具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法與應(yīng)用。該制備方法先將辣木干葉粉加入乙醇溶液進(jìn)行超聲提??；依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)提取濃縮液進(jìn)行分級(jí)萃取；將萃取液進(jìn)行減壓濃縮、真空冷凍干燥得到粉末A；將粉末A溶于乙醇中，過聚酰胺樹脂層析柱，采用乙醇溶液依次進(jìn)行梯度洗脫，冷凍干燥得粉末B；將粉末B溶于甲醇中，過葡聚糖凝膠LH‐20層析柱，甲醇洗脫，收集合并洗脫液，濃縮、冷凍干燥得粉末C；將粉末C溶于甲醇中，用制備液相反相C18柱進(jìn)行梯度洗脫，收集30％～35％甲醇洗脫出來的化合物峰，濃縮、冷凍干燥。所得黃酮粉末純度達(dá)99％以上，具有較強(qiáng)的抗補(bǔ)體和α‐葡萄糖苷酶抑制活性。
【專利說明】
具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種辣木葉黃酮，特別是涉及一種具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉 黃酮及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣木(Moringa oleifera Lam.)，又稱鼓槌樹、馬蘿卜、不死樹、蘿卜樹等，為辣木科 辣木屬熱帶落葉木本蔬菜及油料作物。原產(chǎn)于印度北部喜馬拉雅山麓及非洲，在亞洲、非洲 的熱帶和亞熱帶地區(qū)有較長(zhǎng)的種植歷史，共14個(gè)品種，目前供食用栽培的只有印度傳統(tǒng)辣 木、印度改良種辣木和非洲辣木三個(gè)品種。近年來，辣木在我國云南、廣東、福建、臺(tái)灣等地 得到了廣泛的引種栽培，其產(chǎn)品的開發(fā)也成為了熱點(diǎn)。
[0003] 辣木含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、脂肪、碳水化合物等，是傳統(tǒng)的食物和藥 物來源。在非洲的一些農(nóng)村地區(qū)也常用辣木粉做凈水劑，得到純凈的飲用水。辣木葉被廣泛 食用，特別是在印度、菲律賓群島、夏威夷及部分非洲國家，將其作為高營(yíng)養(yǎng)蔬菜的補(bǔ)充。古 印度的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為辣木葉有護(hù)肝、利尿、消炎、止痛、降壓、強(qiáng)心、催欲等功效，常用來預(yù)防 和治療糖尿病、高血壓、肥胖癥、免疫力弱、消化器官腫瘤等疾病。2012年11月，我國衛(wèi)生部 批準(zhǔn)辣木葉作為新資源食品。
[0004]辣木葉極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值使其成為當(dāng)今國際社會(huì)普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。近幾年的研究發(fā) 現(xiàn)，辣木葉含有較高的多糖、黃酮、多酚等生物活性物質(zhì)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、 抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂等作用。因此，辣木葉具有很好的開發(fā) 前景，值得進(jìn)一步的研究和利用。
[0005] 專利號(hào)為201410178030.1的中國發(fā)明專利公開了"從辣木葉中提取辣木黃酮的方 法"，該方法包括如下步驟:1)將辣木葉片干燥裝入濾筐中，投入亞臨界萃取釜中，密閉萃取 釜;然后加入有機(jī)萃取劑，升溫至亞臨界萃取釜中萃取液處于亞臨界狀態(tài);提取萃取液投入 溶劑回收釜，減壓回收溶劑，得到黑綠色浸膏；2)向浸膏中加入用水飽和的正丁醇萃取;使 用離心機(jī)離心，收集萃取相;將萃取相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至棕黃色浸膏;3)將棕黃色浸 膏上大孔樹脂柱，然后用洗脫液按洗脫液的極性由小到大，梯度洗脫，檢測(cè)，取黃酮含量大 于97%的餾分濃縮至干粉，用甲醇或乙醇重結(jié)晶，得純度為98%以上的黃酮類產(chǎn)品，但未對(duì) 該黃酮類產(chǎn)品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。由于黃酮類化合物種類多樣，故不同的提取分離方法得到的 黃酮單體化合物也不盡相同。
