專利名稱：肽核酸探針生物芯片及其表面等離子體共振的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域及基于其的檢測方法，尤其是涉及肽核酸探針生 物芯片及其表面等離子體共振的檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，芯片技術(shù)必將成為未來臨床疾病 診斷中不可缺少的一個新內(nèi)容。芯片技術(shù)是伴隨人類基因組計劃而產(chǎn)生的，是 近年來分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的重要逸艮，其突出特點在于高速度、高通 量、高并行性及多樣化、微型化、自動化等，已經(jīng)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)技術(shù)研究 的熱點，在基因診斷、藥物開發(fā)和毒性分析、病原檢測等多個領(lǐng)域顯示出巨大 的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價值。
目前，盡管芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，得到世人的矚目，但是仍然 存在著許多的問題，而且價格昂貴，從而嚴重地制約了芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用和 進一步發(fā)展。如在標(biāo)記方法上，熒光法是目前使用最多的方法，但它的靈敏度 不高、需要避光，雜交完成后要快速檢測以免熒光淬滅，另外結(jié)果檢測需用價
格極其昂貴的激光掃描儀等特殊設(shè)備；同位素標(biāo)記法由于需要同位素和放射自 顯影，有使用不便，操作復(fù)雜，耗時較長、有污染的缺點。尤其是在基因芯片
的檢測中，由用熒光標(biāo)記會影響PCR擴增效率，同位素標(biāo)記常用的如"P和"P 半衰期又太短，均不易推廣使用，而且PCR擴增既需要設(shè)計引物，又要PCR儀， 需要對各檢測對象的耙序列建立不同的擴增體系、擴增方法和擴增條件，這顯 然大大增加了工作量和工作難度?？傊?，芯片技術(shù)在樣品的制備、探針合成與 固定、分子的標(biāo)記、^t據(jù)的讀取與分析等幾個方面仍然存在著許多難以解決的 問題。特別是技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜、檢測靈敏度較低、重復(fù)性差、分析泛圍較 狹窄等問題限制了該技術(shù)在生物檢測中的應(yīng)用。
肽核酸(Peptide Nucleic Acid, PNA)是借助計算機輔助設(shè)計的一種DM 模擬物，與DNA—樣也是由ATCG四種堿基的單體聚合而成，只是兩者的骨架 結(jié)構(gòu)不同DNA是由磷酸二酯鍵連接而成的磷酸戊糖骨架；而PNA是由酰胺鍵 連接的重復(fù)的N-2-氨乙基苷氨酸單位構(gòu)成的。PNA不易被蛋白酶、核酸酶等降 解，也不與血清中蛋白結(jié)合，但可以通過ATCG四種堿基的互補配對原則和DNA 雜交結(jié)合。由于PNA的假肽骨架是電中性的，PNA與DNA或RNA間的雜交不存在靜電斥力，因而具有更強的親和性，其結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大大提高。
雖然目前還未有以PNA作為探針用于基因或蛋白芯片檢測方面的報道，但 我們的分析認為，與傳統(tǒng)的DNA探針相比，PM做為核酸雜交探針在理論上可 能更具有優(yōu)勢。因為傳統(tǒng)DNA探針只能與單鏈的DM雜交結(jié)合，我們知道PCR 產(chǎn)物都是雙鏈的，因此在雜交前必須通過變性過程使雙鏈的PCR產(chǎn)物解體為單 鏈的DNA片段，而且在雜交過程中必須保持低溫以防止產(chǎn)物DNA復(fù)性而影響雜 交效率，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。但PNA作為探針其不僅僅可以與單鏈的DNA雜交高 效雜交，甚至還可以直接與雙鏈DNA以鏈侵襲模式結(jié)合形成穩(wěn)定的 MA-PNA-DNA的三鏈復(fù)合物，因此大大增加了對DNA的檢測能力，且可降低標(biāo) 本處理的復(fù)雜性，簡化前期標(biāo)本的準(zhǔn)備時間和操作過程，從而為臨床快速基因 檢測提供了可能。
