8-取代氧化異阿樸菲衍生物的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一系列8-取代氧化異阿樸菲衍生物的應(yīng)用。具體是8-取代氧化異阿樸菲衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備Aβ聚集抑制劑藥物中的應(yīng)用，以及在制備同時(shí)具有抑制乙酰膽堿酯酶和抗Aβ聚集的藥物中的應(yīng)用。
【申請(qǐng)人】發(fā)現(xiàn)該類衍生物不僅在體外對(duì)乙酰膽堿酯酶具有很好的抑制活性，在體內(nèi)也同樣具有很好的抗乙酰膽堿酯酶效果，而且化合物無(wú)論在分子水平還是在細(xì)胞水平都具有很好的抗Aβ聚集活性。更難得的是該類化合物大部分能夠透過(guò)血腦屏障并且具有較低的毒性，在治療阿爾茨海默病和腦血管癡呆等疾病方面具有良好應(yīng)用前景。所述8-取代氧化異阿樸菲衍生物的結(jié)構(gòu)如下述式(I)所示：其中，n＝1～5。
【專利說(shuō)明】
8-取代氧化異阿樸菲衍生物的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及8-取代氧化異阿樸菲衍生物的新應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD)是由德國(guó)的神經(jīng)病理學(xué)家阿爾茨海默 (Alois Alzheimer)于1907年首先發(fā)現(xiàn)，并W其名字而命名的一種疾病，AD是一種漸進(jìn)性 的神經(jīng)變性性疾病，運(yùn)種疾病表現(xiàn)為全面的認(rèn)知障礙，包括記憶、定位、判斷和推理。其臨床 特點(diǎn)是W潛隱性病，逐漸出現(xiàn)記憶力減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常和社交障礙。通常病情 呈進(jìn)行性加重，逐漸喪失獨(dú)立生活能力。由于AD病設(shè)及多種病理過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制是個(gè)很 復(fù)雜、多機(jī)制、多因素的過(guò)程。
[0003] 盡管AD的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全清楚，但由淀粉樣β蛋白（Αβ)沉積造成的老 年斑和包含tau蛋白的神經(jīng)纖維原纏結(jié)被認(rèn)為是AD的主要發(fā)病機(jī)理。
[0004] 現(xiàn)有已經(jīng)上市的五種治療AD病的藥物：Donepezil ;Rivastigmine ;Galantamine ; Tacrine和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA)受體調(diào)節(jié)劑Memantine。運(yùn)類藥物的勒1點(diǎn)為乙 酷膽堿醋酶（A化巧，它們雖然不能徹底治愈疾病，但能改善病人的癥狀。目前較為先進(jìn) 的緩解疾病候選藥物（disease-modifying化ug DMD)包括WA0抑制產(chǎn)生和清除為目 標(biāo)的Tramip;rosate(已進(jìn)入Ξ期臨床研究）；調(diào)節(jié)丫-分泌酶的TarenflurbiU已進(jìn)入 Ξ期臨床研究）；淀粉樣蛋白的主動(dòng)免疫疫苗ACC-001和被動(dòng)免疫疫苗Bapineuzum油和 LY2062430(已進(jìn)入二期臨床研究）等。 陽(yáng)0化]上述已經(jīng)上市的和正在開(kāi)發(fā)的藥物都是單一祀點(diǎn)的治療藥物，鑒于AD發(fā)病的復(fù) 雜性，運(yùn)類藥物很難從根本上解決問(wèn)題。因?yàn)橐环矫鍭D本身發(fā)病機(jī)理中往往由多個(gè)信號(hào)通 路參與，而單祀點(diǎn)的理論忽視了細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)生物大分子的相互影響及信號(hào)通路中構(gòu)成的 網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的相互影響，祀分子在細(xì)胞內(nèi)多存在備份，當(dāng)藥物抑制一種信號(hào)分子時(shí)，信號(hào)通路 可W通過(guò)回路或啟用備份，最終抵消藥物的作用。另一方面，現(xiàn)有藥?kù)胗卸喙δ苄?，?qiáng)烈抑 制或激活某一藥?kù)霑?huì)導(dǎo)致副作用的產(chǎn)生，如使用抗膽堿醋酶藥物往往會(huì)導(dǎo)致外周的乙酷膽 堿的積累增加而引起惡屯、、嘔吐等外周膽堿樣反應(yīng)。
[0006] 多祀點(diǎn)藥物的設(shè)計(jì)是旨在利用生物結(jié)構(gòu)信息和藥效團(tuán)模型，獲得所需的多樣生物 活性，同時(shí)去除不需要的生物活性，其化合物的特點(diǎn)是針對(duì)疾病的不同病理環(huán)節(jié)發(fā)揮作用 而增強(qiáng)療效。另外，多祀點(diǎn)化合物對(duì)諸祀點(diǎn)作用的聯(lián)合較相應(yīng)各單祀點(diǎn)藥物對(duì)其作用的相 加要有效的多，原因在于運(yùn)種不完全的多祀向作用具有適度阻斷分子之間的相互作用的優(yōu) 點(diǎn)。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種信號(hào)通路參與此過(guò)程，許多信號(hào)分子在其中發(fā)揮重要作用，近 年來(lái)科學(xué)研究者嘗試將多祀向治療策略應(yīng)用于治療，發(fā)現(xiàn)較單祀點(diǎn)藥物治療具有更優(yōu)越的 療效和臨床前景。
