本發(fā)明屬于光遺傳學與光學顯微成像領域，特別涉及了一種自適應光學聚焦干涉補償方法與系統(tǒng)，并應用于新一代非侵入性光遺傳學光刺激與活體深穿透光學顯微成像。

背景技術：

在生物醫(yī)學光學領域，光學散射是制約光學成像質(zhì)量的主要因素。多數(shù)深部組織成像的光學技術(例如，激光共聚焦成像，雙光子顯微鏡和光學相干層析掃描)主要利用非散射光子(即彈道光子)成像。彈道光子的數(shù)量隨深度增加呈指數(shù)式衰減，因此將光學聚焦范圍限制在了1mm的深度。

光遺傳學技術需要對特定的神經(jīng)元進行光刺激，以研究其神經(jīng)環(huán)路機理。但是傳統(tǒng)的光纖植入式光遺傳學對活體生物的損傷嚴重，不利于長期研究。早先應用在天文學中的自適應光學技術，為實現(xiàn)深層生物組織光刺激與成像提供了新的技術支持。

現(xiàn)有的非侵入式自適應光遺傳學技術是基于自適應光學的精確相位校正，通過將空間光調(diào)制器分成若干分區(qū)，依次等間隔改變分區(qū)內(nèi)的光束附加相位，探測其最佳光學聚焦相位。每個分區(qū)依次循環(huán)迭代，從而獲得最終校正相位，對入射光束進行相位補償，從而校正其畸變相位，形成良好光學聚焦。

但是以上精確相位校正需要消耗大量的時間，為了獲得更好地光學校正，就需要劃分更多的分區(qū)與更細的相位間隔。由于空間光調(diào)制器的圖像刷新率較低，導致光學校正消耗大量時間，不利于活體生物中進行實時光遺傳學刺激和實時高分辨率光學成像，制約了自適應光遺傳技術和顯微技術的推廣。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決背景技術中存在的問題，本發(fā)明目的在于利用圖像刷新率較高的數(shù)字微鏡器件解決傳統(tǒng)自適應光遺傳學中空間光調(diào)制器耗時較長的問題。從光學干涉原理出發(fā)，將光束分為若干區(qū)域，并探測各分區(qū)內(nèi)光束對聚焦中心的干涉作用。通過保留對聚焦中心干涉相長的區(qū)域內(nèi)的光束，同時對聚焦中心干涉相消的區(qū)域內(nèi)的光束附加相位差π，使其滿足干涉相長條件并將其再次引入光路中。通過將原本對聚焦光斑中心起到負面作用的干涉相消的光束轉(zhuǎn)為能夠干涉相長的光束，使得光束得到充分利用，從而提升了光學聚焦的質(zhì)量，縮短了自適應光刺激的校正時間。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案包括以下步驟：

一、一種自適應光學聚焦干涉補償方法：

1)物鏡的焦平面處不放置實驗樣品，用無加載分區(qū)的數(shù)字微鏡器件進行光束聚焦，在物鏡的焦平面處得到理想聚焦光斑，記錄理想聚焦光斑的聚焦中心位置of；

2)將實驗樣品置于物鏡的焦平面處，用無加載分區(qū)的數(shù)字微鏡器件進行光強探測，記錄獲得聚焦中心位置of的光強值，作為光強閾值ith；

3)將數(shù)字微鏡器件的反射面分為多塊區(qū)域，以每一區(qū)域依次作為目標區(qū)域，對目標區(qū)域的反射光束進行相位補償，遍歷各個區(qū)域用加載分區(qū)的數(shù)字微鏡器件進行光強探測，獲得各個區(qū)域?qū)涗浀降木劢怪行奈恢胦f處的一系列光強值；