[0006] 黃酮類化合物具有很好的抗氧化、抗腫瘤、降血壓等功效。專利號(hào)為 201310531168.0的中國發(fā)明專利從啤酒花中分離得到純度較高的蘆丁、異槲皮苷單體化合 物，并檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其有很好的抗氧化與抗過敏功效;然而目前沒有涉及從辣木葉中分離純化 出具有較好抗補(bǔ)體和降血糖活性，且活性成分較純的黃酮產(chǎn)品的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法， 整個(gè)工藝流程簡(jiǎn)單，加工制備的成本低，收率和純度高。
[0008] 本發(fā)明采用活性向?qū)е鸺?jí)分離純化方法，首次從辣木葉中分離、純化、鑒定出一種 具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的高純度的黃酮物質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0010] -種具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，以辣木葉為原料，經(jīng)過 提取、離心濃縮、聚酰胺樹脂、葡聚糖凝膠LH-20及制備液相等工藝純化后得到。
[0011] -種具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)將辣木葉粉末與浸提溶劑按料液比混合攪拌均勻，進(jìn)行超聲提取，得提取液， 離心得到上清液，將濾渣進(jìn)行二次提取，離心，合并上清液;分別以克和毫升作為單位，所述 料液比為1:25~1:45;以體積百分比計(jì)，所述浸提溶劑為60~80%乙醇；
[0013] (2)取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到濃縮液；
[0014] (3)將濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，再用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁 醇萃取液，將正丁醇萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得到粉末A;
[0015] (4)利用聚酰胺樹脂層析柱純化步驟(3)得到的粉末A，洗脫溶劑為乙醇水溶液，以 體積百分比計(jì)，薄層色譜進(jìn)行跟蹤，收集30 %乙醇的第3~7倍柱體積的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃 縮、冷凍干燥得粉末B;
[0016] (5)利用葡聚糖凝膠LH-20柱層析純化步驟(4)得到的粉末B，洗脫溶劑為甲醇水溶 液，以體積百分比計(jì)，薄層色譜進(jìn)行跟蹤，收集60~80 %甲醇洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干 燥，得到粉末C;
[0017] (6)將粉末C溶于甲醇中，控制粉末C在溶液中的濃度為3~5mg/mL;用制備液相反 相C18柱進(jìn)行梯度洗脫，收集30%~35%甲醇洗脫出來的化合物峰，HPLC進(jìn)行跟蹤，合并相 同組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥，得辣木葉黃酮固體粉末產(chǎn)品D。
[0018] 為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述辣木葉粉末是過40~60目篩得到。
[0019]優(yōu)選地，步驟（1)的超聲提取條件為：提取溫度為40~70°C，提取時(shí)間為30~ 70min，超聲功率為100~300W。
[0020] 優(yōu)選地，步驟(1)的離心的轉(zhuǎn)速為4000~5000r/min，時(shí)間為5~20min。
[0021]優(yōu)選地，步驟(2)~(6)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)都為真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溫度為45~65 °C。
[0022]優(yōu)選地，步驟(4)的聚酰胺樹脂純化中所用的聚酰胺型號(hào)為30~60目，洗脫梯度依 次為6~8倍柱體積水、8~10倍柱體積10 %乙醇、8~10倍柱體積30 %乙醇、8~10倍柱體積 50 %乙醇和8~10倍柱體積70 %乙醇。
[0023]優(yōu)選地，步驟(5)的葡聚糖凝膠LH-20柱層析純化中所用的甲醇洗脫梯度依次為3 ~4倍柱體積20~30%甲醇和5~6倍柱體積60~80%甲醇。
