天山堇菜抗腫瘤提取物及其組合物的制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種維吾爾藥天山堇菜抗腫瘤提取物及其組合物的制備方法和其在制備預(yù)防及治療腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞株藥物中的應(yīng)用。維吾爾藥天山堇菜經(jīng)有機(jī)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用體積比100:17的石油醚：乙酸乙酯洗脫，繼用體積比100:20的石油醚：乙酸乙酯洗脫，石油醚：乙酸乙酯100:20洗脫液干燥后即得；或先用體積比100:25石油醚：乙酸乙酯洗脫，繼用體積比100：50的石油醚：乙酸乙酯洗脫，石油醚：乙酸乙酯100：25-100:50，收集100：25-100：50的洗脫液，回收有機(jī)溶劑，干燥即得。
【專利說明】
天山堇菜抗腫瘤提取物及其組合物的制備方法和醫(yī)藥應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種維吾爾藥天山堇菜抗腫瘤提取物及其組合 物的制備方法和其在制備預(yù)防或/和治療腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、 宮頸癌、肝癌等惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 本品為堇菜科植物天山堇菜，學(xué)名Viola tianschanica Maxim.，堇菜科植物 Violaceae天山堇菜的全草。分布于新疆等地。主根圓柱狀或倒長(zhǎng)圓錐形，黃白色。葉基 生。根狀莖短，垂直，比較粗，根黃色或淡褐色。無地上莖和匍匐枝。蒴果卵形，光滑?；ㄆ?6-7月，果期7-8月。
[0003] 天山堇菜功效祛風(fēng)清熱；解毒消腫。主感冒發(fā)熱；疔瘡癰腫；淋巴結(jié)腫大，眼睛腫 痛，腸炎，痢疾等；外敷治療瘡腫毒。
[0004] 本發(fā)明通過系統(tǒng)地篩選研究，意外地發(fā)現(xiàn)天山堇菜提取物具有顯著抗腫瘤活性， 即天山堇菜提取物對(duì)乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫 瘤的具有很好的預(yù)防及治療作用，可以應(yīng)用于癌癥的預(yù)防和治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種天山堇菜提取物，該提取物具有抗腦膠質(zhì) 瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、肝癌等惡性腫瘤的作用。
[0006] 本發(fā)明還提供了以天山堇菜提取物作為活性成分的藥物組合物及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 維吾爾藥天山堇菜經(jīng)甲醇超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠 柱，用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑=100 : 100梯度洗脫（石油醚：乙酸乙酯，具體比 例見表1)，各石油醚：乙酸乙酯比例混合溶劑洗脫液，濃縮，干燥后，利用體外抗腫瘤活性 篩選體系測(cè)試其抗腫瘤活性，意外地發(fā)現(xiàn)先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸 乙酯，100 :0-100:17,體積比）洗脫，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯， 100:20,體積比）洗脫，石油醚：乙酸乙酯100:20洗脫液干燥后，具有顯著地抗腫瘤活性，而 其他比例的洗脫部位，沒有抗腫瘤活性。即，抗腫瘤活性的化合物，可以通過以上方法，得到 富集，從而與其他雜質(zhì)類成分分離開。該活性部位從未見文獻(xiàn)報(bào)道，其100 :20洗脫液的TLC 分析表征如圖1，TLC分析條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：丙酮：乙酸乙酯（6:1:1) 顯色方法：香草醛-硫酸顯色。
[0009] 或維吾爾藥天山堇菜經(jīng)甲醇超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅 膠柱，用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫（石油醚：乙酸乙酯，具體比例見表1)，各石 油醚：乙酸乙酯比例混合溶劑洗脫液，濃縮，干燥后，利用體外抗腫瘤活性篩選體系測(cè)試其 抗腫瘤活性，意外地發(fā)現(xiàn)先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:25,體積 比）洗脫，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100 :30-100:50,體積比）洗 脫，石油醚：乙酸乙酯100 :30-100:50,具有顯著地抗腫瘤活性，而其他比例的洗脫部位，沒 有抗腫瘤活性。即，抗腫瘤活性的化合物，可以通過以上方法，得到富集，從而與其他雜質(zhì)類 成分分離開。該活性部位從未見文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)石油醚：乙酸乙酯=100:50時(shí)，其TLC分析表 征如圖2,TLC分析條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：丙酮：乙酸乙酯（6:1:1)顯色方 法：香草醛-硫酸顯色。
[0010] 具體，發(fā)現(xiàn)過程如下：
[0011] 1、天山堇菜經(jīng)甲醇超聲提取物的制備
[0012] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，得提取物 SN0020A 2.6915g，留樣 0.6915g。
[0013] 2、石油醚：乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫方法和結(jié)果
[0014] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，得提取物 SN0020A 2. 6915g，留樣0. 6915g。上柱，甲醇溶解，共用甲醇15ml。上硅膠柱色譜，拌樣硅 膠2g，空白硅膠10g，玻璃柱內(nèi)徑2. 0cm，石油醚：乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫（石油醚：乙酸乙 酯，體積比，見表1)，每個(gè)梯度洗脫200ml，得到，各個(gè)濃度提取洗脫液的洗脫物，回收溶劑， 即得，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脫提取物，TLC分析結(jié)果見圖3。色譜條件：GF 254硅膠板，展 開系統(tǒng)：石油醚：丙酮：乙酸乙酯=6:1:1，顯色方法：香草醛濃硫酸顯色。
[0015] 表 1

[0018] 3、抗腫瘤活性篩選方法和結(jié)果
[0019] 1)實(shí)驗(yàn)條件
[0020] a)細(xì)胞株信息
[0021] 大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6購于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫。
[0022] b)藥品及試劑
[0023] 樣品無菌條件下，DMSO溶解配置成母液濃度為100mg/mL，使用時(shí)用RPMI-1640培 養(yǎng)液稀釋至所需濃度（DMSO彡1%。）。
[0024] RPMI Medium 1640培養(yǎng)基干粉購于美國(guó)GIBCO公司。胎牛血清購于北京元亨圣馬 生物技術(shù)研究所。Trypsin 1:250、二甲基二苯基四氮唑溴鹽（MTT)。
[0025] c)儀器
[0026] CO2培養(yǎng)箱（SANYO,日本）
[0027] 垂直層流潔凈工作臺(tái)（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）
[0028] 倒置生物顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）
