專(zhuān)利名稱(chēng)：質(zhì)譜分析用板及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及質(zhì)譜分析用板(plate for mass spectrometry)及其制備方法和用途，所述板能夠大量、快速、高靈敏度地進(jìn)行蛋白質(zhì)組(proteome)分析。
背景技術(shù)：
由于藥物創(chuàng)新基礎(chǔ)研究的進(jìn)步，包括分子生物學(xué)和基因組學(xué)(基因組科學(xué))的基礎(chǔ)研究的進(jìn)步，在這幾年內(nèi)，藥物創(chuàng)新的情況已經(jīng)發(fā)生顯著變化，并且也正在開(kāi)發(fā)基因組藥物創(chuàng)新代表的藥物創(chuàng)新新方法。
然而，仍不能從基因組明確的核苷序列中預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能(生理作用)；為建立連接遺傳信息和新藥的技術(shù)，需要存在后基因組(post-genome)。因此，蛋白組學(xué)(蛋白質(zhì)分析學(xué))正受到關(guān)注，其目的在于分離和鑒別上述核苷序列中翻譯的全部蛋白質(zhì)(報(bào)告多于100000種)，并指定它們的功能。
盡管，蛋白質(zhì)組狹義上是指構(gòu)成單個(gè)生物體的全部蛋白質(zhì)，但是廣義上有時(shí)是指組織學(xué)或解剖學(xué)指定的生物體部位，如，特定細(xì)胞的細(xì)胞液中的全部蛋白質(zhì)、血清中含有的全部蛋白質(zhì)、特定組織中含有的全部蛋白質(zhì)等。在本說(shuō)明書(shū)中，該術(shù)語(yǔ)以廣義使用，但是顯而易見(jiàn)的是，廣義上的蛋白質(zhì)組的完全集合體是狹義上的蛋白質(zhì)組。
在蛋白質(zhì)組分析中，普遍使用結(jié)合二維電泳和質(zhì)譜分析的常規(guī)方法，但是下述問(wèn)題仍沒(méi)有解決。也就是說(shuō)，在常規(guī)方法中，在遷移后對(duì)試樣進(jìn)行質(zhì)譜分析之前，遷移凝膠(migration gel)必須分裂成碎片，必須用特定溶液從各個(gè)碎片中提取蛋白質(zhì)。由于花費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)和多步驟復(fù)雜操作的要求，測(cè)量時(shí)間縮短、裝置尺寸減小、大量分析物的篩選和整個(gè)裝置的自動(dòng)化已經(jīng)變得極其困難。
此外，存在另一個(gè)問(wèn)題，即稱(chēng)為“低豐度蛋白質(zhì)”的問(wèn)題。例如，在酵母中只有100個(gè)基因產(chǎn)生酵母的總蛋白質(zhì)重量的50％。這意味著剩余的50％蛋白質(zhì)是數(shù)千個(gè)基因的產(chǎn)物。大量低豐度蛋白質(zhì)含有大量對(duì)生物體來(lái)說(shuō)是最重要的蛋白質(zhì)，例如調(diào)節(jié)蛋白和信號(hào)傳輸?shù)鞍?，包括受體。但是，常規(guī)方法產(chǎn)生的情況是不能回收電泳法分離的大量和痕量蛋白質(zhì)試樣。
在為了克服電泳和質(zhì)譜的組合技術(shù)中的這些缺陷的嘗試中，以及為了闡明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，正在進(jìn)行各種努力。例如，同位素編碼親和標(biāo)簽方法(ICATisotope-coded affinity tag；Nat.Biotech.，17994-999(1999))、酵母中的雙雜交系統(tǒng)、BIA-MS-MS、蛋白質(zhì)陣列法(protein arraymethod)(溶液，芯片；Trends Biotechnol.，19s34-39(2001))和利用LC-MS-MS的peptidomics等是可以使用的。特別地，作為蛋白質(zhì)陣列方法的實(shí)例，可提及固相蛋白質(zhì)陣列法(芯片方法；Curr.Opin.Biotechnol.，1265-69(2001))、信息結(jié)合在納米顆粒中的液相陣列法(熒光解碼珠粒；Clin.Chem.，431749-1756(1997)；Nat.Biotech.，19631-635(2001)；條形碼狀納米顆粒(barcoded nanoparticles)；Trends Biotechnol.(2001)，同上)等。
同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)提出一種蛋白質(zhì)組分析的方法，其使得能夠同時(shí)分析膜蛋白質(zhì)和通過(guò)編組(grouping)膜蛋白質(zhì)能夠與其發(fā)生相互作用的化合物(WO02/56026)。
除了這種在測(cè)量方法(體系)的改進(jìn)之外，還報(bào)道了在蛋白質(zhì)質(zhì)譜領(lǐng)域中的改進(jìn)的努力，但是它們的目的并非為了蛋白質(zhì)組分析，或者它們技術(shù)上難以應(yīng)用于蛋白質(zhì)組分析。已經(jīng)報(bào)道過(guò)下述方法，所述方法包括將由電泳法分離出來(lái)的蛋白質(zhì)印跡(blotting)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，并使用雙面涂布的帶(Electrophoresis，17954-961(1996))、框架(Anal.Chem.，692888-2892(1997))或油脂(Anal.Chem.，714800-4807(1997)；Anal.Chem.，714981-4988(1999)；WO00/45168)對(duì)固定至用于MALDI型質(zhì)譜的不銹鋼板上的膜進(jìn)行測(cè)量。這些方法不完美，原因在于不僅這些方法由于在測(cè)量過(guò)程中將PVDF膜固定至質(zhì)譜分析用板而費(fèi)力，而且背景高，相對(duì)峰強(qiáng)度極其低，因此它們不適合蛋白質(zhì)組分析，而蛋白質(zhì)組分析要求高的檢測(cè)靈敏度。