[0024] 優(yōu)選地，步驟(6)的制備液相反相C18柱純化中所用的洗脫程序?yàn)?~60min采用 30%~35%甲醇；60~105min采用35%~75%甲醇；105~115min采用75%~100%甲醇； 115~145min采用100%甲醇；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為250~280nm。
[0025] -種具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮，由上述制備方法制備。
[0026]本發(fā)明黃酮固體粉末D主要為槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷，純度達(dá)99%以上，其化 學(xué)式為：
[0028] 所述的化合物在制備抗補(bǔ)體和降血糖藥物和保健品中的應(yīng)用。所制得的黃酮單體 化合物具體涉及具有綿羊紅細(xì)胞溶血抑制活性及a_葡萄糖苷酶抑制活性，可用于制備抗補(bǔ) 體和降血糖類藥物或保健品。
[0029] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0030] 本發(fā)明首次從辣木葉中分離、純化、鑒定出一種具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的黃酮 化合物。
[0031] 該化合物對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶血抑制作用與肝素鈉相當(dāng)，高濃度時(shí)甚至高于肝素 鈉；
[0032] 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用與阿卡波糖相當(dāng)，可用于具有抗補(bǔ)體和降血糖功效的保 健食品或輔助治療藥物。
【附圖說明】
[0033]圖1為實(shí)施例1化合物的MS圖譜。
[0034] 圖2為實(shí)施例1化合物的1H-NMR圖譜。
[0035] 圖3為實(shí)施例1化合物的13C_NMR圖譜。
[0036] 圖4為實(shí)施例1化合物對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶血抑制作用效果圖。
[0037] 圖5為實(shí)施例1化合物對(duì)α_葡萄糖苷酶的抑制作用效果圖。 具體實(shí)施方案
[0038] 為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)發(fā)明的具體實(shí)施作進(jìn)一步說明， 但本發(fā)明的實(shí)施方式不限如此。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] (1)辣木干葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40目篩得辣木葉粉末；
[0041 ] (2)(2)將辣木葉粉末與浸提溶劑按料液比1: 25(單位分別為g和mL)混合攪拌均 勻，進(jìn)行超聲提?。ㄒ掖俭w積濃度70 %，提取溫度50°C，提取時(shí)間55min，超聲功率100W)，得 提取液，離心得到上清液，將濾渣進(jìn)行二次提取，離心，合并上清液;取上清液于50°C下進(jìn)行 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液。
[0042] (3)將濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，依次除去葉綠素等脂溶性成分， 小極性及中等極性的物質(zhì);再用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取液，將正丁醇萃取液經(jīng)真 空旋蒸濃縮、冷凍干燥得到粉末A。
[0043] (4)利用聚酰胺樹脂層析柱純化步驟(3)得到的粉末A，洗脫溶劑為乙醇水溶液，以 體積百分比計(jì)，洗脫梯度依次為6倍柱體積水、8倍柱體積10%乙醇、10倍柱體積30 %乙醇、 10倍柱體積50 %乙醇和8倍柱體積70 %乙醇，薄層色譜(TLC)進(jìn)行跟蹤，收集30 %乙醇的第3 ~7倍柱體積的洗脫液，濃縮、冷凍干燥得到粉末B;
[0044] (5)利用葡聚糖凝膠LH-20柱層析純化步驟(4)得到的粉末B，洗脫溶劑為甲醇水溶 液，以體積百分比計(jì)，洗脫梯度依次為3倍柱體積20%甲醇和5倍柱體積60%甲醇，薄層色譜 (TLC)進(jìn)行跟蹤，收集60 %甲醇洗脫液，濃縮、冷凍干燥得到粉末C;
