專利名稱：一種提高pva降解速度的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高PVA降解速度的發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體來說是 一種通過添加1，4_ 丁二醇提高PVA降解速度的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
PVA是一種可生物降解的化工高分子聚合物。它具有良好的應(yīng)用性能，例如良好 的熱穩(wěn)定性、很強的粘性和抗溶劑性等。但由于在自然環(huán)境下PVA的降解速度很低，大量廢 棄的PVA導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染。關(guān)于提高PVA降解速度的研究主要分為兩大類(1)對 PVA進(jìn)行化學(xué)修飾。例如TakasU曾報道用葡萄糖對PVA上的部分羥基進(jìn)行糖基化修飾， 可以加速PVA主鏈的生物降解；但也有報道稱用鄰苯二甲酸苷或乙醛修飾PVA的部分羥基 后，PVA降解速度反而下降。(2)篩選能高效降解PVA的微生物。但結(jié)果顯示各研究小組篩 選得到的微生物對PVA的降解速度都處于較低的水平。所以仍然有必要尋找新的方法來提 高PVA的降解速度。一種可行的方法就是用發(fā)酵的方法提高細(xì)胞對PVA的降解活力和細(xì)胞 的生長活力，從而從整體上提高PVA的降解速度。在混合微生物相對高效降解PVA的基礎(chǔ) 上，本技術(shù)通過一種與PVA結(jié)構(gòu)類似的小分子碳源(1，4_ 丁二醇)顯著提高了 PVA的降解 速度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種提高PVA降解速度的發(fā)酵方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下在混合微生物降解PVA的過程中， 添加1，4-丁二醇。所述1，4_ 丁二醇的添加方式為在發(fā)酵36h向發(fā)酵液中一次性添加7. 65g/L 1， 4- 丁二醇；所述1，4_ 丁二醇的添加方式為在發(fā)酵21h向發(fā)酵液中一次性添加7. 65g/L 1， 4- 丁二醇；所述1，4_ 丁二醇的添加方式為在發(fā)酵21h向發(fā)酵液中一次性添加7. 65g/L 1， 4_ 丁二醇，然后在發(fā)酵30h向發(fā)酵液中連續(xù)流加1，4_ 丁二醇，流加速度為0. 3g/L/h。所述混合微生物為從無錫太平洋紡織廠PVA退漿車間下水道口篩選出一個可以 徹底降解培養(yǎng)基中l(wèi)g/L PVA的混合微生物體系(Chen J, Zhang Y，Du G_C，Hua Z_Z，Zhu Y， Biodegradation of polyvinyl alcohol by a mixed microbial culture,Enzyme Microb. Technol.，2007,40(7)，1686-1691)。混合微生物降解PVA的培養(yǎng)基組成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)酵母粉2. 0，K2HP04 1. 0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1， FeS04 7H200. 05，CaCl2 0. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 滅菌 15min?；旌衔⑸锝到釶VA的過程為液體種子培養(yǎng)方法500mL三角瓶裝50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種后在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min，30°C振蕩培養(yǎng) 36h ；分批補料發(fā)酵法1 :3L發(fā)酵罐裝1. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5g/ LPVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0% )，接種150mL液體種子后，pH通過添加 2. Omol/L HC1和2. Omol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速(200rpm-400rpm) 和通氣量(2L/min-3L/min)控制在60%飽和度，溫度控制在30°C，在發(fā)酵36h向發(fā)酵液中 一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇；分批補料發(fā)酵法2 :3L發(fā)酵罐裝1. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5g/ LPVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0% )，接種150mL液體種子后，pH通過添加 2. 0mol/L HC1和2. 0mol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速(200rpm-400rpm) 和通氣量(2L/min-3L/min)控制在60%飽和度，溫度控制在30°C，在發(fā)酵21h向發(fā)酵液中 一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇；連續(xù)補料發(fā)酵法3L發(fā)酵罐裝1. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5g/L PVA1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0% )，接種150mL液體種子后，pH通過添加 2. 0mol/L HC1和2. Omol/LNaOH控制在7. 20,溶氧通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速(200rpm-400rpm) 和通氣量(2L/min-3L/min)控制在60%飽和度，溫度控制在30°C，在發(fā)酵21h向發(fā)酵液中 一次性添加7. 