本發(fā)明涉及雙光子熒光成像技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光成像系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)：

在自由活動(dòng)的動(dòng)物中直接記錄神經(jīng)元活動(dòng)是研究動(dòng)物行為與神經(jīng)功能之間的關(guān)系最直接有效的方法之一。在之前的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，這一任務(wù)都是通過電生理學(xué)途徑(electrophysiologicalapproach)來執(zhí)行的。近些年來，光學(xué)成像特別是熒光顯微技術(shù)在這項(xiàng)任務(wù)中起了越來越重要的作用。相比于電生理方法，光學(xué)成像最大的優(yōu)勢(shì)是其具有非侵入性以及更大的成像視野和更多的可觀察目標(biāo)。而與普通的單光子熒光成像技術(shù)相比，雙光子顯微鏡具有更好的光學(xué)切片能力和更深的穿透深度。這使得雙光子顯微鏡成為利用熒光成像對(duì)大腦神經(jīng)元觀察中最重要和最廣泛使用的工具。同時(shí)，為了觀測(cè)清醒動(dòng)物在活動(dòng)狀態(tài)下的神經(jīng)活動(dòng)，研究者通常會(huì)將大型的臺(tái)式雙光子顯微鏡進(jìn)行改造，加入一些模擬運(yùn)動(dòng)的裝置例如跑步機(jī)或者轉(zhuǎn)輪等等；但實(shí)驗(yàn)時(shí)必須將小鼠的頭部固定在顯微鏡鏡頭之下，僅僅不限制軀干的活動(dòng)，用這種方式來模擬真實(shí)的運(yùn)動(dòng)。隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)這種模擬暴露出許多的弊端。首先，人們認(rèn)為這種模擬不能反映真實(shí)的活動(dòng)狀態(tài)。因?yàn)閯?dòng)物例如小鼠真實(shí)活動(dòng)中所需要參與的很多過程，例如身體的扭動(dòng)，周圍環(huán)境的線索，重力的轉(zhuǎn)換等等在頭部固定式都不具備。其次，許多經(jīng)典的行為學(xué)研究，例如恐懼，社交和探索等等無法在頭部固定時(shí)實(shí)現(xiàn)。

所以，從2001年開始，人們就開始嘗試制造微型的，可以安裝在動(dòng)物頭部如大鼠或小鼠頭部的，可以在其完全自由活動(dòng)時(shí)進(jìn)行熒光成像的微型雙光子顯微鏡系統(tǒng)。從2001年美國(guó)denk教授課題組嘗試制作的25g小型雙光子顯微鏡到2011年kerr教授課題組制作的5g微型雙光子顯微鏡?？茖W(xué)家進(jìn)行了數(shù)次嘗試，然而都沒有達(dá)到很理想的效果。總體來講，由于微型雙光子顯微鏡將所有的光學(xué)鏡片尺寸都進(jìn)行了大大的縮減，使得整體的光學(xué)質(zhì)量很難控制。再加上微小的鏡頭之間的裝配和耦合很難跟大型鏡片一樣好。更重要的是，小型的物鏡由于鏡片數(shù)量的限制，對(duì)由樣本引入的畸變更加敏感。所有這些問題導(dǎo)致微型化雙光子顯微鏡無法達(dá)到跟大型臺(tái)式雙光子顯微鏡一樣的高分辨率成像。這極大的限制了微型化雙光子顯微鏡的推廣和應(yīng)用。

另一方面，自適應(yīng)光學(xué)在天文學(xué)，眼底檢查以及顯微成像領(lǐng)域，都被很好的利用，以糾正由系統(tǒng)和樣板帶來的畸變，進(jìn)而提高像質(zhì)。特別是在大型的臺(tái)式雙光子顯微鏡中，已有人嘗試?yán)米赃m應(yīng)光學(xué)來糾正像差，提高成像質(zhì)量。然而，由于常規(guī)的自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)需要復(fù)雜的波前檢測(cè)裝置和波前矯正裝置，整體體積巨大，是無法應(yīng)用在微型化雙光子顯微鏡當(dāng)中的。所以，只有提出新的自適應(yīng)光學(xué)方案，設(shè)計(jì)新的自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)，使用新的微型自適應(yīng)光學(xué)器件，才能將自適應(yīng)光學(xué)與微型雙光子顯微鏡結(jié)合，進(jìn)而提高微型化雙光子顯微鏡的成像質(zhì)量。

