雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌egfr靶點(diǎn)的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR靶點(diǎn)的藥物中的應(yīng)用，屬于二脒系列類化合物醫(yī)藥及其用途。本發(fā)明雙溴丙脒二鹽酸鹽抑制SW780、RT112細(xì)胞生長的IC50在5～8μmol/L之間；其濃度與促進(jìn)SW780，RT112細(xì)胞凋亡作用正相關(guān)，與p?EGFR、p?AKT、p?ERK磷酸化程度反相關(guān)。本發(fā)明以雙溴丙脒二鹽酸鹽作為抑制人膀胱癌EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的藥物，提高了藥物的利用效率，具有廣闊的市場前景。
【專利說明】
雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR靶點(diǎn)的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于二脒系列類化合物醫(yī)藥及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]膀胱癌是常見，花費(fèi)最高的惡性腫瘤之一。男女發(fā)病比例3.5:1，發(fā)病高峰年齡50-70歲。雖然膀胱癌發(fā)病率排在第九位，但由于其高復(fù)發(fā)率，治療時(shí)間長，成為花費(fèi)最高的腫瘤之一。膀胱癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。最新的研究發(fā)現(xiàn)EGFR(epidermal growth factorreceptor，表皮生長因子受體)在膀胱癌中起作用:EGFR會(huì)導(dǎo)致膀胱細(xì)胞去分化;EGFR過表達(dá)在膀胱癌中的比例約12?53%，同非肌層浸潤性膀胱癌相比，肌層浸潤性膀胱癌EGFR過表達(dá)比例最高達(dá)53%;肌層浸潤性膀胱癌中有9%存在EGFR基因擴(kuò)增。這些都會(huì)使EGFR持續(xù)性的激活，從而使其下游的蛋白包括SRC、STAT3、Ras、PI3K、AKT和ERK持續(xù)性的激活，導(dǎo)致形成腫瘤。近年來世界各大藥廠和研究機(jī)構(gòu)針對EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，即針對EGFR靶點(diǎn)的小分子抑制劑的研究成為一個(gè)迫在眉睫的熱點(diǎn)。最近許多臨床試驗(yàn)采用單用EGFR抑制劑或者聯(lián)合使用細(xì)胞毒性化療藥物探索治療復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移膀胱癌的新策略。通過使用孔祥復(fù)院士團(tuán)隊(duì)中梁廣錫教授開發(fā)的idock軟件，找尋已經(jīng)在美國、日本、歐洲上市的藥物，但尚未發(fā)現(xiàn)能抑制EGFR功能而具有抗腫瘤作用的藥物。
[0003]雙溴丙脒(Dibrompropamidine)是二脒系列化合物的成員之一，具有抑制細(xì)菌和殺細(xì)菌作用，機(jī)制在于抑制細(xì)菌的氧化代謝。雙溴丙脒還可以用于原蟲感染的治療，比如，棘阿米巴角膜炎。雙溴丙脒依西酸鹽滴眼劑或眼膏用于成人及兒童輕微的眼部和眼瞼感染，商品名有 Brolene (Aventis Pharma)，Go I den Eye (Typharm Ltd)和 Brulidine (ManxHealthcare)。目前尚未報(bào)道雙溴丙脒二鹽酸鹽(Dibromopropamidine Dihydrochloride)具有抗腫瘤的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在針對EGFR靶點(diǎn)的小分子抑制劑提供一種制備抗腫瘤的新藥物，特別是以雙溴丙脒二鹽酸鹽作為抑制人膀胱癌EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的藥物。
[0005]本發(fā)明上述目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的:
雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR勒點(diǎn)的藥物中的應(yīng)用。
[0006]進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用是:雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制SW780、RT112細(xì)胞生長的作用，其IC5q在5?8ymol/L之間。
[0007]進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度與促進(jìn)SW780，RT112細(xì)胞凋亡作用呈正相關(guān)，雙溴丙脒二鹽酸鹽濃度與p-EGFR、p-AKT、p-ERK磷酸化程度呈反相關(guān)。
[0008]進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為10?30ymol/L，以細(xì)胞凋亡數(shù)量減少至OD值0.6計(jì)，促進(jìn)SW780，RT112細(xì)胞凋亡作用時(shí)間為721101^。
[0009]本發(fā)明有益效果和進(jìn)步是: 本發(fā)明通過idock軟件篩到雙溴丙脒二鹽酸鹽，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制人膀胱癌細(xì)胞SW780、RT112存活率。經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡證實(shí)雙溴丙脒二鹽酸鹽具有促進(jìn)SW780、RT112凋亡的作用。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制EGFR的功能，從而證實(shí)它是EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的抑制物。
