一種用于制備微凝膠的微流控裝置的制造方法
【專利摘要】本實用新型提供了一種用于制備固載有活細胞或生物活性分子的微凝膠的微流控裝置，包括第一微通道、第二微通道、第三微通道、輸出通道、紫外光源和收集容器，所述第一微通道、第二微通道和第三微通道分別具有送樣端和插入端，第二微通道的插入端從第一微通道的送樣端非密封地插入；第三微通道的插入端從第二微通道的送樣端非密封地插入，形成套管；輸出通道的一端從第一微通道的插入端非密封地插入，與套管端口非端到端連接，輸出通道的另一端與收集容器相連，在第一微通道的插入端與收集容器之間的輸出通道上設(shè)置有紫外光源。采用該裝置可實現(xiàn)一步法固載細胞微凝膠的制備，對所得微凝膠尺寸可控，且尺寸分布窄，同時保持細胞的存活率。
【專利說明】
-種用于制備微凝膠的微流控裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本實用新型屬于生物工程領(lǐng)域，設(shè)及用于制備固載有活細胞或生物活性分子的微 凝膠的微流控裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 針對損傷或病變的人體組織或器官的修復(fù)，臨床上的傳統(tǒng)仍依賴于器官捐獻。然 而，移植人體組織短缺，有引發(fā)傳染疾病等風險使得器官移植面臨諸多問題。僅W美國為 例，目前等待器官移植的患者每年超過74000例，而每年只有21000人能夠得到移植手術(shù)。近 年來，W組織工程和細胞治療為手段的再生醫(yī)學技術(shù)的誕生和發(fā)展，給器官修復(fù)重建帶來 了新的希望，并有望緩解器官捐獻者短缺的實際問題。其中組織工程是應(yīng)用工程學和生命 科學的原理和方法，利用天然的和合成的成分構(gòu)建提議恢復(fù)、維持或改善組織功能的醫(yī)療 制品。目前組織工程技術(shù)已經(jīng)相對成功的實現(xiàn)了包括皮膚、軟骨等組織的修復(fù)并進入臨床 應(yīng)用。然而，實現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的、Ξ維(3D)空間工程化組織尚未生成。其中一個只要技術(shù)難題 就是在大尺寸支架材料中的活體細胞，由于細胞間信號交換和營養(yǎng)物質(zhì)交換受到限制，因 此難W正常繁殖并組織化，因而導(dǎo)致組織缺損修復(fù)失敗。
[0003] 生物相容性的、可降解親水性高分子材料構(gòu)成的水凝膠可W模擬活體細胞的細胞 外微環(huán)境，因此被大量用于細胞固載和組織工程方面的應(yīng)用。然而被包埋在大尺寸水凝膠 材料中的活體細胞的細胞間信號交換和營養(yǎng)物質(zhì)交換都會受到限制。運是因為在微凝膠的 交聯(lián)高分子網(wǎng)絡(luò)中，信號因子和營養(yǎng)物質(zhì)的滲透速率和距離都受到限制。相對而言，微米尺 度的微凝膠更使用于細胞的固載包埋和Ξ維培養(yǎng)，因為微凝膠有利于物質(zhì)交換并可對細胞 外微環(huán)境形成更精確控制。因此，實現(xiàn)載細胞微凝膠的高通量制備將有利于推進組織工程 和細胞治療技術(shù)的發(fā)展和臨床應(yīng)用。
[0004] 固載有活體細胞的微凝膠可作為基本單元用于構(gòu)建細胞化的類組織結(jié)構(gòu)，也可W 作為藥物控釋載體用于細胞治療技術(shù)。然而，如何精確控制微凝膠的尺寸和尺寸分布仍然 是現(xiàn)有制備工藝技術(shù)難點，而運一參數(shù)不但會影響物質(zhì)交換，更會直接影響被載細胞的行 為。運需要我們開發(fā)新技術(shù)來實現(xiàn)對微凝膠性能參數(shù)的精確調(diào)控，同時保持被固載細胞存 活率。
[0005] 現(xiàn)有的可用于載細胞微凝膠的微加工技術(shù)包括光刻蝕技術(shù)[1]、微模板技術(shù)[2,3] 等。運些技術(shù)都有各自的優(yōu)勢，例如可實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)、對微凝膠尺寸形貌精確控制等。然 而，運些傳統(tǒng)技術(shù)都是基于批量化的生產(chǎn)工藝，無法實現(xiàn)高通量的連續(xù)制備，且批次間產(chǎn)品 性能存在差異。
[0006] 微流控液滴技術(shù)的發(fā)展使精確控制不互溶多相流體成為可能，運一技術(shù)可實現(xiàn)連 續(xù)進樣，快速生產(chǎn)單分散性、可精確控制尺寸的微凝膠或微膠囊材料[4]。油包水(W/0)單乳 液液滴技術(shù)可通過具有T型流道[5]或流體聚焦結(jié)構(gòu)[6]的微流控裝置制備，并且可作為模 板、通過不同聚合方式制備單分散的微凝膠。然而，該方法不能實現(xiàn)連續(xù)的載細胞凝膠生 成，而需要不間斷的收集產(chǎn)物并破除乳液將細胞轉(zhuǎn)移到生物相容性的水相溶液中，加工過 程費時費力。并且，細胞長時間的暴露在油和表面活性劑中會影響細胞的活性[7]。因此，如 何實現(xiàn)細胞在被固載入微凝膠并快速從油相中分離將大大有利于細胞活性的保存，并可實 現(xiàn)連續(xù)制備，提高生產(chǎn)效率。
[0007] 另外，水包水(W/W)乳液技術(shù)也可W實現(xiàn)微凝膠的制備[8,9]。該方法使用含水的 兩相流體，利用兩相間不易共混可形成液滴，并W液滴作為模板，實現(xiàn)在水溶液中生產(chǎn)微凝 膠微粒。該方法避免了額外的破除乳液的步驟，可實現(xiàn)一步法細胞包埋。然而，運一體系限 于特定組合兩種不混溶含水溶質(zhì)，如葡聚糖和聚乙二醇，運限制了運一方法的廣泛應(yīng)用。