[0007] 本
【申請(qǐng)人】在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，具有下述式（A)所示結(jié)構(gòu)的8-取代氧化異阿樸菲 衍生物在體外對(duì)乙酷膽堿醋酶具有很好的抑制作用（具體請(qǐng)見(jiàn)公開(kāi)號(hào)為CN103923009A的 發(fā)明專利），但目前尚未發(fā)現(xiàn)有該類衍生物單獨(dú)具有抗A β聚集作用W及在乙酷膽堿醋酶 的同時(shí)還具有抗Αβ聚集作用的相關(guān)報(bào)道。
[0008]
[0009] 其中，η =1 ~5。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種8-取代氧化異阿樸菲衍生物的新應(yīng)用。
[0011] 具體地說(shuō)，本發(fā)明提供具有下述式（I)所示結(jié)構(gòu)的8-取代氧化異阿樸菲衍生物或 其藥學(xué)上可接受的鹽在制備Αβ聚集抑制劑藥物中的應(yīng)用；
[0012]
[0013] 其中，η = 1 ~5。
[0014] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供具有下述式（I)所示結(jié)構(gòu)的8-取代氧化異阿樸菲衍生物 或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備同時(shí)具有抑制乙酷膽堿醋酶和抗Αβ聚集的藥物中的應(yīng)用；
[0015]
[0016] 其中，η = 1 ~5。
[0017] 本發(fā)明所述技術(shù)方案中設(shè)及的具有式（I)所示結(jié)構(gòu)的8-取代氧化異阿樸菲衍生 物可參考公開(kāi)號(hào)為CN103923009A的發(fā)明專利進(jìn)行合成。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了具有式（I)所示結(jié)構(gòu)的8-取代氧化異阿樸菲衍生 物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備A β聚集抑制劑藥物中的應(yīng)用，W及該類衍生物在制備同 時(shí)具有抑制乙酷膽堿醋酶和抗Αβ聚集的藥物中的應(yīng)用。
【申請(qǐng)人】發(fā)現(xiàn)該類衍生物不僅在體 外對(duì)乙酷膽堿醋酶具有很好的抑制活性，在體內(nèi)也同樣具有很好的抗乙酷膽堿醋酶效果， 而且化合物無(wú)論在分子水平還是在細(xì)胞水平都具有很好的抗Aβ聚集活性。更難得的是該 類化合物大部分能夠透過(guò)血腦屏障并且具有較低的毒性，在治療阿爾茨海默病和腦血管癡 呆等疾病方面具有良好應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明所述的8-取代氧化異阿樸菲衍生物對(duì)Αβ 42轉(zhuǎn)基因果蛹腦內(nèi)乙酷 膽堿醋酶的抑制活性條形圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明所述的8-取代氧化異阿樸菲衍生物對(duì)甜-SY5Y-APPsw細(xì)胞A β 42的 抑制活性條形圖；
[0021] 圖3為平行人工膜滲透模型的示意圖；
[0022] 圖4為采用圖3所示模型檢測(cè)9個(gè)市售藥物的ΡΑΜΡΑ-ΒΒΒ實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值的相 關(guān)性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，W更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但 本發(fā)明并不限于W下實(shí)施例。
[0024] 本發(fā)明中按下述合成路線合成得到式（I)所示結(jié)構(gòu)的8-取代氧化異阿樸菲衍生 物。 陽(yáng)0巧]
[00%] 實(shí)施例1 :4-氯-2-苯基異二氨嗎I噪-1，3-二酬（化合物1)的合成
[0027] 將57g(0. lmol)3-氯鄰苯二甲酸酢和45g(0.1mol)苯乙胺加入到1L的Ξ孔圓底 燒瓶中，再加入500ml甲苯，回流6小時(shí)，趁熱倒出，冷卻，析出結(jié)晶，抽濾，得到化合物1(白 色片狀結(jié)晶），產(chǎn)率約98%。
[0028] 對(duì)化合物1進(jìn)行分析，其波譜特性如下：
[0029] 古 NMR (CDC!3, 500MHz) : δ 3. 00 ~3. 04 (m, 2H)，3. 94 ~3. 97 (m, 2H)，7. 23 ~ 7. ：M(m，5H)，7. 65(d，J = 1.7，1H)，7. 66(s，lH)，7. 78(dd，Ji= 5. Oand J2= 3. 2，1H); ESI-MS(m/z) :287[M+H]".