[0029] 低/高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）
[0030] 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）
[0031] 酶標(biāo)儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）
[0032] 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）
[0033] 鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）
[0034] PH 計(jì)（SART0RIUS，德國(guó)）
[0035] 2)實(shí)驗(yàn)方法和過程
[0036] 大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6以4000/孔的密度鋪于96孔板，每孔IOOul，12h后使用。 各組分以DMSO溶解為lOOmg/mL儲(chǔ)存液，保存于-20°C待用。鋪板后12h，觀察細(xì)胞匯合率 約為40%，加藥，濃度均為100 μ g/mL，每個(gè)組分3個(gè)復(fù)孔。每板細(xì)胞設(shè)立二個(gè)對(duì)照組（培 養(yǎng)基+細(xì)胞；含〇. 1 % DMSO培養(yǎng)基+細(xì)胞），3個(gè)空白孔（只有培養(yǎng)基）。加入藥物24小 時(shí)后，加入20 μ 1四甲基偶氮唑鹽化學(xué)名為3-(4, 5-二甲基噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽 (3_(4, 5-dimethyl_2thiazolyl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide，ΜΤΤ)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時(shí)。完全棄去上清液，加入100 μ I DMSO,混勻使MTT完全溶解，去氣泡。490nm測(cè)定OD 值。
[0037]
[0038] 3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0039] 表 2
[0044] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：維吾爾藥天山堇菜經(jīng)有機(jī)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分 離，上樣后的硅膠柱，先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:17,體積比） 洗脫，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100 :20,體積比）洗脫，石油醚： 乙酸乙酯100 :20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，得到高活性提取物，即為該抗腫瘤的提取 物。該活性部位從未見文獻(xiàn)報(bào)道，其100 :20洗脫液的TLC分析表征如圖1。
[0045] 維吾爾藥藥天山堇菜經(jīng)有機(jī)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后 的硅膠柱，先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:25,體積比）洗脫，繼 用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100 :50,體積比）洗脫，石油醚：乙酸乙 酯100 :50洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，得到高活性提取物，即為該抗腫瘤的提取物。該活 性部位從未見文獻(xiàn)報(bào)道，其100 :50洗脫液的TLC分析表征如圖2。
[0046] 4、抗腫瘤有效提取物的提取方法研究
[0047] 1)提取溶劑的種類研究
[0048] 分別用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑等有 機(jī)溶劑提取，并測(cè)試提取物的對(duì)C6細(xì)胞的抗腫瘤活性，結(jié)果如下：
[0049]表 3
[0051] 研究結(jié)果表明：提取用有機(jī)溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水 混合溶劑、乙醇水混合溶劑。
[0052] 2)提取溶劑的用量研究
[0053] 分別用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/體積比）有機(jī)溶劑提取，并測(cè)試提取物 對(duì)C6細(xì)胞的抗腫瘤活性，結(jié)果如下：
[0054] 表 4

[0057] 提取物提取用有機(jī)溶劑用量為藥材重量的2-50倍（重量/體積比）。
[0058] 3)干燥方法的研究
[0059] 分別用真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等方法，對(duì)得到 的抗腫瘤活性部位進(jìn)行干燥，以含水量、TLC、活性測(cè)試為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)真空干燥法、冷凍干燥 法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法適用于對(duì)C6細(xì)胞的抗腫瘤活性提取物進(jìn)行干燥，其 中，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。
[0060] 表 5
[0062] 因此，天山堇菜抗腫瘤提取物的制備方法為：
[0063] 維吾爾藥天山堇菜經(jīng)有機(jī)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的 硅膠柱，先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:17,體積比）洗脫2-50倍 柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:20，體積比）洗脫2-50倍 柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥即為該提取物。以上條件最 優(yōu)為先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:17,體積比）洗脫15倍柱體 積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:20,體積比）洗脫20倍柱體 積。
[0064] 維吾爾藥天山堇菜經(jīng)甲醇超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠 柱，用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:25,體積比）洗脫2-50倍柱體 積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:50,體積比）洗脫2-50倍柱 體積。石油醚：乙酸乙酯100:200洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥即為該提取物。以上條件最 優(yōu)為先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:25,體積比）洗脫25倍柱體 積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100 :50,體積比）洗脫35倍柱體 積。其中，
[0065] 1)提取物提取用有機(jī)溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶 劑、乙醇水混合溶劑，最優(yōu)條件為甲醇和95%乙醇。提取物提取用有機(jī)溶劑用量為藥材重量 的2-50倍（重量/體積比）。
[0066] 2)提取物干燥方法可以為真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干 燥法等，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。