此外，還報(bào)道過(guò)以下的方法，包括將電泳之后的凝膠直接印跡至基質(zhì)涂布的質(zhì)譜分析用板并進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法，以及包括將蛋白質(zhì)電印跡至用于印跡的PVDF膜上，然后將該蛋白質(zhì)擴(kuò)散印跡至基質(zhì)涂布的質(zhì)譜分析用板(US5595636)。然而，在這些方法中，當(dāng)使用電印跡時(shí)，存在的問(wèn)題是在印跡期間基質(zhì)溶解在印跡緩沖液中，并且測(cè)量它們變得幾乎不可能。另一方面，當(dāng)使用擴(kuò)散印跡時(shí)，印跡效率低，以致于檢測(cè)靈敏度不夠，特別是對(duì)將低豐度蛋白質(zhì)印跡至質(zhì)譜分析用板上的檢測(cè)靈敏度不夠。
而且，還報(bào)道了基于上述方法改進(jìn)的方法，該方法包括將硝化纖維素(用于印跡用途的膜組分)和基質(zhì)的混合物施用(apply)于質(zhì)譜分析用板(GB2312782A)。然而，在電印跡或擴(kuò)散印跡的情況下，即使該方法，也不能說(shuō)完全解決了這些問(wèn)題。
至于質(zhì)譜分析用板，常用的鋁板或不銹鋼板，以及它們的改進(jìn)類(lèi)型，例如涂布有氧化硅的質(zhì)譜分析用板或者添加有憎水基的質(zhì)譜分析用板，可商業(yè)購(gòu)買(mǎi)(Ciphergen制造的，WO94/28418)。然而，即使這些技術(shù)和產(chǎn)品也不能總是滿(mǎn)足大量、快速和高靈敏度地進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析的研究和開(kāi)發(fā)需要。
本發(fā)明的目的是介紹比基于電泳和質(zhì)譜分析組合的蛋白質(zhì)組常規(guī)分析方法更新的新方法。具體地，本發(fā)明的目的是提供能夠快速和高靈敏度地進(jìn)行大量蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下的發(fā)現(xiàn)與PVDF固定在膜狀的基板上的板相比，通過(guò)用PVDF涂布基板而在基板上形成PVDF薄層所制備的質(zhì)譜分析用板提供了顯著改進(jìn)的質(zhì)譜分析檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。此外，因?yàn)檫@種質(zhì)譜分析用板在印跡時(shí)不含有基質(zhì)，所以額外的優(yōu)點(diǎn)是即使在電印跡中，基質(zhì)也不溶解。
因此，本發(fā)明涉及1)質(zhì)譜分析用板，其包括支撐體和其上的含PVDF的涂層；2)制備質(zhì)譜分析用板的方法，其包括用PVDF涂布支撐體；以及3)鑒別分析物的方法，其包括對(duì)含分析物的試樣進(jìn)行凝膠電泳，以分離分析物，將分離出的分析物印跡至上述1)中的色譜分析用的板或上述2)的方法中制備的色譜分析用的板，并對(duì)印跡的分析物進(jìn)行質(zhì)譜分析。
通過(guò)以下本發(fā)明的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它目的和特點(diǎn)，以及本發(fā)明的效果將顯而易見(jiàn)。


圖1顯示從遷移凝膠電印跡至質(zhì)譜分析用板的程度。A表示遷移凝膠(印跡之前)，B表示遷移凝膠(印跡之后)，以及C表示本發(fā)明的質(zhì)譜分析用板(印跡之后)。左側(cè)的數(shù)字符號(hào)顯示相應(yīng)帶的蛋白質(zhì)的分子量。這表明在一些蛋白質(zhì)中，由于電印跡，凝膠中幾乎全部部分的蛋白質(zhì)遷移至色譜分析用的板。
圖2顯示遷移凝膠和色譜分析用板之間的位置關(guān)系(圖2A)和板上遷移的蛋白質(zhì)所接受的激光量(圖2B)。在這兩圖中，1、2和3分別表示色譜分析用板、遷移凝膠和蛋白質(zhì)。此外，A、B和C分別表示最大光通量(lightquantity)、最小光通量和零光通量。
圖3顯示使用本發(fā)明質(zhì)譜分析用板(圖3A)、鋁板(圖3B)和蛋白質(zhì)芯片陣列(H4，圖3C)所獲得的質(zhì)譜峰的相對(duì)強(qiáng)度。
圖4顯示使用本發(fā)明的質(zhì)譜分析用板或鋁板所獲得的SCUPA和HSA的質(zhì)譜光譜(峰圖像)。橫軸表示分子量，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。圖4A和B顯示SCUPA的結(jié)果，圖4C和D顯示HSA的結(jié)果。此外，圖4A和C顯示了使用本發(fā)明質(zhì)譜分析用板的情況，圖4B和D顯示了使用鋁板的情況。
圖5顯示了通過(guò)質(zhì)譜分析，使用本發(fā)明的質(zhì)譜分析用板進(jìn)行電印跡的蛋白質(zhì)(SCUPA)和對(duì)其發(fā)生特定反應(yīng)的抗體(抗SCUPA抗體)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的分析結(jié)果。橫軸表示分子量，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。圖中的數(shù)值符號(hào)表示峰的分子量。圖5A顯示分離并印跡的SCUPA與抗SCUPA抗體之間的相互作用。此外，圖5B顯示單獨(dú)使用抗SCUPA抗體所獲得的結(jié)果。
圖6顯示當(dāng)將電泳-分離的蛋白質(zhì)印跡至PVDF膜時(shí)所獲得的質(zhì)譜光譜。橫軸表示分子量，縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度。圖中的數(shù)值符號(hào)表示峰的分子量。圖6A表示SCUPA的結(jié)果，圖6B表示HSA的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
質(zhì)譜分析用板本發(fā)明的質(zhì)譜分析用板在支撐體(support)(基本結(jié)構(gòu))上具有涂層(薄層)，所述涂層含有聚偏二氟乙烯(PVDF)。對(duì)支撐體的材料沒(méi)有限制，只要其為用于質(zhì)譜分析用板的常用之一。例如，可提及絕緣體(玻璃、陶瓷、塑料/樹(shù)脂等)、金屬(鋁、不銹鋼等)、導(dǎo)電聚合物，以及它們的組合等。優(yōu)選使用鋁板。
本發(fā)明質(zhì)譜分析用板的形狀設(shè)計(jì)為特別適合所使用的質(zhì)譜儀的試樣入口。例如，可提及集合型(cluster type)質(zhì)譜分析用板等，所述集合型質(zhì)譜分析用板預(yù)先開(kāi)槽過(guò)，以使得容易分離單獨(dú)的片斷，從而在蛋白質(zhì)印跡至適合電泳后凝膠尺寸的集合型(assembly type)質(zhì)譜分析用板后，各板適合質(zhì)量分析的試樣入口，然而，本發(fā)明不應(yīng)解釋為局限于此。