[0030] 因此，可確定上述化合物1為4-氯-2-苯基異二氨嗎I噪-1，3-二酬，其結(jié)構(gòu)式如 下式所示：
[0031]
[0032] 實(shí)施例2 :8-α-1-氮雜苯并蔥酬（化合物2)的合成 陽(yáng)03引將75g(0. 56mol)的無(wú)水Ξ氯化侶和15g氯化鋼加入1L的Ξ孔圓底燒瓶中，混合 加熱至140°C烙融，再向其分批緩慢加入53g (0. 2mol)的化合物1，加入完畢，升溫至220°C， 攬拌反應(yīng)3小時(shí)，乘熱倒入研鉢中，冷卻，搗碎，得到紅棟色固體，放置于干燥器皿中。
[0034] 取600ml濃硫酸加入到化的Ξ孔圓底燒瓶中，升溫到80°C時(shí)，開(kāi)始分批加入上述 得到的紅棟色固體，加完后升溫至230°C，攬拌反應(yīng)2. 5小時(shí)，冷卻，倒入到約600g的冰水 中，用化OH調(diào)節(jié)抑值約2-3,析出大量固體，抽濾，水洗，得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析 (石油酸/乙酸乙醋=20:1)純化，得到化合物2 (黃色粉末），產(chǎn)率約35 %。
[0035] 對(duì)化合物2進(jìn)行分析，其波譜特性如下： W36] NMR (CDC13, 500 MHz): 57.72(d,J = 5.6Hz lH),7.76(t,J = 8. 2Hz, IH) , 7. 89 (t, J = 7. 3Hz, IH) , 8. 12 (d, J = 8. 2Hz, IH) , 8. 64 (d, J = 7. 3Hz，lH)，8. 71(d，J = 7. 9Hz，lH)，8. 76(d，J = 5.細(xì)z，lH)，9. 07(d，J = 7. 3Hz，lH); ESI-MS (m/z) : 266 [M+田+.因此，可確定上述化合物2為8-Cl-1-氮雜苯并蔥酬，其結(jié)構(gòu)式如 下式所示：
[0037]
W38] 實(shí)施例3 :8-氨基-7H-二苯并哇嘟-7-酬（化合物扣的合成
[0039] 取1. 5g化合物2于高壓蓋內(nèi)膽中，再加入100ml的氨水，于180°C下反應(yīng)12h后， 停止反應(yīng)。待冷卻后用3mol/L的肥1調(diào)抑至7-8,抽濾，烘干。粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析（石 油酸/氯仿=7:1)純化，得到化合物3 (紅色固體），產(chǎn)率40 %。
[0040] 對(duì)化合物3進(jìn)行分析，其波譜特性如下：
[0041] iH NMR (50 0MHz, DMS0):58.73(d，J = 5.5Hz，lH)，8.45(d，J = 7. 2Hz, IH)，8. 29 (d, J = 8. 2Hz, IH)，8. 06 (d, J = 8. 4Hz, IH)，8. 02 - 7. 97 (m, IH)，7. 94 (d, J =5.細(xì)z, IH)，7. 55 - 7. 48 (m, IH)，7. 00 (d, J = 7. 3Hz, IH)，2. 51 (t, J = 2. 8Hz, 2H); ESI-MS(m/z) :247[M+H]".
[0042] 因此，可確定上述化合物3為8-氨基-7H-二苯并哇嘟-7-酬，其結(jié)構(gòu)式如下式所 示：
[0043]
柳44] 實(shí)施例4 :8- (2-贓晚乙酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬（化合物4)的合成 柳45] 取0. 3g〇). 0012m〇U化合物3于25血圓底燒瓶中，加入15血邸2化使其全部溶解 后，向裝有2. 95g(0. 0183mol)2-(l-贓晚基）乙酷氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后化C 追蹤反應(yīng)2. 5h，用Na肥〇3調(diào)抑值至2-3,并用蒸饋水洗涂3-4次，CH 2化層用無(wú)水化2SO4干 燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油酸/氯仿=5:1)純化，得到化合物4(澄黃色粉末），產(chǎn)率 89. ο%。
[0046] 對(duì)化合物4進(jìn)行分析，其波譜特性如下：
[0047] iH NMR 巧OOMHz, CDC!3) δ 13. 45 (S, 1Η)，9. 10 (d, J = 7. 3Ηζ, 1Η)，8. 78 (d, J =5. 5Hz, IH), 8. 73 (d, J = 6. 7Hz, IH), 8. 66 (d, J = 7. 2Hz, IH), 8. 14 (d, J = 7. 2Hz, IH)，7. 95 - 7. 88 (m, IH)，7. 79 (t, J = 8. IHz, IH)，7. 74 (d, J = 5. 6Hz, IH)，3. 27 (s, 2H ),2. 67 (s, 4H), 1. 97 - 1. 82 (m, 4H), 1. 28 (s, 2H). ESI-MS (m/z) : 372 [M+H]
[0048] 因此，可確定上述化合物4為8- (2-贓晚乙酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬，其結(jié) 構(gòu)式如下式所示：
[0049]