[0067] 5.天山堇菜抗腫瘤有效提取物（洗脫液為100 :20時(shí)干燥獲得的提取物）的抗腫 瘤活性研究
[0068] 利用各種腫瘤細(xì)胞，如腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、肝 癌等惡性腫瘤細(xì)胞株，分別測(cè)試天山堇菜抗腫瘤提取物的抗腫瘤活性，IC 5。結(jié)果如下：
[0069] 表 6
[0071] 因此，我們發(fā)現(xiàn)，天山堇菜抗腫瘤提取物具備抗腫瘤活性，可望用于各種腫瘤如腦 膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞株的預(yù)防及治 療。
[0072] 6、天山堇菜抗腫瘤有效提取物的組合物及其制備方法研究
[0073] 1)固體分散體
[0074] 處方
[0076] 制備方法：
[0077] 稱取天山堇菜提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的質(zhì)量 比分別放入燒杯中，加入無水乙醇，磁力攪拌器攪拌至天山堇菜提取物和載體完全溶解，轉(zhuǎn) 入旋蒸儀中除去有機(jī)溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得天山堇菜提取物PVP包合物。
[0078] 2)環(huán)糊精包合物
[0079] 處方：
[0081] 制備方法：
[0082] 將β -環(huán)糊精與1~5倍水研勻，加天山堇菜提取物（水難溶性的應(yīng)先溶于少量 有機(jī)溶劑中）充分研磨至成糊狀物，低溫干燥即得。
[0083] 3)分散片處方：
[0085] 制備方法：
[0086] 1.天山堇菜提取物淀粉分散體的制備，精密稱取天山堇菜提取物，加入適量的 十二烷基硫酸鈉，用70%的乙醇溶解加入等比例的可溶性淀粉混合均勻后，在70°C的溫度 下蒸干，粉碎，過100目篩；
[0087] 2.稱取處方量，天山堇菜提取物淀粉分散體，交聯(lián)聚維酮，預(yù)膠化淀粉，用70%乙 醇做濕潤(rùn)劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過14目篩，室溫下放置15min后，60°C烘箱烘干 45min，16目篩整粒，加入滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片。
[0088] 7、天山堇菜抗腫瘤有效提取物的檢測(cè)方法研究
[0089] 我們發(fā)現(xiàn)，可以用薄層色譜的方法，很好地檢測(cè)和標(biāo)示天山堇菜抗腫瘤有效提取 物的特征。見圖1、圖2。
[0090] 具體條件為：色譜條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：丙酮：乙酸乙酯（3:1:1) 顯色方法：香草醛-硫酸顯色。
【附圖說明】：
[0091 ] 圖1天山堇菜C6抑制活性提取物的TLC色譜圖；
[0092] 圖2天山堇菜C6抑制活性提取物的TLC色譜圖；
[0093] 圖3天山堇菜得到的化學(xué)組分的TLC色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0094] 以下實(shí)施例表示本發(fā)明的實(shí)用性，本發(fā)明不受此限制。
[0095] 實(shí)施例1 :
[0096] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱 分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸 乙酯，100:17,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙 酯，100:20,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑， 真空干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 019%。
[0097] 實(shí)施例2 :
[0098] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL乙醇超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱 分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸 乙酯，100:17,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙 酯，100:20,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑， 冷凍干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 075%。
[0099] 實(shí)施例3 :
[0100] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL丙酮超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱 分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸 乙酯，100:17,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙 酯，100:20,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑， 鼓風(fēng)干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 026%。
[0101] 實(shí)施例4:
[0102] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL氯仿超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱 分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸 乙酯，100:17,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙 酯，100:20,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑， 離心干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 014%。
[0103] 實(shí)施例5 :
[0104] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL乙酸乙酯超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅 膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚： 乙酸乙酯，100:17,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙 酸乙酯，100:20，體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶 劑，旋蒸干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 022%。
[0105] 實(shí)施例6 :
[0106] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL甲醇水混合溶劑（甲醇：水=1:1)超聲提取 15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙 酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:17,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙 酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:20,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙 酯100:20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的 提取物，收率為0.026%。