因此，希望有一種技術(shù)方案來克服或至少減輕現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷中的至少一個(gè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子成像系統(tǒng)及方法來克服或至少減輕現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷中的至少一個(gè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光成像系統(tǒng)，所述微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光成像系統(tǒng)包括：激光光源裝置，其用于輸出激發(fā)光；微型探頭裝置，其用于接收所述激光光源裝置輸出的激發(fā)光，并利用所述激發(fā)光激發(fā)活體樣本內(nèi)部的組織平面，以產(chǎn)生熒光信號(hào)；以及用于在所述活體樣本被釋放的情形下，根據(jù)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面成像視場(chǎng)的各等暈區(qū)的平均波前畸變分布，對(duì)各所述等暈區(qū)進(jìn)行波前校正；波前檢測(cè)裝置，其信號(hào)輸入端口可操作性地與所述微型探頭裝置的信號(hào)輸出端口連接，用于在所述活體樣本被固定的情形下，接收所述微型探頭裝置輸出的熒光信號(hào)，并檢測(cè)所述平均波前畸變分布；去掃描構(gòu)件，其設(shè)置在所述微型探頭裝置與波前檢測(cè)裝置之間的光路上，用于在所述波前檢測(cè)裝置檢測(cè)所述平均波前畸變分布之前，實(shí)時(shí)補(bǔ)償所述微型探頭裝置產(chǎn)生的等暈區(qū)離軸效應(yīng)；和熒光成像裝置，其信號(hào)輸入端口可操作性地與所述微型探頭裝置的信號(hào)輸出端口連接，用于采集所述微型探頭裝置輸出的經(jīng)由波前校正后的熒光信號(hào)，完成所述活體樣本內(nèi)部的組織平面的成像。

進(jìn)一步地，所述微型探頭裝置包括：激光輸入模塊，用于接收所述激光光源裝置輸出的激發(fā)光；波前校正模塊，用于在所述活體樣本被釋放的情形下，根據(jù)活體樣本內(nèi)部的組織平面成像視場(chǎng)的各等暈區(qū)的平均波前畸變分布對(duì)各所述等暈區(qū)進(jìn)行波前校正；和掃描成像模塊，用于接收波前校正后的激發(fā)光，該激發(fā)光以二維運(yùn)動(dòng)的方式對(duì)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面進(jìn)行掃描，以激發(fā)所述活體樣本產(chǎn)生所述熒光信號(hào)。

進(jìn)一步地，所述掃描成像模塊包括：第一雙軸轉(zhuǎn)鏡，其用于通過轉(zhuǎn)動(dòng)改變激發(fā)光入射角角度的方式將由所述波前校正模塊波前校正后的激發(fā)光對(duì)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面進(jìn)行二維掃描；目鏡，其用于將來自所述第一雙軸轉(zhuǎn)鏡的激發(fā)光會(huì)聚到所述活體樣本內(nèi)部，以激發(fā)所述活體樣本產(chǎn)生所述熒光信號(hào)；以及用于輸出所述熒光信號(hào)；掃描鏡，其布置在所述第一雙軸轉(zhuǎn)鏡和目鏡之間的光路上，用于將所述第一雙軸轉(zhuǎn)鏡二維掃描所產(chǎn)生的角度變化的激發(fā)光轉(zhuǎn)化成位置變化的激發(fā)光；和雙色鏡，其設(shè)在所述掃描鏡和目鏡之間，用于將激發(fā)光和熒光信號(hào)分開以及輸出所述熒光信號(hào)。

進(jìn)一步地，所述去掃描構(gòu)件包括：第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡，其設(shè)置在所述微型探頭裝置的信號(hào)輸出端口和波前檢測(cè)裝置之間的光路上；和第一透鏡，其設(shè)置在所述第一微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡與所述微型探頭裝置的信號(hào)輸出端口之間的光路上，用于接收所述微型探頭裝置輸出的熒光信號(hào)，并將所述熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變成波前以及將該波前的共軛面投射到所述第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡上；所述第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡以能夠?qū)崟r(shí)補(bǔ)償所述第一微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡掃描產(chǎn)生的等暈區(qū)離軸效應(yīng)的方式與所述第一微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡相配合，再將實(shí)時(shí)補(bǔ)償后的激發(fā)光傳輸給所述波前檢測(cè)裝置；所述第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡與所述第一微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡之間的配合關(guān)系需要滿足：在時(shí)間上，同頻率、同相位；在空間上，掃描角度要求為：所述第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡轉(zhuǎn)動(dòng)的角度與所述第一微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡轉(zhuǎn)動(dòng)的角度的比值為所述掃描鏡的焦距與所述第一透鏡的焦距的比值；掃描方向要求為：方向相反。