4)將每一光強值與光強閾值ith進行比較，并采用以下方式處理得到判斷結果：

若光強值小于光強閾值ith，則該光強值對應的區(qū)域為不需相位補償區(qū)域；

若光強值大于等于光強閾值ith，則該光強值對應的區(qū)域為需相位補償區(qū)域；

5)將根據(jù)判斷結果調(diào)整分區(qū)并加載到數(shù)字微鏡器件上進行光強探測，在實驗樣品內(nèi)形成干涉補償后的最終光學聚焦補償光斑，在聚焦中心位置為of處激發(fā)出更強的熒光。

所述步驟1)中的光束聚焦具體是：激光器發(fā)射出光束，經(jīng)過準直擴束后，在數(shù)字微鏡器件上反射，然后經(jīng)過物鏡聚焦。

所述步驟3)中所指的相位補償具體是指，在光束的原相位上附加一個數(shù)值為π的相位差。

所述步驟2)、3)和5)中的光強探測具體是：激光器發(fā)射出光束，經(jīng)過準直擴束后，在數(shù)字微鏡器件上反射，然后經(jīng)過物鏡聚焦到樣品上，樣品帶有熒光材料，在樣品內(nèi)產(chǎn)生畸變散射光斑并激發(fā)出熒光，激發(fā)出的熒光再經(jīng)透鏡聚焦后由光電倍增管和振鏡配合進行掃描探測獲得散射光斑激發(fā)出的熒光圖像，記錄聚焦中心位置of的光強值。

所述步驟3)用加載分區(qū)的數(shù)字微鏡器件進行光強探測具體是指光強探測時，數(shù)字微鏡器件上的目標區(qū)域?qū)⒆陨斫邮杖肷涔馐螽a(chǎn)生的反射光束調(diào)整反射角度，使反射光束到旁側(cè)光路進行相位補償后再回到未調(diào)整反射角度前的反射光路中，同時除目標區(qū)域以外的其他區(qū)域保持反射光束的反射角度與所述步驟2)光強探測時反射光束的反射角度相同。

所述步驟5)根據(jù)判斷結果補償分區(qū)具體是指：經(jīng)過數(shù)字微鏡器件時，判斷后需相位補償區(qū)域?qū)⒆陨斫邮杖肷涔馐螽a(chǎn)生的反射光束調(diào)整反射角度，使反射光束到旁側(cè)光路進行相位補償后再回到未調(diào)整反射角度前的反射光路中，同時判斷后不需相位補償區(qū)域保持反射光束的反射角度與所述步驟2)光強探測時反射光束的反射角度相同。

所述的熒光材料包括熒光蛋白、熒光小球或者熒光染料。

所述實驗樣品為但不限于活體生物組織、離體生物組織、含小球的瓊脂塊等。

所述步驟3)中將數(shù)字微鏡器件的反射面分為多塊區(qū)域具體是指將數(shù)字微鏡器件的微鏡像素元以n×n方式均勻分區(qū)，從而將準直擴束后的入射光束分為對應的n×n個光束單元。

二、一種自適應光學聚焦干涉補償系統(tǒng)：

系統(tǒng)包括激光器、光束準直擴束模塊、數(shù)字微鏡器件、相位補償模塊、分束器、縮束模塊、掃描模塊、二向色鏡、顯微物鏡、實驗樣品和光強探測模塊。光束準直擴束模塊布置在激光器之后，激光器發(fā)射出光束經(jīng)準直擴束模塊平行擴束并空間濾波后入射到數(shù)字微鏡器件，數(shù)字微鏡器件旁側(cè)出射端前方置有相位補償模塊，數(shù)字微鏡器件正側(cè)出射端置有分束器和縮束模塊，相位補償模塊位于分束器的旁側(cè)處，數(shù)字微鏡器件的旁側(cè)反射光束經(jīng)相位補償模塊后再反射到分束器中，數(shù)字微鏡器件的正側(cè)反射光束直接反射到分束器中；縮束模塊前方設有二向色鏡；光束經(jīng)二向色鏡反射后經(jīng)過掃描模塊進入顯微物鏡聚焦，實驗樣品位于顯微物鏡焦平面上；實驗樣品內(nèi)激發(fā)出的熒光經(jīng)過顯微物鏡與掃描模塊后透過二向色鏡被光強探測模塊接收進行光強探測。