[0050] 實(shí)施例5 :8- (3-贓晚丙酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬（化合物5)的合成 陽(yáng)0川取0. 3g〇). 0012m〇U化合物3于25血圓底燒瓶中，加入15血邸2化使其全部溶 解后，向裝有3. 2g(0. 018mol)3-(l-贓晚基）丙酷氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后化C 追蹤反應(yīng)化，用Na肥〇3調(diào)抑值至2~3,并用蒸饋水洗涂3~4次，CH 2〇2層用無(wú)水化2SO4 干燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油酸/氯仿=5:1)純化，得到化合物5 (澄黃色粉末），產(chǎn)率 90%。
[0052] 對(duì)化合物5進(jìn)行分析，其波譜特性如下：
[0053] iH NMR 巧OOMHz, CDC!3) δ 12. 81 (S, 1H), 8. 97(d, J = 8. 4Hz, 1H), 8. 79(d, J =5. 5Hz, IH) , 8. 70 (d, J = 7. 9Hz, IH) , 8. 6 1 (d, J = 7. 3Hz, IH) , 8. 16 (d, J =8. 2Hz, IH), 7. 92 (t, J = 7. 7Hz, IH), 7. 78 (t, J = 8. IHz, IH), 7. 75 (d, J = 5.7Hz，lH)，2.92(t，J = 7.2Hz，2H)，2.82(t，J = 7.3Hz，2H)，2.58(s，4H)，1.79- 1. 60 (m, 4H), 1. 28 (s, 2H). ESI-MS (m/z) : 386 [M+H]
[0054] 因此，可確定上述化合物5為8- (3-贓晚丙酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬，其結(jié) 構(gòu)式如下式所示： 陽(yáng)化引
[0056] 實(shí)施例6 :8- (4-贓晚下酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬（化合物6)的合成
[0057] 取0. 2g〇). OOOSmoU化合物3于25血圓底燒瓶中，加入15血邸2化使其全部溶解 后，向裝有2. 3g(0. 012m〇U4-(l-贓晚基）下酷氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后TLC追 蹤反應(yīng)2. 5h，用Na肥化調(diào)抑值至2~3,并用蒸饋水洗涂3~4次，CH 2化層用無(wú)水化2SO4 干燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油酸/氯仿=20:1)純化，得到化合物6(澄黃色粉末），產(chǎn) 率 85%。
[0058] 對(duì)化合物6進(jìn)行分析，其波譜特性如下：
[0059] iH NMR 巧OOMHz, CDC!3) δ 12. 83 (S, 1H)，8. 95 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，8. 79 (d, J =5. 5Hz, IH), 8. 71 (d, J = 7. 9Hz, IH), 8. 62 (d, J = 7. 2Hz, IH), 8. 17 (d, J = 8.2Hz，lH)，7.97 - 7.89(m，lH)，7.79(d，J = 8.1Hz，lH)，7.76(d，J = 5.5Hz，lH)，3.85- 3.71(m，2H)，3.29(t，J=12.6Hz，2H)，2.91-2.76(m，4H)，2.69(t，J = 7.0Hz，2H)，1.92- 1. 77 (m, 4H)，1. 28 (s, 2H). ESI-MS (m/z) : 400 [M+田 +.
[0060] 因此，可確定上述化合物6為8- (4-贓晚下酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬，其結(jié) 構(gòu)式如下式所示：
[0061]
[0062] 實(shí)施例7 :8- (5-贓晚戊酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬（化合物7)的合成 陽(yáng)〇6引取0. 3g〇). 0012m〇U化合物3于25血圓底燒瓶中，加入15血邸2化使其全部溶 解后，向裝有3. 7g(0. 018mol)5-(l-贓晚基）戊酷氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后化C 追蹤反應(yīng)2. 5h，用Na肥〇3調(diào)抑值至2-3,并用蒸饋水洗涂3-4次，CH 2化層用無(wú)水化2SO4干 燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油酸/氯仿=20:1)純化，得到化合物7 (澄黃色粉末），產(chǎn)率 75%。
[0064] 對(duì)化合物7進(jìn)行分析，其波譜特性如下： 陽(yáng)0化]iH NMR 巧OOMHz, CDC!3) δ 12. 84(s, 1H), 8. 94(d, J = 8. 4Hz, 1H), 8. 80(d, J =5. 5Hz, IH), 8. 73 (d, J = 7. 9Hz, IH), 8. 64 (d, J = 7. 3Hz, IH), 8. 18 (d, J = 8. 2Hz, IH)，7. 99 - 7. 91 (m, IH)，7. 80 (d, J = 8. 2Hz, IH)，7. 78 - 7. 76 (m, IH)，4. 15 (q, J = 7. 2Hz, 2H)，3. 12 - 3. 00 (m, 2H)，2. 68 (t, J = 7. IHz, 4H)，2. 39 (t, J = 7. IHz, 2H)，1. 92 (dd, J =15. 2, 7.甜z, 4H)，1. 76 - 1. 63 (m, 2H)，1. 28 a, J = 7. IHz, 2H). ESI-MS (m/z) : 414 [M+田 +.