[0045] (6)將粉末C溶于甲醇中，使其濃度為3mg/mL，用制備液相反相C18柱進(jìn)行梯度洗 脫，所用的洗脫程序?yàn)椹杶60min采用30%~35%甲醇；60~105min采用35%~75%甲醇； 105~115min采用75%~100%甲醇；115~145min采用100%甲醇；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為 254nm。收集31 %甲醇洗脫出來的化合物峰，HPLC進(jìn)行跟蹤，紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為 254nm，合并相同組分，真空旋蒸濃縮、冷凍干燥得辣木葉黃酮固體粉末產(chǎn)品D。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] (1)辣木干葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過60目篩得辣木葉粉末；
[0048] (2)將辣木葉粉末與浸提溶劑按料液比（1: 35，單位分別為g和mL)混合攪拌均勻， 進(jìn)行超聲提?。ㄒ掖紳舛?0%，提取溫度40°C，提取時(shí)間70min，超聲功率150W)，得提取液， 離心得到上清液，將濾渣進(jìn)行二次提取，離心，合并上清液;取上清液于50°C下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)濃縮得到濃縮液。
[0049] (3)將濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，依次除去葉綠素等脂溶性成分、 小極性及中等極性的物質(zhì);再用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取液，將正丁醇萃取液經(jīng)真 空旋蒸濃縮、冷凍干燥得到粉末A。
[0050] (4)利用聚酰胺樹脂層析柱純化步驟(3)得到的粉末A，洗脫溶劑為乙醇水溶液，以 體積百分比計(jì)，洗脫梯度依次為8倍柱體積水、8倍柱體積10 %乙醇、10倍柱體積30 %乙醇、8 倍柱體積50%乙醇和10倍柱體積70%乙醇，薄層色譜(TLC)進(jìn)行跟蹤，收集30%乙醇的第3 ~7倍柱體積的洗脫液，濃縮、冷凍干燥得到粉末B;
[0051] (5)利用葡聚糖凝膠LH-20柱層析純化步驟(4)得到的粉末B，洗脫溶劑為甲醇水溶 液，以體積百分比計(jì)，洗脫梯度依次為3倍體積30 %甲醇和5倍體積80 %甲醇，薄層色譜 (TLC)進(jìn)行跟蹤，收集80 %甲醇洗脫液，濃縮、冷凍干燥得到粉末C;
[0052] (6)將粉末C溶于甲醇中，使其濃度為4mg/mL，用制備液相反相C18柱進(jìn)行梯度洗 脫，所用的洗脫程序?yàn)椹杶60min采用35%甲醇；60~105min采用35%~75%甲醇；105~ 115min采用75%~100%甲醇；115~145min采用100%甲醇；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為265nm。 [0053]收集32%甲醇洗脫出來的化合物峰，HPLC進(jìn)行跟蹤，紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為 265nm，合并相同組分，旋蒸濃縮、冷凍干燥得辣木葉黃酮固體粉末產(chǎn)品D。
[0054] 實(shí)施例3
[0055] (1)辣木干葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過60目篩得辣木葉粉末；
[0056] (2) (2)將辣木葉粉末與浸提溶劑按料液比（1:45，單位分別為g和mL)混合攪拌均 勻，進(jìn)行超聲提取（乙醇濃度60%，提取溫度70°C，提取時(shí)間30min，超聲功率300W)，得提取 液，離心得到上清液，將濾渣進(jìn)行二次提取，離心，合并上清液;取上清液于50°C下進(jìn)行旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)濃縮得到濃縮液。
[0057] (3)將濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，依次除去葉綠素等脂溶性成分、 小極性及中等極性的物質(zhì);再用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取液，將正丁醇萃取液經(jīng)真 空旋蒸濃縮、冷凍干燥得到粉末A。
[0058] (4)利用聚酰胺樹脂層析柱純化步驟(3)得到的粉末A，洗脫溶劑為乙醇水溶液，以 體積百分比計(jì)，洗脫梯度依次為8倍柱體積水、8倍柱體積10 %乙醇、10倍柱體積30 %乙醇、8 倍柱體積50 %乙醇和8倍柱體積70 %乙醇，薄層色譜(TLC)進(jìn)行跟蹤，收集30 %乙醇的第3~ 7倍柱體積的洗脫液，濃縮、冷凍干燥得到粉末B;
