)按每孔200ul加入到M孔板中，輕輕晃動培養(yǎng)板使其混勻。3.3.加陽性藥物利福平處理6h后，換新鮮含10%胎牛血清的MEM，同時加入藥物。設對照組、陽性藥物利福平組(IOumol)，每組4個復孔。3.4.利福平對報告基因的活性影響3. 4. 1孵育24h后，將培養(yǎng)基從待檢細胞吸出。3. 4. 2用1 X PBS輕輕漂洗細胞洗3次。3. 4. 3向細胞培養(yǎng)孔中加入適量1 X被動裂解緩沖液(PLB)。3. 4. 4檢測熒光素酶活性。a)在1. 5ml離心管中加入20ul細胞裂解液，然后加入 IOOul的LARII溶液，混合后放入發(fā)光檢測儀檢測第一次發(fā)光值(螢火蟲熒光值)；b)然后加入Mop&Glo檢測液，終止第一次發(fā)光，同時開始第二次發(fā)光，混合后放入發(fā)光檢測儀檢測第二次發(fā)光值(海腎熒光值)。4.結果判定以螢火蟲熒光與海腎熒光的比值分別反映不同待檢測化合物激活PHUiOATPlBl 啟動子活性的影響。啟動活性就是看兩個熒光素酶的比值，比值大活性強，比值小活性弱。 那么評價標準就是看加藥組的比值與不加藥組的比值的差異。有差異就認為藥物有活性。 如加有利福平的細胞組熒光比值為5. 013士0. 894，未加利福平處理的細胞組，熒光值為 2. 305士0. 630，(ρ < 0. 05)(見圖 4)。實施例2采用上述建立的實驗方法研究中藥單體化合物黃芩苷是否可以通過激活P)(R來誘導0ATP1B1表達。操作步驟1.培養(yǎng)H印G2細胞；待H印G2細胞生長至對數期時，消化以每孔2X IO5個細胞的密度接種至M孔板， 待細胞生長至80%。2.共轉染2. 1每孔分別需轉入600ng P)(R質粒，300ng 0ATP1B1啟動子熒光報告基因質粒和50ng海參熒光素酶。用適量不含抗生素和胎牛血清的培養(yǎng)液分別稀釋DNA和 Lipofectamine2000脂質體后，將二者混合，室溫放置20min。
2. 2用PBS清洗細胞三次，然后每孔加入不含胎牛血清MEM培養(yǎng)基1ml。2. 3將上述混合物(DNA/脂質體)按每孔200ul加入到M孔板中，輕輕晃動培養(yǎng)板使其混勻。3.加中藥單體化合物處理6h后，換新鮮含10%胎牛血清的MEM，同時加入藥物。設對照組、陽性藥物利福平組(IOumol)、待檢測中藥單體化合物黃芩苷組(1、10、IOOumol三個濃度組)，每組4個復孔。4.中藥單體化合物黃芩苷對報告基因的活性影響4. 1孵育24h后，將含有藥物中藥單體化合物黃芩苷的培養(yǎng)基從待檢細胞吸出。4. 2用IXPBS輕輕漂洗細胞洗3次。4. 3向細胞培養(yǎng)孔中加入適量IX被動裂解緩沖液(PLB)。4. 4檢測熒光素酶活性。a)在1. 5ml離心管中加入20ul細胞裂解液，然后加入 IOOul的LARII溶液，混合后放入發(fā)光檢測儀檢測第一次發(fā)光值(螢火蟲熒光值)；b)然后加入Mop&Glo檢測液，終止第一次發(fā)光，同時開始第二次發(fā)光，混合后放入發(fā)光檢測儀檢測第二次發(fā)光值(海腎熒光值)。以螢火蟲熒光值與海腎熒光值的熒光比值分別反映中藥單體化合物黃芩苷激活P)(R對0ATP1B1啟動子活性的影響。5.結果判定以螢火蟲熒光與海腎熒光的比值分別反映不同可能活性化合物激活P)(R對 0ATP1B1啟動子活性的影響。研究發(fā)現黃芩苷能通過激活P)(R使0ATP1B1轉錄活性增強 (見圖5)。黃芩苷在UlOUOOumol三個濃度時，其測得的熒光比值分別為4. 527士0. 291、 4. 810士0. 846,5. 102 士0. 586，與對照組 2. 348士0. 404 比較 P 值小于 0. 05。
權利要求
1.一種含有0ATP1B1啟動子和報告基因的重組質粒，所說的0ATP1B1的啟動子區(qū)域是-128 至-111 和-9957 至-9940。
2.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于所說的報告基因為螢火蟲熒光素酶。
3.一種高通量篩選0ATP1B1誘導劑的方法，包括如下步驟第一步將權利要求1或2所獲得的重組質粒、P)(R表達質粒、以及內參質粒海腎熒光素酶共轉染至人肝癌細胞株HepG2細胞中；第二步加入待篩選的可能具有激活P)(R調節(jié)0ATP1B1基因表達的化合物； 第三步采用化學發(fā)光檢測報告基因的表達以及海腎熒光素酶熒光，以二者的比值來反映不同的待篩選化合物對0ATP1B1基因表達的影響。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子藥理學領域，涉及一種通過激活孕烷受體(PXR)來調節(jié)其下游靶基因有機陰離子轉運體1B1表達的誘導劑篩選方法。該方法是通過克隆有機陰離子轉運體1B1(OATP1B1)基因的啟動子特異性序列(-128to-111和-9957to-9940)并重組到螢火蟲熒光素酶報告基因載體，同時構建人PXR表達質粒。將構建的OATP1B1熒光報告基因重組質粒，人PXR表達質粒以及海腎熒光素酶共轉染至人肝癌細胞株HepG2細胞。同時檢測螢火蟲和海參熒光素酶的活性反應OATP1B1基因啟動子的轉錄活性。從而建立靶向篩選OATP1B1誘導劑的方法，進而為疾病治療、藥物相互作用、藥物安全合理運用及新藥臨床前研究提供更多的科學依據。
文檔編號C12Q1/66GK102373231SQ20101025249
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權日2010年8月13日
發(fā)明者吳蘭香, 周宏灝, 張偉, 郭成賢 申請人:中南大學