[0066] 因此，可確定上述化合物7為8- (5-贓晚戊酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬，其結(jié) 構(gòu)式如下式所示：
[0067]
W側(cè)實(shí)施例8 :8- (6-贓晚己酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬（化合物8)的合成
[0069] 取0. 3g化0012mol)化合物3于25血圓底燒瓶中，加入15血CH2CI2使其全部溶解 后，向裝有3. 9g(0.0 lSmoU 6-(1-贓晚基）己酷氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后TLC追 蹤反應(yīng)2. 5h，用Na肥〇3調(diào)抑值至2~3,并用蒸饋水洗涂3~4次，CH 2化層用無(wú)水化2SO4 干燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油酸/氯仿=20:1)純化，得到化合物8 (澄黃色粉末），產(chǎn) 率 66%。
[0070] 對(duì)化合物8進(jìn)行分析，其波譜特性如下：
[0071] 電 NMR 巧OOMHz'CDCls) δ 12. 80(s, 1H)，8. 97(dd, J = 8. 4, 1. IHz, 1H)，8. 79(d, J =5. 5Hz，lH)，8. 70(dd，J = 7. 9,1. lHz，lH)，8. 62(dd，J = 7. 3，1.0Hz，lH)，8. 17(dd，J =8. 2, 0. 9Hz, IH), 7. 93 (dd, J = 8. 1, 7. 4Hz, IH), 7. 78 (d, J = 8. IHz, IH) ,1.11 - 7. 73 (m, IH)，2. 99 (s, 2H)，2. 93 - 2. 84 (m, 2H)，2. 61 (t, J = 7. 3Hz, 2H)，1. 97 (m, 6H)，1. 89 (m ,2H), 1. 63 (s, 2H), 1. 54 (m, 2H), 1. 27 (s, 2H). ESI-MS (m/z) : 428 [M+H] 陽(yáng)072] 因此，可確定上述化合物8為8-(6-贓晚己酷氨基）-7H-二苯并哇嘟-7-酬，其結(jié) 構(gòu)式如下式所示：
[0073]
[0074] 為進(jìn)一步說(shuō)明8-取代氧化異阿樸菲衍生物的用途，
【申請(qǐng)人】進(jìn)行了 W下實(shí)驗(yàn)：
[0075] 實(shí)驗(yàn)例1 :8-取代氧化異阿樸菲衍生物體外乙酷膽堿醋酶和下酷膽堿醋酶抑制活 性的測(cè)定
[0076] 應(yīng)用 Ellman (Ellman, G. L. ；Courtney, Κ. D. ；Andres, V. ；et al. Biochem. 化armacol. 1961，7, 88.)的方法測(cè)試化合物對(duì)乙酷膽堿醋酶和下酷膽堿醋酶抑制的IC5。 值。所有測(cè)試都是用Microplate reader ELX808?型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），在37°C 條件下測(cè)定。數(shù)據(jù)分析軟件使用化igin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用化crine作為對(duì)照品。
[0077] 1、抑制劑儲(chǔ)備液的配制：所測(cè)試的抑制劑配成lOmM的DMS0溶液。
[0078] 2、酶儲(chǔ)備液的配制：乙酷膽堿醋酶（從電媛中提取）和下酷膽堿醋酶（從馬的血 漿中提?。┵?gòu)自Sigma公司；用抑=8. 0的憐酸鹽緩沖液分別配成0.1 mg/mL，0. 5mg/mL。
[0079] 3、底物儲(chǔ)備液的配制：乙酷琉基膽堿（乙酷膽堿醋酶底物）和下酷琉基膽堿（下 酷膽堿醋酶底物）購(gòu)自Sigma公司；用抑=8. 0的憐酸鹽緩沖液分別配成2mg/mL，2mg/mL。
[0080] 4、顯色劑儲(chǔ)備液的配制：顯色劑DTNB購(gòu)自Sigma公司；用抑=8. ο的憐酸鹽緩沖 液分別配成4mg/mL和2mg/mL。 陽(yáng)0川 5、測(cè)試海次測(cè)試的體積都為150 μ L的抑=8. 0的憐酸鹽緩沖液。
[0082] 往96孔酶標(biāo)板中加入抑=8. 0憐酸鹽緩沖溶液150 μ L，10 μ L顯色劑儲(chǔ)備液， 10 μ L酶儲(chǔ)備液，再分別加入20 μ L不同濃度抑制劑溶液（用抑=8. 0憐酸鹽緩沖溶液稀 釋抑制劑儲(chǔ)備液），在37°C的酶標(biāo)儀中保溫15min，立即加入20 μ L底物儲(chǔ)備液，混勻后立即 測(cè)其在λ = 420nm處一分鐘吸光度變化（斜率）。參比液為抑=8. 0憐酸鹽緩沖溶液。
[0083] 6、結(jié)果判斷：W未加樣品所測(cè)得的吸光度變化（斜率）作為100個(gè)活力單位； 相對(duì)酶活力=(加入抑制劑的吸光度變化（斜率）/沒(méi)有加入抑制劑的吸光度變化（斜 率））X 100,當(dāng)酶的相對(duì)活力為50時(shí)的抑制劑的濃度即為抑制劑的ICw值。
[0084] 7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0085] 化合物4-8對(duì)乙酷膽堿醋酶和下酷膽堿醋酶抑制活性的ICs。值和抑制的選擇性如 下述表1所示。
[0086] 表1 :化合物4-8對(duì)乙酷膽堿醋酶和下酷膽堿醋酶抑制活性的ICs。值和抑制的選 擇性
[0087]