[0059] (5)利用葡聚糖凝膠LH-20柱層析純化步驟(4)得到的粉末B，洗脫溶劑為甲醇水溶 液，以體積百分比計(jì)，洗脫梯度依次為6倍體積20 %甲醇和5倍體積70 %甲醇，薄層色譜 (TLC)進(jìn)行跟蹤，收集70 %甲醇洗脫液，濃縮、冷凍干燥得到粉末C;
[0060] (6)將粉末C溶于甲醇中，使其濃度為5mg/mL，用制備液相反相C18柱進(jìn)行梯度洗 脫，所用的洗脫程序?yàn)椹杶60min采用30%~35%甲醇；60~105min采用35%~75%甲醇； 105~115min采用75%~100%甲醇；115~145min采用100%甲醇；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為 280nm。收集32%甲醇洗脫出來的化合物峰，HPLC進(jìn)行跟蹤，紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為 280nm，合并相同組分，旋蒸濃縮、冷凍干燥得辣木葉黃酮固體粉末產(chǎn)品D。
[0061] 按以上實(shí)施例1制得的黃酮固體粉末產(chǎn)品通過以下方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，該化合物 為槲皮素-3-(H3-D-葡萄糖苷，實(shí)施例2和3的結(jié)果與實(shí)施例1類似，圖1為實(shí)施例1所得化合 物的MS圖譜，由圖可知[M-H] -= 463, [2M-H] -= 927,確定分子量為464。根據(jù)圖2和圖3的1H-NMR和13C-NMR可知該化合物有21個(gè)碳原子，確定其分子式為C 21H2Q〇12.
[0062] 圖 2 為實(shí)施例 1所得化合物的h-NMR圖譜，iH-NMRWOOMHz，DMS0-d6)Sl2.65( 1H, s， 5-OH)，10·90(lH，s，lAr-OH)，9.76(lH，s，lAr-OH)，9.25(lH，s，lAr-OH)，7.59((1, J = 2.0Hz， H-2'），6.42((1, J = 2.0Hz，H-8)，6.22((1, J = 2.0Hz，H-5'），5.48((1, J = 7.4Hz，H-l'），5· 31 (d，J = 3.7Hz，0H)，5.10(d，J=1.9Hz，0H)，4.98(lH，s，0H)，4.29(s，6，-OH)，3.59(d，J = 4.0Hz，6H)，3.47(s，4H)，3.44(s，52H)，3.24(dd，J=78.4,69.7Hz，41H)，2.55-2.48(m，4H)， 1.21(d，J = 19.8Hz，lH)〇
[0063] 圖 3 為實(shí)施例 1 所得化合物的 13C-NMR 圖譜，13C-NMR(151MHz，DMS0)S177.92
[0064] (C-4)，164.57(07)，161.71(05)，156.79(09)，156.66(02)，148.92(04'）， 145.27(03'），133.79(03)，122.07(06'），121.64(01'），116.68(05'），115.68(02'）， 104.46(010)，101.33(C-r)，99.12(C-6)，93.97(C-8)，78.02(C-3"），76.97(C-5"），74.56 (C-2"），70.40(C-4"），61.44(C-6"）。由此確定該化合物為槲皮素-3-〇-i3-D-葡萄糖苷。 [0065]可見，本發(fā)明得到黃酮固體粉末D為槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷，純度達(dá)99%以上， 其化學(xué)式為：
[0067]本發(fā)明實(shí)施例可見，整個(gè)制備工藝流程簡(jiǎn)單，制備成本低，收率和純度高。
[0068] 應(yīng)用實(shí)例1
[0069] 4% (v/v)綿陽紅細(xì)胞及豚鼠血清購自廣州蕊特生物科技有限公司，兔抗綿陽紅細(xì) 胞溶血素購自玉環(huán)縣南方試劑廠。