[0008] 綜上所述，盡管載細胞微凝膠技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，然而如 何實現(xiàn)的細胞固載包埋與微凝膠，并同時維持細胞的存活率，仍然是運一領(lǐng)域重要的技術(shù) 難題，必須開發(fā)出更簡單、效率更高、可實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的新技術(shù)。
[0009] 已有技術(shù)存在的缺陷或問題：
[0010] 1)光刻蝕技術(shù)、微模板技術(shù)、基于離屯、力的液滴:運些傳統(tǒng)技術(shù)都是基于批量化的 生產(chǎn)工藝，無法實現(xiàn)高通量的連續(xù)制備，且批次間產(chǎn)品性能存在差異。
[0011] 2)水包油(W/0)單乳液液滴技術(shù):該方法不能實現(xiàn)連續(xù)的載細胞凝膠生成，而需要 不間斷的收集產(chǎn)物并破除乳液將細胞轉(zhuǎn)移到生物相容性的水相溶液中，加工過程費時費 力。并且，細胞長時間的暴露在油和表面活性劑中會影響細胞的活性。
[0012] 3)水包水(W/W)乳液技術(shù):運一體系限于特定組合兩種不混溶含水溶質(zhì)，如葡聚糖 和聚乙二醇，運限制了運一方法的廣泛應(yīng)用。 【實用新型內(nèi)容】
[0013] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本實用新型提供一種用于制備固載有活細胞或 生物活性分子的微凝膠的微流控裝置。
[0014] 本實用新型是采用如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
[0015] -種用于制備固載有活細胞或生物活性分子的微凝膠的微流控裝置，包括第一微 通道、第二微通道、第Ξ微通道、輸出通道、紫外光源和收集容器，所述第一微通道、第二微 通道和第Ξ微通道分別具有送樣端和插入端，所述第二微通道的插入端從第一微通道的送 樣端非密封地插入于第一微通道中；第Ξ微通道的插入端從第二微通道的送樣端非密封地 插入于第二微通道中，形成套管;輸出通道的一端從第一微通道的插入端非密封地插入于 第一微通道中，與第一微通道內(nèi)的套管端口非端到端連接，輸出通道的另一端與收集容器 相連，在第一微通道的插入端與收集容器之間的輸出通道上設(shè)置有紫外光源。
[0016] 進一步地，所述的微流控裝置中，所述的第二微通道的插入端的端口為錐形端口， 所述的第Ξ微通道的插入端的端口為錐形端口，所述的輸出通道的插入于第一微通道的一 端的端口為錐形端口。第二微通道W及第Ξ微通道的插入端設(shè)計成錐形端口，增加流體的 阻力和剪切力，從而使液滴更容易形成。
[0017] 進一步地，所述的第二微通道的插入端端口的直徑為5-1000μπι，所述的第Ξ微通 道的插入端端口的直徑為5-1000μπι，所述的輸出通道的插入于第一微通道的一端的端口的 直徑為10-2000皿。
[0018] 進一步地，所述的微流控裝置中，在所述套管中，第Ξ微通道插入端的端口不超出 且第二微通道的插入端端口，兩端口之間距離大于1mm。運樣的配置，保證在內(nèi)相水凝膠預(yù) 聚體水溶液注入中間油相溶液時首先形成油包水的單乳液。
[0019] 進一步地，所述的微流控裝置中，所述的第一微通道、第二微通道和第Ξ微通道的 送樣端分別與微蠕動累或微注射器相連，W實現(xiàn)自動進樣。
[0020] 進一步地，所述的微流控裝置中，在所述第一微通道內(nèi)，所述套管的端口與輸出通 道的端口的距離為50~500μπι。運樣的配置，保證在套管中形成的單乳液在注入外相水溶液 時，輸出端口的流體阻力保持穩(wěn)定且各相同性，從而使外相流體對單乳液流體產(chǎn)生的剪切 力保持穩(wěn)定，有利于雙乳液液滴形成過程的穩(wěn)定性，且保證形成液滴具有良好的單分散性。 [0021 ]進一步地，所述的微流控裝置中，所述第一微通道插入端連接有排氣口。
[0022] 進一步地，所述的微流控裝置中，第一微通道內(nèi)壁表面進行親水處理，所述第二微 通道內(nèi)壁表面進行疏水處理，所述第Ξ微通道內(nèi)壁表面進行親水處理，所述輸出微通道內(nèi) 壁表面進行親水處理。
[0023] 本實用新型的微流控裝置中，微通道通過套管結(jié)構(gòu)的設(shè)計保證內(nèi)相水溶液與中間 油相共混時形成穩(wěn)定的單乳液，再進一步與外相水溶液共混時形成穩(wěn)定的雙乳液；同時各 相流體注入微通道的流速保持穩(wěn)定，因此液滴在形成時所受到的毛細管作用力和流體拉力 始終保持穩(wěn)定，故液滴形成過程始終保持穩(wěn)定、液滴尺寸具有良好的單分散性。
[0024] 本實用新型的上述微流控裝置，在實際應(yīng)用中，所述的紫外光源可由設(shè)置在輸出 通道輸出端外壁上的加熱或制冷裝置，或輸出通道內(nèi)注入離子的離子注入裝置來代替。
[0025] 本實用新型還提供利用上述微流控裝置制備固載有活細胞或生物活性分子的微 凝膠的一步法連續(xù)制備方法，包括如下步驟：
[0026] (1)W含有活細胞或生物活性分子、光固化劑和水凝膠預(yù)聚體的溶液作為內(nèi)相；W 含有油和表面活性劑的混合溶液作為中間相；W聚乙締醇水溶液作為外相；