基于上迷理論，我們開創(chuàng)性地以PNA為探針，對PM與DNA、蛋白質(zhì)的結(jié)合 活性，^t其做為芯片檢測的探針特性和雜交特性等系統(tǒng)地進行了研究，并與 現(xiàn)行的芯片檢測探針進行比較；在此^il上，并首次將PNA芯片引X^面等離 子體共振傳感器，對其做為檢測探針的芯片的特異性、敏感性，及實際檢測應(yīng) 用的方法與特性進行了詳細的研究。
表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)傳感器是近年迅 速發(fā)M來的新型光學(xué)傳感器裝置，其突出特點是可以實時(real time)、在 線(on line)地檢測生物分子之間的相互作用，而且不需要標(biāo)記及純化，是 當(dāng)前國際傳感器領(lǐng)域的研究熱點之一。其基本原理是當(dāng)入射光以一定的角度經(jīng) 一組光學(xué)器件一一通常為一高折射率的棱鏡上順序放置一層低折射率的耦合 層(多為金屬薄膜)耦合激發(fā)后，在金屬膜界面上發(fā)生表面等離子體共振，即 入射光與界表面的自由電子會發(fā)生相互作用，其中部分入射光波被電荷密度波 吸收，則入射光線不能發(fā)生全反射，從而導(dǎo)致反射光的強度大大減弱，反射角 也發(fā)生明顯的偏差，而且這種反射光的強度和角度的變化與界面上吸附的生物 物質(zhì)分子數(shù)量的多少成一定的比例關(guān)系。
作為探針固定的硫醇化合物表面單分子層自組裝層(Self- assembled Monolayer, SAM)技術(shù)自20世紀80年代初報道以來，由于其滿足了作為模型 界面的幾個主要要求，包括和基底的牢固結(jié)合，可控制的分子取向有序排列， 可控制的外表面性質(zhì)及可控制的厚度等方面，因此很快地得到了各方的關(guān)注。 總的來說，SAM是基于g化合物與基底材料(如金、銀、鉑等)的強烈化學(xué) 結(jié)合而形成的。如在金膜表面，巰基被氧化而生成石危金化合鍵。其化學(xué)反應(yīng)式 如下2Au+2RSH—2Au-SR+H2。 Au-S之間的化學(xué)鍵合力;f艮強，其鍵能高達184k J/mol，很少有其他基團可以與其竟?fàn)?，這就保證了結(jié)合的選擇性。同時，SAM的排列緊密有序，對酸、堿、離子滲透等有較強的抵抗力。應(yīng)用此方法固定探 針可以使探針結(jié)合牢固，且排列有序、分布均勻。我們基于巰基與金屬表面的
這種強烈化學(xué)結(jié)合的特性，在本發(fā)明中將巰基修飾的PNA探針與SPR設(shè)備的金 屬薄膜結(jié)合，制成PNA探針陣列的芯片，從而完成對各種把基因、蛋白的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供肽核酸(PNA )作為探針的生物芯片及其相應(yīng)的SPR 檢測方法。通過本發(fā)明，可以繞過對樣品進行擴增，簡化樣本處理步驟，提高 檢測的靈敏度和特異性；且以光學(xué)信號作為檢測信號，既穩(wěn)定，又易于檢測， 使結(jié)果檢測、分析的設(shè)備和技術(shù)大為簡化。從而可以充分利用生物芯片技術(shù)的 高通量、高敏感、高特異的特性，克服目前檢測芯片存在的主要缺點。并且為 了進一步提高芯片檢測的效率。我們還在傳統(tǒng)SPR傳感器的基礎(chǔ)上，研究開發(fā) 了一種更簡單的、易實施的、價廉的納米金屬膜的鍍制方法，自行設(shè)計編制了 相應(yīng)的的信息處理和操作控制軟件，設(shè)計裝配了小型的流動樣本注入系統(tǒng)，及 適用于芯片預(yù)雜交、雜交及漂洗的溫控測試池，從而使該傳感器更具有了適用 于芯片檢測的高自動化及智能化。