[0070] 以經(jīng)典途徑的紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)進(jìn)行化合物抗補(bǔ)體活性的測(cè)定。用明膠巴比妥緩沖 溶液(GVB2+)將溶血素（1:4000)稀釋10倍，將稀釋好的溶血素緩慢注入等體積的2%(v/v)綿 羊紅細(xì)胞中，輕輕混合均勻，37 °C水浴30min，即為致敏綿羊紅細(xì)胞。取200yL稀釋5倍的豚鼠 血清與200yL各濃度槲皮素-3-〇-i3-D-葡萄糖苷溶液混勻，37°C水浴lOmin，加入200yL致敏 綿羊紅細(xì)胞，輕輕混勻，于37°C水浴中反應(yīng)30min后，在2500r/min下離心10min，取上清液 150yL于96空板中，405nm測(cè)吸光值，同時(shí)設(shè)置樣品對(duì)照組(200yL各濃度槲皮素-3-〇-i3-D-葡 萄糖苷溶液+400yLGVB)、補(bǔ)體組(200yL豚鼠血清+200yL致敏綿羊紅細(xì)胞+200yLGVB)和全溶 血組（lOOyL 2%綿羊紅細(xì)胞+500yL超純水），用相同濃度的肝素鈉作為陽性對(duì)照（200yL豚 鼠血清+200yL致敏綿羊紅細(xì)胞+200yL肝素鈉）。結(jié)果如圖4所示，中低樣品濃度(0.25~3mg/ mL)范圍內(nèi)，槲皮素-3-〇-i3-D-葡萄糖苷的紅細(xì)胞溶血抑制率低于肝素鈉，當(dāng)樣品濃度增大 到4mg/mL時(shí)，其抗補(bǔ)體活性明顯高于陽性對(duì)照，且有繼續(xù)上升的趨勢(shì)。由此可知，該化合物 具有很好的抗補(bǔ)體活性，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系，其CH 5Q值為1.75mg/mL。
[0071] 應(yīng)用實(shí)例2
[0072]降血糖活性的測(cè)定：取各濃度槲皮素-3-〇-i3-D-葡萄糖苷溶液50yL，加入200yL 0.35U/mLa-葡萄糖苷酶（lOOmM pH6.9的PBS配制），混勻，37°C水浴中孵育lOmin，加入100yL 1.5mM pNPG(100mM ρΗ6·9的PBS配制），混勻，37°C水浴反應(yīng)20min，加入lmL 1M Na2C03終止 反應(yīng)，混勻，于400nm處測(cè)定吸光值，同時(shí)用相同濃度的阿卡波糖作為陽性對(duì)照組。結(jié)果如圖 5所示，與陽性對(duì)照阿卡波糖相比，槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷具有很好的α-葡萄糖苷酶抑 制活性，并且隨著樣品濃度的增加對(duì)酶的抑制率迅速增大，在〇.2mg/mL時(shí)抑制率(95.02 土 1 · 10 % )略低于阿卡波糖(99 · 61 ± 0 · 79 % )，其EC5q值為0 · 039mg/mL。
[0073]由圖4和圖5可知，槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷具有較強(qiáng)的抗補(bǔ)體和α-葡萄糖苷酶 抑制活性，高濃度(>3.5mg/mL)時(shí)甚至高于肝素鈉;對(duì)α -葡萄糖苷酶抑制作用與阿卡波糖相 當(dāng)，可用于具有抗補(bǔ)體和降血糖功效的輔助治療藥物，也可作為食品添加物摻入到特定保 健用食品、特殊營(yíng)養(yǎng)食物、營(yíng)養(yǎng)輔助食物、健康食品、功能性食品和病人用食品等飲食品中。 [0074] 應(yīng)用實(shí)例3
[0075]將槲皮素-3 - O-β- D-葡萄糖苷、木糖醇、甘露醇、5 %聚乙二醇乙醇液與硬脂酸鎂混 合均勻，以質(zhì)量百分比計(jì)，其中槲皮素-3-〇-i3-D-葡萄糖苷含量為10%，木糖醇含量為10%， 甘露醇65 %，5 %聚乙二醇乙醇液含量為10 %，硬脂酸鎂含量為5 %，壓片，每片0.5g，一次1 片，一日3次。功能與主治:可用于胰島素依賴型或非胰島素依賴型的糖尿病，18歲以下青少 年、兒童以及孕婦和哺乳婦女避免使用。
[0076] 應(yīng)用實(shí)例4
[0077]將槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷、木糖醇、山梨醇、5%聚乙二醇乙醇液與硬脂酸鎂混 合均勻，以質(zhì)量百分比計(jì)，其中槲皮素-3-〇-i3-D-葡萄糖苷含量為5%，木糖醇含量為10%， 山梨醇70%，5%聚乙二醇乙醇液含量為10%，硬脂酸鎂含量為5%，壓片，每片0.5g，每日每 千克體重1~1.5mg，分3次飯后服用。功能與主治:可用于免疫性疾病，18歲以下青少年、兒 童以及孕婦和哺乳婦女避免使用。