[0027] (2)將所述內(nèi)相、中間相和外相通過微量累或微注射器分別注入至微流控裝置的 相應(yīng)微通道中，形成單分散的水包油包水雙乳液；
[0028] (3)步驟(2)的所述單分散的水包油包水雙乳液流經(jīng)微流控裝置的輸出通道，收集 在裝有水性溶液的收集容器中，得固載有活細胞或生物活性分子的微凝膠；
[0029] 其中，在所述輸出通道的出口端設(shè)置有激發(fā)水凝膠預(yù)聚體交聯(lián)的裝置;所述注入 中間相的微通道內(nèi)壁表面進行疏水處理;所述輸出通道的內(nèi)壁表面進行親水處理;所述注 入內(nèi)相的微通道內(nèi)壁表面進行親水處理。
[0030] 進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述水凝膠預(yù)聚體在內(nèi)相中的濃度為0.2-50W/ V%，優(yōu)選為W/V5-10%，更優(yōu)選為8%w/v;光固化劑在內(nèi)相中的濃度為0.25-2W/V%，優(yōu)選為 0.5-1 w/v %，更優(yōu)選為0.5w/v %。
[0031] 進一步地，所述表面活性劑在中間相中的濃度為0.1-5v/v%，優(yōu)選為0.5-lv/v%， 更優(yōu)選為〇.5v/v%。
[0032] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，所述聚乙締醇在聚乙締醇水溶液中的濃度為 l-20w/v%，優(yōu)選為5-lOw/v%，更優(yōu)選為5w/v%。
[0033] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，所述的激發(fā)水凝膠預(yù)聚體交聯(lián)的裝置是紫外 光源、設(shè)置在輸出通道輸出端外壁上的加熱或制冷裝置或輸出通道內(nèi)注入離子的離子注入 裝置中的一種。在上述技術(shù)方案中，所述步驟(2)的所述單分散的水包油包水雙乳液，最內(nèi) 層為內(nèi)相，所述單分散的水包油包水雙乳液經(jīng)過設(shè)置在輸出通道輸出端上的所述裝置時， 內(nèi)相中的水凝膠預(yù)聚體可w快速交聯(lián)，形成微凝膠。所述紫外光源可誘發(fā)光固化聚合物單 體的交聯(lián)，所述設(shè)置在輸出通道輸出端外壁上的加熱或制冷裝置可誘發(fā)溫敏性聚合物單體 的交聯(lián)，所述輸出通道內(nèi)注入離子的離子注入裝置誘發(fā)離子交聯(lián)聚合物單體的交聯(lián)。
[0034] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，在步驟(2)中，將所述內(nèi)相、中間相和外相通過 微量累或微注射器分別^100-2000化Ηγ-ι、100-2000^ hr-i和1000-20000化hr-i的流速 輸送至微流控裝置的相應(yīng)微通道中，在出口處形成單分散的水包油包水雙乳液。優(yōu)選地，所 述內(nèi)相的流速與中間相的流速比為0.5:1~4:1，內(nèi)相和中間相流速總和與外相的流速比為 1:5~1:50。
[0035] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，所述的水凝膠預(yù)聚體為可光固化聚合物單體、 可離子交聯(lián)的聚合物單體、溫敏性的聚合物單體或其他可實現(xiàn)快速交聯(lián)固化的水凝膠預(yù)聚 體中的一種。優(yōu)選地，所述的可光固化聚合物單體為聚乙二醇雙丙締酸醋、甲基丙締酸醋或 二丙締酸醋接枝的水溶性高分子中的一種;所述的可離子交聯(lián)的聚合物單體為多糖類親水 性高分子海藻酸鋼或殼聚糖中的一種;溫敏性的聚合物單體為明膠、聚(N-異丙基丙締酷 胺)或瓊脂糖中的一種。
[0036] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，所述的細胞選自原代培養(yǎng)細胞、傳代培養(yǎng)細 胞、細胞株培養(yǎng)細胞和雜合體;所述生物活性分子選自具有生物活性的藥物、蛋白質(zhì)和信號 因子中的一種。其中，所述信號因子不僅限于蛋白，分子量大于1000化的中分子或大分子藥 物都適用。分子比凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙率大會被限制在微凝膠內(nèi)部即適用。
[0037] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，所述的光固化劑為1-[4-(2-徑基乙氧基)-苯 基]-2-?基-2-甲基-1-丙烷-1-酬（bga州re2959)、1-徑基己基苯基酬（bga州rel84)或安 息香雙甲酸（I：rgacure651)中的一種。
[0038] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，所述的油為礦物油、植物油、橄攬油或氣化油 中的一種。
[0039] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，所述的表面活性劑為Span20(山梨醇酢月桂酸 醋）、Span40(山梨醇單棟桐酸醋）、Span80(失水山梨醇油酸醋）、Span83(倍半油酸山梨坦）、 Span85(S油酸山梨坦）、Spanl20(失水山梨醇異硬脂醋）、Tween85(聚氧乙締山梨醇Ξ油酸 醋）、G1086(聚氧乙締山梨醇六油酸醋）、HB239(A塊共聚物表面活性劑）、Monotane70(脫水 山梨醇單異硬脂酸醋）、化ij96(聚氧乙締（10)油基酸）、化ij92(聚氧乙締（2)油基酸)等用 于穩(wěn)定水/碳化油界面的表面活性劑的一種，或是用于穩(wěn)定水/氣化油界面的Krytox-PEG- Krytox表面活性劑。