[0107] 實(shí)施例7 :
[0108] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=1:1)超聲提取 15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙 酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:17,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙 酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:20,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙 酯100:20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，真空干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的 提取物，收率為0.017%。
[0109] 實(shí)施例8 :
[0110] 取維吾爾藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=90:10)超聲提 取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚： 乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:17,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙 酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:20,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙 酯100:20洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的 提取物，收率為0.010%。
[0111] 實(shí)施例9:
[0112] 取維吾爾藥藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠 柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙 酸乙酯，100:25,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙 酸乙酯，100:50，體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:50洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶 劑，真空干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 6%。
[0113] 實(shí)施例10 :
[0114] 取維吾爾藥藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL乙醇超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠 柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙 酸乙酯，100:25,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙 酸乙酯，100:50，體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:50洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶 劑，冷凍干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 44%。
[0115] 實(shí)施例11 :
[0116] 取維吾爾藥藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL丙酮超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠 柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙 酸乙酯，100:25,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙 酸乙酯，100:50，體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:50洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶 劑，鼓風(fēng)干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 27%。
[0117] 實(shí)施例12 :
[0118] 取維吾爾藥藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL氯仿超聲提取15min，提取液濃縮后，用硅膠 柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙 酸乙酯，100:25,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙 酸乙酯，100:50，體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:50洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶 劑，離心干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 19%。
[0119] 實(shí)施例13 :
[0120] 取維吾爾藥藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL乙酸乙酯超聲提取15min，提取液濃縮后， 用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油 醚：乙酸乙酯，100:25,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙酸乙酯混合溶劑（石油 醚：乙酸乙酯，100:50,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙酯100:50洗脫液經(jīng)回收 有機(jī)溶劑，旋蒸干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的提取物，收率為0. 23%。
[0121] 實(shí)施例14:
[0122] 取維吾爾藥藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL甲醇水混合溶劑（甲醇：水=1:1)超聲提 取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚： 乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:25,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙 酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:50,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙 酯100:50洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的 提取物，收率為0.41 %。
[0123] 實(shí)施例15 :