[0088] a對(duì)乙酷膽堿醋酶的選擇性二1C 5。（下酷膽堿醋酶）/ICs。（乙酷膽堿醋酶）。
[0089] 由表1可知，所合成的8-取代氧化異阿樸菲衍生物（4~8)對(duì)乙酷膽堿醋酶的抑 審iJiCe。值都在微摩爾水平。而對(duì)下酷膽堿醋酶的抑制，也達(dá)到了微摩爾的水平?；衔? 在所有測(cè)試的化合物中具有最高的對(duì)乙酷膽堿醋酶的抑制活性（ICw= 0. 081 μ M)，且其對(duì) 乙酷膽堿醋酶的選擇性大約是對(duì)照品他克林的56倍。
[0090] 實(shí)驗(yàn)例2 :8-取代氧化異阿樸菲衍生物對(duì)Αβ42轉(zhuǎn)基因果蛹腦內(nèi)乙酷膽堿醋酶的 抑制活性測(cè)定
[0091] 將各組果蛹同時(shí)飼養(yǎng)25天，每種取100只雄果蛹，顯微鏡下切下腦部，液氮研磨， 加入400 μ 1生理鹽水，在冰水浴中W 3000r/min勻漿10s，反復(fù)進(jìn)行3次，制成組織勻漿； 再W eOOOr/min離屯、lOmin，取上清液。按CHE測(cè)定試劑盒說(shuō)明操作。 陽(yáng)09引結(jié)果：化合物4-8對(duì)Αβ 42轉(zhuǎn)基因果蛹腦內(nèi)乙酷膽堿醋酶的抑制活性如圖1所示。 [009引實(shí)驗(yàn)例3 :8-取代氧化異阿樸菲衍生物對(duì)Αβ 42自誘導(dǎo)聚集的抑制活性測(cè)定 [0094] 1.溶液的配制 陽(yáng)0巧](1) 0. 215Μ抑8. 0憐酸鹽緩沖溶液：向500血0. 215Μ胞2冊(cè)0冰溶液中緩慢滴加 0. 215M NaH2P〇4水溶液，攬拌混勻，用抑計(jì)將溶液抑值調(diào)至8. 0,存儲(chǔ)于4°C備用；
[0096] 似用HFIP使A 0 (1-蝴單體化（2mg/mU :稱取0. 2mg A 0溶于4°C的HFIP，定 容至100 μ L ;室溫解育60min，然后將A M1-42) /HFIP溶液于4°C靜置lOmin，再使其在室 溫下自然揮發(fā)，過(guò)夜；真空冷凍干燥除去剩余的HFIP ;
[0097] (3) 2mM A 0 (1-蝴/DMSO儲(chǔ)備溶：將冷凍干燥后的A 0溶于DMSO溶液，配制成2mM 的儲(chǔ)備液，靜置于4°C備用； 陽(yáng)09引 （4) 1. 5 μ Μ硫黃素 T溶液：稱取一定量的硫黃素 T用lOmM抑8. 5甘氨酸-NaOH緩 沖溶液配置成1. 5 μ Μ硫黃素 T儲(chǔ)備液，存儲(chǔ)于4°C備用；
[0099] 巧）ImM抑制劑溶液：用0. 215M P冊(cè).0憐酸鹽緩沖溶液將lOmM的樣品DMS0儲(chǔ)備 液稀釋至ImM的待測(cè)液。
[0100] 2.化合物對(duì)A β 42自誘導(dǎo)聚積抑制作用分析方法 陽(yáng)101] 取2 W L Λ 0(1-4。儲(chǔ)備液分別加人16 W L的緩沖溶液和2 W L的抑審。齊1]溶液（抑 制劑的最終濃度為10 μΜ)，混勻，37°C共同解育化；然后加入180 μ L 1. 5 μΜ硫黃素 Τ的 甘氨酸-NaOH溶液混勻后，立即在446nm激發(fā)波長(zhǎng)和490nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定其巧光值；W 0.215M pH 8.0憐酸鹽緩沖溶液為參比，并設(shè)置A β加緩沖液作為空白；存在抑制劑時(shí)巧光 值為巧(Α β +Α化Ε+抑制劑），無(wú)抑制劑下的巧光值為化(Α β +Α化Ε)，化合物的抑制率= l〇〇-[(IFi/IF0) Χ100]。
[0102] 結(jié)果：化合物4-8對(duì)A042自誘導(dǎo)聚集的抑制率如下述表2所示： 陽(yáng)10引表2 :化合物4-8對(duì)Αβ 42自誘導(dǎo)聚集的抑制 陽(yáng) 104]
陽(yáng)1化]3Αβ 42濃度為20 μ mol · L 1，化合物濃度為10 μ mol · L 1，每個(gè)化合物至少平行測(cè) 試Ξ次，結(jié)果表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 陽(yáng)106] 實(shí)驗(yàn)例4 :8-取代氧化異阿樸菲衍生物對(duì)SH-SY5Y-APPsw細(xì)胞A β 42的抑制活性測(cè) 定 陽(yáng)107] 1.細(xì)胞培養(yǎng)：將甜-SY5Y-APPsw細(xì)胞培養(yǎng)于含有W = 10% FBS和W = 1 %青鏈霉 素的DMEM培養(yǎng)液中，在37°C、q)=5%C02、100%飽和相對(duì)濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度超過(guò)80 %時(shí)，用W = 0. 25 %膜蛋白酶消化傳代。 陽(yáng)108] 2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后W 1 X 106個(gè)/血的濃度接種于6孔板。24h后加 入終濃度為1 μ mol/L的藥物，另設(shè)只加0. 1 % DMS0的對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24h后分 別收集細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C、12000r/min離屯、5min后取上清，將上清置于-20°C保存。 陽(yáng)109] 3.按照試劑盒的說(shuō)明將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、加樣（分別設(shè)空白孔與待測(cè)樣品孔）、溫 育、配洗涂液、洗涂、加入酶標(biāo)試劑（空白孔除外）、再溫育、再洗涂、加入顯色劑避光顯色 15min、每孔加入50 μ L的終止液終止反應(yīng)、用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）。 [0110] 結(jié)果：化合物4-8對(duì)甜-SY5Y-APPsw細(xì)胞A 0 42的抑制如圖2所示。 陽(yáng)111 ] 實(shí)驗(yàn)例5 :8-取代氧化異阿樸菲衍生物對(duì)甜-SY5Y細(xì)胞毒性的測(cè)定