[0040] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，所述的內(nèi)相中活細胞濃度為1-107個/mL。
[0041] 進一步地，在上述所有技術(shù)方案中，在步驟(3)中所述的水性溶液為去離子水、鹽 溶液或細胞培養(yǎng)基中的一種。
[0042] 本實用新型的上述方法制備得到的微凝膠的直徑為10-1000皿。所述微凝膠的粒 徑分布的離散系數(shù)在3 %~10 %。
[0043] 本實用新型的上述方法制備得到的微凝膠可進一步組裝得到具有宏觀結(jié)構(gòu)的載 細胞支架，或作為可注射材料用于細胞的移植。
[0044] 本實用新型通過上述技術(shù)方案，實現(xiàn)了一步法連續(xù)制備固載有活細胞或生物活性 分子的微凝膠，區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)?，F(xiàn)有的固載活體細胞或生物分子藥物的技術(shù)都是基于油 包水單乳液技術(shù)，需要在油相中收集之后清除油相并轉(zhuǎn)換到水相中，需要兩步法操作，不能 實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)加工。同時，活體細胞在油相中受到油相、表面活性劑、光固化劑等成分的細 胞毒性的影響而成活率逐漸降低，因此不適用于產(chǎn)業(yè)化批量生產(chǎn)。本實用新型通過微流忍 片不共混的內(nèi)相、中間相和外相依次混合:通過將水相為內(nèi)相注入中間油相形成第一重乳 液(單乳液），再將該單乳液注入外相水溶液中形成水包油包水雙乳液。通過調(diào)整內(nèi)相和中 間相流速比例控制第一重乳液的穩(wěn)定形成，通過控制內(nèi)相和中間相流速總和與外相流速比 例，保證單分散的水包油包水雙乳液穩(wěn)定形成。雙乳液液滴在毛細管微通道產(chǎn)生的毛細管 力和同軸流體產(chǎn)生的拉力作用下最終形成超薄的油相殼層。油層越厚，穩(wěn)定性更強，難W實 現(xiàn)油水分離。本實用新型形成的雙乳液液滴具有超薄油層，在內(nèi)相固化形成微凝膠并在大 量水性溶液中收集導(dǎo)致超薄油層在界面潤滑系數(shù)改變和表面活性劑被水相稀釋作用下，而 難W維持穩(wěn)定的界面并發(fā)生去濕化(Dewetting)，導(dǎo)致油相在凝膠表面團聚并由于密度差 異在浮力作用下自動分離脫落，可直接將微凝膠收集在水性溶液中，使細胞在乳液中停留 時間只有幾分鐘，并且通過收集相水溶液可直接稀釋掉有細胞毒性的成分。實現(xiàn)一步法、連 續(xù)的生產(chǎn)載細胞微凝膠，適于產(chǎn)業(yè)化大批量生產(chǎn)。
[0045] 采用本實用新型的微流控裝置制備本實用新型所述的微凝膠時，所述的外相通過 第一微通道注入，所述的中間相通過第二微通道注入，所述的內(nèi)相通過第Ξ微通道注入。所 述的微流控裝置具有Ξ個微通道，其中第Ξ微通道插入于第二微通道形成套管，套管再插 入于第一微通道，運樣，當內(nèi)相、中間相和外相的液體輸送至各自的微通道時，形成內(nèi)外層 同屯、軸流體，運樣的設(shè)置可W保證內(nèi)相水溶液從第Ξ通道注入中間相第二通道時所受到的 流體阻力保持穩(wěn)定且各向同性，從而使外相流體對單乳液流體產(chǎn)生的剪切力保持穩(wěn)定，有 利于雙乳液液滴形成過程的穩(wěn)定性，且保證形成液滴具有良好的單分散性。
[0046] 如上所述，本實用新型提供一個簡單而有效的方法制備載有細胞或生物活性分子 的微凝膠的技術(shù)方案，該技術(shù)方案利用微流控裝置制備具有超薄殼層的核殼結(jié)構(gòu)雙乳液， 并W雙乳液為模板制備單分散性的載細胞微凝膠。具體為，采用毛細管微流控裝置，實現(xiàn)由 中間油相包圍內(nèi)相預(yù)聚物水溶液的同軸流體，由于兩相的不共混而形成第一重油包水乳 液，隨后將該單乳液注入到連續(xù)外相水溶液中，由于乳液與外相不共混而形成水包油包水 雙乳液。由于在本實用新型設(shè)計的毛細管微流裝置中，具有套管結(jié)構(gòu)的微通道設(shè)計結(jié)合各 相流體注入微通道時流速穩(wěn)定，導(dǎo)致液滴形成時所受的毛細管作用和流體拉力保持穩(wěn)定， 保證雙乳液液滴形成過程的穩(wěn)定性，且形成液滴具有良好的單分散性。在紫外線照射中，最 內(nèi)層預(yù)聚物溶液發(fā)生交聯(lián)固化，實現(xiàn)對懸浮細胞的Ξ維包裹。進一步將產(chǎn)物溶液直接收集 在由細胞緩沖液或培養(yǎng)基組成的水相中，油相殼層在界面潤滑系數(shù)改變和表面活性劑被收 集水溶液稀釋的共同作用下，而難W維持穩(wěn)定的界面并發(fā)生去濕化(Dewetting)，導(dǎo)致油相 在凝膠表面團聚并由于密度差異在浮力作用下自動分離脫落，可直接將微凝膠收集在水性 溶液中，最終得到分散在水溶液中的固體微凝膠微粒。
[0047] 本實用新型的有益效果：