在本發(fā)明中，“含PVDF的涂層”是指通過(guò)將分散體PVDF分子沉積在支撐體上而形成的薄層，而不是通過(guò)在支撐體上重疊預(yù)先模塑過(guò)的結(jié)構(gòu)體(如使用常規(guī)公知的PVDF膜)而制備的層。盡管對(duì)PVDF沉積的方式?jīng)]有限制，優(yōu)選使用下述制備質(zhì)譜分析用板的方法的實(shí)例中所述的方法。
適當(dāng)?shù)剡x擇薄層的厚度，只要其不對(duì)蛋白質(zhì)印跡的效率和質(zhì)譜分析測(cè)量靈敏度等產(chǎn)生不利的影響即可，例如，該厚度為約0.1至約1000微米，優(yōu)選為約1至約300微米。
制備質(zhì)譜分析用板的方法本發(fā)明的質(zhì)譜分析用板是通過(guò)PVDF涂布支撐體表面而制備的。至于涂布方法的優(yōu)選實(shí)例，可提及涂抹(painting)、噴射(spraying)、氣相沉積、浸漬、印刷和濺射等。
在“涂抹”的情況下，可使用適當(dāng)?shù)墓ぞ?例如，刷子)，將溶解在合適溶劑(例如，如二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑)中的合適濃度(例如，約1至約100mg/mL)的PVDF(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“含PVDF的溶液”)涂抹至支撐體(基本結(jié)構(gòu)，基板)上。
在“噴射”的情況下，可將以上述相同方式制備的含PVDF的溶液從噴射器噴射出，從而PVDF均勻地沉積在支撐體上。
在“氣相沉積”的情況下，PVDF薄層可形成在支撐體表面上，其是通過(guò)使用用于制備有機(jī)薄膜的常用真空氣相沉積裝置在含有支撐體的真空室中加熱和蒸發(fā)PVDF(固態(tài)或溶液的)而形成的。
在“浸漬”的情況下，可將支撐體浸漬在以上述相同方式制備的含PVDF的溶液中。
在“印刷”的情況下，可根據(jù)支撐體的材料，適當(dāng)?shù)剡x擇和利用各種可常用的印刷技術(shù)；例如，可優(yōu)選使用絲網(wǎng)印刷等。
在“濺射”的情況下，可形成薄層，例如，通過(guò)在支撐體和PVDF之間施加直流高壓，同時(shí)將惰性氣體(例如，氬氣等)導(dǎo)入真空室中，并且使電離的氣體碰撞PVDF，使得濺射的PVDF分子沉積在支撐體上。
可在支撐體的各個(gè)表面上施用涂層，也可只在進(jìn)行質(zhì)譜分析的一個(gè)表面上施用涂層。
可根據(jù)涂布方式，適當(dāng)?shù)厥褂脙?yōu)選形式的PVDF；例如，可以以含PVDF的溶液、含PVDF的蒸汽和PVDF固體分子等形式，將PVDF施用至支撐體上。優(yōu)選以含PVDF的溶液的形式施用?！笆┯谩笔侵甘筆VDF與支撐體接觸，以使其在接觸后保留和積聚在支撐體上。對(duì)施用的量沒(méi)有限制；至于PVDF的量的實(shí)例，可提及約1至100μg/cm2。在施用后，通過(guò)自動(dòng)干燥和真空干燥等除去溶劑。
本發(fā)明質(zhì)譜分析用板中的支撐體(基本結(jié)構(gòu)，基板)可具有表面，該表面在用PVDF涂布之前，由適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)技術(shù)預(yù)先改性(處理)。具體地，可提及板表面拋光、磨蝕(abrasion)、酸處理、堿處理和玻璃處理(四甲氧基硅烷等)作為實(shí)例。
本發(fā)明質(zhì)譜分析用板在穩(wěn)定性上是優(yōu)異的。也就是說(shuō)，本發(fā)明質(zhì)譜分析用板的特征在于即使在浸漬在pH值為2-10或含有各種鹽、如甲醇或乙腈等溶劑或它們的混合溶劑的水溶液中、電力負(fù)荷、濕潤(rùn)和干燥的重復(fù)循環(huán)和高度真空狀態(tài)的條件下，粘合表面(adhesive surface)也不剝落。
板的用途A.鑒別(identification)蛋白質(zhì)等使用本發(fā)明的質(zhì)譜分析用板，可鑒別各種化合物，包括蛋白質(zhì)在內(nèi)。也就是說(shuō)，對(duì)含有分析物(例如，蛋白質(zhì)、核酸、寡核苷酸、糖、寡糖、細(xì)胞膜受體激動(dòng)劑或拮抗劑、毒素、病毒表位(virus epitope)、激素、肽、酶、酶底物或酶抑制劑、輔因子、藥物(drug)、凝集素、抗體等)的試樣進(jìn)行電泳(例如，聚丙烯酰胺凝膠電泳)，以分離出分析物，將分離出的分析物印跡至本發(fā)明質(zhì)譜分析用板上，并利用質(zhì)譜分析印跡的分析物，如此鑒別分析物(從有關(guān)分析物分子量的信息上)。
含分析物的試樣含分析物的試樣可使用任何公知的技術(shù)從(生物)材料中制備。此處，至于(生物)材料的實(shí)例，可提及如動(dòng)物、植物和微生物等任意選擇的生物體的細(xì)胞或組織，或者細(xì)胞外液(例如，血液、血漿、尿、骨髓液、腹水等)、細(xì)胞內(nèi)液、細(xì)胞小顆粒中的液體等。此外，也包括細(xì)胞培養(yǎng)液和通過(guò)基因重組獲得的培養(yǎng)液等。
為制備進(jìn)行電泳分析的含分析物的試樣，使用公知的方法。例如，在含蛋白質(zhì)試樣的情況下，通過(guò)在蛋白酶抑制劑存在下，在合適的緩沖液中勻化靶細(xì)胞之后，或者在使用如Polytron等細(xì)胞破碎裝置懸浮細(xì)胞之后，或者在通過(guò)低滲透壓休克(shock)破碎細(xì)胞之后，或者在超聲破碎細(xì)胞膜之后，收集離心上清液，可獲得可溶性的部分。此外，可在利用表面活性劑或者蛋白質(zhì)變質(zhì)劑增溶后，使用所獲得的沉淀物(不可溶)部分。
電泳這是試樣中的分析物通過(guò)電泳分離出(在凝膠上展開(kāi))的步驟。所使用的電泳裝置可以是公知的裝置?？墒褂蒙虡I(yè)產(chǎn)品。根據(jù)目的，可使用任何一維凝膠電泳和二維凝膠電泳。在二維凝膠電泳中，一維遷移是基于由于分析物等電點(diǎn)的分離，二維遷移是基于由于分析物的分子量的分離。對(duì)用于電泳的凝膠尺寸沒(méi)有限制。盡管10cm×10cm是常用的尺寸，但是必要時(shí)也可使用20cm×20cm或者其它尺寸。此外，盡管凝膠的材料主要是聚丙烯酰胺，取決于用途，使用其它介質(zhì)，例如瓊脂糖凝膠和醋酸纖維素膜也是可行的。至于凝膠的濃度，既可使用均勻的濃度，也可使用梯度濃度。