65g/L 1，4_ 丁二醇，然后在發(fā)酵30h向發(fā)酵液中連續(xù)流加1，4_ 丁二醇，流加 速度為0. 3g/L/h。PVA含量測定采用Finley法，具體方法為將發(fā)酵液離心(10000r/min，10min)，棄去沉淀，收集上清液。將上清液經(jīng)微孔濾膜 (孔徑0. 45 u m,直徑50mm)過濾，然后用0. lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8. 0)透析24h，即為 粗酶液。在5X15試管中加入0. 5mL粗酶液和0. 5mL底物(lg/L PVA1799溶于pH 8. 0的 磷酸鉀緩沖液中)，將此混合體系于35°C反應(yīng)6h，分別測定反應(yīng)前后反應(yīng)混合液所對應(yīng)PVA 含量的吸光度。每分鐘吸光度下降0. 001定義為一個酶活單位。1，4-丁二醇測定方法為首先向發(fā)酵液中添加65g/L的乙酸鈣，然后將樣品進(jìn)行離心(10，000Xg、10min) 去除沉淀，收集上清液。將上清液經(jīng)微孔濾膜(孔徑0.45 ym，直徑50mm)過濾。然后用 Waters 600HPLC System (Waters Corp. , USA) with an 2487UV detector 檢測 1，4-丁二醇。 固定相是WatersSugar-Pakl，流動相是0. 4mL/min的去離子水。柱溫為85°C。細(xì)胞干重測定方法為將發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，在600nm下檢測吸光值(0D)；細(xì)胞干重(DCW)的計算 公式為:(DCff = 0. 153X0D+0. 014)?；旌衔⑸镬o止細(xì)胞降解PVA:混合微生物在不同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在發(fā)酵60h通過離心發(fā)酵液(10，000 Xg, lOmin)收集細(xì)胞，然后用磷酸緩沖液(0. lmol/L, pH 7.0)清洗3次細(xì)胞，將含有1. 0g/ L(DCff)細(xì)胞和1. 0g/L PVA的5mL反應(yīng)液，在150rpm和30°C的條件下培養(yǎng)10h，檢測培養(yǎng)前 后PVA含量。本發(fā)明采用的1，4- 丁二醇是PVA的結(jié)構(gòu)類似物，它在細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑和PVA類 似，因此它不會抑制PVA的降解。同時它作為一種小分子容易進(jìn)入細(xì)胞并被代謝，能提高菌 體的生長和代謝活力。所以1，4_ 丁二醇能提高細(xì)胞對PVA的降解活力和細(xì)胞的生長活力，從而從整體上提高PVA的降解速度。本發(fā)明提高混合微生物對PVA的降解速度，平均PVA降解速度從0. 049g/L/h提高 到了 0.547g/L/h，這為消除PVA所導(dǎo)致的環(huán)境污染提供了一種方法。本發(fā)明還具有操作簡 單、原料價格便宜、效果明顯等優(yōu)點。


圖1PVA降解速度曲線(■ PVA(對比)/ PVA+1，4_ 丁二醇)和單位細(xì)胞PVA降 解速度曲線(□ PVA (對比)/〇PVA+PVA+1，4- 丁二醇)。圖2細(xì)胞生長曲線(DCW - □-實施例3/-— □-—實施例2)和PVA降解曲線 (PVA -A-實施例3/-— A -—實施例2，單位細(xì)胞PVA降解速度■實施例3/ 實施例 2/ ▲對比)。
具體實施例方式對比例1.培養(yǎng)基組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)酵母粉2. 0，K2HP04 1. 0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1， FeS04 7H200. 05，CaCl2 0. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 滅菌 15min。微生物培養(yǎng)方法3L發(fā)酵罐裝1. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5g/L PVA1799 (平均分子量 113kDa，醇解度99. 0% )，接種150mL液體種子后，pH通過添加2. Omol/L HC1和2. Omol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速(200rpm-400rpm)和通氣量(2L/min_3L/min) 控制在60%飽和度，溫度控制在30°C。結(jié)果見表1，在不添加1，4- 丁二醇的情況下，混合體系發(fā)酵結(jié)束后，平均PVA降 解速度為0.049士0.0013g/L/h。在此發(fā)酵條件下，靜止細(xì)胞對PVA的平均降解速度為 0.025士0. 0005g/L/h。表1不同發(fā)酵條件下1，4_ 丁二醇對混合微生物體系降解PVA的影響
實施例1 分批補料發(fā)酵法1培養(yǎng)基組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L) :PVA 1799(平均分子量113kDa，醇解度99.0% )5.0，酵母 粉 2. 0，K2HP04 1.0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1，F(xiàn)eS04 7H20 0. 05，CaCl20. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 滅菌 15min。1，4-丁二醇補料培養(yǎng)基(g/L) :1，4-丁二醇 7. 65，酵母粉 3.0