[0048] 本實用新型的一種用于制備固載有活細胞或生物活性分子的微凝膠的微流控裝 置:利用流體聚焦設(shè)計實現(xiàn)內(nèi)外層同屯、軸流體的構(gòu)建，再通過外相剪切得到水包油包水雙 乳液，通過控制油相和水相的流速可實現(xiàn)超薄殼層的雙乳液液滴;在微流忍片上直接外加 紫外光福照，從而實現(xiàn)水凝膠預(yù)聚體的在位聚合/交聯(lián)反應(yīng);通過直接將輸出樣品收集在水 相溶液中，實現(xiàn)快速的油水分離從而得到微凝膠直接分散在水相溶液中的產(chǎn)物。
[0049] 利用本實用新型的微流控裝置制備固載有活細胞或生物活性分子的微凝膠：1)實 現(xiàn)了一步法固載細胞微凝膠的制備，2)保持了細胞的存活率，3)對所得微凝膠尺寸可控，切 尺寸分布窄、單分散，4)制備過程降低了油相和表面活性劑的用量，5)微凝膠可W作為細胞 Ξ維生長的細胞外基質(zhì)，支持細胞的生長繁殖，6)微凝膠可進一步組裝得到具有宏觀結(jié)構(gòu) 的載細胞支架，或作為可注射材料用于細胞的移植。
【附圖說明】
[0050] 圖1是本實用新型的微流控裝置結(jié)構(gòu)示意圖；
[005。 圖2A為在圖1中a-a'線上的剖視圖，圖2B為收集容器；
[0052] 圖3為本實用新型所述W超薄殼層雙乳液為模板一步法制備微凝膠的工作原理示 意圖；
[0053] 圖4是本實用新型所述方法中的微流控裝置制備微凝膠顯微照片；
[0054] 圖5是本實用新型所述方法中微流控裝置制備的超薄殼層雙乳液液滴的巧光顯微 鏡照片；
[0055] 圖6是本實用新型所述方法中微流控裝置制備的超薄殼層雙乳液液滴經(jīng)過交聯(lián)后 油相自動團聚成小油滴附著在微凝膠表面的巧光顯微鏡照片；
[0056] 圖7是本實用新型所述方法中微流控裝置制備的超薄殼層雙乳液液滴經(jīng)過交聯(lián)后 油相自動團聚成小油滴后從微凝膠表面脫落，形成微凝膠的巧光顯微鏡照片；
[0057] 圖8是本實用新型所述方法中微流控裝置制備的超薄殼層雙乳液液滴經(jīng)過交聯(lián)后 油相自動團聚成小油滴后從微凝膠表面脫落，形成自動分離的水相和油相兩相液體的樣品 照片和顯微照片；
[0058] 圖9是本實用新型所述方法中微流控裝置制備的微凝膠微粒的尺寸和尺寸分布；
[0059] 圖10是本實用新型所述方法中的微流控裝置制備載細胞微凝膠的顯微照片；
[0060] 圖11是本實用新型所述方法中制備的載細胞微凝膠的顯微照片，其中巧光標記的 為活體細胞；
[0061] 圖12是本實用新型所述方法中制備的載細胞微凝膠的正交Ξ維成像顯微照片，其 中巧光標記的為活體細胞；
[0062] 圖13是本實用新型所述方法中制備的載細胞微凝膠的尺寸和尺寸分布；
[0063] 圖14是本實用新型所述方法中經(jīng)過本方法制備過程與傳統(tǒng)單乳液方法制備過程 后的細胞存活率對比；
[0064] 圖15是本實用新型所述方法中活體細胞經(jīng)過本方法制備過程后的細胞存活率；
[0065] 圖16是本實用新型所述方法中活體MDCK內(nèi)皮細胞在被固載于微凝膠內(nèi)部后的增 殖情況，并最終形成類組織細胞球；
[0066] 圖17是本實用新型所述方法中制備的活體MDCK內(nèi)皮細胞在微凝膠中生長一周后 形成類組織細胞球的正交Ξ維成像顯微照片，其中巧光標記的為活體細胞；
[0067] 圖18是本實用新型所述方法中活體MDCK內(nèi)皮細胞在微凝膠中生長形成細胞團的 尺寸隨Ξ維培養(yǎng)時間的變化；
[0068] 圖19是本實用新型所述方法中活體NIH/3T3成纖維細胞在被固載于微凝膠內(nèi)部后 的生長、增殖隨時間變化的巧光顯微照片，其中巧光標記的為活體細胞；
[0069] 圖20是本實用新型所述方法中活體NIH/3T3成纖維細胞在被固載于微凝膠內(nèi)部后 的生長、增殖對時間變化的Ξ維重建纖維照片，其中巧光標記的為活體細胞；
[0070] 圖21是本實用新型所述方法中活體NIH/3T3成纖維細胞在微凝膠中生長、增殖并 使微凝膠顆?？s小的過程；
[0071 ]附圖標號：1、第一微通道，2、第二微通道，3、第Ξ微通道，4、輸出通道，5、紫外光福 照，6、收集容器，7、基臺，11、第一微通道的送樣端，12、第一微通道插入端上的排氣口，21、 第二微通道的送樣端，22、第二微通道的插入端，31、第Ξ微通道的送樣端，32、第Ξ微通道 的插入端，41、輸出通道與收集容器的連接口，8、內(nèi)相溶液，9、中間相溶液，81、分散于內(nèi)相 溶液中的細胞，10、外相溶液，13、載有細胞的微凝膠微粒，14、收集水溶液，15、分離的油相， 16、水凝膠預(yù)聚體水溶液，17、超薄油層，18、團聚的油滴、19、微凝膠微粒，20、分離的油滴， 25、浮于油水界面的油滴，26、水相中單分散性的微凝膠顆粒，a、具有超薄油層的雙乳液液 滴，b、油相在微凝膠表面聚集，C、油滴與微凝膠分離
【具體實施方式】
[0072] 下述非限制性實施例可W使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本實用新型，但 不W任何方式限制本實用新型。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī) 方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學公司購買。
[0073] 實施例1
[0074] 下面結(jié)合附圖通過實施例對本實用新型所述W超薄殼層的核殼結(jié)構(gòu)雙乳液為模 板制備單分散性的載細胞微凝膠的方法做進一步說明。