進(jìn)一步地，所述波前檢測(cè)裝置包括：波前傳感器，其用于接收所述第一透鏡輸出的波前；和第一中繼機(jī)構(gòu)，其設(shè)置在所述第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡與波前傳感器之間的光路上，用于使所述第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡與波前傳感器共軛，使所述波前傳感器能夠檢測(cè)到所述平均波前畸變分布。

進(jìn)一步地，所述波前校正模塊包括：可變型反射鏡，其用于接收所述激光輸入模塊輸出的激發(fā)光，并根據(jù)所述平均波前畸變分布，改變和控制發(fā)射出的激發(fā)光的波前；和第二中繼機(jī)構(gòu)，其用于使所述可變型反射鏡和掃描鏡共軛，并將被所述可變型反射鏡波前校正后的激發(fā)光投射到所述第一雙軸轉(zhuǎn)鏡的反射面。

進(jìn)一步地，所述波前校正模塊還包括設(shè)置在光路上的第二透鏡、第一半波片、偏振分光立方體、第二半波片和四分之一波片，其中：所述激光輸入模塊輸出的激發(fā)光先后經(jīng)由所述第二透鏡和第一半波片，再從所述偏振分光立方體的第一側(cè)面進(jìn)入所述偏振分光立方體，然后從所述偏振分光立方體的第二側(cè)面輸出，并依次通過所述第二半波片和四分之一波片后投射到所述可變型反射鏡的反射面；所述可變型反射鏡反射出的激發(fā)光再次先后通過所述四分之一波片和第二半波片，從所述偏振分光立方體的第二側(cè)面進(jìn)入所述偏振分光立方體，經(jīng)由所述偏振分光立方體的激發(fā)光從所述偏振分光立方體的第三側(cè)面投射到所述第二中繼機(jī)構(gòu)。

進(jìn)一步地，所述熒光成像裝置的信號(hào)輸入端口通過柔性光線束與所述微型探頭裝置的信號(hào)輸出端口連接。

本發(fā)明提供一種微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光成像方法，所述微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光成像方法包括：步驟1，波前檢測(cè)，其具體包括：步驟11，固定活體樣本，并在所述活體樣本的預(yù)設(shè)位置固定安裝微型探頭裝置；步驟12，通過去掃描構(gòu)件實(shí)時(shí)補(bǔ)償所述微型探頭裝置產(chǎn)生的等暈區(qū)離軸效應(yīng)；和步驟13，通過波前檢測(cè)裝置檢測(cè)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面成像視場(chǎng)的各等暈區(qū)的平均波前畸變分布；步驟2，熒光成像，其具體包括：步驟21，釋放所述活體樣本；步驟22，根據(jù)所述步驟13檢測(cè)到的所述平均波前畸變分布，所述微型探頭裝置對(duì)各所述等暈區(qū)進(jìn)行波前校正并輸出波前校正后的熒光信號(hào)；和步驟23，通過熒光成像裝置采集所述步驟22輸出的所述熒光信號(hào)，完成所述活體樣本內(nèi)部的組織平面的成像。

本發(fā)明在固定活體樣本的情形下，能夠?qū)晒庑盘?hào)的波前從微型探頭裝置導(dǎo)出，并使用去掃描構(gòu)件實(shí)時(shí)補(bǔ)償微型探頭裝置產(chǎn)生的等暈區(qū)離軸效應(yīng)，再利用波前檢測(cè)裝置檢測(cè)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面成像視場(chǎng)的各等暈區(qū)的平均波前畸變分布，然后在釋放活體樣本的前提條件下，微型探頭裝置根據(jù)檢測(cè)到的平均波前畸變分布，對(duì)各等暈區(qū)進(jìn)行波前校正并輸出波前校正后的熒光信號(hào)，完成活體樣本內(nèi)部的組織平面的成像，因此可以實(shí)現(xiàn)具有可在自由活動(dòng)的動(dòng)物中進(jìn)行大視場(chǎng)、高時(shí)空分辨率、深層生物組織成像。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所提供的微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子成像系統(tǒng)的原理性示意圖。