[0010]本發(fā)明以現(xiàn)有上市的藥物為資源，從中發(fā)掘出以雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR靶點(diǎn)的藥物中的應(yīng)用，使其獲得了在抗腫瘤領(lǐng)域的用途，提高了藥物的效率，節(jié)省了設(shè)計(jì)新藥的成本和時(shí)間，降低了患者的成本，具有廣闊的市場前景。
【附圖說明】
[0011]圖1為雙溴丙脒二鹽酸鹽抑制SW780細(xì)胞生長的MTT實(shí)驗(yàn)示意圖，其IC5Q為8ymol/L。
[0012]圖2為雙溴丙脒二鹽酸鹽抑制RT112細(xì)胞生長的MTT實(shí)驗(yàn)示意圖，其IC5q為5ymol/L。
[0013]圖3為SW780隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽作用時(shí)間的延長和濃度的增加，SW780細(xì)胞存活率逐漸下降示意圖。
[0014]圖4為RTl12隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽作用時(shí)間的延長和濃度的增加，RTl 12細(xì)胞存活率逐漸下降示意圖。
[0015]圖5為雙溴丙脒二鹽酸鹽促進(jìn)SW780細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的直方圖。
[0016]圖6為對照組的SW780細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的示意圖。
[0017]圖7為3ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進(jìn)SW780細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的示意圖。
[0018]圖8為ΙΟμπιοΙ/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進(jìn)SW780細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的示意圖。
[0019]圖9為30ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進(jìn)SW780細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的示意圖。
[0020]圖10為雙溴丙脒二鹽酸鹽促進(jìn)RT112細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的直方圖。
[0021]圖11為對照組的RTl 12細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的觀測示意圖。
[0022]圖12為3ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進(jìn)RTl12細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的觀測示意圖。
[0023]圖13為ΙΟμπιοΙ/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進(jìn)RTl12細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的觀測示意圖。
[0024]圖14為30ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽與對照組比較促進(jìn)RTl12細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)72小時(shí)的觀測示意圖。
[0025]圖15為雙溴丙脒二鹽酸鹽3，10，30ymol/L濃度下抑制p-EGFR磷酸化及其下游蛋白口-八1(1'、口41?1(磷酸化的￥68七61'11-13101:不意圖。
[0026]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步說明，這些實(shí)施方式所表明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括但不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0027]l、MTT 實(shí)驗(yàn):
實(shí)驗(yàn)方法:膀胱癌細(xì)胞SW780、RT112以每孔6\103個(gè)，其中，3￥780用0.125°/洲5 L-15培養(yǎng)基，RT112用0.125%FBS RPM1-1640培養(yǎng)基，在96孔板中培養(yǎng)24h，棄掉培養(yǎng)基后用含有I，3，10，3(^11101/1濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽的10%完全培養(yǎng)基，8卩3￥780用10°/^83 L-15培養(yǎng)基，燈112用10°/^85 RPM1-1640培養(yǎng)基(下同)，分別培養(yǎng)24，48，72h。以上培養(yǎng)后的SW780、1^112細(xì)胞用0.5% 3-(4,5)-二甲基噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍(lán)(簡稱噻唑藍(lán))孵育4小時(shí)。生成的甲臘用200yL二甲基亞砜溶解后，于波長570nm檢測。ICso用軟件GraphPadPrism 5計(jì)算。
[0028]實(shí)驗(yàn)證實(shí):
MTT分析人膀胱癌細(xì)胞存活率如圖1'2JTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制SW780、RT112細(xì)胞生長的作用，其IC5q在5?8ymol/L之間。
[0029]圖3、4分別為SW780、RT112隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽作用時(shí)間的延長和濃度的增加，SW780，RTl 12細(xì)胞存活率逐漸下降結(jié)果。