所述的光束準直擴束模塊包括前光束準直擴束模塊透鏡、光束空間濾波器和后光束準直擴束模塊透鏡；前光束準直擴束模塊透鏡、光束空間濾波器和后光束準直擴束模塊透鏡依次平行布置在激光器出射端的前方，入射光束依次經(jīng)前光束準直擴束模塊透鏡、光束空間濾波器和后光束準直擴束模塊透鏡平行擴束后入射到數(shù)字微鏡器件。

所述的相位補償模塊包括但不限于光學延遲線、空間光調(diào)制器、相位延遲片等。

所述的縮束模塊包括前縮束模塊透鏡和后縮束模塊透鏡；前縮束模塊透鏡和后縮束模塊透鏡依次平行布置在分束器的前側(cè)，數(shù)字微鏡器件反射的光束依次經(jīng)前縮束模塊透鏡和后縮束模塊透鏡平行縮束后入射到二向色鏡的旁側(cè)。

所述的掃描模塊包括前掃描振鏡、前光束準直透鏡、后光束準直透鏡、后掃描振鏡、前掃描模塊透鏡和后掃描模塊透鏡；前掃描振鏡、前光束準直透鏡、后光束準直透鏡、后掃描振鏡、前掃描模塊透鏡和后掃描模塊透鏡依次布置在二向色鏡的前側(cè)，二向色鏡反射的光束依次經(jīng)前掃描振鏡、前光束準直透鏡、后光束準直透鏡、后掃描振鏡、前掃描模塊透鏡和后掃描模塊透鏡后入射到顯微物鏡。

所述的光強探測模塊包括光學濾波器、聚焦透鏡、空間濾波器和光電倍增管；光學濾波器、聚焦透鏡、空間濾波器和光電倍增管依次布置在二向色鏡的后側(cè)，實驗樣品發(fā)出的熒光依次經(jīng)顯微物鏡、后掃描模塊透鏡、前掃描模塊透鏡、后掃描振鏡、后光束準直透鏡、前光束準直透鏡、前掃描振鏡、二向色鏡、光學濾波器、聚焦透鏡和空間濾波器后進入光電倍增管進行光強探測。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明利用數(shù)字微鏡器件實現(xiàn)了簡易的自適應光學聚焦補償，利用數(shù)字微鏡器件快速的圖像刷新速率，克服了以往利用空間光調(diào)制器進行串行相位校正時速度慢的問題，提升了光學聚焦與光學刺激的速度。

本發(fā)明基于光學干涉成像原理，通過數(shù)字微鏡器件判斷出對聚焦光斑有干涉相消作用的分區(qū)光束，并將在其相位上附加值為π的相位差，使其滿足干涉相長的條件，從而使得聚焦中心的光強顯著提升，提高了強散射介質(zhì)內(nèi)部光學聚焦的質(zhì)量。

本發(fā)明使用數(shù)字微鏡器件進行自適應光學校正，且有多種簡便方式實現(xiàn)相位補償，降低了實驗成本，更利于方法與系統(tǒng)在研究實驗中的應用。

并且本發(fā)明可方便地與已有的各種顯微成像技術相結合，有助于非光纖植入式光遺傳學光刺激技術發(fā)展，實現(xiàn)大腦深處同步的光刺激與顯微成像，推動腦科學研究進展。