圖2是圖1的微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子成像系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)波前檢測(cè)部分的一優(yōu)選實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是圖2中的去掃描構(gòu)件與掃描成像模塊的配合關(guān)系說明示意圖。

圖4是圖1的微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子成像系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)熒光成像部分的一優(yōu)選實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5是圖1的激光光源裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

在附圖中，使用相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。

在本發(fā)明的描述中，術(shù)語“中心”、“縱向”、“橫向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”“內(nèi)”、“外”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡(jiǎn)化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

本發(fā)明的活體樣本是有生命的小動(dòng)物，例如：小老鼠等。鑒于活體樣本的體積較小，因此，本發(fā)明屬于微型器件，整體結(jié)構(gòu)的體積在1～5cm³范圍內(nèi)。

現(xiàn)有技術(shù)中的微型探頭裝置內(nèi)的掃描構(gòu)件在成像/波前檢測(cè)時(shí)，即激光掃描時(shí)對(duì)激發(fā)光產(chǎn)生了一定程度的偏折，這使得激發(fā)光的會(huì)聚位置偏離了整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的光軸，進(jìn)而使得產(chǎn)生的熒光信號(hào)的等暈區(qū)也偏離了光軸，這種現(xiàn)象也稱為“離軸效應(yīng)”?，F(xiàn)有技術(shù)中的波前檢測(cè)幾乎都是采用基于等暈區(qū)不變的波前傳感方式，而這種方式在存在“離軸效應(yīng)”的情形下，無法檢測(cè)到活體樣本內(nèi)部的組織平面成像視場(chǎng)的各等暈區(qū)的平均波前畸變分布。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明欲通過微型探頭裝置與波前傳感裝置之間的光路上新增一套去掃描機(jī)構(gòu)，并利用控制算法將該去掃描機(jī)構(gòu)與微型探頭內(nèi)的掃描機(jī)構(gòu)聯(lián)動(dòng)，將熒光信號(hào)的偏折反向離軸的等暈區(qū)實(shí)時(shí)地糾正到整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的光軸上，這樣，即便是采用現(xiàn)有技術(shù)中的基于等暈區(qū)不變的波前傳感方式，也能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)到活體樣本內(nèi)部的組織平面成像視場(chǎng)的各等暈區(qū)的平均波前畸變分布。

根據(jù)本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，本實(shí)施例所提供的微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光成像方法包括：

步驟1，波前檢測(cè)，其具體包括：

步驟11，固定活體樣本，并在所述活體樣本的預(yù)設(shè)位置固定安裝微型探頭裝置。“預(yù)設(shè)位置”通常選取在活體樣本頭部(小老鼠的頭部)的開窗位置。該開窗位置能夠顯露出熒光標(biāo)記后的大腦組織。

步驟12，通過去掃描構(gòu)件實(shí)時(shí)補(bǔ)償所述微型探頭裝置中的掃描構(gòu)件產(chǎn)生的等暈區(qū)離軸效應(yīng)。該步驟可以采用如下方法實(shí)現(xiàn)：

如圖1和圖3所示，去掃描構(gòu)件4包括第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41和第一透鏡42，第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41設(shè)置在微型探頭裝置2的信號(hào)輸出端口和波前檢測(cè)裝置3之間的光路上。第一透鏡42設(shè)置在第一微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡31與微型探頭裝置2的信號(hào)輸出端口之間的光路上，用于接收所述微型探頭裝置2輸出的熒光信號(hào)，并將所述熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變成波前以及將該波前的共軛面投射到第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41上。微型探頭裝置2中的掃描構(gòu)件包括第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231、和掃描鏡233，第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231用于以轉(zhuǎn)動(dòng)改變角度的方式將由波前校正模塊22波前校正后的激發(fā)光對(duì)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面進(jìn)行二維掃描。掃描鏡233用于將第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231二維掃描所產(chǎn)生的角度變化的激發(fā)光轉(zhuǎn)化成位置變化的激發(fā)光。第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41和第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231同步掃描需要滿足以下要求：

1.在時(shí)間上，頻率相同，范圍在100～300hz；相位相同。

2.在空間上，掃描角度要求為：第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41轉(zhuǎn)動(dòng)的角度和第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231轉(zhuǎn)動(dòng)的角度的比值為掃描鏡233的焦距和第一透鏡42的焦距的比值。掃描方向要求為：方向相反。