印跡這是將通過(guò)凝膠電泳分離出的分析物從凝膠中轉(zhuǎn)印(transfer)至本發(fā)明質(zhì)譜分析用板的步驟。至于印跡裝置，可使用公知的裝置?？墒褂蒙虡I(yè)產(chǎn)品。印跡方法本身是公知的。通過(guò)各種方法(例如，擴(kuò)散、電力和其它方法)，將遷移后在凝膠上展開(kāi)的分析物轉(zhuǎn)印至質(zhì)譜分析用板上。該步驟通常稱(chēng)為印跡?？商峒皵U(kuò)散印跡、電印跡等。特別優(yōu)選為電印跡。
至于在電印跡時(shí)使用的緩沖液，優(yōu)選使用pH為7-9和低鹽濃度的緩沖液。具體地，可提及三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris buffer)、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液等作為實(shí)例。至于三羥甲基氨基甲烷緩沖液，可提及Tris/甘氨酸/甲醇緩沖液、SDS-Tris-Tricine緩沖液等；至于磷酸鹽緩沖液，可提及ACN/NaCl/等滲磷酸鹽緩沖液、磷酸鈉/CAN等；至于硼酸鹽緩沖液，可提及硼酸鈉/氯化氫緩沖液、Tris-硼酸鹽/EDTA緩沖液和硼酸鹽/ACN等；至于乙酸鹽緩沖液，可提及Tris-乙酸鹽/EDTA等。優(yōu)選地，緩沖液為T(mén)ris/甘氨酸/甲醇緩沖液或硼酸鈉/氯化氫緩沖液。作為T(mén)ris/甘氨酸/甲醇緩沖液的組成實(shí)例，可提及約10-15毫摩爾(mM)Tris、70-120毫摩爾甘氨酸和7-13％甲醇。作為硼酸鈉-氯化氫緩沖液的組成實(shí)例，可提及約5-20毫摩爾硼酸鈉。
此外，在印跡后，可添加稱(chēng)為基質(zhì)的試劑，以吸收激光，并且通過(guò)能量轉(zhuǎn)移促進(jìn)分析物分子的電離，從而進(jìn)行隨后的質(zhì)譜分析(通過(guò)MALDI方法)。至于基質(zhì)，可使用質(zhì)譜分析領(lǐng)域中公知的基質(zhì)。例如，芥子酸(SPA(＝3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(cinammic acid)))、吲哚丙烯酸(IAA)、2，5-二羥基苯甲酸(DHB)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)等，然而基質(zhì)不應(yīng)解釋為局限于此。優(yōu)選地，基質(zhì)為DHB或CHCA。在CHCA的情況下，優(yōu)選添加至少為21％飽和濃度的基質(zhì)。具體地，可提及21-100％飽和濃度的基質(zhì)，優(yōu)選為40-100％飽和濃度的基質(zhì)，特別優(yōu)選為50-100％飽和濃度的基質(zhì)。
質(zhì)譜分析這是通過(guò)質(zhì)譜分析，分析印跡至本發(fā)明質(zhì)譜分析用板上的分析物而鑒別分析物(從有關(guān)分子量的信息)的步驟。質(zhì)譜儀是通過(guò)電離氣態(tài)試樣，因而物質(zhì)的分子或分子碎片進(jìn)入電磁場(chǎng)，基于物質(zhì)的轉(zhuǎn)印狀態(tài)(transfer status)，通過(guò)質(zhì)量數(shù)/電荷數(shù)分離物質(zhì)，并測(cè)定物質(zhì)的光譜，而測(cè)量和檢測(cè)物質(zhì)的分子量的裝置?？墒褂没谝韵路椒ㄔ淼馁|(zhì)譜儀，所述方法為MALDI-TOFMS方法，其是基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix-aided laserdeionization，MALDI)與飛行時(shí)間質(zhì)譜(time-of-flight mass spectrometry，TOFMS)的組合，所述MALDI包括混合和干燥試樣與吸收激光基質(zhì)以產(chǎn)生結(jié)晶，通過(guò)來(lái)自基質(zhì)的能量轉(zhuǎn)移，使晶體電離，并通過(guò)激光照射瞬時(shí)加熱，以及將電離的分析物引入真空中，所述TOFMS包括通過(guò)由于初始加速，試樣分子離子飛行時(shí)間的差異來(lái)分析質(zhì)量數(shù)；包括將單獨(dú)的試樣置于一個(gè)液滴中，從液體中直接電離分析物的方法；納米級(jí)電噴射質(zhì)譜(nano-ESMS)方法，其包括將試樣溶液電噴射至大氣中，以將單獨(dú)的分析物氣化成未折疊狀態(tài)的多價(jià)離子；等等。
對(duì)放置在本發(fā)明質(zhì)譜分析用板上的分析物進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法本身是公知的。
此外，為根據(jù)本發(fā)明充分自動(dòng)化蛋白組分析，通過(guò)朝著一維方向或二維方向移動(dòng)激光出口，或者相反移動(dòng)其上有質(zhì)譜分析用板的臺(tái)座，以及進(jìn)行連續(xù)的全表面掃描(在間斷的掃描方法中，存在未用激光照射的剩余的分析物，也就是說(shuō)，未分析的剩余的分析物)，可分析通過(guò)電泳一維展開(kāi)或二維展開(kāi)的全部分析物。結(jié)合該方法和間斷的掃描方法，使得可以將分配至96孔板的96種試樣作為一個(gè)整體包埋(mount)至質(zhì)譜分析用板上(96種試樣在長(zhǎng)方形芯片上以恒定的間隔排列)，并且對(duì)該試樣進(jìn)行質(zhì)譜分析。
B.鑒別分析物組根據(jù)本發(fā)明，可同時(shí)分析多種分析物的集合(分析物組)。也就是說(shuō)，從上述各種生物材料制備的含分析物的試樣通常含有多種和各種分析物。通過(guò)用一維或二維凝膠電泳分離這種分析物組，以及將分離出和展開(kāi)在凝膠上的分析物組印跡在，如尺寸與遷移凝膠(優(yōu)選為集合型質(zhì)譜分析用板，其具有預(yù)先形成的穿孔線(xiàn)，以使能夠容易分離每個(gè)片，以使其在印跡后符合質(zhì)譜儀的試樣入口)相符合的本發(fā)明質(zhì)譜分析用板上，通常可將含分析物試樣中含有的所有分析物(如果分析物是蛋白質(zhì)，則為蛋白質(zhì)組)，分離至相應(yīng)的位置，并將它們印跡至質(zhì)譜分析用板上。通過(guò)使用上述連續(xù)掃描型質(zhì)譜儀，測(cè)量這些分析物組，可同時(shí)鑒別印跡的分析物組。