由于本發(fā)明研究提供的這種生物芯片及其快 速檢測的方法具有雜交、檢測設(shè)備簡單，技術(shù)穩(wěn)定易于掌握，靈敏度高，重復(fù) 性好，應(yīng)用范圍廣等的特性，其必將成為可廣泛應(yīng)用于普通實驗室，甚至野外 環(huán)境的新一代生物芯片。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明檢測系統(tǒng)的生物芯片固相栽體上連接 的是肽核酸(PNA)檢測探針，肽核酸(PNA)探針?biāo)街木哂斜砻娴入x子體 共振(SPR)響應(yīng)特性的金屬薄膜是金膜，采用化學(xué)還原法制備納米金膠體液，在
芯片片基表面直接鋪制二維的納米金膜層，應(yīng)用探針的固化-自組裝單分子層 技術(shù)在納米金膜表面點制探針陣列；基于肽核酸探針生物芯片的表面等離子體 共振的檢測方法，其檢測步驟如下
(1) 在芯片片M面鋪制具有等離子體共振(SPR)感應(yīng)性的納米金膜(厚度 為10nm~ 150mn),在納米金膜表面點制肽核酸(PNA )探4十陣列制備芯
片；
(2) 處理標(biāo)本，并與生物芯片上的探針進行雜交反應(yīng)；
(3) 利用等離子體共振(SPR)設(shè)備對^:針雜交區(qū)進行偏振it^測，利用等 離子體共振(SPR)原理分析陣列探針雜交反應(yīng)，獲取結(jié)果。
在芯片片基表面鋪制具有等離子體共振(SPR)感應(yīng)性的納米金膜和在納米 金膜表面點制肽核酸(PNA)探針陣列方法的步驟包括
(1) 按Frens法(檸檬酸三鈉還原法)制備納米金溶液；
(2) 以(氨乙基)-Y氨丙基三價氧M烷UPTMS)為核心鋪制性質(zhì)均一的SPR納米金膜；
(3) 所鋪納米金膜氮氣干燥后密封備用；
(4) 清潔處理制備好的鈉米金膜；
(5) 以表面自組裝單分子層4支術(shù)點制肽核酸(PNA )探針陣列，生成揮:4十 的自組裝陣列；
(6) 清洗芯片，去除未組裝的探針，干燥后封閉備用。 標(biāo)本的處理方法及生物芯片上的探針進行雜交反應(yīng)步驟包括
(1)提取細菌、細胞及組織的DNA或RM;由PCR或RT-PCR反應(yīng)生成的核 酸物質(zhì)，如DNA、 cDNA;
(2) 提取細菌、細胞及組織的蛋白質(zhì)，以及分泌液體中的蛋白質(zhì)；
(3) 將處理好的標(biāo)本注入微流動反應(yīng)池中進行雜交反應(yīng)；
(4) 清洗去除未雜交結(jié)合的標(biāo)本。 等離子體共振(SPR)檢測步驟包括
(1) 對芯片雜交反應(yīng)區(qū)進行等離子體共振(SPR)掃描；
(2) 對掃描結(jié)果分析，獲得芯片檢測結(jié)果。
本發(fā)明所使用的術(shù)語"生物芯片"是由生物大分子或組織附著于玻璃、陶 資、金屬片或尼龍膜、硝酸纖維素膜等基片物質(zhì)上構(gòu)建而成的陣列。生物芯片 的實例包括基因(核酸)芯片、細胞芯片、蛋白芯片、抗體芯片或組織芯片等。
本發(fā)明所述的核酸包括DNA、 RNA、 cDNA或PM。
本發(fā)明所使用的術(shù)語"肽核酸"是核酸的一種DNA模擬物，與DNA —樣也 是由ATCG四種堿基的單體聚合而成，只是兩者的骨架結(jié)構(gòu)不同DNA是由磷酸 二酯鍵連接而成的磷酸戊糖骨架；而PNA是由酰胺鍵連接的重復(fù)的N-2-氨乙基 苷氨酸單位構(gòu)成的。
本發(fā)明所述的蛋白包括各種抗體、抗原、核酸功能相關(guān)酶等。
本發(fā)明所使用的術(shù)語"納米金屬膜"是指由直徑在10nm"150咖之間的納米 金顆粒形成的厚度為IO咖-150咖金膜層。本發(fā)明使用的優(yōu)選的納米金屬膜層 為厚度為50咖的納米金膜。
本技術(shù)發(fā)明的優(yōu)點與效果如下
(1) 本發(fā)明采用PM做為雜交探針，較之普通DNA或PNA探針具有更高的靈 敏度和特異性；
(2) 本發(fā)明采用PNA做為雜交探針，不M免了PCR反應(yīng)，而且降低了樣品 的處理要求，簡化了操作步驟，縮短了檢測時間；