[0075] 如圖1所述，一種微流控裝置，包括第一微通道、第二微通道、第Ξ微通道、輸出通 道、紫外光源和收集容器，所述第一微通道、第二微通道和第Ξ微通道分別具有送樣端和插 入端，所述第二微通道的插入端從第一微通道的送樣端處向插入端非密封地插入于第一微 通道中；第Ξ微通道的插入端從第二微通道的送樣端處向插入端非密封地插入于第二微通 道中，形成套管;輸出通道的一端從第一微通道的插入端處向送樣端非密封地插入于第一 微通道中，與第一微通道內(nèi)的套管端口非端到端連接，輸出通道的另一端與收集容器相連， 在第一微通道插入端與收集容器之間的輸出通道上設(shè)置有紫外光源;該裝置可W固定于基 臺，便于使用。
[0076] 其中所述的第二微通道的插入端的端口為錐形端口，所述的第Ξ微通道的插入端 的端口為錐形端口，所述的輸出通道的插入于第一微通道的一端的端口為錐形端口；
[0077] 在所述套管中，第Ξ微通道插入端的端口不超出且不對齊于第二微通道的插入端 端口，第Ξ微通道插入端的端口與第二微通道的插入端端口之間的距離為10mm;
[0078] 所述的第一微通道、第二微通道和第Ξ微通道的送樣端處分別與微蠕動累或微注 射器相連，W實現(xiàn)自動進樣；
[0079] 在所述第一微通道內(nèi)，所述套管的端口與輸出通道的端口的距離為200WI1。
[0080] 在第一微通道插入端上設(shè)置有排氣口，用于在流體首次注入忍片時將忍片中氣體 排出。
[0081] 該微流控裝置中，第一微通道為內(nèi)經(jīng)均一（內(nèi)徑為1.05μπ〇的方形AIT玻璃毛細管， 使用聚乙二醇對毛細管內(nèi)壁進行親水處理。第二微通道為內(nèi)徑均一（內(nèi)徑為560μπι)的AIT玻 璃毛細管，其插入端的端口為錐形端口，端口內(nèi)徑為50皿，使用Ξ甲氧基硅烷(Aldrich公 司）對毛細管內(nèi)壁進行疏水處理，并用乙醇洗涂后干燥。第Ξ微通道為內(nèi)徑均一（內(nèi)徑為350 μπι)的AIT玻璃毛細管，其插入端的端口為錐形端口，端口內(nèi)徑為ΙΟμπι，使用聚乙二醇對毛細 管內(nèi)壁進行親水處理。輸出通道為內(nèi)徑均一（內(nèi)徑為560μπι)的ΑΙΤ玻璃毛細管，插入于第一 微通道的一端的端口為錐形端口，端口內(nèi)徑為100皿，使用2-[甲氧基(聚亞)丙基]Ξ甲氧 基硅烷(Gelest公司）對毛細管內(nèi)壁進行親水處理。
[0082] 實施例2
[0083] 利用實施例1所述的微流控裝置，制備微凝膠的方法，包括如下步驟：
[0084] (1)配置內(nèi)相、中間相和外相溶液：
[0085] 內(nèi)相溶液的配置:在常溫、常壓下將聚乙二醇二丙締酸醋(PEGDA)和光固化劑（1- [4-(2-?基乙氧基）-苯基]-2-徑基-2-甲基-1-丙烷-1-酬）溶解在去離子水中，溶液中 陽GDA最終濃度為lOw/v%，光固化劑的濃度為Iw/v%。
[0086] 中間相溶液的配制：中間相為油和表面活性劑的混合溶液，將SpanSO表面活性劑 溶液加入礦物油中，使其在礦物油中濃度0.5v/v%。
[0087] 外相溶液的配置:將聚乙締醇(PVA)溶于去離子水中，最終質(zhì)量濃度為5%。
[008引（2)制備水包油包水雙乳液：W流速50化1 hr^將內(nèi)相溶液注入第Ξ微通道、W流 速50化L hr^將中間相溶液注入第二微通道、W流速1500化L hr^將外相水溶液注入第一 微通道，內(nèi)相與中間相流速比為1:1，內(nèi)相與中間相流速與外相流速比例為1:15。運樣的流 速設(shè)置確保形成單分散的水包油包水雙乳液，形成具有超薄殼層的、核-殼結(jié)構(gòu)的微液滴 (圖4)。內(nèi)相(含水預(yù)聚物溶液)通過內(nèi)徑最小的第Ξ微通道注入，W形成最內(nèi)層液滴，而中 間相（油相)通過中間的第二微通道注入，由于第二微通道內(nèi)壁進行了疏水性處理，因此兩 種不混溶流體的同時注射時可形成同軸流體。根據(jù)Reighlay不穩(wěn)定性原理，不共混兩相最 終形成油包水的第一重乳液。外相(PVA水溶液)通過最外層的第一微通道注入。從而在將該 單乳液注入到連續(xù)外相水溶液時，由于乳液與外相不共混而形成水包油包水的雙乳液。由 于在本實用新型設(shè)計的毛細管微流裝置中，微通道的尺寸一致、且流速保持穩(wěn)定，因此在毛 細管作用和流體拉力的作用下形成單分散的雙乳液液滴（圖5)。形成的雙乳液液滴流入輸 出通道，在輸出通道出口處放置紫外光源，誘發(fā)雙乳液液滴最內(nèi)層的光交聯(lián)水凝膠預(yù)聚體 發(fā)生交聯(lián)、聚合，在液滴內(nèi)部形成微凝膠的核。通過調(diào)節(jié)流速液滴尺寸可在10-500μπι范圍調(diào) 控。
[0089] 圖5中外側(cè)a層為外相水層，中間b層為中間油層，最內(nèi)側(cè)的C層為內(nèi)相水凝膠預(yù)聚 體水溶液。
[0090] (3)收集微凝膠:在沒有表面活性劑的去離子水中收集步驟(2)得到的微凝膠，由 于油相殼層在界面潤滑系數(shù)改變，且表面活性劑被收集水溶液稀釋的共同作用下，而難W 維持穩(wěn)定的界面并發(fā)生去濕化(Dewetting)，導(dǎo)致油相團聚成一個油滴附著在微凝膠表面 (如圖6)。圖6中a表示外相水溶液，b表示原油相殼層發(fā)生去濕化而團聚成油滴，C表示光固 化的微凝膠。運樣微凝膠迅速、直接的分散在收集水溶液中，避免了二次清洗、破除乳液的 步驟。由于礦物油的密度小于水，附著在微凝膠微粒表面的油滴在浮力作用下與凝膠微粒 分離(如圖7)，并浮于水溶液表面，形成清洗的油水界面(如圖8)。該方法可實現(xiàn)單分散性的 微凝膠顆粒的批量生產(chǎn)(如圖8)。