C.鑒別分析物復(fù)合物根據(jù)本發(fā)明，可同時(shí)分析分析物和對(duì)該分析物具有親合力(與其發(fā)生相互作用)的分析物之間的鍵接。也就是說(shuō)，通過(guò)利用電泳分離分析物，將分離出的分析物印跡至本發(fā)明質(zhì)譜分析用板上，然后添加含有對(duì)該分析物具有親合力(與其發(fā)生相互作用)的化合物的試樣(例如，肽、蛋白質(zhì)、核酸、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)品、細(xì)胞提取物、植物提取物、動(dòng)物組織提取物、細(xì)胞膜級(jí)分(fraction)、細(xì)胞器膜級(jí)分等)，以在板上形成復(fù)合物，并對(duì)形成的復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜分析，可鑒別印跡的分析物、對(duì)該分析物具有親合力(與其發(fā)生相互作用)的化合物，和/或它們的復(fù)合物(從有關(guān)分子量的信息)。
為更詳細(xì)地描述本發(fā)明，以下給出實(shí)施例；然而，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明。
實(shí)施例1制備質(zhì)譜分析用板將鋁基本結(jié)構(gòu)(鋁板)浸入1％四甲氧基硅烷/1％乙酸溶液，并在空氣中干燥，然后煅燒(130℃，3小時(shí))，所述鋁基本結(jié)構(gòu)制備成符合蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)(ProteinChip System)(由Ciphergen制造的)的質(zhì)譜分析用板的入口。將溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中的聚偏二氟乙烯(PVDF)，以10mg/mL的量施用在該板上。制備的質(zhì)譜分析用板是扁平的，其尺寸為78毫米×8毫米×2毫米，其具有白色表面。
在隨后步驟中，質(zhì)譜分析用板絕對(duì)不發(fā)生化學(xué)變化、電變化、機(jī)械變化或物理變化，例如破裂、剝落、損傷和褪色，所述的隨后步驟，例如浸漬在有機(jī)溶劑中以預(yù)處理、與電泳凝膠接觸、在各種緩沖液中電印跡，以及在隨后的基質(zhì)應(yīng)用期間高真空和干燥以及質(zhì)譜分析。
使用該質(zhì)譜分析用板，進(jìn)行下述研究。
實(shí)施例2將蛋白質(zhì)電印跡至質(zhì)譜分析用板對(duì)預(yù)先染色的分子量標(biāo)記(Bio-Rad制造)進(jìn)行12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在90mA電流下，于12.5mM Tris/96 mM甘氨酸/10％甲醇緩沖液中將凝膠上的蛋白質(zhì)電印跡至實(shí)施例1中制備的質(zhì)譜分析用板上。因此，盡管少量分子量為90000-110000的預(yù)先染色的蛋白質(zhì)印跡之后殘留在聚丙烯酰胺凝膠中(圖1B)，但是所有蛋白質(zhì)被有效地印跡至本發(fā)明質(zhì)譜分析用板上(圖1C)。
實(shí)施例3質(zhì)譜分析印跡至質(zhì)譜分析用板的蛋白質(zhì)在對(duì)試樣(蛋白質(zhì)混合物)進(jìn)行12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，將凝膠直接與實(shí)施例1的質(zhì)譜分析用板接觸，將通過(guò)電泳分離出來(lái)的蛋白質(zhì)電印跡至實(shí)施例1中制備的質(zhì)譜分析用板上，并且立即將該質(zhì)譜分析用板放置在質(zhì)譜儀中并測(cè)量。使用2，5-二羥基苯甲酸(DHB；75mg/mL乙醇溶液)作為基質(zhì)，并使用蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)(上述的)作為測(cè)量裝置，進(jìn)行測(cè)量的條件如下檢測(cè)器電壓1800V，檢測(cè)器靈敏度8，以及激光器強(qiáng)度280。為了質(zhì)量校正，利用肌紅蛋白(獲自馬肌肉)、GAPDH(獲自兔)和白蛋白(獲自牛血清)，進(jìn)行外部校正。在該試驗(yàn)中，兩種蛋白質(zhì)，即單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(SCUPA)和人血清白蛋白(HSA)，用作蛋白質(zhì)混合物，在還原條件下，對(duì)4μg蛋白質(zhì)混合物串聯(lián)電泳兩次，至12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠。也就是說(shuō)，添加初始試樣，在30mA電流下進(jìn)行電泳40分鐘，然后斷開(kāi)電流，將相同的試樣再次添加至相同的泳道中，進(jìn)一步在30mA電流下電泳23分鐘。遷移后，切割各遷移通道的凝膠，進(jìn)一步在離凝膠上表面上的添加位置39mm處切割，然后將兩片凝膠以它們的上表面各自接觸而放置，其后與質(zhì)譜分析用板相互接觸(圖2A)。此時(shí)，以SCUPA、HSA、SCUPA、HSA、HSA、SCUPA、HSA和SCUPA的順序布置遷移試樣，將各蛋白質(zhì)的4個(gè)帶，總共8個(gè)帶印跡至質(zhì)譜分析用板上。
因?yàn)樗褂玫馁|(zhì)譜儀不是連續(xù)地，而是在24個(gè)等間距的點(diǎn)照射激光至單個(gè)質(zhì)譜分析用板上，所以發(fā)生了對(duì)激光不曝光、部分曝光和全曝光的情況，這取決于質(zhì)譜分析用板上印跡的蛋白質(zhì)的位置(圖2B)。為了增加對(duì)激光最大曝光的概率，并因此增加在該分析裝置內(nèi)，在該限制下的最高峰強(qiáng)度，設(shè)計(jì)了以下的模式，即通過(guò)上述技術(shù)，將各模型蛋白印跡至質(zhì)譜分析用板上四個(gè)不同的位置。因此，即使印跡理論上質(zhì)量相同的蛋白質(zhì)，獲自質(zhì)譜分析的峰高是可變的(圖3)。因此，在該實(shí)驗(yàn)中，假設(shè)所獲得多個(gè)峰中最大相對(duì)強(qiáng)度的峰的值與對(duì)激光完全曝光的實(shí)際值最接近，進(jìn)行了討論。