(3) 本發(fā)明采用PM做為雜交探針，并應(yīng)用SPR技術(shù)進行信號檢測，不需要 昂貴的檢測儀器，降低了芯片的使用成本及實驗條件。總之，該技術(shù)的研制成功將真正實現(xiàn)芯片技術(shù)的高通量、特異性、敏感性 以及快速等特點。既可對病原微生物進行快速而準(zhǔn)確的檢測和鑒定，也可以進 行某一或多個特定基因、或與其相關(guān)的表達產(chǎn)物的研究，還可以進行基因和蛋 白質(zhì)與疾病關(guān)系的研究、疾病相關(guān)基因的驗證以及新藥物的開發(fā)與篩選，疾病 的分子診斷，治療過程的追蹤和預(yù)后等方面，為臨床疾病的預(yù)防和治療提供重
要的指導(dǎo)作用；同時該技術(shù)也可以應(yīng)用到在野戰(zhàn)條件下由基層檢驗人員實施戰(zhàn) 場病原體分布的調(diào)查、戰(zhàn)傷感染的早期"^斷、生物戰(zhàn)劑的早期發(fā)現(xiàn)等方面，將 會產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效益。


圖1為本發(fā)明設(shè)計PM探針基本結(jié)構(gòu)模式圖 圖2為本發(fā)明SPR傳感器基本結(jié)構(gòu)模式圖 圖3為本發(fā)明SPR芯片系統(tǒng)模式圖 圖4為本發(fā)明芯片點樣模式
具體實施例方式
具體實施例方式
在玻璃栽玻片上鋪制50咖厚度的具有SPR感應(yīng)性的納米金膜方法，步驟如
下
(1) 、按Frens法(檸檬酸三鈉還原法)制4^r溶膠取0. 01%氯金酸水溶 液100ml加熱煮沸，攪動下準(zhǔn)確加入1%檸檬酸三鈉水溶液0. 75ml，金黃色的 氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水恢 復(fù)到原體積；
(2) 、金膜鋪制
A、 玻片ll酸洗清潔千凈后，i"N-e-(氨乙基)-Y氨丙基三價M^ 烷(APTMS) /甲苯溶液中回流12小時后洗凈，取出，氮氣吹千，置于清潔千 燥處備用；
B、 處理好的玻片11置納米金溶液中浸泡12小時后，浸入O. 01 mol/L， 的PDM7JC溶液中10—20min,取出用超純水清洗。烘干后移入羥胺/氯金酸溶 液中，浸泡0.5小時，玻片11表面既形成光亮的金膜12。
表面自組裝單分子層技術(shù)在金膜表面點制PRA探針陣列方法，步稞如下
(1) 、制備好的鈉米金金膜12在piranha液(30MHA:濃H2S04=1: 3)中浸泡清 洗，然后用雙蒸水反復(fù)清洗，氮氣吹干；
(2) 、滴加500nM濃度的SH-PNAs/PBS緩沖液與納米金膜12上自組裝反應(yīng)， 100%濕度反應(yīng)24小時，生成探針的自組裝陣列13;(3)、分別吸干緩沖液，6-巰基己醇封閉，雙蒸水清洗，氮氣吹干。 通過Chelex-IOO—步法快速處理標(biāo)本，提取細菌DNA，步躁如下
(1) 、用無菌接種環(huán)收集純培養(yǎng)菌落一環(huán)，置于1.5ml滅菌Eppendorf管中；
(2) 、加入5。/。Chelex懸濁液50u 1,混勻，加入20mg/ml蛋白酶K, 56°C 水浴消化2h以上，再經(jīng)沸水浴7. 5min，隨后立即置入冰浴3min， 12000r/min 離心5min,取上清液作DM樣本。
細胞裂解液裂解細胞，粗提細胞核蛋白質(zhì)，步驟是
(1) 、將組織剪成小塊，按每20mg組織加入200 ~ 300 u 1均漿液加入均漿 液，4'C低溫均漿；
(2) 、靜置IO min后加入90ul 10%NP-40，劇烈震蕩30 s， 4。C 800g離 心15 min，棄去上清；
(3) 、沉淀再溶于裂解液5ml中，4 。C震搖孵育30 min， 4°C 13000g離心 15 min，取上清為胞核蛋白提取液；
DNA標(biāo)本與基因芯片上的PM探針進行雜交反應(yīng)，步猓是
(1) 、將制備好的芯片1組裝到所制作的SPR傳感器棱鏡3表面，流動^^應(yīng) 池中注入20mM磷酸鈉緩沖液(PH7，0) 20u 1,預(yù)熱(45°C) 30分鐘，并讀取 此時反射光4反射角度初始數(shù)值；