附圖說明

圖1為本發(fā)明系統(tǒng)的結構示意圖；

圖2為實施例中無數(shù)字微鏡器件校正時的散射聚焦光斑圖像；

圖3為實施例中數(shù)字微鏡器件分區(qū)依次補償后所得光強值與閾值的比較圖；

圖4為實施例中數(shù)字微鏡器件判斷后需要補償?shù)姆謪^(qū)相位分布圖；

圖5為實施例中對所有需要補償?shù)姆謪^(qū)進行相位補償后的聚焦光斑圖像。

具體實施方式

以下自適應光學聚焦補償實施例可以更詳細的說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。

本發(fā)明的實施例及其具體過程如下：

如圖1所示，本發(fā)明系統(tǒng)包括激光器1、前光束準直擴束模塊透鏡2、光束空間濾波器3和后光束準直擴束模塊透鏡4、數(shù)字微鏡器件5、相位補償模塊6、分束器7、前縮束模塊透鏡8和后縮束模塊透鏡9、二向色鏡10、前掃描振鏡11、前光束準直透鏡12、后光束準直透鏡13、后掃描振鏡14、前掃描模塊透鏡15和后掃描模塊透鏡16、顯微物鏡17、實驗樣品18、光學濾波器19、聚焦透鏡20、空間濾波器21和光電倍增管22。

(1)激光器1發(fā)出的光束依次經(jīng)過前光束準直擴束模塊透鏡2、光束空間濾波器3和后光束準直擴束模塊透鏡4進行擴束后，照射到數(shù)字微鏡器件5上。在數(shù)字微鏡器件5無加載圖像且不加載實驗樣品18時，光束被反射經(jīng)過分束器7、前縮束模塊透鏡8和后縮束模塊透鏡9，照射到二向色鏡10的側(cè)面被反射，反射光束經(jīng)過前掃描振鏡11、前光束準直透鏡12、后光束準直透鏡13、后掃描振鏡14、前掃描模塊透鏡15和后掃描模塊透鏡16后進入顯微物鏡17，并在焦平面處形成理想的聚焦光斑，記聚焦光斑中心在焦平面的位置為of。

(2)加載實驗樣品18，數(shù)字微鏡器件5無加載圖像時，激光器1發(fā)出的光束依次經(jīng)過前光束準直擴束模塊透鏡2、光束空間濾波器3和后光束準直擴束模塊透鏡4進行擴束后，照射到數(shù)字微鏡器件5上，光束被反射經(jīng)過分束器7、前縮束模塊透鏡8和后縮束模塊透鏡9，照射到二向色鏡10的側(cè)面被反射，反射光束經(jīng)過前掃描振鏡11、前光束準直透鏡12、后光束準直透鏡13、后掃描振鏡14、前掃描模塊透鏡15和后掃描模塊透鏡16后進入顯微物鏡17，并在實驗樣品18內(nèi)焦平面處形成畸變的散射聚焦光斑，并激發(fā)出熒光。

(3)熒光從實驗樣品18內(nèi)發(fā)射進入顯微物鏡17，然后依次經(jīng)過后掃描模塊透鏡16、前掃描模塊透鏡15、后掃描振鏡14、后光束準直透鏡13、前光束準直透鏡12、前掃描振鏡11、二向色鏡10、光學濾波器19、聚焦透鏡20和空間濾波器21后進入光電倍增管22進行光強探測，通過掃描得到無數(shù)字微鏡器件校正時的散射聚焦光斑圖像，如圖2所示。記此時of對應位置的光強值ith為光強閾值。在本具體實施案例中由于光強最強點偏移，of對應位置的光強值ith為15.76。

(4)在本具體實施案例中將數(shù)字微鏡器件的微鏡像素元以32×32方式均勻分為1024個區(qū)域，從而將準直擴束后的入射光束分為對應的1024個光束單元。一個分區(qū)內(nèi)的微鏡同時向同一方向偏轉(zhuǎn)，將該區(qū)光束反射至旁側(cè)光路的相位補償模塊6，使其相位改變π之后回到原反射光路，與此同時，其他分區(qū)內(nèi)的微鏡保持不變，使得其光束形成光學聚焦，即僅去除一個分區(qū)內(nèi)的光束，而保持其余1023個分區(qū)的光束不變，由光電倍增管記錄在of處的熒光光強值。所有分區(qū)依次重復上述步驟直到記錄所有分區(qū)對應的光強值。