預(yù)先將質(zhì)譜分析用板浸入甲醇中，并用印跡緩沖液(10mM硼酸鈉緩沖液，pH8.0)平衡，然后在90mA電流下對(duì)其進(jìn)行電印跡2小時(shí)。隨后，進(jìn)行質(zhì)譜分析，并測(cè)量相對(duì)峰強(qiáng)度。為參考對(duì)照，以相同的方式進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)，不同之處在于使用常規(guī)非PVDF涂布的鋁板和引入有十六烷基的鋁板(ProteinChip array，Ciphergen制備，H4)。結(jié)果示于圖3和圖4中。
在SCUPA的情況下，本發(fā)明質(zhì)譜分析用板的相對(duì)峰強(qiáng)度(圖3A)為12.31，是常規(guī)鋁板強(qiáng)度值(圖3B)(0.87)的14倍。對(duì)HSA進(jìn)行類(lèi)似的比較，該質(zhì)譜分析用板的相對(duì)峰強(qiáng)度，是鋁板強(qiáng)度值的49倍(6.260.129)。此外，質(zhì)譜分析用板產(chǎn)生的相對(duì)峰強(qiáng)度是H4產(chǎn)生的2倍至4倍(圖3C)。而且，本發(fā)明質(zhì)譜分析用板(圖4A和C)比鋁板(圖4B和D)產(chǎn)生了更多明顯的光譜。從這些結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用本發(fā)明質(zhì)譜分析用板，可同時(shí)快速和高靈敏度地通過(guò)質(zhì)譜分析，分析電泳分離之后的多種蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4分析電泳分離之后電印跡的蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白之間的相互作用作為本發(fā)明質(zhì)譜分析用板的應(yīng)用實(shí)例，進(jìn)行了以下的研究印跡至質(zhì)譜分析用板的蛋白質(zhì)和能夠與其發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合；隨后通過(guò)質(zhì)譜分析鑒別它們的蛋白質(zhì)復(fù)合物。至于材料，使用SCUPA及其抗體(抗SCUPA抗體)。
在將SCUPA(4μg)添加至12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠之后，進(jìn)行電泳1小時(shí)。在遷移之后，切割凝膠，并以實(shí)施例3中相同的方式，將凝膠上的SCUPA電印跡至實(shí)施例1中制備的質(zhì)譜分析用板上。在阻斷SCUPA印跡的質(zhì)譜分析用板之后，添加抗血清(用硫酸銨粗精制的，且含有抗SCUPA抗體)，并反應(yīng)過(guò)夜。在完成反應(yīng)后，用PBS緩沖液洗滌該板，添加基質(zhì)，進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果示于圖5中。
在電泳之后印跡至質(zhì)譜分析用板的SCUPA在48，616處產(chǎn)生峰，并觀察到與固定在同一板上的SCUPA發(fā)生相互作用的抗SCUPA抗體在145,300(73，115指定給相同抗體的二價(jià)離子)處的峰(圖5A)。此外，在作為對(duì)比的沒(méi)有SCUPA的凝膠中，在此質(zhì)譜分析用板中沒(méi)有觀察到峰，盡管進(jìn)行了相同過(guò)程，例如電印跡、阻斷、添加抗SCUPA抗體以及用PBS洗滌(圖5B)。
上述結(jié)果顯示了，在電泳分離之后，印跡至質(zhì)譜分析用板上的SCUPA保留結(jié)合能夠與其發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)(抗SCUPA抗體)的活性，并且實(shí)際上同時(shí)測(cè)量印跡的蛋白質(zhì)和與其發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)的分子量，從而可鑒別兩種分子物種；上述結(jié)果表明了可以檢測(cè)該質(zhì)譜分析用板上的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及可以鑒別在該質(zhì)譜分析用板上形成的復(fù)合物。
比較例1印跡至PVDF膜和質(zhì)譜分析在還原條件下，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，對(duì)兩種蛋白質(zhì)，即SCUPA和HSA各4μg的混合物串聯(lián)電泳兩次。添加初始試樣，在30mA電流進(jìn)行電泳40分鐘，然后斷開(kāi)電流，將相同的試樣再次添加至相同的泳道中，進(jìn)一步在30mA電流下進(jìn)行電泳23分鐘。遷移后，切割各遷移通道的凝膠，進(jìn)一步在離凝膠上表面上的添加位置39mm處切割；如圖2A所示，將兩片凝膠以它們的上表面各自接觸而放置，并將78mm×8mm切割的PVDF膜放置在凝膠上，并在10mM硼酸鈉緩沖液(pH8.0)中在90mA電流下進(jìn)行電印跡2小時(shí)。在完成印跡之后，用PBS洗滌PVDF膜，用蒸餾水沖洗，干燥，并使用透明的雙面涂布的帶(Sumitomo 3M Ltd.制造的)施加至鋁板。向其添加基質(zhì)(DHB)，使用ProteinChip System(如上所述的)進(jìn)行質(zhì)譜分析。
結(jié)果是，印跡至PVDF膜上的SCUPA在50,096.9處產(chǎn)生峰，HSA在67,394.5處產(chǎn)生峰；然而，難以鑒定這兩個(gè)峰，這是因?yàn)橄鄬?duì)峰強(qiáng)度極其低，以及信噪比(S/N比)低(圖6)。此外，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)譜分析用板的情況下(同樣適用于本發(fā)明的質(zhì)譜分析用板)，花費(fèi)2-3分鐘到達(dá)真空狀態(tài)，然后立即測(cè)量是可行的；然而，在PVDF膜的情況下，長(zhǎng)達(dá)45分鐘到達(dá)真空狀態(tài)，從而導(dǎo)致所使用的質(zhì)譜儀過(guò)量負(fù)載，并且質(zhì)譜儀不經(jīng)受頻繁使用。