通過上述方式，掃描構(gòu)件掃描導(dǎo)致的等暈區(qū)“離軸效應(yīng)”恰好被去掃描構(gòu)件的同步偏轉(zhuǎn)補(bǔ)償，進(jìn)而將微型探頭裝置輸出的熒光信號(hào)的偏折反向離軸的等暈區(qū)實(shí)時(shí)地糾正到整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的軸上，從而為步驟13有效進(jìn)行平均波前畸變分布檢測(cè)提供了有利條件。

步驟13，通過波前檢測(cè)裝置檢測(cè)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面成像視場(chǎng)的各等暈區(qū)的平均波前畸變分布。

步驟2，熒光成像，其具體包括：

步驟21，釋放所述活體樣本，并利用柔性光纖束收集所述微型探頭裝置輸出的熒光信號(hào)，柔性光纖束需要足夠的長(zhǎng)度，這樣活體樣本即便是頭頂著所述微型探頭裝置，也能夠自如活動(dòng)，而不會(huì)受到約束，進(jìn)而有利于反映活體樣本真實(shí)的活動(dòng)狀態(tài)，有利于獲取活體樣本的深層腦部組織的真實(shí)圖像數(shù)據(jù)。

步驟22，根據(jù)所述步驟13檢測(cè)到的所述平均波前畸變分布，所述微型探頭裝置對(duì)各所述等暈區(qū)進(jìn)行波前校正并輸出波前校正后的熒光信號(hào)。

步驟23，通過熒光成像裝置采集所述步驟22輸出的所述熒光信號(hào)，完成所述活體樣本內(nèi)部的組織平面的成像。

反復(fù)操作步驟1和步驟2，也就是說，每次在上一次的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化，直到收斂到一個(gè)最佳值，即殘余波前誤差最小，從而能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)整個(gè)深層生物組織進(jìn)行大視場(chǎng)、高時(shí)空分辨率、逐點(diǎn)掃描熒光顯微成像。

如圖1所示，本實(shí)施例提供實(shí)現(xiàn)如上述微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光成像方法的微型化自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括激光光源裝置1、微型探頭裝置2、波前檢測(cè)裝置3、去掃描構(gòu)件4和熒光成像裝置5，其中：

如圖5所示，激光光源裝置1用于輸出激發(fā)光。激光光源裝置1由一臺(tái)飛秒激光器11，飛秒激光器11的脈寬在80至250fs(飛秒)之間，重復(fù)頻率范圍為40至100mhz，最高功率在500mw以上。

微型探頭裝置2固定安裝在活體樣本的預(yù)設(shè)位置，即活體樣本的頭部開窗位置。微型探頭裝置2用于接收激光光源裝置1輸出的激發(fā)光，并利用所述激發(fā)光激發(fā)活體樣本內(nèi)部的組織平面，以產(chǎn)生熒光信號(hào)；以及用于在所述活體樣本被釋放的情形下，根據(jù)活體樣本內(nèi)部的組織平面成像視場(chǎng)的各等暈區(qū)的平均波前畸變分布，對(duì)各所述等暈區(qū)進(jìn)行波前校正。

如圖1所示，在一個(gè)實(shí)施例中，微型探頭裝置2包括激光輸入模塊21、波前校正模塊22和掃描成像模塊23，其中：

如圖5所示，激光輸入模塊21用于接收激光光源裝置1輸出的激發(fā)光。激光輸入模塊21具體包括光強(qiáng)調(diào)制模塊和光纖耦合模塊215，其中，所述光強(qiáng)調(diào)制模塊包括電動(dòng)快門211、半波片212和電光/聲光調(diào)制器213。光纖耦合模塊215通過非球面透鏡214將準(zhǔn)直激光束耦合進(jìn)光子晶體光纖中(hollow-corephotoncrystalfiber)。

如圖1所示，波前校正模塊22用于在所述活體樣本被釋放的情形下，根據(jù)活體樣本內(nèi)部的組織平面成像視場(chǎng)的各等暈區(qū)的平均波前畸變分布對(duì)各所述等暈區(qū)進(jìn)行波前校正。

如圖2所示，在一個(gè)實(shí)施例中，波前校正模塊22包括可變型反射鏡221和第二中繼機(jī)構(gòu)222，其中：可變型反射鏡221用于接收激光輸入模塊21輸出的激發(fā)光，并根據(jù)所述平均波前畸變分布，改變和控制發(fā)射出的激發(fā)光的波前。