[0091] 圖9是上述方法制備得到的微凝膠微粒的尺寸和尺寸分布，圖9的結(jié)果可見最終得 到的微凝膠平均粒徑為87μπι，粒徑分布窄，離散系數(shù)為3%。
[0092] 實施例3
[0093] 利用實施例1所述的微流控裝置，制備再有活體細胞微凝膠的方法，包括如下步 驟：
[0094] (1)配置內(nèi)相、中間相和外相溶液：
[00Μ]內(nèi)相溶液的配置:在常溫、常壓下將甲基丙締酸醋接枝明膠和光固化劑（1-[4-(2- 徑基乙氧基)-苯基]-2-徑基-2-甲基-1-丙烷-1-酬），溶解于細胞培養(yǎng)基中，得水凝膠預(yù)聚 體溶液。其中細胞培養(yǎng)基是Du化ecco改良的化gle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma-Al化ich公司），加有 10%v/v的胎牛血清(FBS，Gibco公司）。將體外培養(yǎng)、擴增后的活體細胞分散在細胞培養(yǎng)基 中，加入上述水凝膠預(yù)聚體溶液，使得最終溶液中細胞濃度在1 X 1〇6個細胞/ml，甲基丙締 酸醋接枝明膠濃度為lOw/v%，光固化劑濃度為Iw/v%。
[0096] 中間相溶液的配制：中間相為油和表面活性劑的混合溶液，將Krytox-PEG-K巧tox 表面活性劑加入氣化油化FE7500)中，得到表面活性劑最終質(zhì)量濃度為0.5%的油相溶液。
[0097] 外相溶液的配置:將聚乙締醇(PVA)溶于去離子水中，最終質(zhì)量濃度為5%。
[0098] (2)制備水包油包水雙乳液:按照實施例1的方法得到微流控裝置，裝置微流控通 道W及其他部件用75%乙醇和100%的乙醇依次清洗，然后使用紫外燈(λ~254納米，120分 鐘)殺菌消毒。
[0099] W流速1000化hr-i將內(nèi)相溶液注入第Ξ微通道、W流速1000化hr-i將中間相注 入第二微通道溶液、W流速1500化L hr^將外相水溶液注入第一微通道，內(nèi)相與中間相流速 比為1:1，內(nèi)相與中間相流速和與外相流速比例為2:15。運樣的流速設(shè)置確保形成單分散的 水包油包水雙乳液，形成具有超薄殼層的、核-殼結(jié)構(gòu)的微液滴（圖2)。內(nèi)相(含細胞水預(yù)聚 物溶液)通過內(nèi)徑最小的第Ξ微通道注入，W形成最內(nèi)層液滴，而中間相(油相)通過中間的 第二微通道注入，由于第二微通道內(nèi)壁進行了疏水性處理，因此兩種不混溶流體的同時注 射時可形成同軸流體。外相(PVA水溶液)通過最外層的第一微通道注入。向微流控裝置同時 注入各相流體，得到具有單分散性、超薄油層的水包油包水雙乳液液滴（圖10)。圖10中可見 細胞被包裹在凝膠中。形成的雙乳液液滴流入輸出通道，在輸出通道出口處放置紫外光源， 誘發(fā)雙乳液液滴最內(nèi)層的光交聯(lián)水凝膠預(yù)聚體發(fā)生交聯(lián)、聚合，從而實現(xiàn)細胞的固載(如圖 11)。圖11中，巧光標記的為活體細胞。。
[0100] (3)收集微凝膠:使用細胞培養(yǎng)基作為收集微凝膠的水溶液，由于油相中表面活性 劑被水相稀釋，使超薄油層不再穩(wěn)定包裹在微凝膠的表面，發(fā)生去濕化現(xiàn)象而團聚成一個 油滴附著在微凝膠表面。運樣微凝膠迅速、直接的分散在收集水溶液中，避免了二次清洗、 破除乳液的步驟。
[0101] 圖12是上述方法制備的載細胞微凝膠的正交Ξ維成像顯微照片，其中巧光標記的 為活體細胞。
[0102] 圖13為上述方法制備的載細胞微凝膠尺寸和尺寸分布，圖13中可見，微凝膠的直 徑大部分分布在240-250WI1范圍內(nèi)，得到的載細胞微凝膠具有很好的單分散性。
[0103] 由于整個制備過程中，細胞在油相中的停留時間只有幾分鐘，并直接分散在含有 細胞生長所需養(yǎng)分的水溶液中，大大提高了細胞的存活率(如圖14)。圖14中，本實用新型雙 乳液制備方法固載于微凝膠中的細胞與傳統(tǒng)的單乳液制備方法[5]固載于微凝膠中的細胞 的存活率對比。本實用新型雙乳液法固載后的細胞存活率與直接接種在細胞培養(yǎng)板上的細 胞存活率相當，運是因為本方法載細胞微凝膠在收集水溶液中直接與油相分離，實現(xiàn)快速 的和水相溶液中的細胞生長營養(yǎng)物質(zhì)形成物質(zhì)交換，且有潛在細胞毒性的光固化劑和表 面活性劑成分被水相快速稀釋，降低其對細胞影響。因此本實用新型所述方法具有優(yōu)異的 生物相容性、細胞毒性小。相反，單乳液法中載細胞微凝膠收集在油相中，并進行二次清洗 破除乳液才能將微凝膠從油相中分離;并且為了增加微凝膠產(chǎn)量，需要長時間制備收集，因 此細胞在油相中停留時間增加，細胞因為無法與外界進行物質(zhì)交換，缺乏營養(yǎng)成分，且乳液 中表面活性劑和光固化劑含量高具有潛在細胞毒性，因此細胞存活率隨著在油相中停留時 間的增加而降低。
[0104] 并且該方法可自由選擇細胞種類（如圖15)。圖15中，在對骨髓性白血病細胞 化562)，狗腎上皮細胞(MDCK)細胞和NIH/3T3成纖維細胞（ATCC"公司）幾種細胞的固載實 驗中，均證實雙乳液法固載后的細胞存活率與直接接種在細胞培養(yǎng)板上的細胞存活率相 當，說明該制備過程不會顯著降低細胞的存活率。