(5)將步驟(4)所得1024個光強值與步驟(3)所得光強閾值ith相比較，得到如圖3所示光強比較圖。保持光強值小于閾值的分區(qū)不變并將光強值大于等于閾值的分區(qū)標記為補償分區(qū)，得到補償分區(qū)圖像。在本具體實施案例中數(shù)字微鏡器件分區(qū)依次補償后所得光強值與閾值的比較圖如圖3所示；所需補償?shù)姆謪^(qū)相位分布圖如圖4所示。

(6)將補償分區(qū)圖像加載到到數(shù)字微鏡器件5上，入射光束經(jīng)前光束準直擴束模塊透鏡2、光束空間濾波器3和后光束準直擴束模塊透鏡4進行擴束后，照射到數(shù)字微鏡器件5上，需要補償?shù)姆謪^(qū)對應的光束被反射至旁側(cè)光路的相位補償模塊6上，從而發(fā)生π的相位差改變，并回到分束器7中與被保留的分區(qū)對應的光束一起經(jīng)過前縮束模塊透鏡8和后縮束模塊透鏡9，照射到二向色鏡10的側(cè)面被反射，反射光束經(jīng)過前掃描振鏡11、前光束準直透鏡12、后光束準直透鏡13、后掃描振鏡14、前掃描模塊透鏡15和后掃描模塊透鏡16后進入顯微物鏡17，并在實驗樣品18內(nèi)焦平面處形成最終的光學聚焦補償光斑，并激發(fā)更強的熒光。在本具體實施案例中所用相位補償模塊為光學延遲線。

(7)經(jīng)過光學聚焦補償后激發(fā)的熒光從實驗樣品18內(nèi)發(fā)射進入顯微物鏡17，然后依次經(jīng)過后掃描模塊透鏡16、前掃描模塊透鏡15、后掃描振鏡14、后光束準直透鏡13、前光束準直透鏡12、前掃描振鏡11、二向色鏡10、光學濾波器19、聚焦透鏡20和空間濾波器21后進入光電倍增管22進行光強探測，通過掃描得到數(shù)字微鏡器件5加載補償分區(qū)進行補償后的聚焦光斑圖像，如圖5所示，在本具體實施案例中該圖像of位置對應的光強值為202.2。

傳統(tǒng)的最優(yōu)化自適應光學聚焦技術采用空間光調(diào)制器進行相位的逐次校正。假設將空間光調(diào)制器分成32×32個分區(qū)，每個分區(qū)從0到2π以π/5的間隔依次改變對應光束的相位，從而獲得具有最好校正效果的相位值。假設空間光調(diào)制器工作時的圖像加載速率上限為60hz，則完成一次光學聚焦相位探測所需要的時間為：

而本發(fā)明所使用的數(shù)字微鏡器件的圖像刷新率上限為22727hz，同樣將其分為32×32個分區(qū)，其完成一次光束聚焦增強分區(qū)的判斷時間為：

由于最優(yōu)化自適應光學聚焦技術需要多次迭代運算，完成光束聚焦校正的時間較長。而本發(fā)明利用數(shù)字微鏡器件快速的圖像刷新率，極大地減少了光束聚焦增強所需要的處理時間，顯著提升了光學聚焦補償?shù)奶幚硭俣取?/p>

由上述實施例可見，本發(fā)明自適應光學聚焦干涉補償方法與系統(tǒng)簡單、便捷，能夠在簡單、快速的串行光束判斷之后，將目標聚焦點的光強提升約1183％。相比于利用空間光調(diào)制器進行逐次相位校正，本發(fā)明能夠在提升聚焦光斑中心光強的同時縮短校正時間，為非光纖植入式光遺傳學光刺激與深穿透實時成像提供了更低成本更便捷的實驗技術，提升了實驗效率。