[0112] 1.細(xì)胞培養(yǎng)：將甜-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含有W = 10% FBS和W = 1%青鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)液中，在37°C、(()=5%C02、100%飽和相對(duì)濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度超過(guò)80 %時(shí)，用W = 0. 25 %膜蛋白酶消化傳代。
[0113] 2. MTT法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)活力：藥物對(duì)細(xì)胞生存能力的影響可用MTT試驗(yàn)檢測(cè)。取對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，W 1 X 104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔含200 μ 1培養(yǎng)基， 24h后，加入終濃度為50和100 μ mol/L的藥物，另設(shè)只加0. 1 % DMS0的對(duì)照組，每一個(gè)濃 度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。24h后，每孔加入20 μ 1濃度為5mg/ml的MTT，作用4-化，棄去液體，每孔 加入150 μ 1的DMS0,于搖床上振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（0D值）。 各加藥組與對(duì)照組相比得到的數(shù)值即代表細(xì)胞的相對(duì)活力（Cell Vi油ility)。
[0114] 結(jié)果如下述表3所示：
[0115] 表3 :化合物4-8對(duì)甜-SY5Y細(xì)胞的毒性 陽(yáng)116] 陽(yáng)117]
[0118] 實(shí)驗(yàn)例6 :8-取代氧化異阿樸菲衍生物的血腦屏障透過(guò)能力測(cè)定
[0119] 血腦屏障平行人工膜滲透模型（Parallel artificial membrane permeation assay for Blood-Brain Barrier, PAMPA-BBB)的實(shí)驗(yàn)裝置如圖3所示：上層板由聚四氣 乙締和池底的聚偏氣乙締（PVD巧多孔過(guò)濾膜構(gòu)成，實(shí)驗(yàn)中將不同的憐脂溶于鏈燒中使 其均勻分布于PVDF膜上形成模擬生物膜，然后向池內(nèi)注入相應(yīng)的緩沖溶液作為受體池 (Acc巧tor plates);下層的供體池值onor plates)加入一定體積的樣品溶液后將制備好 的受體池轉(zhuǎn)移至供體池中，使憐脂膜與供體液相互接觸形成明治"結(jié)構(gòu)一一上層為受體 池，中間為人工憐脂膜，底部為待測(cè)藥物的供體液。
[0120] 藥物分子通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散從供體池中透過(guò)模擬生物膜進(jìn)入上層受體池中（見(jiàn)圖 3)，擴(kuò)散完畢后，分別移取受體液和供體液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度[化Ug]A。。。。,。^和 [化ug]。。。"，根據(jù)公式算得藥物的有效透過(guò)率：
[0121]
[0122] 其中，Vd為供體池中化合物待測(cè)液的體積；V A為受體池中緩沖液的體積；A為多 孔過(guò)濾的有效面積（cm2) ;t為擴(kuò)散時(shí)間（S);[化Ug]AeeeptDr為受體池中藥物的濃度；[化Ug] equilibrium為藥物的理論吸收濃度；Pe的單位為cm S 1。
[0123] 表4 :9個(gè)市售藥物的PAMPA-BBB實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)值 陽(yáng) 124]
陽(yáng) 1巧]a來(lái)至參考文獻(xiàn)：Di L ;Ke;rns E. H. ;Fan K. ;et al. Hi曲 t虹OU曲put artificial membrane permeability 曰ss曰y for blood-br曰in b曰rrier[J]. Eur. J. Med. Chem. 2003, 38(3) :223-232. 陽(yáng)126] b實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為至少立次平行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值