實(shí)施例5使用本發(fā)明質(zhì)譜分析用板進(jìn)行各種蛋白質(zhì)組分析使用各種細(xì)胞或組織提取試樣，在相對(duì)低的分子量范圍內(nèi)(分子量1,000-20,000)確定本發(fā)明質(zhì)譜分析用板的性能。在下述試驗(yàn)中，將試樣施加至16％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(在Tris-Tricine緩沖液中)，并電泳90分鐘，然后在10mM硼酸鈉緩沖液(用鹽酸將pH值調(diào)節(jié)值8.0)中將分析物從凝膠中電印跡至本發(fā)明色譜分析用板上1-2小時(shí)。在印跡完成之后，沖洗該板，沾污(spot)基質(zhì)，并進(jìn)行質(zhì)譜分析。
(1)在4℃下使用1N醋酸勻化豬小腦，并在4℃下，以3,000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，回收上清液。添加乙腈，獲得最終10％的濃度，將上清液施用至反相色譜的柱上。用含有10％乙腈的0.1％三氟乙酸(TFA)洗滌該柱，并用含60％乙腈的0.1％TFA洗脫。冷凍干燥洗脫物，并將其用作豬小腦提取物。在通過(guò)SDS-PAGE分離出提取物后，將其電印跡至本發(fā)明質(zhì)譜分析用板上。使用含有飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)作為基質(zhì)的0.5％TFA/50％ACN，進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果是，在3,000-20,000的分子量范圍內(nèi)，峰是可檢測(cè)的。
將其與使用DHB(150mg/mL乙醇)或飽和SPA(在0.5％TFA/50％ACN)代替飽和CHCA作為基質(zhì)的情況作比較。在DHB的情況下，在3,000-20,000的分子量范圍內(nèi)，沒(méi)有觀察到明顯的峰。在飽和SPA的情況下，在相同的分子量范圍內(nèi)，只有觀察到幾個(gè)峰。相反，在飽和CHCA的情況下，在2,000-10,000和5,000-20,000的分子量范圍內(nèi)，觀察到大量的峰。從這些結(jié)果中，顯示CHCA更優(yōu)選用于鑒別相對(duì)低分子量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)。
(2)以與上述(1)中相同的方式，進(jìn)行豬小腦提取物的質(zhì)譜分析，不同之處在于使用50％飽和CHCA作為基質(zhì)。結(jié)果是，在1,000或更大的分子量范圍內(nèi)，峰是可檢測(cè)的。特別地，在檢測(cè)3,000-20,000分子量范圍內(nèi)的峰時(shí)，表現(xiàn)出了優(yōu)越的性能。
在1,000-10,000分子量范圍內(nèi)的質(zhì)譜分析中峰出現(xiàn)的程度方面，將其與使用10％或20％飽和CHCA代替50％飽和CHCA的情況作比較。在10％飽和CHCA的情況下，觀察到幾個(gè)峰。在20％飽和CHCA的情況下，峰的數(shù)目略微多于使用10％飽和CHCA的情況。相反，在50％飽和CHCA的情況下，觀察到很多峰。
(3)在100ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸鹽(PMA)的存在下，在含10％FCS的RPMI1640介質(zhì)中培養(yǎng)U937細(xì)胞(1×105至2×106個(gè)細(xì)胞/ml)48小時(shí)。進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，但是沒(méi)有PMA，以作為對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞，并制備細(xì)胞團(tuán)(cell pellet)。此外，添加蛋白質(zhì)提取試劑(Novagen Inc.)和蛋白酶抑制劑，在離心細(xì)胞團(tuán)之后，在4℃下靜置細(xì)胞團(tuán)15分鐘，并回收上清液，用作細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。在通過(guò)SDS-PAGE分離之后，將其電印跡至本發(fā)明質(zhì)譜分析用板上。隨后，進(jìn)行質(zhì)譜分析；3,000-20,000分子量范圍內(nèi)的所檢測(cè)到的峰的強(qiáng)度方面，比較PMA刺激U937細(xì)胞的結(jié)果和對(duì)照U937細(xì)胞的結(jié)果。結(jié)果是，在蛋白質(zhì)的PMA刺激表達(dá)中觀察到下述變化(表1)。
表1

(4)進(jìn)行剖面小鼠組織。使用Beads Shocker(Yasui Kikai Corporation，Osaka)，在2,500rpm轉(zhuǎn)速下處理10-30秒，破裂小鼠組織(腦、肺、肝、肌肉)，添加TricinePAGE試樣緩沖液(Wako Pure Chemical Industries)，在12,000rpm下離心5分鐘，回收上清液。在用SDS-PAGE分離之后，將上清液電印跡至本發(fā)明質(zhì)譜分析用板上，進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果是，在各組織中檢測(cè)到組織特異的肽(分子量3,000-20,000)。
實(shí)施例6研究電印跡時(shí)緩沖液的影響作為電印跡時(shí)的緩沖液，使用Tris緩沖液(25mM Tirs/192mM甘氨酸/20％甲醇，pH8.3)、磷酸鹽緩沖液(5％ ACN/125mM NaCl/PBS，pH7.2)、乙酸鹽緩沖液(40mM Tris-乙酸鹽/1mM EDTA，pH8.0)和硼酸鹽緩沖液(10mM硼酸鈉-鹽酸，pH8.0)。至于質(zhì)譜分析用的蛋白質(zhì)，使用HSA和SCUPA。除了這些條件之外，依照實(shí)施例5的方法，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果是，在檢測(cè)的緩沖液中，硼酸鹽緩沖液產(chǎn)生最大的質(zhì)譜峰強(qiáng)度。例如，對(duì)SCUPA而言，硼酸鹽緩沖液的峰強(qiáng)度的最大值約是磷酸鹽緩沖液的21倍，對(duì)HSA而言，約4倍。