[0124] 取維吾爾藥藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=1:1)超聲提 取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚： 乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:25,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙 酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:50,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙 酯100:50洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，真空干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的 提取物，收率為0.36%。
[0125] 實(shí)施例16 :
[0126] 取維吾爾藥藥天山堇菜20g，經(jīng)100mL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=90:10)超聲提 取15min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2. Ocm內(nèi)徑小柱），先用石油醚： 乙酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:25,體積比）洗脫15倍柱體積，繼用石油醚：乙 酸乙酯混合溶劑（石油醚：乙酸乙酯，100:50,體積比）洗脫20倍柱體積，石油醚：乙酸乙 酯100:50洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，得到的高活性提取物，即為該C6抑制活性的 提取物，收率為0.24%。
[0127] 實(shí)施例17 :固體分散體
[0128] 稱取天山堇菜提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的質(zhì)量 比分別放入燒杯中，加入無水乙醇，磁力攪拌器攪拌至天山堇菜提取物和載體完全溶解，轉(zhuǎn) 入旋蒸儀中出去有機(jī)溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得天山堇菜提取物PVP包合物。
[0129] 實(shí)施例18 :環(huán)糊精包合物
[0130] 將β -環(huán)糊精與1~5倍水研勻，加天山堇菜提取物（水難溶性的應(yīng)先溶于少量 有機(jī)溶劑中）充分研磨至成糊狀物，低溫干燥即得。
[0131] 實(shí)施例19 :分散片
[0132] 1.稱取干燥的天山堇菜提取物，加入適量的十二烷基硫酸鈉，使用70%的乙醇充 分溶解，加入水溶性淀粉與天山堇菜提取物（1 :1)，攪拌混合均勻，在70°c下干燥，粉碎，過 100目篩，得天山堇菜提取物分散體。
[0133] 2.精密稱取處方量，天山堇菜提取物分散體，交聯(lián)聚維酮，可壓性淀粉，用70% 乙醇做濕潤(rùn)劑，邊加入邊攪拌，14目篩制成濕顆粒，室溫下放置15min后，70°C烘箱烘干 45min，16目篩整粒，加入滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種維吾爾藥天山堇菜提取物，其特征為，維吾爾藥天山堇菜經(jīng)溶劑超聲提取，提取 液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用體積比為100:0-100:17的石油醚-乙酸乙 酯混合溶劑洗脫，繼用體積比100 :20的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，用體積比為100 : 20的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫的洗脫液經(jīng)回收溶劑，干燥即為該提取物。2. 或先用體積比為100:25的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，繼用體積比100 : 30-100:50的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，用體積比為100 :30-100:50的石油醚-乙 酸乙酯混合溶劑洗脫的洗脫液經(jīng)回收溶劑，干燥即為該提取物。3. 如權(quán)利要求1所述的維吾爾藥天山堇菜提取物，其特征為，提取用溶劑為甲醇、乙 醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑或乙醇水混合溶劑，優(yōu)選甲醇或95%乙醇。4. 如權(quán)利要求1所述的維吾爾藥天山堇菜提取物，其特征為，先用石油醚-乙酸乙酯 混合溶劑(石油醚：乙酸乙酯，100:17,體積比）洗脫，繼用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑(石油 醚：乙酸乙酯，100:20,體積比）洗脫，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑(石油醚-乙酸乙酯， 100:20,體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收溶劑，干燥即為該提取物； 或用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑(石油醚：乙酸乙酯，100:25,體積比）洗脫，繼用石油 醚-乙酸乙酯混合溶劑(石油醚：乙酸乙酯，100:50,體積比)洗脫，用石油醚-乙酸乙酯混合 溶劑(石油醚-乙酸乙酯，100:50,體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收溶劑，干燥即為該提取物。5. 如權(quán)利要求1所述的維吾爾藥天山堇菜提取物，其特征為，先用體積比為 100:0-100:17的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑2-50倍洗脫，繼用體積比100 :20的石油 醚-乙酸乙酯混合溶劑2-50倍洗脫，優(yōu)選先用體積比為100:0-100:17的石油醚-乙酸乙 酯混合溶劑10倍洗脫，繼用體積比100 :20的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑15倍洗脫。6. 如權(quán)利要求1所述的維吾爾藥天山堇菜提取物，其特征為，先用體積比100:25的石 油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫2-50倍柱體積，繼用體積比100:30-100:50的石油醚-乙酸 乙酯混合溶劑洗脫2-50倍柱體積，優(yōu)選先用體積比100:25的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑 洗脫10倍柱體積，繼用體積比100:50的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫15倍柱體積。7. -種藥物組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的提取物和藥學(xué)上 可接受的載體。8. -種藥物制劑，其特征在于，包含權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的提取物或權(quán)利要求6 所述的藥物組合物。9. 權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的天山堇菜提取物或權(quán)利要求6所述的組合物或權(quán)利要 求7所述的藥物制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。10. 如權(quán)利要求8所述維吾爾藥天山堇菜提取物，其特征為，所述腫瘤為乳腺癌、肺癌、 胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、腦膠質(zhì)瘤或肝癌。11. 權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的一種維吾爾藥天山堇菜提取物，其特征在于，用TLC 法檢測(cè)，其色譜條件為：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：石油醚：丙酮：乙酸乙酯（6:1:1)顯色方法： 香草醛-硫酸顯色。
【文檔編號(hào)】A61K36/86GK105983022SQ201510079796
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月15日
【發(fā)明人】王金輝, 黃健, 焦佳媛
【申請(qǐng)人】沈陽藥科大學(xué)