第二中繼機(jī)構(gòu)222用于使可變型反射鏡221和第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231共軛，并將被可變型反射鏡221波前校正后的激發(fā)光投射到第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231的反射面。也就是說，設(shè)定本實(shí)施例需要檢測(cè)和校正圖中示意出來的#1面的波前，通過第二中繼機(jī)構(gòu)222，可變型反射鏡221和第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231形成一個(gè)4f系統(tǒng)，那么，可變型反射鏡221校正的#1面的共軛面為第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231的發(fā)射面。

在進(jìn)行波前校正的過程中，可變型反射鏡221的控制電流和第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231之間的配合關(guān)系可利用下式表示：

δs(n)＝-2*t(in)/λ

其中：δs(n)是共軛面#1上第n個(gè)子孔徑上的平均波前畸變(與平面波前之間的相位差)；in為施加在可變型反射鏡221的第n個(gè)獨(dú)立變形單元上的電流；t(i)為可變型反射鏡221的驅(qū)動(dòng)函數(shù)，即當(dāng)施加數(shù)值為i的電流時(shí)，某一獨(dú)立變形單元上的空間位移量；λ為入射激光波長(zhǎng)。

在一個(gè)實(shí)施例中，波前校正模塊22還包括設(shè)置在光路上的第二透鏡223、第一半波片224、偏振分光立方體225、第二半波片226和四分之一波片227，其中：激光輸入模塊21輸出的激發(fā)光先后經(jīng)由所述第二透鏡223和第一半波片224，再從所述偏振分光立方體225的第一側(cè)面進(jìn)入所述偏振分光立方體225，然后從所述偏振分光立方體225的第二側(cè)面輸出，并依次通過所述第二半波片226和四分之一波片227后投射到可變型反射鏡221的反射面?？勺冃头瓷溏R221反射出的激發(fā)光再次先后通過四分之一波片227和第二半波片226，從偏振分光立方體225的第二側(cè)面進(jìn)入偏振分光立方體225，經(jīng)由偏振分光立方體225的激發(fā)光從偏振分光立方體225的第三側(cè)面投射到第二中繼機(jī)構(gòu)222，最后通過第二中繼機(jī)構(gòu)222投射到第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231的反射面上。本實(shí)施例中，第二透鏡223用于準(zhǔn)直從光線發(fā)出的激光。第一半波片224用于改變激光偏振方向。偏振分光立方體225用于將入射光和反射光分開。第二半波片226和四分之一波片227共同用于使得入射光與發(fā)射光的偏振方向恰好垂直，這樣才可以利用225將入射光和反射光分開。

掃描成像模塊23用于接收波前校正后的激發(fā)光，該激發(fā)光以二維運(yùn)動(dòng)的方式對(duì)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面進(jìn)行掃描，以產(chǎn)生所述熒光信號(hào)。

在一個(gè)實(shí)施例中，掃描成像模塊23包括第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231、目鏡232、掃描鏡233和雙色鏡234，其中：

第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231用于以轉(zhuǎn)動(dòng)改變角度的方式將由波前校正模塊22波前校正后的激發(fā)光對(duì)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面進(jìn)行二維掃描。第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231每變換一次角度，波前校正模塊22的波前校正更新一次，以補(bǔ)償不同等暈區(qū)的不同波前畸變。第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231采用的是微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡，其參數(shù)范圍包括：鏡面尺寸：0.8～1.0mm；掃描角度：±5～±7°；第一諧振頻率：大于2000hz。

目鏡232用于將來自第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231的激發(fā)光會(huì)聚到所述活體樣本內(nèi)部，以激發(fā)所述活體樣本內(nèi)部產(chǎn)生所述熒光信號(hào)，以及用于輸出所述熒光信號(hào)。圖2中示出的#2面為成像面，所述活體樣本內(nèi)部的組織平面的成像面，與#1面互為傅里葉變換。

掃描鏡233布置在第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231和目鏡232之間的光路上，用于將第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231二維掃描所產(chǎn)生的角度變化的激發(fā)光轉(zhuǎn)化成位置變化的激發(fā)光。雙色鏡234設(shè)在掃描鏡233和目鏡232之間，用于將激發(fā)光和熒光信號(hào)分開。

如圖1所示，波前檢測(cè)裝置3的信號(hào)輸入端口可操作性地與微型探頭裝置2的信號(hào)輸出端口連接，用于在所述活體樣本被固定的情形下，接收微型探頭裝置2輸出的熒光信號(hào)，并檢測(cè)所述平均波前畸變分布。波前檢測(cè)裝置3在波前檢測(cè)時(shí)，與微型探頭裝置2配合使用。在波前檢測(cè)時(shí)，需要固定所述活體樣本。