[0030]其中，雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為10?30ymol/L，以細(xì)胞凋亡數(shù)量減少至0.6(0D值)計(jì)，SW780，RT112細(xì)胞凋亡作用時(shí)間為72hour。尤其是，當(dāng)雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為30μπιο 1/L時(shí)，提前和縮短了 SW780 ,RTll 2細(xì)胞凋亡作用時(shí)間。
[0031]2、Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn):
實(shí)驗(yàn)方法:膀胱癌細(xì)胞以每孔5Χ104個(gè)/500yL，其中，SW780用0.125%FBS L-15培養(yǎng)基，RT112用0.125%FBS RPM1-1640培養(yǎng)基在24孔板中培養(yǎng)24h，棄掉培養(yǎng)基后用含有3，10，30μmol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽的10%完全培養(yǎng)基進(jìn)行72h的培養(yǎng)。72h后用去離子水將4 X結(jié)合緩沖液稀釋成I X結(jié)合緩沖液；用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，于室溫100rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞；用預(yù)冷TOS(4°C )洗細(xì)胞兩次，加入250μ1的I X結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為I X1VmL;取該濃度細(xì)胞ΙΟΟμΙ懸液于5mL的流式管中，加入5μ1的Annexin V-FITC和1yL 20yg/mL的碘化丙錠溶液，混勻，避光，室溫孵育15分鐘；在流式管中加400yL PBS，流式細(xì)胞儀(Partec)分析。
[0032]實(shí)驗(yàn)證實(shí):雙溴丙脒二鹽酸鹽具有促進(jìn)SW780、RT112細(xì)胞凋亡的作用，SW780、RT112隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽濃度的增加，SW780，RT112細(xì)胞存活率下降，其72小時(shí)的顯示結(jié)果如圖5?14。
[0033]3、Western_blot 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法:膀胱癌細(xì)胞以每孔20-40\104個(gè)/21^，其中，31780用0.125°/^83 L-15培養(yǎng)基，RT112用0.125%FBS RPM1-1640培養(yǎng)基，二者分別在6孔板中培養(yǎng)24h。棄掉培養(yǎng)基后用含有3，10，30ymol/L濃度的雙溴丙脒二鹽酸鹽的10%完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后提取細(xì)胞蛋白。收集的細(xì)胞用含有ImM蛋白磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液在4°C消化30分鐘，13,000轉(zhuǎn)離心15分鐘，收集上清，用BCA蛋白測定試劑盒(Thermo)進(jìn)行蛋白濃度測定。用與上清等量的細(xì)胞裂解液通過10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。封閉后，根據(jù)抗體使用說明書加入一抗和二抗與膜孵育。經(jīng)底物顯色，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)測定(Amersham, Piscataway, NJ)。使用抗β-actin抗體作為內(nèi)參抗體進(jìn)行校正。
[0034]實(shí)驗(yàn)證實(shí):雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制p-EGFR磷酸化，因此其下游蛋白p-AKT、p-ERK磷酸化也被抑制。并且，隨著雙溴丙脒二鹽酸鹽濃度的增加，p-EGFR、p-AKT、p-ERK磷酸化程度降低(如圖15)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.雙溴丙脒二鹽酸鹽在制備抑制膀胱癌EGFR勒點(diǎn)的藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是:雙溴丙脒二鹽酸鹽具有抑制SW780、RT112細(xì)胞生長的作用，其IC5q在5?8ymol/L之間。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度與促進(jìn)SW780，燈112細(xì)胞凋亡作用呈正相關(guān)，雙溴丙脒二鹽酸鹽濃度與？46?1?、？^1(1'、？4孤磷酸化程度呈反相關(guān)。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為10?30μπιΟ1/L，以細(xì)胞凋亡數(shù)量減少至OD值0.6計(jì)，促進(jìn)SW780，RT112細(xì)胞凋亡作用時(shí)間為72hour。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是:雙溴丙脒二鹽酸鹽的濃度為10?30ymol/L，以細(xì)胞凋亡數(shù)量減少至OD值0.6計(jì)，促進(jìn)SW780，RT112細(xì)胞凋亡作用時(shí)間為721101^。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106074473SQ201610626162
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月3日 公開號(hào)201610626162.5, CN 106074473 A, CN 106074473A, CN 201610626162, CN-A-106074473, CN106074473 A, CN106074473A, CN201610626162, CN201610626162.5
【發(fā)明人】柯坤彬, 孔祥復(fù), 李宏健, 梁廣錫, 王文漢, 林李家宓, 劉旭, 劉孝東
【申請人】昆明醫(yī)科大學(xué), 香港中文大學(xué), 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院