(2) 、將處理好的標(biāo)本上清液注入20u 1流動反應(yīng)池中，45-C循環(huán)流動雜交 3小時，并讀取M針13點樣點反射光4反射角度數(shù)值；
(3) 、流動反應(yīng)池14中充入20ul 20mM磷酸鈉緩沖液(PH7. 0)， 37。C清洗 芯片1小時，重復(fù)3次。
蛋白質(zhì)標(biāo)本與蛋白芯片上的PNA探針進行雜交反應(yīng)，步驟是
(1) 、將制備好的芯片1組裝到所制作的SPR傳感器棱鏡3表面，流動反應(yīng) 池14中注入10mMTE緩沖液20ul，預(yù)熱(37°C ) 30分鐘，讀取此時反射光4 反射角度初始數(shù)值；
(2) 、將處理好的蛋白質(zhì)標(biāo)本上清液注入20ul流動反應(yīng)池中，37。C雜交2 小時，并讀取^^針點樣點反射光反射角度數(shù)值；
(3) 、流動反應(yīng)池14中充入20ul lOmMTE緩沖液，37。C清洗芯片1小時， 重復(fù)3次。
實施例1利用PNA探針實施DNA芯片檢測步驟為
淋球菌由大碎醫(yī)院檢驗科細菌室提供，鑒定標(biāo)準(zhǔn) 《全國臨床檢驗操作規(guī) 程》；Chelex-100購自BioRad公司，制備5%Chelex緩沖液，含"/oNP-40， 1% Tween-20， 0. 03%SDS;
淋球菌PNA探針13: HS-線)6-5， — TCGC TT C T CGG T CGCT -3，;美國 Applied Biosystems公司合成；
TCEPHCL: Tis (2-carboxyethyl)-Phosphine Hydrochloride,美國Pierce， 0. 287mg TCEP溶于1000ul水中制備lmmol/L TCEP;
(1) 、用無菌接種環(huán)收集純培養(yǎng)淋球菌菌落一環(huán)，置于1. 5ml滅菌 Eppendorf管中；
(2) 、加入5%Chelex懸濁液50ix l，混勻，加入蛋白酶K ( 20mg/ml) 2 y 1， 56。C水浴消4匕6h,再經(jīng)沸水浴7. 5min,隨后立即置入冰浴3min， 12000r/min 離心5min，取上清液作DNA樣本；
(3) 、制備好的鈉米金金膜在piranha (30%H2O2:濃H2S04=4: 3)液中浸泡清洗， 然后用雙蒸水反復(fù)清洗，氮氣吹干；
(4) 、 25uM的SH-PNA中加等體積l咖ol/L TCEP， 37 。C還原30分鐘，加 入PBS緩沖液(1.44 g薩氛8 g NaCL、 0.2 g KCL、 0.24 g K跳,加入 800mL去離子水溶解后，用HCL調(diào)pH為6. 5，定溶至1L，高壓滅菌)，SH-PNA 終濃度500nM;
(5) 、滴加500nM濃度的SH-PNA/PBS緩沖液與納米金膜上自組裝反應(yīng)，100% 濕M應(yīng)24小時，生成探針的自組裝陣列；
(6) 、將制備好的芯片組裝到所制作的SPR傳感器棱鏡表面，流動>^應(yīng)池中 注入20mM磷酸鈉緩沖液(PH7. 0) 20ul (10ul/min)，預(yù)熱30min x 45°C， 并讀取此時反射光反射角度初始數(shù)值；
(7) 、將處理好的標(biāo)本上清液注入20y 1流動反應(yīng)池中(5iil/min), 45°C 循環(huán)雜交3小時，并讀取^^針點樣點反射光反射角度數(shù)值；
(8) 、流動反應(yīng)池中充入20y 1 20mM磷酸鈉緩沖液(PH7. 0) (10y 1/min), 37t:清洗芯片l小時，重復(fù)3次。
實施例2利用PM探針實施蛋白芯片檢測，步樣為
根據(jù)NF- k B的核酸結(jié)合位點(GGGACTTTCC )設(shè)計PNA探針， HS-(CH》6-5， -AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3，;