如圖2所示，在一個(gè)實(shí)施例中，波前檢測(cè)裝置3包括波前傳感器31和第一中繼機(jī)構(gòu)，其中：波前傳感器31用于接收第一透鏡42輸出的波前。第一中繼機(jī)構(gòu)設(shè)置在第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41與波前傳感器31之間的光路上，用于使所述第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41與波前傳感器31共軛，使波前傳感器31能夠檢測(cè)到所述平均波前畸變分布。第一中繼機(jī)構(gòu)由透鏡33和透鏡34組成，使得第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41和波前傳感器31形成一個(gè)4f系統(tǒng)，那么，#1面的共軛面為波前傳感器31的檢測(cè)面。#2面通過透鏡33和第一透鏡42形成的4f關(guān)系形成在反射鏡35的反射面上。

也就是說，在不需要光纖6將熒光信號(hào)引入系統(tǒng)5的情況下，也可以利用探測(cè)器37來進(jìn)行成像。這樣便于在波前檢測(cè)和不斷優(yōu)化波前矯正的過程中評(píng)價(jià)成像質(zhì)量的改進(jìn)。

如圖1和圖2所示，在一個(gè)實(shí)施例中，去掃描構(gòu)件4設(shè)置在微型探頭裝置2與波前檢測(cè)裝置3之間的光路上，用于在波前檢測(cè)裝置3檢測(cè)所述平均波前畸變分布之前，實(shí)時(shí)補(bǔ)償微型探頭裝置2產(chǎn)生的等暈區(qū)離軸效應(yīng)。

具體地，去掃描構(gòu)件4包括第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41和第一透鏡42，其中：

第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41設(shè)置在微型探頭裝置2的信號(hào)輸出端口和波前檢測(cè)裝置3之間的光路上。第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41采用的是大口徑微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡，其參數(shù)范圍包括：鏡面尺寸：3-5mm；掃描角度：±1～±3°；第一諧振頻率：大于200hz。

第一透鏡42設(shè)置在第一微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡31與微型探頭裝置2的信號(hào)輸出端口之間的光路上，用于接收所述微型探頭裝置2輸出的熒光信號(hào)，并將所述熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變成波前以及將共軛面#1投射到第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41上。

第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41轉(zhuǎn)動(dòng)的角度與第一微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡231轉(zhuǎn)動(dòng)的角度的比值為掃描鏡233的焦距與第一透鏡42的焦距的比值，以實(shí)時(shí)補(bǔ)償?shù)谝晃C(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡231掃描產(chǎn)生的等暈區(qū)離軸效應(yīng)，再實(shí)時(shí)補(bǔ)償后的激發(fā)光傳輸給所述波前檢測(cè)裝置3。

結(jié)合圖3，為了實(shí)現(xiàn)去掃描構(gòu)件4實(shí)時(shí)補(bǔ)償微型探頭裝置2產(chǎn)生的等暈區(qū)離軸效應(yīng)，第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41和第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231同步掃描需要滿足以下要求：

1.在時(shí)間上，頻率相同，范圍在100～300hz；相位相同。

2.在空間上，掃描角度要求為：第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41轉(zhuǎn)動(dòng)的角度和第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231轉(zhuǎn)動(dòng)的角度的比值為掃描鏡233的焦距和第一透鏡42的焦距的比值，即圖3中示意出來的β1為第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41轉(zhuǎn)動(dòng)的角度，α1為第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231轉(zhuǎn)動(dòng)的角度，f1為掃描鏡233的焦距，f2為第一透鏡42的焦距。掃描方向要求為：方向相反。

通過上述方式，掃描構(gòu)件掃描導(dǎo)致的等暈區(qū)“離軸效應(yīng)”恰好被去掃描構(gòu)件的同步偏轉(zhuǎn)補(bǔ)償，進(jìn)而將微型探頭裝置輸出的熒光信號(hào)的偏折反向離軸的等暈區(qū)實(shí)時(shí)地糾正到整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的軸上，從而為波前檢測(cè)裝置3有效進(jìn)行平均波前畸變分布檢測(cè)提供了有利條件。