工業(yè)實(shí)用性由于使用PVDF作為配體吸附劑，本發(fā)明質(zhì)譜分析用板能夠均勻地吸附各種蛋白質(zhì)，在印跡效率上優(yōu)異，并能夠正常保留蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和功能。本發(fā)明質(zhì)譜分析用板的特征也在于沒(méi)有非特定吸附，印跡后進(jìn)行質(zhì)譜分析的能力等。
利用本發(fā)明質(zhì)譜分析用板的特征，可大量、快速和高靈敏度地分析和鑒別蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可為一種蛋白質(zhì)，或者多種蛋白質(zhì)的集合體(蛋白質(zhì)組)，甚至同樣可分析和鑒別對(duì)該蛋白質(zhì)具有親合力(與其相互作用)的化合物的復(fù)合物(也就是說(shuō)，大量，快速而又高靈敏度地)。
此外，能夠顯著減少操作時(shí)間、步驟簡(jiǎn)化、裝置尺寸減小、成本降低、自動(dòng)化和篩選大量分析物，并使大規(guī)模蛋白質(zhì)分析容易。而且，能夠蛋白質(zhì)組分析生理重要的低豐度蛋白質(zhì)，從而有助于發(fā)現(xiàn)診斷用途的生物標(biāo)記和發(fā)現(xiàn)新藥物研發(fā)的種子化合物(seed compound)。
因此，本發(fā)明使得可以向傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組分析中引入一種新技術(shù)，其是電泳和質(zhì)譜分析的結(jié)合。
本申請(qǐng)是基于向美國(guó)申請(qǐng)的US10/264,505和向日本申請(qǐng)的日本專(zhuān)利申請(qǐng)No.2002-344710，在本說(shuō)明書(shū)中整體引入這兩申請(qǐng)的教導(dǎo)。
在該說(shuō)明書(shū)中引入所有引用，包括在此提及的出版物和專(zhuān)利，通過(guò)在此以如同它們單獨(dú)表現(xiàn)出被引入的程度，作為參考，它們中全部在此限定。
盡管重點(diǎn)以?xún)?yōu)選的實(shí)施方式，描述了本發(fā)明，但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，這些優(yōu)選的實(shí)施方式可以更改。本發(fā)明可通過(guò)除此處詳細(xì)描述的方法之外的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明包括囊括在權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的各種更改。
權(quán)利要求
1.質(zhì)譜分析用板，其包括支撐體和與其粘附的涂層，其中所述涂層含有聚偏二氟乙烯。
2.權(quán)利要求1的板，其中支撐體是由鋁或不銹鋼制成的。
3.制備質(zhì)譜分析用板的方法，其包括用聚偏二氟乙烯涂布支撐體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中涂布的方式是涂抹、噴射、氣相沉積、浸漬、印刷或?yàn)R射。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其包括將含有聚偏二氟乙烯的溶液施用至支撐體。
6.權(quán)利要求5的方法，其包括施用后，除去所述溶劑。
7.質(zhì)譜分析用板，其是通過(guò)權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)的方法制備的。
8.鑒別分析物的方法，其包括下述步驟(a)-(d)(a)提供權(quán)利要求1或7的質(zhì)譜分析用板，(b)對(duì)含有分析物的試樣進(jìn)行凝膠電泳，(c)將遷移后的凝膠印跡至所述板上，以將所述分析物轉(zhuǎn)印至所述板上，以及(d)對(duì)所述板進(jìn)行質(zhì)譜分析，以分析轉(zhuǎn)印的分析物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中印跡是電印跡。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中質(zhì)譜分析是MALDI-MS。
11.權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的方法，其中含分析物的試樣含有多種分析物。
12.權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的方法，其中分析物選自蛋白質(zhì)、核酸、寡核苷酸、糖、寡糖、細(xì)胞膜受體激動(dòng)劑或拮抗劑、毒素、病毒表位、激素、肽、酶、酶底物或酶抑制劑、輔因子、藥物、凝集素和抗體。
13.權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)和(d)之間的步驟(c2)，其中使含有對(duì)轉(zhuǎn)印的分析物具有親合力的物質(zhì)的試樣與所述板接觸，以在板上形成所述分析物和所述物質(zhì)的復(fù)合物，由此在步驟(d)中同時(shí)分析所述分析物和所述物質(zhì)。
14.權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)或(c2)和步驟(d)之間，將質(zhì)譜分析用基質(zhì)添加至所述板。
15.權(quán)利要求14的方法，其中基質(zhì)是2，5-二羥基苯甲酸。
全文摘要
本發(fā)明提供質(zhì)譜分析用板，其包括支撐體和其上的含PVDF的涂層(即，PVDF沉積的薄層)；制備質(zhì)譜分析用板的方法，其包括用PVDF涂布支撐體表面。本發(fā)明還提供鑒別分析物的方法，其包括對(duì)含分析物的試樣進(jìn)行凝膠電泳，以分離分析物，將分離出的分析物從凝膠中印跡至上述色譜分析用板，并將該板進(jìn)行質(zhì)譜分析，由此分析轉(zhuǎn)印的分析物。
文檔編號(hào)H01J49/26GK1720450SQ20038010519
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2003年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月4日
發(fā)明者田中憲次, 李良子, 棟近公司, 有國(guó)尚, 落合文吾 申請(qǐng)人:普羅托賽拉株式會(huì)社