蛋白芯片雜交緩沖液20mMHEPES, lmMDTT， 0. lmMEDTA, 50qjMKC1， 5%甘油，200 Pg/ml牛血清白蛋白；
(1)、將肝組織剪成小塊，加入均漿液A(咖ol/L: H印eslO、 Na3V04 1、 MgCl2 1.5、 KC1 10、 NaF 50、 EDTAO. 1、 EGTAO. 1、 phenylmethylsulfonyl fluoride0.5、 dithiothreitol 1和0. 02% protease inhibitors cocktail ， pH7. 9 ) 固，4。C低溫均漿;
(2) 、靜置10 min后加入90 li 1 10%NP-40，劇烈震蕩30 s, 4 °C 800 g離 心15 min，棄去上清；
(3) 、沉淀再溶于裂解液B(咖ol/L: H印es 20、 NaCl 420、 MgCl2 1.5、 EDTA1、 EGTA 1、 dithiothreitol 1、 phenylmethylsulfonyl fluoride 0.5、 glycerol 20%和() 02% protease inhibitors cocktail, pH 7-9) 5ml中，4。C 震搖孵育30min， 4°C 13000 g離心15rain，取上清為胞核蛋白提取液；
(4) 、制備好的鈉米金金膜在piranha (30%H2O2:濃H2S04=1: 3)液中浸泡清洗， 然后用雙蒸水反復(fù)清洗，氮氣吹干；
(5) 、 25 w M的SH-PNA中加等體積l咖ol/L TCEP， 37。C還原30分鐘，加入 PBS緩沖液(1. 44 g Na戰(zhàn)、8 g NaCL、 0. 2 g KCL、 0. 24 g KH氛加入800mL 去離子水溶解后，用HCL調(diào)pH為6.5，定溶至1L，高壓滅菌)，SH-PM終濃度 500nM;
(6) 、滴加500nM濃度的SH-PNA/PBS緩沖液與納米金膜上自組裝反應(yīng)，100% 濕度反應(yīng)24小時，生成探針的自組裝陣列；
(7) 、將制備好的芯片組裝到所制作的SPR傳感器棱鏡表面，流動反應(yīng)池中 注入蛋白芯片雜交緩沖液20y 1 (10ii l/min), (TC靜置30分鐘，并讀取此時 反射光反射角度初始數(shù)值；
(8) 、將處理好的標(biāo)本上清液30u 1注入20 ix 1流動反應(yīng)池中(5 u 1/min )， 25r循環(huán)雜交3小時，并讀取M針點樣點反射光反射角度數(shù)值；
(9) 、流動反應(yīng)池中^X20iU蛋白芯片雜交緩沖液(10u 1/min)， 0。C清 洗芯片1小時，重復(fù)3次。
雜交檢測和結(jié)果分析 實驗檢測采用折射光角度調(diào)制方式，角度調(diào)制范圍從40度到70度角；角 分辨率精度高于0. 001度；檢測最小濃度小于1X1(T"M。根據(jù)設(shè)計芯片探針的 檢測靶DNA/蛋白質(zhì)，利用標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度分別測量相應(yīng)角度響應(yīng)改變值繪制靶 DM/蛋白質(zhì)濃度/角度反應(yīng)曲線。實驗結(jié)束后根據(jù)實驗結(jié)果角度變化值與曲線 相應(yīng)位置對比檢測靶DNA/蛋白質(zhì)的存在與否以及濃度。
權(quán)利要求
1、肽核酸探針生物芯片，其特征在于檢測系統(tǒng)的生物芯片固相載體上連接的是肽核酸(PNA)檢測探針。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的肽核酸探針生物芯片，其特征在于肽核酸(PNA)探 針?biāo)街木哂斜砻娴入x子體共振(SPR)響應(yīng)特性的金屬薄膜是金膜。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所迷的肽核酸探針生物芯片，其特征在于肽核酸(PNA) ^:針?biāo)街木哂芯哂斜砻娴入x子體共振(SPR)響應(yīng)特性的金屬薄膜是厚度為 iO咖~ i50nm的納米金膜。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽核酸探針生物芯片，其特征在于采用化學(xué)還原 法制備納米金膠體液，在芯片片基表面直接鋪制二維的納米金膜層。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽核酸探針生物芯片，其特征在于應(yīng)用探針的固化-自組裝單分子層技術(shù)在納米金膜表面點制探針陣列。