如圖4所示，熒光成像裝置5信號(hào)輸入端口可操作性地與微型探頭裝置2的信號(hào)輸出端口連接，用于采集微型探頭裝置2輸出的經(jīng)由波前校正后的熒光信號(hào)，完成所述活體樣本內(nèi)部的組織平面的成像。熒光成像裝置5的組成為現(xiàn)有技術(shù)在此不再展開描述。熒光成像裝置5在熒光成像時(shí)，與微型探頭裝置2配合使用。熒光成像裝置5的信號(hào)輸入端口通過柔性光線束6與所述微型探頭裝置2的信號(hào)輸出端口連接。在熒光成像時(shí)，需要釋放所述活體樣本，并利用柔性光纖束6收集所述微型探頭裝置輸出的熒光信號(hào)，柔性光纖束需要足夠的長(zhǎng)度，這樣活體樣本即便是頭頂著所述微型探頭裝置，也能夠自如活動(dòng)，而不會(huì)受到約束，進(jìn)而有利于反映活體樣本真實(shí)的活動(dòng)狀態(tài)，有利于獲取活體樣本的深層腦部組織的真實(shí)圖像數(shù)據(jù)。

利用本發(fā)明進(jìn)行波前檢測(cè)的工作過程如下：

微型探頭裝置2和波前檢測(cè)裝置3組合，如圖2所示。飛秒激光器11輸出的飛秒激發(fā)光通過空心光子晶體光纖傳至微型探頭裝置2中。首先，由第二透鏡223進(jìn)行準(zhǔn)直，再通過第一半波片224調(diào)整偏振方向，并由偏振分光立方體225反射，分別第一次通過第二半波片226和四分之一波片227，到達(dá)可變型反射鏡221的表面。由可變型反射鏡221反射的準(zhǔn)直光第二次經(jīng)過第二半波片226和四分之一波片227并穿過偏振分光立方體225。然后，利用第二中繼機(jī)構(gòu)222，激發(fā)光光束被投射到第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231表面。第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231通過兩路高壓靜電信號(hào)控制，可以在兩個(gè)方向上進(jìn)行激光掃描。通過掃描鏡233的會(huì)聚作用和雙色鏡234的反射作用，掃描光束被聚焦于目鏡232成像面，再通過目鏡232聚焦到活體樣本，從而進(jìn)行二維的點(diǎn)掃描激發(fā)。激發(fā)出的熒光信號(hào)再以落射形式被目鏡232收集，穿過雙色鏡234，從微型探頭裝置2射出，再被第一透鏡42準(zhǔn)直。準(zhǔn)直后的光束照射到第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41上，再被反射鏡反射，并通過透鏡33和透鏡4組成的第一中繼機(jī)構(gòu)，投射到波前傳感器31或者光電探測(cè)器37的接收器上。

在上述過程中，所有的后出瞳面具有成像共軛關(guān)系(#1)；所有的像面具有成像共軛關(guān)系(#2)。距離1與第一透鏡42的工作距離相等；距離2與距離3的和與透鏡3的工作距離相同，并等于距離4；距離5和距離6相同，等于透鏡44的工作距離。在波前測(cè)量時(shí)，要求第一雙軸轉(zhuǎn)鏡231與第二微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡41進(jìn)行同步掃描，即掃描頻率，相位，波形相同。幅度的比值要求達(dá)到“去掃描”效果，即由于微型微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡掃描導(dǎo)致的等暈區(qū)離軸效應(yīng)恰好被大口徑微機(jī)電雙軸轉(zhuǎn)鏡的同步偏轉(zhuǎn)補(bǔ)償，達(dá)到等暈區(qū)不變的效果。進(jìn)而對(duì)較大的視場(chǎng)都可以做到準(zhǔn)確的波前傳感。

利用本發(fā)明進(jìn)行熒光成像的工作過程如下：

微型探頭裝置2和熒光成像裝置5組合，如圖4所示。目鏡232接收并發(fā)出的熒光信號(hào)被柔性光纖束6收集，進(jìn)而由熒光成像裝置5收集。本過程中，根據(jù)計(jì)算出的各等暈區(qū)在后出瞳面#2面上的平均波前畸變分布后，驅(qū)動(dòng)微型探頭裝置2中的可變型反射鏡221產(chǎn)生鏡面變形，完成波前校正。反復(fù)以上兩步的操作，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)深層生物組織進(jìn)行大視場(chǎng)、高時(shí)空分辨率、逐點(diǎn)掃描熒光顯微成像。

最后需要指出的是：以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。