[0127] 表4為采用豬腦憐脂提取物模擬人腦內(nèi)憐脂膜建立的PAMPA-BBB模型。通過(guò)檢測(cè) 9個(gè)市售的藥物的血腦屏障透過(guò)率與文獻(xiàn)值對(duì)比，得到相關(guān)性方程：y = 0. 866X+0. 7068 (R2=0. 9408)(如圖4所示）。根據(jù)相關(guān)性方程和Di等人建立的評(píng)價(jià)條件，我們對(duì)化合物的血 腦屏障透過(guò)能力可作如下定義：
[0128] (a) 'CNS+'（能夠透過(guò)血腦屏障）：化（10 6畑1 S 1)〉4. 2 ; 陽(yáng)129] 化）'CNS-，（不能夠透過(guò)血腦屏障）：Pe(l〇6cm si)<2. 5; 陽(yáng)130] (C) 'CNS+/-'（無(wú)法確定是否能夠透過(guò)血腦屏障）：Pe(l〇 6畑1 S 1) :2. 5~4. 2 ; 陽(yáng)131] 1.溶液的配制 陽(yáng)13引 1)0. 1M抑7. 4憐酸鹽緩沖溶液牌巧：向500血0. 1M胞2冊(cè)0冰溶液中緩慢滴加 0. 1M NaHzPO冰溶液，攬拌混勻，用抑計(jì)將溶液抑值調(diào)至7. 4,存儲(chǔ)于4°C備用； 陽(yáng)13引 。20mg/ml十二燒/P化溶液：稱取20mg P化溶于十二燒中，定容至1. 0血；
[0134] 3) 25 μ g/ml樣品待測(cè)溶：稱取一定量的樣品用DMS0配制成5mg/ml的儲(chǔ)備液，然 后用PBS:乙醇（9:1，體積比）溶液稀釋200倍，即得到25 μ g/ml樣品待測(cè)溶液；
[0135] 2.化合物血腦屏障透過(guò)能力的分析方法
[0136] 取4μΙ 20mg/ml 十二燒/P化溶液均勻分布于96#Multi-well Filter plate 的聚 偏氣乙締膜上制成憐脂膜，然后將配好的PBS:乙醇巧：1，體積比）溶液300 μΙ加入到受 體池中；取300 μ L已配好的25 μ g/ml樣品待測(cè)溶加入到供體池中，然后將其靜置于不受干 擾的地方，再將已制備好的受體池緩慢地移至供體池內(nèi)，形成"Ξ明治"結(jié)構(gòu)；25°C下靜于被 動(dòng)擴(kuò)散lOh ;擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)完畢后，將受體池從供體池中小屯、取出，并將供體池和受體池的溶液 分別移至96#UV透射板內(nèi)，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度[化Ug]DD"Df和[化Ug] Accepts; 根據(jù)公式1，計(jì)算出化合物的PAMPA-BBB有效滲透率化值，并w 9個(gè)市售藥物的實(shí)驗(yàn)值和文 獻(xiàn)值標(biāo)定化合物BBB有效透過(guò)率的可靠性。
[0137] 化合物4-8的血腦屏障透過(guò)率如下述表5所示：
[0138] 表5 :化合物4-8的血腦屏障透過(guò)率 陽(yáng) 139]
陽(yáng) 140] a 乂NS+'（能透過(guò)血腦屏障）：Pe(10 6畑1 · S 1)〉4. 2 ; 陽(yáng)1川 乂NS-'（不能透過(guò)血腦屏障）：Peαo6cm·sl)<2.5; 陽(yáng)14引 乂NS+/-'（不確定）：Pe(l〇 6畑1 · S 1)在2. 5和4. 2之間 陽(yáng)143] 通過(guò)體內(nèi)外乙酷膽堿醋酶的抑制實(shí)驗(yàn)，證明了本發(fā)明的8-取代氧化異阿樸菲衍 生物對(duì)乙酷膽堿醋酶具有很強(qiáng)的抑制活性。體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)A化E抑制的ICs。值達(dá)到微摩爾 水平，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，化合物能有效抑制A β 42轉(zhuǎn)基因果蛹腦內(nèi)的乙酷膽堿醋酶，特別是化 合物5和6,它們能使轉(zhuǎn)基因果蛹腦內(nèi)的乙酷膽堿醋酶降低到正常果蛹水平，甚至更低。同 時(shí)，無(wú)論在體外實(shí)驗(yàn)還是細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，化合物都表現(xiàn)出明顯的抑制A β 42聚集的活性?；?合物的毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，大部分化合物的對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性ICs。值在100 μ mol · L 1 左右，其毒性較少。血腦屏障透過(guò)率實(shí)驗(yàn)表明了化合物具有一定的透過(guò)血腦屏障的能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述式（I)所示結(jié)構(gòu)的8-取代氧化異阿樸菲衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在 制備A β聚集抑制劑藥物中的應(yīng)用；其中，η = 1~5。2. 具有下述式（I)所示結(jié)構(gòu)的8-取代氧化異阿樸菲衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在 制備同時(shí)具有抑制乙酰膽堿酯酶和抗Αβ聚集的藥物中的應(yīng)用；其中，η = 1~5。
【文檔編號(hào)】A61K31/473GK105998022SQ201510525955
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2015年8月25日
【發(fā)明人】唐煌, 衛(wèi)沈旗, 陳薇
【申請(qǐng)人】廣西師范大學(xué)