[0078]本發(fā)明的應(yīng)用方式不僅限于此，也可作為食品添加物摻入到特定保健用食品、特 殊營(yíng)養(yǎng)食物、營(yíng)養(yǎng)輔助食物、健康食品、功能性食品和病人用食品等飲食品中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 將辣木葉粉末與浸提溶劑按料液比混合攪拌均勻，進(jìn)行超聲提取，得提取液，離心 得到上清液，將濾渣進(jìn)行二次提取，離心，合并上清液;分別以克和毫升作為單位，所述料液 比為1:25~1:45;以體積百分比計(jì)，所述浸提溶劑為60~80%乙醇； (2) 取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到濃縮液； (3) 將濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，再用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃 取液，將正丁醇萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得到粉末A; (4) 利用聚酰胺樹脂層析柱純化步驟(3)得到的粉末A，洗脫溶劑為乙醇水溶液，以體積 百分比計(jì)，薄層色譜進(jìn)行跟蹤，收集30%乙醇的第3~7倍柱體積的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、 冷凍干燥得粉末B; (5) 利用葡聚糖凝膠LH-20柱層析純化步驟(4)得到的粉末B，洗脫溶劑為甲醇水溶液， 以體積百分比計(jì)，薄層色譜進(jìn)行跟蹤，收集60~80 %甲醇洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥， 得到粉末C; (6) 將粉末C溶于甲醇中，控制粉末C在溶液中的濃度為3~5mg/mL;用制備液相反相Cl8 柱進(jìn)行梯度洗脫，收集30%~35%甲醇洗脫出來的化合物峰，HPLC進(jìn)行跟蹤，合并相同組 分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥，得辣木葉黃酮固體粉末產(chǎn)品D。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，其特征 在于:所述辣木葉粉末是過40~60目篩得到。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，其特征 在于:步驟（1)的超聲提取條件為:提取溫度為40~70°C，提取時(shí)間為30~70min，超聲功率 為100~300W。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，其特征 在于:步驟(1)的離心的轉(zhuǎn)速為4000~5000r/min，時(shí)間為5~20min。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，其特征 在于:步驟(2)~(6)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)都為真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溫度為45~65°C。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，其特征 在于:步驟(4)的聚酰胺樹脂純化中所用的聚酰胺型號(hào)為30~60目，洗脫梯度依次為6~8倍 柱體積水、8~10倍柱體積10 %乙醇、8~10倍柱體積30 %乙醇、8~10倍柱體積50 %乙醇和8 ~10倍柱體積70 %乙醇。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，其特征 在于:步驟(5)的葡聚糖凝膠LH-20柱層析純化中所用的甲醇洗脫梯度依次為3~4倍柱體積 20~30%甲醇和5~6倍柱體積60~80%甲醇。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮的制備方法，其特征 在于:步驟(6)的制備液相反相C18柱純化中所用的洗脫程序?yàn)?~60min采用30%~35%甲 醇；60~105min采用35%~75%甲醇；105~115min采用75%~100%甲醇；115~145min采 用100 %甲醇；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為250~280nm〇9. 一種具有抗補(bǔ)體和降血糖活性的辣木葉黃酮，其特征在于其由權(quán)利要求1-8任一項(xiàng) 所述制備方法制備。10. 權(quán)利要求1所述的化合物在制備抗補(bǔ)體和降血糖藥物和保健品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P3/10GK105902584SQ201610378444
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】扶雄, 岳秀潔, 李超, 黃強(qiáng)
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué), 廣州粵糖食品科技有限公司