[0105] 圖3是根據(jù)上述步驟(2)~(3)制備載有細胞的微凝膠的原理流程圖。其中圖3A是 將各自配置好的內(nèi)相、中間相和外相溶液按照規(guī)定的流速注入相應(yīng)的微通道的過程，圖3B 是通過各自的微通道注入的內(nèi)相、中間相和外相溶液，形成單分散性、超薄油層的水包油包 水雙乳液液滴，進一步在收集水溶液中脫外層的油相后形成載有細胞的微凝膠微粒的過 程，圖3C的步驟(a)~k)是具有超薄油層的雙乳液液滴在紫外光福照下最內(nèi)層水凝膠預(yù)聚 物溶液發(fā)生交聯(lián)固化，實現(xiàn)對懸浮細胞的Ξ維包裹。進一步將其直接收集在收集水溶液中， 由于油相殼層在界面潤滑系數(shù)改變，且表面活性劑被收集水溶液稀釋的共同作用下，而難 W維持穩(wěn)定的界面并發(fā)生去濕化(Dewetting)，導(dǎo)致油相團聚成一個油滴附著在微凝膠表 面。油滴隨后在浮力作用下自動分離脫落，最終得到分散在水溶液中的微凝膠微粒。
[0106] 實施例4
[0107] 利用實施例3制備得到的微凝膠微粒，進行細胞Ξ維培養(yǎng):將收集的載細胞微凝膠 微粒通過網(wǎng)孔小于顆粒直徑的濾網(wǎng)，從而確保油相能徹底被清除干凈。將微凝膠放入普通 細胞培養(yǎng)板進行Ξ維培養(yǎng)，每Ξ天更新一次培養(yǎng)基。在37 °C，95 %濕度和含5 %二氧化碳氣 體中培養(yǎng)。
[0108] 長期體外細胞培養(yǎng)實驗證實活體細胞在固載于Ξ維微凝膠中能正常生長、增殖， 證明本實用新型所述技術(shù)的生物相容性。MDCK上皮細胞在明膠微凝膠基質(zhì)中后持續(xù)增殖， 體外培養(yǎng)4天后形成多個細胞聚集的細胞團(球）（如圖16、18)。并隨時間延長細胞球的大小 逐漸增大，最終在7天后形成具有典型上皮組織構(gòu)造的類組織微囊結(jié)構(gòu)(如圖17)，其中巧光 標記的為活體細胞。運樣的微囊結(jié)構(gòu)具有由多細胞組成的厚殼和中屯、空腔，是MDCK細胞Ξ 維培養(yǎng)形成的典型形態(tài)。也充分證實了本實用新型所述微加工方法的生物相容性。
[0109] 固載于微凝膠中的NIH/3T3成纖維細胞在Ξ維培養(yǎng)環(huán)境中在包埋后快速附著并持 續(xù)生長繁殖(圖19、20)，其中巧光標記的為活體細胞。圖19、圖20顯示，細胞培養(yǎng)4天后，大多 數(shù)包封細胞從微凝膠內(nèi)部長出，并附著在微凝膠的表面。而細胞的粘附生長產(chǎn)生的壓縮力 使得球形微凝膠發(fā)生收縮變形，致使微凝膠的尺寸隨著培養(yǎng)時間下降（圖21)。另外，成纖維 細胞在微凝膠表面的持續(xù)生長最終使得微凝膠顆粒間形成的鏈接，組裝成尺寸更大的類組 織結(jié)構(gòu)。
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【主權(quán)項】
1. 一種用于制備固載有活細胞或生物活性分子的微凝膠的微流控裝置，包括第一微通 道、第二微通道、第三微通道、輸出通道、紫外光源和收集容器，所述第一微通道、第二微通 道和第三微通道分別具有送樣端和插入端，所述第二微通道的插入端從第一微通道的送樣 端非密封地插入于第一微通道中；第三微通道的插入端從第二微通道的送樣端非密封地插 入于第二微通道中，形成套管;輸出通道的一端從第一微通道的插入端非密封地插入于第 一微通道中，與第一微通道內(nèi)的套管端口非端到端連接，輸出通道的另一端與收集容器相 連，在第一微通道的插入端與收集容器之間的輸出通道上設(shè)置有紫外光源。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控裝置，其特征在于，所述的第二微通道的插入端的端口 為錐形端口，所述的第三微通道的插入端的端口為錐形端口，所述的輸出通道的插入于第 一微通道的一端的端口為錐形端口。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微流控裝置，其特征在于，所述的第二微通道的插入端端口的 直徑為5-1000μπι，所述的第三微通道的插入端端口的直徑為5-1000μπι，所述的輸出通道的 插入于第一微通道的一端的端口的直徑為10-2000μηι。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微流控裝置，其特征在于，在所述套管中，第三微通道插入 端的端口不超出第二微通道的插入端端口，兩端口之間距離大于1_。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控裝置，其特征在于，所述的第一微通道、第二微通道和 第三微通道的送樣端分別與微蠕動栗或微注射器相連，以實現(xiàn)自動進樣。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控裝置，其特征在于，在所述第一微通道內(nèi)，所述套管的 端口與輸出通道的端口的距離為50~500μηι。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控裝置，其特征在于，所述第一微通道插入端連接有排氣 □ 〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控裝置，其特征在于，第一微通道內(nèi)壁表面進行親水處 理，所述第二微通道內(nèi)壁表面進行疏水處理，所述第三微通道內(nèi)壁表面進行親水處理，所述 輸出微通道內(nèi)壁表面進行親水處理。
【文檔編號】C12M1/00GK205549077SQ201620207509
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年3月16日
【發(fā)明人】王華楠
【申請人】王華楠