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微生物培養(yǎng)方法3L發(fā)酵罐裝1. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5g/L PVA1799 (平均分子量 113kDa，醇解度99. 0% )，接種150mL液體種子后，pH通過添加2. Omol/L HC1和2. Omol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速(200rpm-400rpm)和通氣量(2L/min_3L/min) 控制在60%飽和度，溫度控制在30°C，在發(fā)酵36h向發(fā)酵液中一次性添加7.65g/L 1，4_ 丁結(jié)果見表1，在發(fā)酵36h向發(fā)酵液中一次性添加7. 65g/L 1，4_ 丁二醇的情況下，混 合體系發(fā)酵結(jié)束后，平均PVA降解速度為0. 073士0. 0015g/L/h，是對比的1.5倍。在此發(fā)酵 條件下，靜止細(xì)胞對PVA的平均降解速度為0. 029士0. 0003g/L/h，和對比基本一致。實施例2 分批補料發(fā)酵法2培養(yǎng)基組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L) :PVA 1799 (平均分子量113kDa，醇解度99. 0% )5. 0，酵母粉 2. 0，K2HP04 1. 0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1，F(xiàn)eS04 7H20 0. 05，CaCl2 0. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 滅菌 15min。1，4-丁二醇補料培養(yǎng)基(g/L) :1，4-丁二醇 7. 65，酵母粉 3.0微生物培養(yǎng)方法3L發(fā)酵罐裝1. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5g/L PVA1799 (平均分子量 113kDa，醇解度99. 0% )，接種150mL液體種子后，pH通過添加2. 0mol/L HC1和2. 0mol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速(200rpm-400rpm)和通氣量(2L/min_3L/min) 控制在60%飽和度，溫度控制在30°C，在發(fā)酵21h向發(fā)酵液中一次性添加7.65g/L 1，4_ 丁結(jié)果見表1，在發(fā)酵21h向發(fā)酵液中一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇的情況下， 混合體系發(fā)酵結(jié)束后，平均PVA降解速度為0. 150士0. 0021g/L/h，是對比的3. 1倍，是實施 例1的2. 1倍。如圖1所示，在此發(fā)酵條件下，細(xì)胞對PVA的總降解速度顯著高于對比；但 單位細(xì)胞對PVA的降解速度和對比無顯著差異。實施例3 連續(xù)補料發(fā)酵法培養(yǎng)基組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L) :PVA 1799 (平均分子量113kDa，醇解度99. 0% )5. 0，酵母粉 2. 0，K2HP04 1. 0，KH2P04 0. 125，MgS04 7H20 0. 1，F(xiàn)eS04 7H20 0. 05，CaCl2 0. 025，NaCl 0. 01，pH 7. 5，121°C 滅菌 15min。1，4-丁二醇補料培養(yǎng)基(g/L) :1，4-丁二醇 7. 65，酵母粉 3.0。1，4-丁二醇流加培養(yǎng)基(g/L) :1，4-丁二醇 7. 65，酵母粉 3.0。微生物培養(yǎng)方法3L發(fā)酵罐裝1. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5g/L PVA1799 (平均分子量 113kDa，醇解度99. 0% )，接種150mL液體種子后，pH通過添加2. 0mol/L HC1和2. 0mol/L NaOH控制在7. 20，溶氧通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速(200rpm-400rpm)和通氣量(2L/min_3L/min) 控制在60%飽和度，溫度控制在30°C，在發(fā)酵21h向發(fā)酵液中一次性添加7.65g/L 1，4_ 丁 二醇，然后在發(fā)酵30h向發(fā)酵液中連續(xù)流加1，4_ 丁二醇，流加速度為0. 3g/L/h。如圖2所示，在連續(xù)補料發(fā)酵法的情況下，在Oh到48h實施例3和實施例2在PVA降解速度上無明顯差距。但在48h到60h，實施例3單位細(xì)胞PVA降解速度得到了顯著提 高，這說明實施例3顯著提高了細(xì)胞對PVA的降解活力，同時實施例3也顯著提高了總的細(xì) 胞量，所以混合微生物對PVA的總降解速度得到了顯著的提高。結(jié)果見表1，實施例3的平 均PVA降解速度為0. 547士0. 0027g/L/h，是對比的11. 2倍。
權(quán)利要求
一種提高PVA降解速度的發(fā)酵方法，其特征在于，在混合微生物降解PVA的過程中添加1，4-丁二醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4_丁二醇的方法為在混合 微生物發(fā)酵36h向發(fā)酵液中一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4_丁二醇的方法為在混合 微生物發(fā)酵21h向發(fā)酵液中一次性添加7. 65g/L 1,4- 丁二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4_丁二醇的方法為在混合 微生物發(fā)酵21h向發(fā)酵液中一次性添加7.65g/L 1，4_ 丁二醇，然后在發(fā)酵30h向發(fā)酵液中 連續(xù)流加1，4_ 丁二醇，流加速度為0. 3g/L/h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高PVA降解速度的發(fā)酵方法。通過在發(fā)酵過程中添加1，4-丁二醇，提高了PVA降解速度。通過分批補料發(fā)酵方法和連續(xù)補料發(fā)酵方法，平均PVA降解速度分別達(dá)到了0.073g/L/h、0.150g/L/h和0.547g/L/h，與不添加1，4-丁二醇相比，平均降解速度分別提高了1.5倍、3.1倍和11.2倍，為消除PVA所導(dǎo)致的環(huán)境污染提供了一種可行的方法。本發(fā)明還具有操作簡單、原料價格便宜等優(yōu)點。
文檔編號A62D101/28GK101850167SQ20101018131
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者唐波, 堵國成, 張東旭, 陳堅 申請人:江南大學(xué)