6、 基于肽核酸探針生物芯片的表面等離子體共振的檢測方法，其檢測步驟如 下(1) 在芯片片基表面鋪制具有等離子體共振(SPR)感應(yīng)性的納米金膜(厚度 為10nm~150nm)，在納米金膜表面點制肽核酸(PNA )探針陣列制備 芯片；(2) 處理標(biāo)本，并與生物芯片上的探針進行雜交反應(yīng)；(3) 利用等離子體共振(SPR)設(shè)備對^^針雜交區(qū)進行偏振ib險測，利用等 離子體共振(SPR)原理分析陣列探針雜交反應(yīng)，獲取結(jié)果。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于肽核酸探針生物芯片的表面等離子體共振的檢 測方法，在芯片片基表面鋪制具有等離子體共振(SPR)感應(yīng)性的納米金膜和在 納米金膜表面點制肽核酸(PNA )探針陣列方法的步驟包括(1) 按Frens法(檸檬酸三鈉還原法)制備納米金溶液；(2) 以(氨乙基)-Y氨丙基三價^J^烷UPTMS)為核心鋪制性 質(zhì)均一的SPR納米金膜；(3) 所鋪納米金膜氮氣千燥后密封備用；(4) 清潔處理制備好的鈉米金膜；(5) 以表面自組裝單分子層技術(shù)點制肽核酸(PNA )探針陣列，生成探針 的自組裝陣列；(6) 清洗芯片，去除未組裝的探針，干燥后封閉備用。
8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于肽核酸探針生物芯片的表面等離子體共振的檢 測方法，標(biāo)本的處理方法及生物芯片上的探針進行雜交反應(yīng)步驟包括(1)提取細菌、細胞及組織的DNA或RNA;由PCR或RT-PCR反應(yīng)生成的核 酸物質(zhì)，如DM、 cDNA;(2) 提取細菌、細胞及組織的蛋白質(zhì)，以及分泌液體中的蛋白質(zhì)；(3) 將處理好的標(biāo)本注入微流動反應(yīng)池中進行雜交反應(yīng)；(4) 清洗去除未雜交結(jié)合的標(biāo)本。
9.森據(jù)權(quán)利要求6所述的基于肽核酸探針生物芯片的表面等離子體共振的檢 ^方法，等離子體共振(SPR)檢測步驟包括(1) 對芯片雜交反應(yīng)區(qū)進行等離子體共振(SPR)掃描；(2) 對掃描結(jié)果分析，獲得芯片檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肽核酸探針生物芯片及其表面等離子體共振的檢測方法，本發(fā)明檢測系統(tǒng)的生物芯片固相載體上連接的是肽核酸(PNA)檢測探針，肽核酸(PNA)探針?biāo)街木哂斜砻娴入x子體共振(SPR)響應(yīng)特性的金屬薄膜是金膜。該技術(shù)的研制成功將真正實現(xiàn)芯片技術(shù)的高通量、特異性、敏感性以及快速等特點。既可對病原微生物進行快速而準(zhǔn)確的檢測和鑒定，同時該技術(shù)也可以應(yīng)用到在野戰(zhàn)條件下由基層檢驗人員實施戰(zhàn)場病原體分布的調(diào)查、戰(zhàn)傷感染的早期診斷、生物戰(zhàn)劑的早期發(fā)現(xiàn)等方面，將會產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號C40B40/04GK101591711SQ20091010575
公開日2009年12月2日 申請日期2009年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日
發(fā)明者唐國林, 趙為武, 顧大勇 申請人:唐國林;趙為武;顧大勇